KR20020068262A - 타겟 및 경로 유효/무효화 방법 - Google Patents

타겟 및 경로 유효/무효화 방법 Download PDF

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Abstract

질병이나 그 상태의 기능과 이러한 질병이나 그 상태에 관련되는 것으로 추정되는 타겟 폴리펩티드를 코드화 할 유전자나 mRNA 간의 상호관계의 존재를 결정하는 방법으로서,
최고 약 15% 아데노신(A)의 함량을 갖거나 혹은 바람직하게 아데노신 함량을 갖지않은 것으로서, 타겟 유전자 및 이의 상응하는 mRNA, 3' 및 5' 인트론-엑손 경계부와 또한 코드화 및 비코드화 영역 사이의 근접부위로 구성된 군에서 선택되는 게놈성 및 mRNA 측생부위, 또한 사전선택된 질병이나 그의 상태에 관계하는 폴리펩티드를 코드화 할 모든 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 한 타겟에 대하여 항감지성인 올리고뉴클레오티드 (올리고)를 수득하고; 상기 올리고 중에서 타겟 mRNA에 대해 체외 교배시 mRNA에 의하여 폴리펩티드의 발현을 크게 저해 혹은 제거하는 올리고를 선택하고; 타겟 mRNA에 대해 체내 교배에 효과적인 양의 선택된 올리고를 대상체에 투여하고; 또한 올리고 투여 전후 질병이나 그 상태에 관련된 대상체의 기능을 평가하는 단계로 구성되고;
이 때, 기능의 수치가 70% 이상이면 상호관계성이 양성이고, 40 내지 70% 이면 잠재적으로 양성이며, 또한 30% 이하이면 상호관계성이 음성인 것으로 표시되는 것을 특징으로 하는 상호관계 결정방법을 발표한다. 본 발명의 방법은 바람직하게 타겟이 위치하는 장소 즉, 악성물질 및 기타 폐와 호흡기의 기능에 관련된 타겟을 유효을 유효화 할 때 대상체의 호흡기 속으로 올리고를 투여함으로써 상기 작용제가 폐속에 직접 접근하도록 하는 것이다. 또는, 이러한 탈아데노신 올리고를 공지의 전달제형을 통해 직접 CNS나 다른 기관, 조직 및 기관계통에 전달할 수도 있다.

Description

타겟 및 경로 유효/무효화 방법{METHOD FOR VALIDATING/INVALIDATING TARGET(S) AND PATHWAYS}
대략 100,000 정도의 인체 유전자 서열이 1-3년 내에 밝혀질 것으로 예상된다. 이 정보는 새로운 과거 혹은 현재 인류를 괴롭히고 있는 거의 모든 질병을 치료할 수 있는 신약을 개발할 수 있는 기회를 제공할 것이다. 이 대형 서열축적은 그러나, 이들 유전자의 잠재적인 영향력 즉, 치료학적 혹은 독성학적 작용에 관한 기능성을 구별할 수 있는 기술을 이용하게 될 때까지, 그 자체로서는 신약개발에 유용하지 못할 것이다. 예를 들어, 상기 기능을 신속하고 정확하게 테스트할 수 있는 방법이 절대적으로 필요하며 따라서, 새롭게 발견된 유전자 생성물을 약물개발 프로그램의 "타겟" 으로 유용하게 사용하여야 한다. 약물개발을 위한 자원을 보존하기 위해, "타겟"을 약물개발 과정에서 가능한 빨리 유효화 혹은 무효화 시킬 필요가 있다. 그럼에도, 이러한 방법의 실현은 서열은 밝혀졌으나 그 기능은 아직 알 수 없는 유전자군에 대한 약물개발 프로그램의 대규모 실행을 요구한다. 약물발견 프로그램의 핵심으로서, 새롭게 발견된 유전자 유전자 생성물의 가치를 평가하는 적절한 한가지 방법은 항감지 올리고뉴클레오티드를 활용하여 체내 혹은 체외에서 유전자 생성물을 제거하는 것이다. 이 방법은 이론적으로는 그 중요성이 매우 크나, 항감지 올리고뉴클레오티드가 체내 혹은 체외에서 분해되어 이것의 구성성분인 뉴클레오티드를 방출할 가능성이 있다는 점이 문제가 된다. 실제로 올리고뉴클레오티드 분해 생성물 중 하나인 아데노신은 어떤 조직에 대해 매우 큰 생체반응성을 갖는 것이 입증되었다. 아데노신은 신경전달 약화, 시상추 리듬 유지, 수면유발, D1 및 D2 도파민 수체의 길항작용, 항-자극작용, 혹은 동적 협동운동 실조증, 심장기능의 자율적 조절, 기관지수축, 네거티브-주기변동, 심근수축성 및 변전도작용 등을 포함한 에탄올에 의한 각종 영향의 조정, 항-베타-아드레날린형 반응 및 신장염 잔류 등을 포함하여 다면적인 자극의 영향을 제어한다. 좀더 명확히 말하면, 미량의 아데노신이라도 특정의 조직 즉, 특히 CNS, 과민성 천식이 있는 폐 및 신장 등에서 유리되는 경우 부분적으로 아데노신 수체를 활성화 할 수 있다. 이경우 타겟 유효화 데이타를 확실하고 분명한 방식으로 해석하기가 불가능해진다. 따라서, 아데노신을 함유하는 항감지 올리고뉴클레오티드는 분해되어 다면적 아데노신-조절 영향을 일으키므로 정확한 타겟 유효데이타를 제공하는데 적합하지 못하다.
과거 수년간의 초기 신경과학 연구는 여기성 아미노산(EAA) 중추신경계(CNS) 전달자, 예컨대 글루타민산 및 아스파트산과 다양한 경로학적 상태 즉, 심장발작과 CNS외상 간의 관계을 확인하기 위한 것이었다. 예를 들어, 중빈혈, 뇌빈혈, 발작 혹은 외상 등에 따른 신경조직 변성이 주 메카니즘은 뇌 속의 EAA계의 과잉활성 즉, 글루타메이트 및 아스파테이트의 과다 방출을 수반한다고 이해된다. 이 과정은 여기지연성 독성이라고도 하며 특정의 신경세포군은 이러한 여기독성을 선택적으로 감지한다.
아데노신은 다른 활성중에서도 사전-시냅스적으로(pre-synaptically) EAA의 방출을 억제하고 따라서 여기독성을 감쇠시키는 것으로 밝혀졌으며 이러한 방출은 이 계의 유효화 연구에 큰 방해가 되고있다. 아데노신의 영향은 대체로 세포외 수체에 의해 조절되기 때문에 약학적으로 적합한 아데노신풀이 세포 외측에 존재한다. 아데노신은 또한 신경-작용성 효과를 갖고 있으며 CNS 진정제 역할 즉, 신경활성을 억제하는 역할을 한다. 또한, 천연의 항경련 및 진정작용제이기도 하다. 새로운 연구를 통해, 정상조건에서 아데노신이 수면을 촉진하여 수면관련 반응 예컨대, 수면중 호흡정지에 수반되는 경로를 방해하기도 한다는 사실이 밝혀졌다. 아데노신이 중요한 "피로인자"이고 또한 수면주기의 분자적 지원에 관련한 유효화연구를 방해할 수 있다는 사실을 입증하는 증거가 속속 나타나고 있다. 예를 들어, 뇌에 있어서, 키이(key)수체가 뇌자극망의 신경세포에 존재하는 것이 연구를 통해 밝혀졌다. 과학자들 중에는 아데노신이 콜린계 등의 뇌속 자극망을 타겟화하여 수면력을 촉진한다고 믿는 사람도 있다. 이러한 모든 영향들은 아데노신이 작용하는 시스템 및 경로에서의 타겟 유효성 연구에 장애가 된다.
따라서, 다수의 유전자 및 이들의 기능을 결정하는 발현 생성물들을 스크리닝할 신속하고 효과적인 방법과 또한 타겟 유전자 및/또는 이들의 발현 생성물과 연계되는 질병 및 그 상태를 치료할 약제를 개발하는데 이들을 유용하게 사용하는 것이 크게 요구된다. 더욱더, 개별 유전자 기능을 시험하고 동시에 그 결과를 해석함에 있어서 장애가 될 다른 유전자 기능의 트리거를 피하기에 적합한 방법도 필요하다.
본 발명은 타겟 유전자 즉, 저아데노신(저A) 혹은 무아데노신(탈A) 함량을 활용하는 항감지(안티센스: antisense) 올리고뉴클레오타이드 (올리고)를 이용하여 중추신경(CNS) 유전자를 유효화하는 방법에 관계한다. 이 방법은 타겟 유전자의 스크리닝 및 타겟 유전자 생성을 억제함으로써 이들 기능을 저해하는데 도움을 준다. 이 방법은 특히 체내 응용에 적합하며 그 이유는 대상자의 기능이 대부분 아데노신에 응답하기 때문으로써 아데노신의 영향력이 특정의 타겟 유전자 검출기능을 마스크한다.
도 1은 염수(대조부), 아데노신(0) 및 dAMP(P)를 토끼에게 개별 투여한 실험을 도시하고;
도 2는 아데노신(A)을 함유하나 아데노신(desA)은 함유하지 않는 올리고뉴클레오티드(올리고)가 생체활성 아데노신을 방출하는 것을 도시하고;
도 3은 토끼 모델에서 기관지 경로의 동적순응에 대한 아데노신 A 수체에 대해 항감지성인 올리고뉴클레오티드 및 부적절한 대조부인 항감지 올리고뉴클레오티드의 영향을 도시하고;
도 4는 A1아데노신 수체 항감지 올리고뉴클레오티드-치료를 받은 기관지 경로 조직에 존재하는 A1및 A2아데노신 수체의 수로 표시된 바와 같이, A1아데노신수체에 대해 항감지성인 올리고뉴클레오티드의 특이성을 도시한다.
본 발명은 질병 혹은 그 상태와 또한, 이러한 질병 혹은 그 상태에 연루되는 것으로 예측되는 타겟 폴리펩티드를 코드화할 유전자 혹은 mRNA 간의 함수관계 존재성을 유효/무효화 혹은 결정하기 위한 방법에 관계한다. 이 방법은 대체로, 최고 15% 정도의 아데노신(A)으로 구성되고 또한, 타겟 유전자 및 이에 상응하는 mRNA, 게놈 및 mRNA 측생부, 3' 및 5' 인트론-엑손 부분, 코드화 및 비-코드화 영역 사이의 근접구역, 및 사전선택된 질병 혹은 그 상태에 관련된 폴리펩티드를 코드화할 모든 mRNA 시그먼트로 구성된 군에서 선택된 타겟에 대하여 항감지성인 올리고뉴클레오티드(올리고)를 수득하고; 이들 올리고 중에서 타겟 mRNA에 대한 체외 교배시 mRNA에 의해 코드화되는 폴리펩티드의 발현을 크게 억제 혹은 방해할 수 있는 것을 선택하고; 선택된 올리고를 타겟 mRNA에 대한 체내 잡종교배에 유효한 양으로써 대상체에 투여하고; 및 올리고의 투여전이나 후에 질병 혹은 그 상태에 연루한 대상체의 기능을 평가하는 것으로써, 여기서 각 기능값이 약 70% 이상 변화하는 경우 관련성이 양성이고; 40 내지 70%이면 관련성이 잠재된 것이며; 또한 30% 이하이면 관련성이 적은 것으로 판단한다. 본 발명의 방법을 응용할 수 있는 분야는 폐, 뇌, 심장, 신장, 종양, 혈액, 면역계, 피부, 눈, 코, 경로계통, 두피, 미각, 자궁경부, 인두부, 식도, 장(소장 및 대장), 활액조직, 근육, 난소 및 귀, 그 밖에도 대체로 타겟 부위를 포함하거나 이로부터 유래된 다른 세포들에 대해 영향을 미치는 질병 혹은 그 상태에 관련되는 유전자 혹은 유전자망을 명료하게 확인하는 분야이다.
본 발명을 첨부 도면과 함께 상세히 기술하기로 한다. 기타의 목적 및 이 발명의 장점과 특징은 다음의 상세한 설명에서 더욱 명확해질 것이다.
본 발명은 다음의 구체적인 실시예에 대한 상세 설명에서 더욱 잘 이해될 것이다.
본 발명은 타겟 유전자 및 그의 생성물의 기능 및 이에 따른 유용한 효과에 대한 신속하고 효율적인 발견기술을 제공하려는 발명자의 의도에 의해 개발된 것이다. 발명자는 저 아데노신 항감지 올리고뉴클레오티드(올리고)를 대상자의 체내에 투여하고 동시에 아데노신 수체에 의한 다른 부적절한 부작용을 제거하는 것에 관련한 발명자의 선행발견을 응용함으로써 이러한 목적을 성공적으로 달성할 수 있을 것으로 예상했다. 본 발명은 약물발견 프로그램의 핵심인 신발견된 유전자 및 유전자 생성물의 가치를 체내 및 체외에서의 이들 기능을 없애는 항감지 올리고뉴클레오티드의 도움으로 평가할 수 있게 해준다. 과거에는, 항감지 올리고뉴클레오티드를 유전자 발현의 제거에 활용하는 것이 이론적인 중요성을 가졌으나 본 발명자는 항감지 올리고뉴클레오티드가 체내 혹은 체외에서 분해되어 구성분인 뉴클레오티드를 방출하고 또한 뉴클레오시드는 이들의 응용을 방해함으로써 무효함을 밝혔다. 본 발명자는 올리고뉴클레오시드 분해 생성물, 아데노신 모노포스페이트 중 하나가 아데노신 자체로서 각종 조직에 큰 생체활성을 갖는다는 것을 확인했다. 아데노신 자체는 신경전달 약화, 수면유발, D1 및 D2 도파민 수체의 길항작용, 항-자극작용, 혹은 동적 협동운동 실조증, 심장기능의 자율적 조절, 기관지수축, 네거티브-주기변동, 심근수축성 및 변전도작용 등을 포함한 에탄올에 의한 각종 영향의조절, 항-베타-아드레날린형 반응 및 신장염 잔류 등을 포함하여 다면적인 자극의 영향을 제어하는 것으로 알려졌다. 좀더 명확히 말하면, 본 발명의 실시예에서 보는 바와 같이 미량의 아데노신이라도 특정의 조직 즉, 특히 CNS, 폐, 심장 및 신장 등에 있는 아데노신 뉴클레오시드는 국소 환경에서 아데노신 수체를 활성화 할 수 있다. 이는 신뢰할만한 확실한 방식으로 타겟 유효데이타를 해석하는 것을 불가능하게 만든다. 본 발명의 실시예 30 및 3과 도 1 및 2는 생체활성 아데노신 뉴클레오시드를 방출하는 아데노신-함유 올리고뉴클레오티드의 분해현상을 도시한다. 도면에서는 아데노신(A)를 함유하나 아데노신(desA)는 함유하지 않는 올리고뉴클레오티드(올리고)가 생체활성 아데노신을 방출하는 것으로 나타났다. 예시적인 설명에서, 2개의 21-mer 임의의 포스포로티오에이트 항감지 올리고뉴클레오티드(올리고) 중 하나는 아데노신을 함유하고(>) 다른 하나는 desA 올리고(o)를 함유하는 것으로써 모두 마취된 토끼에 투여하였다.
도 1에서 염수는 아무런 효과도 없었으나 아데노신 및 dAMP는 약량의존 방식으로 서로 유사한 감소효과를 나타냈다. 이 결과는 dAMP 같은 뉴클레오시드가 직접적으로 혹은 아데노신에 대한 분해 및/또는 대사 뒤에 아데노신 수체에서 아데노신이 생리학적인 영향을 나타낸다는 것을 의미한다.
도 2에서, 방출된 아데노신은 아데노신 수체를 활성화하고 또한 유효화 연구에서 관측된 신호를 방해할 생물할적 응답을 일으킨다. 여기서 2개의 21-mer 임의의 포스포로티오에이트 항감지 올리고뉴클레오티드(올리고) 중 하나는 아데노신을 함유하고(>) 다른 하나는 desA 올리고(o)를 함유하는 것으로써 모두 마취된 토끼에투여되었다. 아데노신 함유 올리고뉴클레오티드는 기관지에 대한 순응도를 크게 저하시키며 이는 A수체가 활성이나 desA 임의 올리고는 활성이 아니었음을 반영한다. 하기의 실시예 31을 참조한다. 도 3 및 4는 항감지 올리고뉴클레오티드가 폐 혹은 호흡기 질환에 관련된 타겟의 유효화에 효과적인 작용제로서 활용될 수 있음을 도시한다. 또한, 아데노신 뉴클레오시드(dAMP)는 아데노신 수체에서 아데노신과 유사한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 실시예 30을 참조한다.
본 발명의 실시예에서 설명된 연구 및 이에 따른 결과로부터, 타겟 유효화를 성공적으로 달성하였음을 알 수 있으며 이는 본 발명의 방법을 새롭게 발견된 타겟 및/또는 기능이 공지된 타겟에 본 발명의 방법을 적용하여 얻은 결과이다. 실험결과는 또한, 타겟 단백질의 제어를 받는 영향들에 대항하거나 혹은 이들을 감소시킴으로써 본 발명의 방법이 특별히 타겟설정된 비-포스포디에스테르 항감지 올리고뉴클레오티드를 이용할 때 고선별적으로 및 효과적으로 타겟을 유효/무효화 할 수 있는 것으로 확인됨을 보여준다. 아데노신 A1수체 mRNA를 타겟화하는 모든 항감지 올리고,아데노신 A2b수체 mRNA를 타겟화하는 1개의 항감지 올리고, 아데노신 A3수체 mRNA를 타겟화하는 2개의 항감지 올리고 및 브래디키닌 수체를 타겟화하는 1개의 항감지 올리고는 외부투여된 아데노신에 의해 유도된 특이성 아데노신 수체에 의해 조절되는 영향들에 대응한 것으로 나타났다. 본 발명의 방법은 더욱더, 특별히 선택된 타겟을 유효/무효화 하는데 특이적이며 아데노신 A1및 브래디키닌 유전자 와 mRNA에 대해 타겟화된 항감지 올리고에서 보는 바와 같이 다른 타겟들을 억제하지못한다. 덧붙여서, 결과에서 보는 바와 같이 저아데노신 혹은 무아데노신 함유 올리고를 이용하는 본 발명의 방법은 부작용 혹은 독성이 거의 없거나 혹은 전혀 없는 것으로 나타난다. 이는 호흡기 계에 대해 실험한 결과에서 알 수 있듯이 타겟의 유효화에 대하여 특히 효율적이고 특이적인 방법을 100% 제공하는 결과를 보여준다. 본 발명은 CNS같은 특별한 기능이나 엔드포인트(end point)와 관련된 특이적인 질병 혹은 그 상태에 연루된 다른 계통의 타겟과 함께 호흡경로계 질환과 상관있거나 이에 수반하는 호흡기/기관기 계의 모든 유전자 및 이에 대응된 mRNA 코드화 단백질에 대해 동일한 방식으로 광범위하게 응용가능하다. 또한 비교실험을 포스포디에스테르 올리고와 함께 본 발명의 방법에 따라 실행하였고 여기에서 사용된 동일한 올리고뉴클레오티드는 그 일부가 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된다. 본 발명의 방법을 응용하여 얻은 결과에서 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드의 치환물은 예상외의 탁월한 특성을 보여주었다. 아데노신 고함량(33%) 항감지 올리고뉴클레오티드는 따라서 분해되어 다면적 아데노신-조절 영향을 일으킬 수 있으므로 타겟 유효데이타를 소거하는데 적합하지 않다. 본 발명의 방법에 의해 활용되는 저아데노신 올리고머는 이러한 부작용이 완벽하게 소거된 것이다. 본 발명은 예컨대, 기도나 폐, CNS 및 기타 다른 기관이나 계통에서 아데노신의 유리에 의해 다면적 영향들이 발생하는 경우에 실행될 모호한 "타겟 유효화를 위한 활용방법을 개시한다. 이 방법은 저A 혹은 desA 항감지 올리고 즉, 저A함량 혹은 아데노신 결핍된 올리고를 사용하는 것을 수반하며 따라서 고생체활성 아데노신이 분해과정에서 유리되지 않도록 할 수 있다. 본 발명의 기술은 사실상 어떤 유전자에서도 실행 가능하나 특히 다음의 유전자 서브셋에 바람직하게 적용된다; G-단백질 결합수체, 신경호르몬 수체, 신경펩티드 수체, 칼륨채널 수체, 염화물 채널 수체, 즉 사실상 정상 혹은 질병 상태의 CNS, 심장, 폐, 신장, 혈액, 면역계에서 발현된 임의의 유전자나 하기에서 열거된 것 외의 대부분의 유전자를 포함한다. 따라서, 본 발명에서 설명한 유효화 방법은 특별히 여기서 언급된 유전자나 계에 국한되지 않고 다른 유전자 및 유전자망 종류나 서브종류에도 적용되는 것이다.
성공적인 악물발견 프로그램은 약물개발 타겟이 되는 후보 유전자 생성물의 적합성에 대한 신속하고 정확한 평가에 따른다. 통례적으로, 이 방법은 막대한 시간, 인적자원 및 재원을 소비했다. 본 발명은 특별한 저 혹은 des아데노신(desA) 항감지 올리고뉴클레오티드 (모두 통틀어 desA-ASONs 라고 함)을 활용하는 다양한 생물학적 계에서 신속하고 확실한 타겟 유효/무효화 방법을 제공한다. desA-ASONs을 사용하는 본 발명의 방법은 종래의 기술로는 달성할 수 없었던 속도 및 정확도로써 잠재적 유전자 타겟을 유효/무효화한다. desA-ASONs은 전통적인 방법에 대비할 때 훨씬 우수한 정확도 및 속도를 제공한다. desA-ASONs는 아데노신 -유발 부작용을 일으켜 타겟 유효화를 불분명하게 만드는 생체활성 아데노신을 분해 및 방출할 수 없다. ASONS 중에서 호흡계통 투여를 위한 서브군을 RASONs 라고 한다. desA-RASONs 은 본 발명의 방법을 실행할 때 아데노신 A1, A2, A3타겟을 유효화 하기 위해 사용되었다. 본 발명기술은 또한 뇌 생리학의 주조절자로서, 분해 및 아데노신 방출을 할 수 없는 뇌 항감지 올리고뉴클레오티드(뇌에 투약된) desA-BASONs으로 뇌영역 내에서 위치특이적 기능성 유전자를 소거한 뒤의 생화학, 행동학 및 생리학적 평가를 수반하는 CNS 타겟에 대해서도 응용가능하다. 예시된 폐 타겟의 유효화 처리 이외에도 본 발명은, 하기와 같이 CNS 관련 타겟에 대해서도 기술하며, 일반적으로 다음과 같이 desA 항감지 올리고뉴클레오티드를 사용하는 다수의 타겟 유효화 단계들을 실행하는 것을 포함한다.
초기 단계은 타겟 유효화를 위한 일반계통 혹은 범위 즉, CNS, 호흡계, 신장계, 심장부위 등을 확인하는 것이다. 그 후, 공공 도메인의 젠뱅크(GenBank)나 기타 라이브러리 혹은 유명기업에 비치된 비공개 라이브러리의 도움을 받는다. 예를 들어, 모든 G-단백질 결합 수체(GPCRs)를 포위한 것 같은 특이성 라이브러리는 공공 및 비공개 데이타베이스에서 발견되었다. 현재, 약 250개의 GPCRs가 존재한다. 본 발명의 타겟 유효화 방법은 따라서 적절한 desA 항감지 올리고를 이용하여, 선별된 타겟군 즉 GPCRs이 개별적으로 약화되는 경우에 생리학적, 생체물리학적, 생물학적, 행동학적 측면의 사건들이 발생함을 검사하는데 적합하다. 이를 위해, desA 항감지 올리고는 하술하는 바와 같이 안출 및 상기의 GPCRs 등의 사전선별된 타겟 유전자를 위해 합성되었다. desA 항감지 올리고는 다시 1차로 체외에서 예컨대 적절한 세포주, 1차 세포조직 혹은 다른 세포조직을 이용하여 검사한다. 체외검사는 특이적 타겟에 대항하여 안출된 수개의 desA 항감지 올리고가 항감지제로서 "가장 활성적인"지의 여부를 결정하는데 응용된다. 즉, 어느 쪽이나 가장 이상적인 방법으로 유전자 발현을 제어 혹은 소거한다. 이것은 세포의 특이활성과 상관관계을 갖는 다른 생체물리학적, 생물학적, 생리학적 및 기타 분석방식으로 실행하기도 한다. 다른 경우, 체외계 내의 타겟 유전자를 분해하면 유용한 타겟 유효화정보를 얻을 수도 있다. 가장 활성적인 desA 항감지 올리고를 선택하여 예컨대, CNS 연구시의 뇌부위에 직접 심거나, 호흡계 등에 관련된 폐 타겟 내에 투여함으로써 체내에 응용한다. 이것은 공지방법으로 실행할 수 있으며 예컨대, 뇌 타겟을 위한 입체식 캐뉼러삽입법, 호흡기 타겟을 위한 흡입법, 혈액 타겟을 위한 계통적 처리, 국소적인 계통나 다른 기관 및 조직세포, 심장혈관 세포를 위한 투약법, 또한 신장 타겟을 위한 흡입법이나 직접삽입법 등을 활용할 수 있다. 행동학적, 생체물리학적, 생리학적, 생화학적, 면역학적 및 기타의 실험을 통해, 적절한 항감지 올리고뉴클레오티드를 투여하여 하나이상의 타겟 유전자를 제거한 각 동물로부터 자료를 수득하였다. 음식소화, 욕구, 리비도, 인식력 등의 행동학적 기능이나 엔드포인트 혹은 온도, 뇌전도(ECG), 심전도(EKG), 사구체 여과량 및 농도, 이온잔류량, 단백질 손실량 등의 생리학적 엔드포인드 등을 공지방식대로 평가한다. 이들 단계을 하기 도표에서 CNS에 대해 도시한다.
본 발명의 방법은 다량의 생체활성 아데노신을 방출함 없이 호흡기(desA-RASONs), CNS(desA-BASONs), 신장계(desA-KASONs), 심장계(desA-CASONs), 혈액(desA-SASONs), 면역계(desA-IASONs), 악성조직(desA-MASONs) 및 기타 다른 기능계에 응용하기 위한 저A 혹은 desA-ASONs에 의지한다. 이 방식에서, 본 발명의 방법은 폐, CNS, 신장, 심장, 혈액, 면역계, 약성세포 응집괴 등에 있어서 불필요한 아데노신 수체의 활성작용을 방지한다. 현재 실용화된 방법으로 수득한 결과는표준 항감지 구조물이 정상의(고함량) 아데노신을 25% 정도 함유하고 아데노신 수체를 활성화하기 때문에 해석도가 떨어진다. 이 영향 때문에 기능도 해석에 혼란이 야기되고 그 결과도 정확치 못하게 된다. 예를 들어, 폐에서 올리고-방출 아데노신은 기도직경의 변화를 일으키거나 (기관지수축), 감염 및 가래 분비 등을 일으키며 이러한 영향은 본 발명의 경우 다른 타겟 유효화 처리와 전혀 무관한 것이다. 이러한 "부작용"은 올리고뉴클레오티드나 혹은 리보자임에서 얻은 데이타를 해석할 수 없게 만든다. 유사하게, A-함유 항감지 올리고뉴클레오티드가 뇌에 이용될 때 그 영향은 타겟 유효화의 엔드포인트로 이용될 수 있는 다수 기능들에 장애가 된다. 예를들어, 아데노신은 신경전달 약화, 수면유발, 항-자극작용 등을 일으키고 또한, 동적 협동운동 실조증, 심장기능의 자율적 조절, D1 및 D2 도파민 수체의 길항작용, CNS 혈류의 변동 및 기타 영향의 숙주를 조절한다. 항감지 올리고를 아데노신 수체를 함유하거나 혹은 아데노신ㅇ에 응답하는 과민성 폐, CNS 및 기타 기관에서의 타겟 유효화 연구에 이용할 때 다량의 아데노신은 반드시 피해야 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 탁월한 타겟 유효화 수단을 제공한다. 특히, 본 발명이 바람직하게 응용되는 분야는 각각 별도로 타겟화되어 있으며 타겟에 관련한 하나 이상의 기능을 개별적으로 측정할 수 있는 장소로써 호흡기관, CNS, 혈액, 악성 및 비제어형 성장세포, 기타 다른 시스템에 관련된 치료부위를 조사하는 것이다.
본 발명의 방법은 생물과학 역사상 유례가 없는 시기에 개발된 것으로서 인간 게놈의 서열화로부터 수득한 정보를 더욱 신속하고 효율적으로 활용할 수 있게 해준다. 인각 게놈의 전 유전자 서열을 밝혀낸 것은 현대의학의 성배라고 할 만한일이다. 이 연구의 성공으로 특이성 유전자와 이들의 기능간 상호관계을 구성할 수 있으며 심장병 치료에 더욱 바람직하면서도 현재 시판되는 약물의 부작용이 전혀 없는 새로운 종류의 약제를 개발할 수 있을 것이다. 현재 축적되고 있는 거대한 서열지식은 중요한 타겟을 제공한다. 본 발명의 방법은 신체기능 및 따라서 질병 측면에서 중요한 유전자를 인식하고 및 이들의 기능의 억제가 치료학적 측면에서 유용한지를 결정하는 매우 중요한 수단을 제공해준다. 유전자 기능 억제가 치료효과를 갖는다면 이것은 "타겟 유효화"로 결정한다. 약물 발견과정의 초기단계에서 이것은 매우 중요하며, 주원료가 타겟 유전자의 기능 억제를 위한 신약 개발로 확대될 것인지의 여부를 결정하는데 도움을 준다. 이러한 측면에서, 타겟을 유효화하는 것은, 기능억제가 기능적(치료학적) 효과없이 시행되는 것을 입증함으로써, 이것을 무효화 하는 것 만큼 중요하다. 약물 발견과정 에서의 타겟 초기 무효화는 성과없는 약물 발견 캠페인에 따른 자원의 낭비를 방지할 수 있다. 그러므로, 더 생산적인 타겟에 대한 더욱 신속하고 요점에 접근한 연구가 가능하다. 본 발명에 따른 신속 및 정확한 타겟 유효화 방법은 예컨대, 인간 게놈 프로젝트에서 수득한 대량의 정보를 치료분야에 응용함에 있어서 성공과 실패의 차이를 구획짓는 것이다. 본 발명의 방법에서 항감지 올리고의 체내 실험은 체외 및 동물모델을 대상으로 천식, 호르몬질환, 유전자질환, 비만 등의 호흡기 질병과 또한 CNS, 신장, 심장, 혈액법 등을 포함한 기타 질환에 대해 실행할 수 있다. 공지의 분석법은 본 발명을 실행하기 위하여 의식있는 및 비제한적인 설치류, 토끼 혹은 영장류에 대한 전체 혈량측정법으로써 예컨대 트루프리메이트J 혹은 다른 종류의 기술 등이 활용되었다. 본발명의 방법은 따라서, 질병이나 그 상태와 또한 이것에 연계하는 것으로 예측되는 타겟 폴리펩티드를 코드화 하는 유전자나 mRNA 간에 성립되는 함수관계을 결정하는데 도움을 준다. 이 방법 자체는 대체로 최고 약 15% 아데노신(A)으로 구성되고 및 타겟 유전자 및 그에 상응하는 mRNA, 게놈형 및 3' 및 5' 인트론-엑손 경계부 및 코드부와 비-코드부 사이의 근접영역, 또한 사전선택된 질환 혹은 그 상태에 연계된 폴리펩티드를 코드화하는 모든 mRNA 시그먼트로 구성된 군에서 선택된 mRNA 측면부로 된 군에서 선택된 타겟에 대하여 항감지성인 올리고뉴클레오티드 (올리고)를 수득하고; 올리고 중에서 특히 타겟 mRNA에 대한 체외 잡종교배 하에 mRNA에 의해 코드화 되는 폴리펩티드의 발현을 크게 저해하거나 제거하는 올리고를 선택하고; 또한 타겟 mRNA에 대한 체내 교배에 효과적인 올리고를 적정량으로 대상체에 투여하고; 및 올리고 투여 전 및 후에 질병이나 그 상태에 관련된 대상체의 기능을 평가하는 것을 포함하며, 여기서 기능치의 변화가 약 70% 이상인 경우 상호관련성이 양성이고 40 내지 70% 이면 잠재성이 있으며 및 30% 미만인 경우 상호관련성이 부족한 것으로 판단한다.
항감지 올리고는 G 및 C로 구성된 군에서 선택한 적어도 4개의 인접한 핵산을 구비하고 또한 선별된 분할편을 포함하고 약 0%, 3%, 5%, 10%, 12% 및 최고 15% 까지의 함량으로 C 및 G를 함유한 4,6,8,10 내지 약 15, 25, 45, 60 뉴클레오티드 길이의 제1 올리고뉴클레오티드를 수득함으로써 구성된다. 또는, 타겟 분할편을 특별한 목적에 따라 변화하는 이들의 종류 및/또는 활성강도에 따라 선별하기도 한다. 일정갯수의 아데노신은 1개 내지 전체갯수까지 "포괄적인" 혹은 티미딘 염기에연결되는 한편 아데노신 A1, A2a, A2b, 및 A3수체에서 아데노신 염기 길항활성도가 0.3 이하인 헤테로방향족 염기 또한 아데노신 A2a수체에서 전혀 활성이 없는 헤테로방향족 염기 등의 다른 염기에 의해 치환될 수 있다. 헤테로방향족 염기는 피리미딘과 또한 예컨대, O, 할로, NH2, SH, SO, SO2, SO3, COOH, 측쇄 및 융해된 1차 및 2차 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 알케녹시, 아실, 시클로아실, 아릴아실, 알키녹시, 시클로알콕시, 아로일, 아릴티오, 아릴설폭실, 할로시클로알킬, 알킬시클로알킬, 알케닐시클로알킬, 알키닐시클로알킬, 할로아릴, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 아릴시클로알킬로 치환가능하고 또한 O, 할로, NH2, 1차, 2차 및 3차 아민, SH, SO, SO2, SO3, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬 및 헤테로아릴에 의해 더 치환될 수 있는 퓨린이다. 그러나, 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 화합물 및 다른 치환물도 있다. 전형적으로, 피리미딘과 퓨린은 위치1, 2, 3, 4, 7 및 8에서 치환되며 다른 치환방식도 있다. 피리미딘 및 퓨린의 예를 들면 다음의 화학식으로 표현되는 티오필린, 카페인, 디필린, 에토필린, 아세필린, 피페라진, 바미필린, 엔프로필린 및 크산틴이 있다.
여기서 R1및 R2은 독립적으로 H, 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이며 R3은 H, 아릴, 디시클로알킬, 디시클로알케닐, 디시클로알키닐, 시클로알케닐, 시클로알키닐, O-시클로알킬, O-시클로알케닐, O-시클로알키닐, NH2-알킬아미노-케톡시알킬옥시-아릴 및 모노 및 디알킬아미노알킬-N-알킬아미노-SO2아릴이다.
통용하거나 별도의 염기에 대한 예로써 3-니트로피롤-2'-데옥시뉴클레오시드, 5-니트로-인돌, 2-데옥시리보실-(5-니트로인돌), 2-데옥시리보푸라노실-(5-니트로인돌), 2'-데옥시이노신, 2'-데옥시네불라린, 6H, 8H-3,4-디히드로피리미도 [4,5-c]-옥사진-7-온 혹은 2-아미노-6-메톡시아미노퓨린 등이 있으며 그외에도 다른 적절한 염기를 사용할 수 있다. 가장 바람직한 것은 아데노신 수체에서의 활성도가 없는 즉, 임의의 아데노신 수체에서 길항제 및 길항근을 갖지 않는 아데노신 유사체이다. 이 방법은 또한 또다른 바람직한 구현예에서, 올리고 내에 존재할 경우의 CpG 디뉴클레오티드에 적어도 하나의 탈메틸화된 C로 치환된 메틸화된 시토신(mC)을 활용할 수 있으며 그 밖의 다른 것도 치환가능하다. 피리미딘의 다른 C-5 변형물 역시 유용하며 특히 C-5 프로핀이 바람직하다. 이 방법을 실행함에 있어서, 항감지 올리고뉴클레오티드의 하나 이상 혹은 모든 연쇄 잔류물은 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 티오에테르, 카르보네이트, 카르바메이트, 설페이트, 설포네이트, 설파메이트, 설폰아미드, 설폰, 설파이트, 설폭시드,설파이드, 히드록실아민, 2'-메틸렌(메틸이미노), (MMI), 2'-메톡시메틸(MOM), 2'-메톡시에틸(MOE), 2'-메틸렌옥시(메틸이미노)(MOMA), 2'-메톡시메틸(MOM), 2'-O-메틸, 포스포라미데이트 및 C-5 치환(즉, C-5 프로핀) 로 구성된 군에서 선택된 잔류물 및 그의 혼합물로 치환 혹은 변형된다. 이 방법을 실행하기에 적합한 항감지 올리고는 약 7, 9, 11, 13, 15, 18, 21 내지 25, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 개의 모노뉴클레오티드쇄 길이를 갖는 것이며 물론 이외의 길이를 가진 것도 적절히 사용된다.
본 발명의 방법은 또한 공지기술 중에서도 세포 및 세포 타겟화 작용제 즉, 트랜스페린, 아시아로글리코프로테인 및 스트렙타비딘 등에 의해 내부화되거나 혹은 흡수되는 작용제에 결합되는 항감지 올리고를 사용할 수 있다. 한가지 구체예로서, 올리고는 원핵세포 혹은 진핵세포인 벡터에 결합된다. 공지된 벡터의 예는 본 발명에서 설명하지 않기로 한다. 투여된 항감지 올리고는 대체로 mRNA의 생성 혹은 이용율을 감소시키거나 혹은 분해현상을 증가시키고 혹은 본래의 모습으로 존재하는 폴리펩티드의 양을 감소시키는데 효과적인 양으로 한다. 예를들어, 유효화된 유전자가 호흡기관에 연관되는 경우 항감지 올리고는 직접 폐에 투여할 수 있다. 유전자 및 그의 기능이 또다른 계에 관련되는 경우, 핵산을 해당부위 즉, 뇌, 심장, 신장, 방광, 생식선 및 재생계와 호흡계 및 폐계, 악성종양, 혈액, 면역계, 폐, 피부, 눈, 비강경로, 두피, 혀, 자궁경부, 구강, 후두부, 식도, 소장 및 대장, 활액조직, 근육, 난소, 외이 및 기타 선택된 타겟부위로부터 유래되는 다른 세포들에 직접 투여하는 것도 바람직하다. 대부분의 경우, 질병이나 그 상태는 상술한 바와같이 특정의 계통 혹은 그 계통의 일부를 괴롭힌다. 예컨대, 만성 호흡기 질환은 기관지수축, 염증, IgE-조절형 알러지, 가래생성 및 기타 천식이나 알러지성 비염, COPD, 폐암, ARDS 등과 같은 질환의 증가에 관계있다. 질병 혹은 그 상태가 면역학적 기능장애와 관계되는 경우, 타겟은 면역글로부린 및 항체 수체, 사이토킨 및 사이토킨 수체, 유전자 및 기타 유전자 생성물, 또한 이에 상응하여 이들 및 다른 관련 기능을 코드화할 mRNA, 유전자 및 이것을 코드화할 mRNA 측생부위 및 인트론과 엑손 경계부 등에서 선택된다. 질병 혹은 그 상태가 악성조직 혹은 암에 관련되는 경우, 타겟은 종양관련 유전자 생성물, 유전자 및 이것을 코드화할 mRNA, 유전자 및 종양생성유전자, 유전성 및 mRNA 측생부 및 엑손과 인트론 경계부에 연계된 mRNA로부터 선택된다.
본 발명의 방법에서 사용할 항감지 올리고는 기도에 고통을 주는 질병 및/또는 상태에 관계하는 폴리펩티드, 유전자 및 이를 코드화할 RNA, 유전성 및 mRNA 측생부 또한 유전자 및 인트론과 엑손 경계부에 연계된 mRNA로 구성된 군에서 타겟을 선택하고, 타겟 유전자에 대응하는 mRNA, 타겟 폴리펩티드, 유전성 및 mRNA 측생부 및 유전자를 코드화할 mRNA, 또한 mRNA 인트론과 엑손 경계부로 구성된 군에서 선택된 mRNA 서열을 수득하고; 적어도 하나의 mRNA 분할편을 선별하여 이 선별된 mRNA 분할편에 대해 항감지성인 하나 이상의 올리고를 합성하고; 또한 필요시 통용 혹은 별개의 염기를 하나 이상의 A에 대해 치환하여 올리고 내에 존재하는 A 함량을 최고 뉴클레오티드의 10% 까지 감소시키는 방법에 의해 생성된다. 폐계와 관련된 코드화된 폴리펩티드의 구체적인 예로써 NkB 전사인자, 인터루이킨-8 수체(IL-8R), 인터루이킨 5 수체(IL-5 R), 인터루이킨 4 수체(IL-4 R), 인터루이킨 3 수체(IL-3 R), 인터루이킨-1β(IL-1β), 인터루이킨 1β 수체(IL-1β R), 이오탁신, 트립타제, 기초단백질, β2-아드레날린성 수체 키나아제, 엔도텔린 수체A, 엔도텔린 수체B, 프레프로엔도텔린, 브래디키닌 B2 수체, IgE 고친화성 수체, 인터루이킨 1(IL-1), 인터루이킨 1 수체(IL-1 R), 인터루이킨 9(IL-9), 인터루이킨-9 수체(IL-9 R), 인터루이킨 11(IL-11), 인터루이킨-11 수체(IL-11 R), 유발성 질산산화물 합성효소, 시클로옥시젠 효소(COX), 세포간 접착분자 1(ICAM-1) 맥관세포성 흡착분자(VCAM), 란테스, 상피형 백혈세포 흡착분자(ELAM-1), 단일세포 확성인자, 뉴트로필 케모탁틱인자, 종양회저인자 α, 5-리폭시제나제, 포스포디에스테라제 IV, P물질, P물질 수체, 히스타민 수체, 키마제, CCR-1 CC 케모카인 수체, CCR-2 CC 케모카인 수체, CCR-3 CC 케모카인 수체, CCR-4 CC 케모카인 수체, CCR-5 CC 케모카인 수체, 프로스타노이드 수체, GATA-3 전사인자, 뉴트로필 접착수체, MAP 키나제, 인터루이킨-9 (IL-9), NFAT 전사인자, STAT 4, MIP-1α, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 시클로필린, 포스포리파제 A2, 염기성 섬유종세포 성장인자, 메탈로프로테이나제, CSBP/p38 MAP 키나제, 트립토스 수체, PDG2, 인터루이킨-3(IL-3), 인터루이킨-1β(IL-1β), 시클로스포린 A-결합 단백질, FK-5-결합 단백질, α4β1 셀렉틴, 피브로넥틴, α4β7 셀렉틴, 매드 CAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), PECAM-1, LFA-1 셀렉틴, C3bi, PSGL-1, E-셀렉틴, P-셀렉틴, CD-34, L-셀렉틴, p150,95, Mac-1(CD11b/CD18), 푸코실 트랜스페라제, VLA-4, CD-18/CD11a, CD11b/CD18, ICAM2 및 ICAM3, C5a, CCR3 (이오탁틴 수체), CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, LTB-4, AP-1 전사인자, 단백질 키나아제 C, 시스테이닐 루코트리엔 수체, 타키치넨 수체(tach R), IkB 키나아제 1 & 2, STAT 6, c-mas 및 NF-인터루킨-6(NF-IL-6) 등이 있다.
폴리펩티드 혹은 CNS, 안구, 심장혈관 및 심폐계 관련 유전자의 예를 들면 G-단백질 결합 수체(약 250 가지가 공지되고 및 아직 서열화 되지 않았으나 약 750-1,000 가지 이상이 현재 존재하는 것으로 가정되는), 뉴로펩티드 유전자, 뉴로펩티드 수체 유전자, 여기성 아미노산 수체 유전자, 염화물 채널 유전자, 칼슘 채널 유전자, 푸린계 수체 유전자, 아드레날린계 수체 유전자, 제로토닌 수체 유전자, 세로토닌 전달유전자, 여기성 아미노산 전달유전자, 칼륨 채널 유전자, 티로신 키나아제, 포스포릴라제, 아세틸콜린 수체, 콜레시스토키닌 수체, 질산화물 합성효소, 도파민 수체, 콜린성 수체, 앤지오텐신, 앤지오텐신 수체, 칼륨채널을 포함하는 이온채널, 미엘린화/탈미엘린화에 관련된 것을 포함하는 구조적 단백질, 액손 및 수지상돌기 구조, 신경전달자 방출조절체 및 구조물, 안과질환, 특히 망막 및 관련 조직의 질환, 칼시토닌 및 그의 수체, 실키네우린 및 그의 수체, CGRP 및 그의 수체, 나트륨염 배설항진성 펩티드 및 그의 수체, 뇌 나트륨 배설항진성 펩티드 및 그의 수체, 브래디키닌 및 그의 수체, 바로수체 GABA/GABA수체, 벤조디아제핀 수체, 콜린스테라제, 카나비노이드 수체, 칼모듈린 및 그의 수체, 칼슘/나트륨 교환펌프 등의 종류이다.
탄소무수물효소 , 카테콜라민 및 그의 수체, 히스타민 수체, 무스카린형 수체, 오피오이드 수체, 케모카인, 콜린 아세틸 전달효소, 콜레카씨페롤, 사이토킨, 인터루킨 및 그의 수체, 리포산소효소 경로, 프로테아제, DP(PGD2) 수체, 이노시톨인산염 관련 효소, 엔도텔린 및 그의 수체, 엔케팔리나제, 엔케팔린, 벤조디아제핀, GABA 트랜스아민효소, 갈라닌 및 그의 수체, 가스트린 방출인자, 성장인자, 성장인자 억제자, 시클린, 뉴클레오시드 키나제, 뉴클레오티드 키나제, 온코겐 수체, 5-히드록시트립타민(5HT)수체, ADH,, IGF, 인슐린수체, 락타마제, 케이네이트 수체, 칼리크레인 및 그의 수체, 류코트리엔 관련 효소, 리포코르틴, L-NMMA 및 그의 수체, 멜라노세포 자극 호르몬, 스테로이드 전달자 및 대사효소와 합성효소, NMDA와 그의 수체, 모르핀 수체, MPTP, 뉴로키닌 및 그의 수체, 니코틴 수체, 포스포리파제, 혈소판 활성인자, 신호 형질변환 단백질, PDGF, 다이노르핀, 프로스타시클린, 프로락틴 및 그의 수체, 프로락티 방출 억제인자, 프로호르몬, 프로스타노이드, 프로스타글란딘 및 그의 수체, 트롬빈, 프로트롬빈, 프테로일글루탐산 및 그의 수체, 리세르그산 수체, 뱀 및 전갈독 수체, 레닌 앤지오텐신계 성분들, 역전사효소, 제2 메신저 및 관련 효소, 나트륨 채널, 소마토스테틴 및 그의 수체, 소마토트로핀 및 그의 수체, P물질, k물질, 시냅스 전달자, 타치키닌, 테트로도톡신 수체, 트롬복산 및 그의 수체, 티로이드 호르몬, 호르몬, 티로트로핀 및 그의 수체, 프로티렐린, T4, T3 토포이소머라제, 종양회저인자 및 그의 수체, TGFs 및 그의 수체, 클레사이스토키닌 및 그의 수체, 혈관작용성 장내 펩티드 및 그의 수체, 모노아민 옥시다제, 티로신-키나제 연쇄 수체 및 기타 다수의 종류가 있다. 다른 특이적 타겟 유전자는 예컨대, G-단백질 및 G-단백질 결합수체, 칼슘채널 단백질 및 관련 단백질 수체, 나트륨 채널 단백질 및 관련 단백질 수체, 칼륨 채널 단백질 ㅁ치 관련 단백질 수체, 염화물 채널 단백질 및 관련 단백질 수체, 신경전달자 및 신경전달자수체, 신경호르몬 및 신경호르몬 수체, 뉴로펩티드 및 뉴로펩티드 수체, 도한 기타 여기에서 언급하지 않은 다수가 있다. 다른 타겟 유전자는 예를 들어, G-단백질 및 G-단백질 결합수체, 칼슘 채널 단백질 및 관련 단백질 수체, 나트륨 채널 단백질 및 관련 단백질 수체, 염화물 채널 단백질 및 관련 단백질 수체, 신경전달자 및 신경전달자 수체, 신경호르몬 및 신경호르몬 수체, 뉴로펩티드 및 뉴로펩티드 수체와 기타 다수의 종류가 있다.
본 발명에서, 조성물은 체외, 경구, 혈관내, 비강내, 직장내, 질내, 자궁내, 두개골내, 폐, 신장내, 결절내, 관절내, 귀내, 임파선내, 피부내, 구강내, 정맥내, 피하내, 근육내, 종양내, 한샘내, 안구내, 뇌내, 기관내, 맥관내, 포자내 주사로 투여하거나, 이식 혹은 흡입법, 피부내, 폐내, 귀내, 피부상에 혹은 두피나 자궁경부내 (즉 경로적으로), 심장내, 저속방출식, 제한 방출 및 펌프를 이용하는 등의 방법으로 투여할 수 있다. 다양한 계 및 질환에 관련된 타겟 유전자 및 mRNA 의 예는 타겟은 전사인자, 자극 및 활성화 인자, 사이토킨 및 그의 수체, 인터루킨, 인터루킨 수체, 케모카인, 케모카인 수체, 내인성 특이 및 비특이적 효소, 면역글로부린, 항체수체, 중추신경계(CNS) 및 말초신경계와 무신경계 수체, CNS 및 말초신경계와 무신경계 펩티드 전달체, 흡착분자, 디펜사인, 성장인자, 혈관활성 펩티드, 펩티드 수체 및 결합단백질로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드 코드화 유전자 및 mRNA와 또한 온코겐에 상응하는 유전자 및 mRNA 등을 들 수 있다. 올리고 투여는 용액, 현탁액 및 수중유적 및 유중수적형 에멀젼 같은 액상담체를 함유한 경구제형을 이용하여 실행하며 및/또는 분체, 당의정, 태블릿, 캡슐, 분무제, 에어로졸, 용액, 현탁액 및 에멀젼 같은 형태로 투여된다. 경로적 제형으로 투여되는 경우, 크림, 겔, 연고, 분무제, 에어로졸, 용액, 현탁액 및 에멀젼 등에서 선택되는 형태로 투여된다. 주사제형의 경우, 담체는 수성 및 알코올형 용액 및 현탁액, 오일용액 및 현탁액 또한 특히 유중수적 에멀젼 형태로 사용될 수 있다. 직장내 투약제형인 경우 좌약 형태로 사용되며 피부제형인 경우는 수성 및 알코올형 용액, 오일용액 및 현탁액, 수중유적 및 유중수적형 에멀젼 등이 바람직하나 기타 다른 형태도 가능하다. 피부제형은 담체를 수성 및 알코올형 용액, 유성용액 및 현탁액과 수중유적 및 유중수적 에멀젼 중에서 선택하는 이온토포레틱(iontophoretic) 피부전달 제형이며, 또한 이 제형은 대부분 공지된 종류의 피부전달 이동촉진제도 함유할 수 있다. 또한 투여 연장에 적합한 것은 제형을 함유한 이식형 캡슐 혹은 카트리지이다. 이 경우, 담체는 또한 수성 및 알코올형 용액 및 현탁액, 오일형 용액 및 현탁액, 유중수적 및 수중유적 에멀젼 중에서 선택되고, 소수성 담체 즉 지질소포나 입자들이며 예컨대, N-(1-[2,3-디올레옥실옥시]프로필)-N,N,N-트리메틸 암모늄 메틸설페이트로 된 리포좀 및/또는 다른 지질이나 미세결정 등이다. 폐에 대한 응용에서, 제형은 호흡 혹은 흡입식 제형 즉, 에어로졸이 바람직하다. 타겟 부위의 장기간 노출시, 올리고는 국소이식물, 좌약, 설하선제형 등 공지의 방식으로 전달된다.
이 방법이 타 기술보다 탁월함을 입증하는 인자는 고신뢰성 및 고정밀성의 데이타를 얻을 수 있는 능력이다. 항감지 리보자임 기술은 체내환경에 적합치 않으며 리보자임내 및 기타 올리고뉴클레오티드 내에 아데노신이 존재할 경우 예컨대과민성 호흡기관에서 확실한 데이타를 성취할 수가 없다. 다수의 아데노신 수체가 존재하는 다른 계에서도 마찬가지이다. 현재까지, A-함유 시스템 즉, 호흡기관 내에서 타겟을 확실하게 감쇠하고 동시에 고신뢰성 및 고정밀도의 상호관계을 제공할 수 있는 방법은 아직 입증되지 않았다. 또한, 본 발명은 유전자망 즉 뉴우런형 유전자망을 이들의 광범위한 환경과 무관하게, 단일유전자 식별 이상의 급격한 양자변동을 해명하는데 활용할 수 있다. 이는 대사경로에 연쇄된 하나 이상의 타겟을 선택하고 이들 각각 혹은 함께 하나의 항감지 올리고를 한번에 투여하고 그후 다시 2개씩, 3개씩 등으로 투여함으로써 검사하고, 그 결과를 비교하여 연쇄가 있는지 혹은 순차적으로 활동하는지의 여부를 확인한다. 본 발명의 방법은 자각, 기억, 고통, 욕망, 활동장애, 소화력, 배고픔 및 만족감, 또한 신경학적 질환, 그 밖의 CNS 관련 기타반응을 포함한 분야에서 중요한 의료적 조치를 필요로 할 면밀한 약물자극성 발견과정을 지원하는데 충분한 유전자망 데이타베이스 창출을 가능하게 한다. 본 발명의 기술은 4가지 기본분야를 포함한다: 즉, 신약 발견에 관련되는 신경유전자망을 식별하는데 응용될 기능성 게놈; 뇌 속에서의 이들 유전자망의 분포를 이해하기위한 잡종교배; 의료적 관련성이 있는 다양한 활동에 대한 유전자 및 유전자망의 참여에 관련한 다변수형 활동의 정량 및 정성분석; 또한 심장혈관 및 폐질환계 같은 대형 피드미드형 시스템 하에서 유전자 및 유전자망의 영향을 인식하기 위한 생리학적, 생체물리학적 및 생체화학적 분석법 등이 있다.
이 방법을 CNS에 대해 응용하는 경우는 통증, 만족도, 욕망/의사질환, 리비도, 인식력/인식형 질환, 수면/수면질환, 기타 다른 종류를 포함하는 분야를 망라한다. 식별된 새로운 유전자 및 유전자망의 기능적 중요성을 확인하는 능력은 이들의 공간적 존재를 평가함에 의존하는 것으로, 본래의 잡종교배는 예컨대 뇌속의 선택된 유전자 및 유전자망의 정확한 3차원(3-D)위치를 결정하는데 이용되며 또한 약물발견 프로그램의 후보로서 그 중요성을 평가하기 위한 유전자 제거시험을 정확기 타겟화할 수 있게 해준다. 위치-특이적 기능유전자 제거(SSFGA)는 뇌 등의 적절한 시스템영역에서 타겟 유전자의 발현을 선별적으로 약화시킨다. CNS 타겟 유효화를 위한 SSFGA는 하기 기술되는 바와 같이 설계된 저A나 desA 항감지 올리고뉴클레오티드의 도움으로 실행될 수 있다. 또다른 항감지 올리고뉴클레오티드를 활용하는 다른 접근방법은 사용된 올리고뉴클레오티드가 분해 및 예컨대, 가장 생체활성적 기본코이드(autocoid)인 아데노신을, CNS 및 다른 아데노신 수체 함유의 타겟계에서 방출하기 때문에 불분명한 데이타를 제공한다. 올리고뉴클레오티드의 분해에 따른 아데노신 방출은 계통 및 특정부위 즉 이것이 방출되면 졸음을 유도하거나, 노시셉션에 영향을 미치거나, 시상 스핀들리듬을 변동시키거나, 무수한 약물작용을 약화 혹은 강화시키거나, 심장혈관 기능 및 호흡기능의 자가제어에 영향을 주거나, Ca+ 흐름 및 GABA의 사전 시냅스 기능을 저해하고, 자발적 및 강제된 신경염증을 완화시키고, 신경전달물질의 방출을 저해하고, 시냅스후 여기력의 감소, 학습과 기억되는 임의의 사건에 대해 요구되는 장기간 약효증대를 억제하고, 또한 기관지확장의 두부 기관지수축으로 인한 플레오트로픽(pleiotropic) 효과를 유발한다. 명확히 말하면, 다량의 아데노신을 실험동물 뇌속의 올리고뉴클레오티드 분해를 통해 방출하거나 타겟 유효화 연구하는 것은 금기된다. CNS 타겟 유효화를 위한 종말점으로 응용하기에 적합한 신경학적 및 활동연구는 공지되어 있다. 예를 들어, 메모리 시험, 3차원 혹은 공간화 능력, 인식, 모터제어, 감지도 또한 외인성 트리거, 가시화, 안구 공동작용, 피부감지력, 미각 및 후각력 등에 대한 응답력 등이 있다. 생리학적 변수의 시험방법도 공지되었으며 EKGs 및 EEGs 등의 전기전도성이나 혹은 심장박동속도 및 리듬, 수분공극성, 슬립패턴 등을 측정하는 것에 의존한다. 대부분의 경우, 부작용 특히 심폐부, 직장부 등의 부작용 및 기타의 부작용은 치료약물의 발견 CNS타겟의 질적저하를 가져오는 주요인으로서 작용한다. 반대로, CNS 부작용은 심폐, 직장 치료제 및 기타 작용제에 부적절한 질저하를 자주 가져온다. 따라서, 약물 개발시 가능한 조속히 CNS 타겟의 약화로 인해 유발된 심폐부작용의 증거를 수득하는 것이 바람직하다 이러한 영향은 최근들어 개발프로그램에서 밝혀지고 있으며 이들은 훨씬 나중 단계에서 프로그램의 취소를 일으킨다. 본 발명은 달갑지 않은 영향들 즉, 호흡계 타겟을 약화시키는 심장혈관의 영향을 평가하기 위해 특히 공지의 분석기술, 절제수술, 전기생리학적 및 기타 시험을 활용하며 혹은 역으로, 특히 CNS나 심장혈관계에서 호흡기 타겟을 약화시키는 손상 부작용을 평가하기 위한 목적으로 공지의 기술을 활용한다. 예를 들어, 의식있는 비구속된 동물에 대한 심장기능 연구에서 CNS 타겟후보를 약화시키는 잠재적 영향을 간파할 수 있다.
타겟 유효화는 상술한 바와 같이 인체의 경로에서 의심되는 기능을 갖는 각종의 공지된 수체 즉, 뉴로펩티드 Y(NPY)/렙틴 수체를 타겟화하는 저A 및 desA 항감지 올리고뉴클레오티드 및 음식섭취 작용, CNS 유전자 라이브러리에서 발견된 새로운 타겟을 함께 사용하는 SSFGA를 통해 실현된다. 동물모델은 특이적 수체의SSFGA 타겟화의 대상이 되며 그후 각종 기능활동 즉, 음식섭취, 무통, 이동, 감지기능 반사, 배출, 성생활 및 생식, 욕구, 학습 및 기억, 기타 활동 같은 다양한 행동의 변화를 평가했다. 이러한 배경에 따른 일련의 행동적 시험에서 특이적 CNS 타겟을 약화시키는 영향에 민감한 측정값을 제공하고 또한 약물 개발결정 과정의 초기단계에서 중요한 정보를 제공한다. 생리학적/생체물리학적/생화학적 분석을 조합한 이 방법은 계속해서 약물 발견시도에 집중할만한 가치가 있는 타겟후보의 잠재력을 신속하고 집중적으로 결정할 수 있게 해준다.
본 발명은 다양한 계에 관련된 유전자를 타겟화한 탈아데노신 항감지 올리고 가 유전자 생성물의 발현을 저해하고 그 영향 및 종합증상을 검사하는데 이용되는 유전자 및 단백질 타겟의 공지된 유효화 방법을 한층 개선한 것으로서 이들 절차를 변화시킨다. 본 발명은 올리고뉴클레오티드가 체내에서 모노뉴클레오티드로 대사될 때 생활성 아데노신 대사물을 방출하는 것을 최근의 발견을 전제로 한 것이다. 아데노신 (A)-함유 올리고뉴클레오티드 분해 및 아데노신 대사물 방출은 예를 들어, 폐내에서 기관지수축, 염증 등을 일으키는 아데노신 수체를 활성화시킨다. 본 발명의 기술은 각종 기능, 만성적 질환 및 병리학 측면에 수반되는 체계에 관련한 유전자 및 mRNA에 타겟화된 항감지 올리고의 설계에 의존한다. 올리고는 이의 분해시 아데노신 방출에 의한 달갑지않은 부작용의 발생을 최소화 하기 위해 아데노신 함량을 저감하도록 변성된다. 이렇게 하면 특히, 아데노신 수체가 관측결과와 유사 혹은 정반대의 영향에 수반되는 경우에 혹은 실험적 모델에서 측정된 계의 항상성 변화를 일으킴에 의하여 간접적으로 측정된 결과의 통계적 중요성이 증가한다. 이방식에서, 본 발명자는 상응하는 mRNA에 선택적으로 결합할 하나 이상의 항감지 올리고뉴클레오티드(올리고)를 설계하기 위한 특이유전자를 타겟화 하고 필요할 경우, 범용의 혹은 대체염기 혹은 아데노신 A1,A2a, A2b혹은 A3수체를 활성화 할 수 없는 아데노신 동종체로 대체하여 아데노신 함량을 저감시킨다. 이러한 선험 기술에 근거하여, 본 발명자는 "하향조정" 혹은 특이성 유전자의 제거 이외에도, 티미딘(T)이 결핍된 혹은 저함량으로 함유된 RNA 시그먼트를 선별하여 결과의 정밀도를 향상시키고 앞서 설계된 올리고뉴클레오티드에 존재하는 하나 이상의 아데노신을, 티미딘에 결합하나 아데노신 수체를 활성화시킬 능력은 부족하고 한편으로는 폐 등에서 아데노신의 작용을 그대로 실행하는, 소위 범용 혹은 대체염기류인 다른 뉴클레오티드 염기로 치환할 수 있다. T가 RNA에 출현할 때 아데노신(A)이 티미딘(T)을 보상하는 뉴클레오티드 염기인 경우 항감지 올리고는 동일 위치에 A를 갖게 될 것이다. 정확히 말하면, 모든 RNA 및 올리고뉴클레오티드는 본 발명에서 왼쪽에서 오른쪽으로 읽을 때 5' 에서 3' 방향으로의 단일 스트랜드로 표시되며 이러한 보상서열은 4개의 코너부 내에 둘러싸여 있다. 또한 모든 뉴클레오티드 염기 및 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학물질 명명학회의 권장규칙 혹은 공지되 3문자 코드법 (아미노산의 경우)에 따라 표시한다.
본 발명의 방법은 한가지 물질에서 하나의 기능에 관련되는 단일 유전자부터 한 체계 내의 네트워크 혹은 경로에 관여되는 복수의 단일 유전자까지 임의의 수의 타겟 유전자를 유효화 혹은 무효화하는데 사용된다. 이 유효화/무효화는 특이성 유전자가 다수 생체물리학적, 생화학적, 생리학적, 행동학적 혹은 기능적이 측면 중 어느 하나 이상에 수반되는지를 실험적으로 입증하여 나타낸 것이다. 유전자가 초기에는 영향을 미치지 않았다고 해도, 다른 유전자 타겟과 함께 시험할 수도 있으며 따라서 어떤 영향을 나타내는 이들의 발현 흔적을 제거해야 하는 경우도 있다. 본 발명의 항감지 작용제의 아데노신 함량은 상기 작용제의 체내 분해시의 유리작용을 방지하기 위해 소량의 A를 함유한다. 예를 들어, 이 계는 폐 혹은 호흡계인 경우 다수의 유전자가 각종 기능에 수반되며 그 예를 하기의 표 1에서 열거하였다:
표 1. 폐질환 혹은 그 상태 및 염증 타겟
NkB 전사인자인터루킨-8 수체 (IL-8R)
인터루킨-5 수체 (IL-5R)인터루킨-4 수체 (IL-4R)
인터루킨-3 수체 (IL-3R) 인터루킨-1β (IL-1β)
인터루킨-1β 수체 (IL-1βR)이오탁신
트립타제기초단백질
β2-아드레날린형 수체 키나아제엔도텔린 수체 A
엔도텔린 수체 B프리프로엔도텔린
브래디키닌 B2 수체(B2BR)IgE (고친화성 수체)
인터루킨-1(IL-1)인터루킨-1 수체 (IL-1R)
인터루킨-9(IL-9)인터루킨-9 수체 (IL-9R)
인터루킨-11 (IL-11)인터루킨-11 수체 (IL-11R)
유발성 질산산화물 합성효소시클로옥시제나제(COX)
세포간 흡착분자 1(ICAM-1) 맥관 세포 흡착분자 P물질 (VCAM)
란테스내피성 백혈구 흡착분자
엔도텔린 ETA 수체(ELAM-1)
시클로옥시제나제-2(COX-2)GM-CSF, 엔도텔린-1
단일세포 활성인자뉴트로필 케모택틱인자
뉴트로필 엘라스타제디펜신 1,2,3
무스카린형 아세틸콜린 수체혈소판 활성인자
종양괴사인자α5-리포옥시제나제
포스포디에스테라제 IVP물질
P물질 수체히스타민 수체
키마제CCR-1 CC 케모카인 수체
인터루킨-1(IL-2)인터루킨-4(IL-4)
인터루킨-12(IL-12)인터루킨-5(IL-5)
인터루킨-6(IL-6)인터루킨-7(IL-7)
인터루킨-8(IL-8)인터루킨-12수체 (IL-12R)
인터루킨-7수체 (IL-7R)인터루킨-1(IL-1)
인터루킨-14수체 (IL-14R)인터루킨-14
CCR-2 CC 케모카인 수체CCR-3 CC 케모카인 수체
CCR-4 CC 케모카인 수체CCR-5 CC 케모카인 수체
프로스타노이드 수체GATA-3 전사인자
뉴트로필 흡착수체MAP 키나제
인터루킨-15(IL-15)인터루킨-15 수체 (IL-15R)
인터루킨-11(IL-11)인터루킨-11 수체 (IL-11R)
NFAT 전사인자STAT 4
MIP-1αMIP-2
MCP-3MIP-4
시클로필린 (A, B 등)포스포리파제 A2
염기성 섬유종 성장인자메탈로프로테아제
CSBP/p38 MAP 키나제트립타제 수체
PDG2인터루킨-3(IL-3)
인터루킨-10(IL-10)시클로스포린 A-결합단백질
FK506-결합단백질α1β1 셀렉틴
피브로넥틴α4β7 셀렉틴
cMad CAM-1LFA-1(CD11a/CD18)
PECAM-1LFA-1 셀렉틴
C3biPSGL-1
E-셀렉틴P-셀렉틴
CD-34L-셀렉틴
p150,95Mac-1(CD11b/CD18)
푸코실 전달효소VLA-4
STAT-1STAT-2
CD-18/CD11aCD11b/CD18
ICAM2 및 ICAM3C5a
CCR3 (이오택신 수체) CCR1, CCR2, CCR4, CCR5
LTB-4AP-1 전사인자
단백질 키나제 C시스테이닐 루코트리엔 수체
타키키넨 수체(tach R)IkB 키나제 1 & 2
인터루킨-2 수체(IL-2R)(예, P물질, NK-1 & NK-3 수체)
STAT 6c-mas
NF-인터루킨-6 (NF-IL-6)인터루킨-10 수체 (IL-10R)
인터루킨-3 (IL-3)인터루킨-2 수체 (IL-2R)
인터루킨-13 (IL-13)인터루킨-12 수체 (IL-12R)
인터루킨-14 (IL-14)인터루킨-6 수체 (IL-6R)
인터루킨-16 (IL-16)인터루킨-13 수체 (IL-13R)
메둘라신인터루킨-16 수체 (IL-16R)
아데노신 A1수체 (A1R)트립타제-I
아데노신 A2b수체 (A2bR)아데노신 A3수체 (A3R)
β 트립타제 STAT-3
아데노신 A2a수체 (A2aR)IgE 수체 β 서브유닛(IgE R β)
Fc-엡실론 수체 CD23 항원IgE 수체 α 서브유닛(IgE R α)
IgE 수체 Fc 엡실론 수체(IgERFεR)P 물질 수체
히스티딘 탈카르복실효소트립타제-1
프로스타글란딘 D 합성효소이오시노필 양이온성 단백질
이오시노필 유도 뉴로톡신이오시노필 페록시다제
내피성 질산산화물 합성효소내피성 단세포 활성인자
뉴트로필 산화효소 인자카텝신 G
마크로파지 염증성 단백질-1-인터루킨-8수체 α서브유닛(IL-8Rα)
알파/란테스 수체엔도텔린 수체 ET-B
이들 유전자 및 기타 물질은 정상적인 호흡기능 작용 및 호흡기 병리학에 관련된 질환 즉, 방광섬유증, 천식, 고혈압 및 혈관수측증, 만성장애성 폐질환(COPD), 만성기관지 수축, 호흡곤란 증후군(ARDS), 알레르기성 비염, 폐암 및 폐(metastatic..)암 및 기타 염증반응을 수반한 기도 질환 등에 수반되는 것이다. 아데노신 A1,A2a, A2b혹은 A3수체에 대한 항감지 올리고, CCR3 (케모카인 수체), 브래디키닌 2B, CAM (맥관세포 흡착분자), 및 에오시노필 수체 등은 특히 이들 유전자의 발현을 하향조정하는데 효과적인 것으로 나타났다. 이들 중에는 예를들어, 아데노신 A1,A2a, A2b혹은 A3수체 및 CCR3, 브래디키닌 2B, VCAM(맥관세포 흡착분자) 및 에오시노필 수체의 "하향 조정"을 통해 호흡기 만성질환 및/또는 염증 증세를 완화시키거나 감소시키는 역할을 하는 것도 있다. 이들 작용제는 본 발명의 방법에 의해 단독으로 혹은 다른 유전자에 타겟화 된 항감지 올리고와 함께 조합하여 이들이 수반되는 경로 및/또는 네트워크를 유효화 하는데 활용된다. 더 나은 결과를 위해서는, 올리고를 직접 실험동물의 호흡계에 투여하는 것 즉, 흡입법이나 기타 방법에 따라 투여함으로써 이들이 전체 계통에 퍼지지 않고 폐에 당도할 수 있게 한다. 이 때문에 계통적으로 투여된 혹은 다른 일반경로를 통해 투여된 경우와 비교하여 더 적은 양의 약죵제를 사용할 수 있으며 따라서 작용제의 체내 전체 분배로 인한 원치않는 부작용의 빈도와 정도를 감소시킬 수 있게 된다. 본 발명의 작용제는 조직에 의해 발현되는 수체 단백질의 양을 감소시키는 것으로 나타났다. 이들 작용제는 따라서, 단순히 타겟 즉 수체와 단순히 상호작용하여 다른 약물과 반응할 타겟 단백질의 수를 줄인다. 이러한 방식으로, 본 발명의 작용제는 아주 우수한 효율성 및 낮은 독성을 제공한다.
상기 검토한 수체는 본 발명의 기술의 우수한 효능을 보여주는 간단한 예이다. 사실, 다수의 유전자가 본 발명의 실현에 의해 유사한 방식으로 타겟화 되고 단백질 발현을 현저히 하향조정 혹은 제거할 수 있으며 또한 임의의 체계 즉, 호흡계, CNS, 심장혈관, 직장 및 기타 계 내에서 하나 이상의 기능에 수반된 변화를 보여준다. 예시적으로, 호흡계의 경우 시험대상 기능은 호흡, 기관지수축, 염증, 만성기관지염, 가래생성 등과 또한 만성장애성 폐질환(CDPD), 호흡기 화끈거림(inhalation burn), 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 방광섬유증, 폐섬유증, 방사선 폐질환, 편도선염, 폐기종, 치통, 구강염, 관절염, 식도염, 폐암, 식도암 등을 포함한 질환 및 그 상태에 관련된 것이다. 이들 기능은 호흡기 기능장애 관련성 때문에 큰 관심의 대상이 되고 천식, 알레르기, 알레르기성 비염, 폐 기관지수축 및 고혈압, 만성장애성 폐질환(COPD), 알레르기, 천식, 방광섬유증, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 직접 혹은 전이에 의해 폐에 고통을 주는 암 등의 경우에서 본 발명의 방법은 상기 표 1에서 열거된 타겟을 포함하는 잠재적 타겟 mRNAs의 목록에 응용될 수도 있다. CNS계에서는, 음식 섭취/포만감, 감정기복, 욕구, 성욕/성적 장애, 인지력, 성기능/장애, 뇌외상, 알츠하이머, 동맥류 질환 등을 선별기능으로 했다.
본 발명의 올리고머는 G 와 C로 구성된 군에서 선택된 4개의 접종 핵산 및/또는 특이형 및/또는 활성량을 갖는 타겟 핵산의 분할편을 1차 선별하고, 다시 선별된 분할편을 포함하는 한편 최고 15%, 바람직하게는 12%, 10%, 7%, 5%, 3%, 1%의 티미딘(T) 핵산 함량으로써 티미딘을 함유하거나 혹은 더 바람직하게는 티미딘을 전혀 함유하지 않는 4 내지 60 뉴클레오티드 길이의 제1 올리고뉴클레오티드를 수득함으로써 얻을 수 있다. 후자의 단계은 다시 선별된 분할편에 대하여 항감지성인 서열을 포함하는 것으로써 아데노신 염기 함량이 최고 15%까지이고, 바람직하게는 12%, 10%, 7%, 5%, 3%, 1%의 함량으로써 아데노신을 함유하거나 혹은 더 바람직하게는 아데노신을 전혀 함유하지 않는 것으로된 4 내지 60 뉴클레오티드 길이의 제2 올리고뉴클레오티드를 수득함으로써 얻을 수 있다. 선별된 분할편이 적어도 하나의 티미딘 염기를 함유하면, 하나의 아데노신 염기는 이에 상응하는 항감지 뉴클레오티드 분할편 내에서, 호흡계에서 유효화 할 때 티미딘염기에 결합되고 반면에 아데노신 A1,A2a, A2b혹은 A3수체에서 약 10% 이하 바람직하게는 1% 이하 더 바람직하게는 0.3% 이하의 아데노신염기 길항제 활성도를 갖는 헤테로방향족 염기, 아데노신 A2b수체에서 전혀 활성을 갖지 않는 헤테로방향족 염기로 구성된 군에서 선택된 범용 혹은 대체염기로 치환될 수 있다. 다른 계에서의 아데노신 활성은 그 계에서 적절히 결정된다.
동종체 헤테로방향족 염기는 O, 할로, NH2, SH, SO, SO2, SO3, COOH 및 측쇄된 및 융해된 1차 및 2차 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 알케녹시, 아실, 시클로아실, 아릴아실, 알키녹시, 시클로알콕시, 아로일, 아릴티오, 아릴설폭실, 할로시클로알킬, 알킬시클로알킬, 알케닐시클로알킬, 알키닐시클로알킬, 할로아릴, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 아릴시클로알킬, 등에 의해 치환되며 또한 다시 이들은 O, 할로, NH2, 1차, 2차 및 3차 아민, SH, SO, SO2, SO3, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬 및 헤테로아릴에 의해 치환된다. 피리미딘 및 퓨린은 공지된 바와 같이 모든 위치에서 치환 가능하며 바람직하게는 위치 1,2,3,4,7 및/또는 8에서 치환된다. 더 바람직하게는 티오필린, 카페인, 디필린, 에토필린, 아세필린 피페라진, 바미필린, 엔프로필린 및 다음 구조식으로 갖는 크산틴 등과 같은피리미딘과 퓨린류이다.
여기서 R1및 R2은 서로 독립적으로 H, 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이고 R3은 수소, 아릴, 디시클로알케닐, 디시클로알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, O-시클로알킬, O-시클로알케닐, O-시클로알키닐, NH2-알킬아미노-케톡시알킬옥시 -아릴, 모노 및 디알킬아미노알킬-N-알킬아미노-SO2-아릴 등에서 선택된 것이다. 설탕내의 유사한 변성물도 또한 본 발명의 한 구현예가 될 수 있다. 타겟 mRNA에 존재하는 티미딘(T)에 상응하는 저아데노신 함량의 항감지 올리고는 올리고가 폐, 뇌, 심장, 신장 등의 조직 환경 같은 계내에서 아데노신 무함유 생성물로 분해되는 것을 방지하는 역할을 하며 따라서 이로 인한 원치않는 영향을 예방할 수 있다.
예를 들어, NkB 전사인자는 타겟, mRNA 혹은 저티미딘(T)이나 탈티미딘(desT)에 대해 검색된 DNA으로서 선택될 수 있다. mRNA이나 DNA의 desT 시그먼트만 선택되며 따라서 이들의 보상 스트랜드로서 desA 항감지물을 형성하게 된다. 다수의 RNA desT 시그먼트가 발견되면, 항감지 시그먼트의 서열이 유도될 수 있다. 전형적으로, 약 10 내지 30 심지어는 훨씬 다수의 desA항감지 올리고뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. 이들 항감지 서열은 상기 표1 및 하기의 표2에서 보는 바와 같은 타겟의 mRNA의 desT 시그먼트와 또한 뇌, 심장혈과 및 직장계와 기타 계의 기능에 관련된 다른 것들에 상응하는 일부 혹은 전체 desA 항감지 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하기도 한다. 이들이 발생하면, 발견된 항감지 올리고뉴클레오티드는 아데노신이 100% 제거되었다고 말한다. 타겟 유전자에 상응하는 최초의 desA 항감지 올리고뉴클레오티드 즉, NFkB 전사인자에서 약 10 내지 30개의 서열이 타겟 유전자 혹은 티미딘(RNA) 저함량의 RNA에서 발견될 수 있다. 본 발명에 따르면, 선별된 분할편 서열은 소수의 티미딘(RNA) 뉴클레오티드를 2차 혹은 3차나 4차 서열 내에 함유하기도 한다. 어떤 경우는, 아데노신 고함량 때문에 항감지 올리고뉴클레오티드를 타겟에 대해 거의 활성이 없거나 전혀 없는 상태로 만들기 어렵게 된다. 본 발명에서 이것을 소위 "불완전 desA" 서열이라고 하며 바람직하게는 15% 이하, 12%이하, 10% 이하, 7% 이하, 5% 이하 및 2% 이하의 아데노신 함량을 갖는 것이다. 더 바람직하게는, 아데노신 함량이 0%인 것이다. 경우에 따라, 고 아데노신 함량을 수용할 수도 있으며 올리고뉴클레오티드는 아직까지 "아데노신 활성"의 완전제거에 성공하지 못하고 있다. 특별한 구현예로서 중요한 것은 아데노신 뉴클레오티드가 "고정화" 되거나 혹은, 자연 DNA에 존재하는 4개의 염기쌍인 A, G, C 및 T 중 2개이상에 대해 유사하거나 동일한 친화력을 갖는 염기쌍으로써 "범용 혹은 대체"염기에 의해 치환되는 경우이다.
범용 혹은 대체염기는 본 발명에서 임의의 화합물 더 일반적으로는 사실상 티미딘에 대해 잡종교배되는 능력이 약하거나 혹은 아데노신이 실험동물 혹은 세포계에 부작용을 일으킬 수 잇는 아데노신 수체나 다른 분자들에 대해 결합하는 능력이 사실상 부족한 아데노신 동종체를 말한다. 또는, 아데노신 A1,A2a, A2b혹은 A3수체 더 바람직하게는 아데노신 A1수체 등의 수체를 전혀 활성화 하지 못하는 아데노신 동종체를 사용할 수 있다. 범용 혹은 대체염기의 한 예를 들면, α-데옥시리보푸라노졸-(5-니트로인돌)이 있으며 전문가라면 이러한 염기의 선택 방법을 알 수 있을 것이다. 이러한 "고정"단계은 또한 자연 상태에서 발견되는 것에 대해 항감지성을 갖는 것과 다른 것으로서, 항감지 올리고뉴클레오티드가 타겟 RNA에 거의 동등하게 결합할 수 있도록 해주는 새로운 서열을 생성하는 것이다. 다른 범용 혹은 대체염기의 예로써 2-데옥시리보실-(5-니트로인돌)을 들 수 있다. 또다른 예로써는 3-니트로피롤-2'-데옥시뉴클레오시드, 5-니트로-인돌, 2-데옥시리보실-(5-니트로인돌), 2-데옥시리보푸라노실-(5-니트로인돌), 2'-데옥시이노신, 2'-데옥시네벌아린, 6H,8H-3,4-디히드로피리미도[4,5-c]옥사진-7-온 및 2-아미노-6-메톡시아미노푸린 등이 있다. 이 외에도, 교배력이 다소 떨어지는 다른 염기의 대체를 위한 범용 혹은 대체염기로서 3-니트로피롤 2'-데옥시뉴클레오시드 2-데옥시리보푸라노실-(5-니트로인돌), 2'-데옥시이노신 및 2'-데옥시네벌아린 (Glen Research, Sterling, VA) 이 있다. 더 구체적인 부정합 교정물은 "P" 뉴클레오티드, 6H,8H-3,4-디히드로피리미도 [4,5-c][1,2]옥사진-7-온 등으로써 구아닌(G) 혹은 아데닌(A)을 가진 염기쌍과 또한 사이티딘(C)이나 티미딘(T)을 가진 염기쌍인 "K"뉴클레오티드, 2-아미노-6-메톡시아미노푸린을 이용하여 제조한다. 기타 공지된 기술을 활용해도 좋다. 예를 들어, Loakes, D. 및 Brown, D.M. Nucl. Acid. Res. 22:4039-4043(1994); Ohtsuka, E. et. al. J. Biol. Chem. 260(5):2605-2608(1985); Lin, P.K.T. 및 Brown, D.M., Nucleic Acids. Res. 20(19):5149-5152(1992; Nichols.,R.et.al., Nature 369(6480): 492-493(1994); Rhhmon, M.S. 및 Humayun, N.Z., Mutation Research 377(2): 263-8(1997); Amosova, O.,et. al., Nucleic Acids Res. 25(10): 1930-1934(1997); Loakes D. & Brown, D.M. Nucleic Acids Res. 22(20); 4039-4043 (1994) 등은 범용 혹은 대체염기와 그의 제조방법 및 핵산결합에서의 이들의 용도 등을 발표한 공지문헌으로서 참고한다.
불완전 desT 서열은 자연발생 타겟에서 발견되면 전형적으로 1-3의 범용 혹은 대체염기 대체물 만으로도 100% "desA" 항감지 올리고뉴클레오티드를 충분히 얻을 수 있도록 하는 것을 선택한다. 따라서, 본 발명의 방법은 A함량이 적거나 사실상 없는 각종 타겟에 항감지 올리고뉴클레오티드를 제공하고 또한 하나이상의 아데노신 뉴클레오티드 즉 1 내지 3 아데노신 뉴클레오티드가 "범용 혹은 대체염기"에 의해 대체됨으로써 "고정화"하는 경우의 항감지 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 범용 혹은 대체염기는 공지되어 있으므로 여기서는 소개를 생략한다. 당해 분야의 전문가라면 A를 대체할 수 있는 종류로서 범용 혹은 대체염기 역할을 할 수 있는 염기에 대해 잘 알 것이다.
여기서, 호흡계, 염증성, CNS, 심폐계, 직장면역계 및 기타 다른 계을 포함한 임의의 계통 내에서 타겟을 "유효화" 혹은 "유효화처리"한다는 것은 상기 계 내에서 치료부위를 선별 즉, CNS나 심장혈과 혹은 심폐계 내에서 치료부위를 선별함으로써 개시되는 처리과정을 말한다. 상기의 선별부위란 욕구, 이상감정, 포만감 및 식욕억제, 고통, 인식력, 수면유도 및 수면질환, 체온조절 및 기타 뇌를 통해 제어 혹은 조절되는 분야를 말하며 이는 하기의 표 2에서 열거한 예를 들 수 있다.
다음 단계는 CNS, 폐, 심장계, 신장/직장계, 혈액, 면역계, 폐 및 호흡계, 성기능/장애, 피부, 눈, 인후, 두피, 미각, 자궁경부, 구강, 인두, 식도, 소장 및 대장, 활액조직, 난소, 이관 및 다른 계에 상응하는 유전자 서열 데이타베이스를 선택하는 것이다. 타겟 유전자는 CNS 혹은 CNS의 일부 부위에 관련된 것으로 알려졌으나 그 기능은 알 수 없는 것을 선택한다. 기능이 알려지고 계 내에 발생할 수 있는 유전자도 선택할 수 있다. 항감지 올리고가 그 후 여기서 설명한 바와 같이 이들 타겟 유전자 혹은 mRNA 분할편을 위해 설계된다. 마지막으로, 올리고는 제거기능 및 세포 및 조직DNA이나 mRNA로의 체외 교배에 의한 타겟 유전자의 현저한 감소기능 측면에 따라 선택된다. 체외 하향조정 효과를 나타낸 올리고는 그 후 체내 시험을 통해, 바람직하게는 위치특이성 투여절차 즉, 뇌, 심장, 신장, 폐 등의 부위에 대한 투여 및 사전 결정된 활동적, 생체물리적, 생화학적, 인지적, 이동, 감각 및 생리학적 기능과 기타 기능에 의해 응용되며 또한 타겟과 기능간의 상호관계성의 여부를 평가한다. 호흡계에서, 예를 들어, 상기 상호관계은 처리대상이 호흡계 혹은 염증성 폐질환이나 기타 악성의 폐질환 상태일 때의 증세를 표시할 유사물을 감소시키는 것으로 나타난다. "하향조정" 이란 세포간 단백질 타겟의 생성, 분비 혹은 활용성의 감소(및 따라서 농도의 감소) 및 심지어는 완전소거를 유도하는 것을 말한다.
표 2
타겟 및 유전자망에 관련된 질환 및 그 상태의 예
치매발작 욕구자극저해무통
심폐기능 행동외상유기뇌
자가조절질환뇌상처질병
퇴행성뇌질환진행성 약물중독
CNS 질환(VIRAL)이상&변성(법정 혹은 비법정 질환)시각
인식력 식욕알코올중독심장마비
학습우울증 소화뇌염증
마취청각장애저산소증정신분열증
뇌종양기억력감퇴신경증신경통
치통두통흥분운동기능
감정질환감정기복음양질환식욕이상
건강불량동맥류심장&혈관충혈성 심장&혈관
심장&혈관 삼출작용심장병 통증
염증발작후두염심장이상
천식플라그형성 협착증 바이러스염증
부정맥혈관 투과성 동맥퇴화증리비도
안지오젠 저해조직 및 생호학적 결손앤저이식거부반응
본 발명은 척추동물의 타겟 유효과를 기본적인 목적으로 하고 여기에는 인간 및 인간 이외의 유인원류, 야생동물 및 가축, 해양 및 육지동물, 가정에서 키우는 애완동물 및 동물원에 있는 예컨대, 고양이과 동물, 개과 동물, 말, 고래류 등을 포함한 포유류 등이 있으며 특히 인간을 대상으로 하는 것이 바람직하다. 구체적인 적절한 응용분야는 야생동물, 해양동물, 가축 및 동물원의 동물 등을 포함한 유인원류의 치료에서 모든 종류의 소형 및 대형 동물을 포함한다. 타겟화된 유전자 및 단백질은 바람직하게는 포유류의 것이며 타겟화된 서열은 치료대상 종과 동일한 것이 바람직하다. 대부분의 경우, 다른 종의 타겟이 특히 수용자의 서열과 45% 이상 바람직하게는 85% 이상의 상동성, 특히 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 시그먼트인 것이 바람직하다. 바람직한 작용제 군은 desA 항감지 올리고로 구성된 것이다. 또다른 바람직한 군은 불완전 desA 올리고뉴클레오티드로 구성된 군이며 여기서 하나이상의 아데노신 염기는 범용 혹은 대체염기에 의해 치환될 수 있다.
여기서, "항감지" 올리고 뉴클레오티드란 본 발명에서 타겟 전령자 RNA(mRNA)의 억제에 의해 유전자 발현을 저해하는데 응용되는 단일-스트랜드의 DNA와 유사한 소형의 합성 올리고뉴클레오티드를 말한다. Milligan, J.F. et.al., J. Med. Chem. 36(14), 1923-1937(1993)의 내용을 참조한다. 본 발명의 방법은 항감지제를 활용하여 상기 표 1에 열거된 바와 같은 타겟 유전자의 유전자 발현을 저해하는 것이다. 이것은 공지된 바와 같이 대체로 타겟화된 전령자 RNA(mRNA)의 코드화(감지)서열에 항감지 올리고뉴클레오티드를 교배처리하여 달성된다. 외부투입된 본 발명의 작용제는 타겟 유전자에 의해 코드화된 mRNA와 단백질의 레벨을 감소시키거나 및/또는 처리된 세포의 성장 특징 혹은 형상의 변화를 일으키기도 한다. Milligan, et.al.(1993); Helene, C. 및 Toulme, J. Bi49, 99-125(1990); Cohen, J.S.D., Ed. Oligodeoxynucleotides as Anti-sense Inhibitors of Gene Expression; CRC Press: Boca Raton, FL (1987) 등의 내용을 참조한다. 또한 여기서의 "항감지 올리고뉴클레오티드"는 (1) 적절한 교배조건 하에서 타겟화된 단백질을 코드화 하는 mRNA의 시그먼트에 교배되고, (2) 교배시 타겟화된 단백질의 유전자 발현의 감소를 일으키는 합성 뉴클레오티드의 짧은 서열을 말한다. "des아데노신"(desA) 및 "des티미딘"(desT)는 아데노신이 부족하거나(desA) 혹은 티미딘이 부족한(desT) 올리고뉴클레오티드를 말한다. 어떤 경우, desT 서열은 자연발생하기도 하며 또한 원치않는 뉴클레오티드(A)를 또한 부적절한 활성이 적은 또다른 것으로 치환하여 생긴 것도 있다. 본 발명에서는, 이 치환반응을 A를 "범용 혹은 대체염기"로 치환하여 달성한 것이다.
타겟화된 단백질의 mRNA 서열은 단백질을 발현하는 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 유도되며 기존의 타겟 혹은 앞으로 발견될 타겟 어느 것이라도 상관없다. 다른 계에서 나온 다수 타겟 유전자의 서열이 현재 공지되어 있다. GenBank 데이타베이스 NIH에 수록된 서열들을 참고한다. 이들 유전자의 서열은 현재 실용화 되고 있지 않으며 공지의 기술을 응용하여 타겟 시그먼트를 분리함으로써 수득된 것이다. 유전자, 그의 RNA 및/또는 단백질의 서열이 공지되면, 항감지 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같이 생성하고 또한 표준기술에 따라 타겟화된 단백질의 생성 및 그의 특이적 기능을 감소시키기 위한 체내 투약 및 시험을 통해 체내 투여에 따라 타겟을 유효화 하는데 활용할 수 있다. 본 발명의 한가지 측면에 있어서, 항감지 올리고뉴클레오티드는 특정의 계 즉, CNS, 호흡계, 폐, 운동계, 감각계, 호르몬 조절계, 심계, 직장, 면역계, 혈액, 종양 유전자 등의 질환 혹은 그 상태에 관련된 단백질을 코드화 하는 mRNA의 일부 혹은 시그먼트와 특별히 결합되는 서열을 갖는다. 이 결합의 효과 중 하나는 상응하는 mRNA의 해석을 감소시키거나 심지어 방해하고 따라서 대상체의 폐 내에서 타겟 단백질의 유효량이 감소되는 결과를 얻는 것이다.
본 발명의 한가지 바람직한 구현예에서, 항감지 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 잔류물 중 하나이상이 변형 혹은 치환된다. 변형 혹은 치환된 포스포디에스테르 잔류물을 함유한 올리고뉴클레오티드의 화학동종체 즉, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 혹은 포스포로아미데이트 등 올리고뉴클레오티드의 체내 활성도가 증가하는 동종체 들이 세포 뉴클레아제에 의해 일부 분해되기 쉽다. 여기서 제안된 잔류물 중 대부분은 반대로, 뉴클레아제 분해작용에 대한 내성이 크다. Milligan et al., 및 Cohen, J.S.D., (상기 참조). 또다른 본 발명의 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 "3'-말단캡"을 첨가하여 분해반응을 저지할 수 있으며 이 캡은 뉴클레아제-내성 연쇄를 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에서 포스포디에스테르 연쇄에 치환시킨다. Tidd., D.M. 및 Warenium, H.M., Be. J. Cancer 60:343-350(1989); Shaw, J.P. etal., Nucleic Acids Res. 19: 747-750 (1991)등의 내용을 참조한다. 포스포아미데이트, 포스포로티오에이트 및 메틸포스포네이트 연쇄는 모두 본 발명의 목적을 위해 이 방식에서 사용하기에 적절한 기능을 하는 것이다. 포스포디에스테르의 기본골격의 변형이 더욱 광범위할 수록, 결과로 나온 작용제는 더 안정하며 대부분 RNA 친화력과 세포투과성이 더욱 증가한다. Milligan et al.(상기참조). 따라서, 변형 혹은 치환된 잔류물 수는 요구에 따라, 타겟 및 투여경로에 따라 변화하며 1 내지 존재하는 모든 수의 잔류물 범위를 포함한다. 새로운 연쇄로 전체 포스포디에스테르 기본골격을 대체하는 다수의 방법이 공지되어 있다. Millikan et al.(상기참조). 염기, 뉴클레오티드간 연쇄, 혹은 당에 대한 바람직한 동종 잔류물은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 티오포름아세탈, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트, 포름아세탈 보라노포스페리트, 3'-티오포름아세탈, 5'-티오에테르, 카르보네이트, 5'-N-카르바메이트, 설페리트, 술포네이트, 술폰아미드, 술폰, 설파이트, 2'-O-메틸, 설폭시드, 설파이드, 히드록실아민, 메톡시메틸(MOM), 메톡시에틸(MOE), 메틸렌(메틸이미노)(MMI)및 메틸렌옥시(메틸이미노)(MOMI) 잔류물 등이 포함된다. 포스포로티오에이트 및 메틸포스포네이트-변형 올리고뉴클레오티드는 자체 올리고뉴클레오티드 합성 때문에 유효성이 있어 특히 바람직하다. Millikan et.al (상기 참조). 적절히, 본 발명의 작용제를 약제학적 수용가능한 염 형태로 투여하거나 혹은 항감지 올리고뉴클레오티드 및 염의 혼합물 형태로 사용할 수 있다. 또다른 본 발명의 구현예에 따르면, 다른 항감지 올리고뉴클레오티드나 그의 약제학적 수용가능한 염의 혼합물을 투여한다. 본 발명의 작용제는 1개의 타겟 mRNA의 발현을 약화시키거나 및/또는 1개의 경로의 활성도를 강화 혹은 약화시키는 능력을 갖는다. 예로써, 본 발명은 티미딘(T) 함량이 적은 모든 가능한 데옥시리보뉴클레오티드 시그먼트 혹은 약 7 이상의 모노뉴클레오티드, 바람직하게는 최고 60개의 모노뉴클레오티드 더욱 바람직하게는 10 내지 36, 특히 가장 바람직하게는 12 내지 21개의 모노뉴클레오티드의 저 아데노신(A) 함량의 데옥시뉴클레오티드 시그먼 트를 타겟 mRNA 혹은 유전자 각각에 대해 확인식별함으로써 실행된다. 이는 아데노신을 보상하는 뉴클레오티드인 티미딘(RNA)이 적거나 없는 타겟 서열 혹은 7 이상의 뉴클레오티드 길이로 된 저아데노신(유전자) 함량을 갖는 타겟 서열내에서 모노뉴클레오티드 시그먼트를 검색하여 수행한다. 대부분의 경우, 이 검색 결과로써 통상 자연적으로 아데노신이 없거나 약 40% 이하의 아데노신을 함유한 10-30 서열의 다양한 길이의 항감지 올리고뉴클레오티드를 평균길이 즉 약 1800 뉴클레오티드 길이로 된 전형의 타겟 mRNA에 대해 수득한다. 고T 혹은 A함량인 것은 하나이상의 A에 대해 범용 혹은 대체염기의 치환처리로써 고정된다.
본 발명의 작용제는 특별히 제한되지 않으나 통상, 약 7 내지 60 뉴클레오티드 길이 바람직하게는 12-45, 더 바람직하게는 30 정도나 특히 더 바람직하게는 21 정도의 뉴클레오티드 길이를 갖지만, 전달방식 및 특정 타겟에 따라 그 길이가 달라질 수 있다. 본 발명의 작용제는 타겟 RNA의 임의 및 전체 시그먼트에 관계한다. 한가지 바람직한 작용제군은 인트론과 액손 사이의 접합점을 함유하는 mRNA 영역에 관계하는 것을 포함한다. 작용제가 인트론/엑손 접합점에 관계할 때 접합점 전체를덮거나 혹은 이 접합점과 충분히 근접하여 선구물질인 mRNA를 즉, 항감지 올리고뉴클레오티드의 3'혹은 5' 말단이 인트론/엑손 접합점의 예컨대 2 내지 10, 바람직하게는 3 내지 5의 뉴클레오티드 내에 위치하는 성숙한 mRNA로 처리하는 과정에서 간섭엑손의 결합을 저해할 수 있다. 또한, 초기 코돈에 겹치는 항감지 올리고뉴클레오티드 및 코드부위의 5' 및 3' 말단 근처에 있는 것이 바람직하다. 항감지 올리고는 0 내지 3%, 5%, 7% 내지 8%, 10%, 12%, 15% 및 이 중간범위의 아데노신 함량을 갖는다. 본 발명의 방법에서는, 하나이상 혹은 전체 A를 티미딘과 결합하는 반면 아데노신 A1,A2a, A2b혹은 A3수체 위치에서 0.5, 0.3, 0.1 이하의 아데노신 길항근 혹은 길항제 활성도를 나타내는 헤테로방향족 염기, 또한 아데노신 A2a수체 위치에서 전혀 활성을 나타내지 않는 헤테로방향족 염기 같은 범용 혹은 대체염기에 의해 치환할 수 있다. 대체염기는 3-니트로피롤-2'-데옥시뉴클레오시드, 5-니트로-인돌, 2-데옥시리보실-(5-니트로인돌), 2-데옥시리보푸라노실-(5-니트로인돌), 2'-데옥시이노신, 2'-데옥시네벌아린, 6H,8H-3,4-디히드로피리미도[4,5-c]옥사진-7-온 혹은 2-아미노-6-메톡시아미노푸린 등이 있다. 올리고는 CpG 디뉴클레오티드 내에서 하나 이상 혹은 전체 메틸화되지 않은 C를 메틸화된 사이토신(mC)로 치환하여 함유하며 상기 디뉴클레오티드는 올리고 내에 존재한다.
피리미딘에 대한 다른 C5변형물 역시 본 발명의 구현예가 될 수 있으며 그 예로써 C5프로파인이 있다. 본 발명 방법에서 사용하기에 적합한 하나 이상 혹은 모든 뉴클레오티드 연쇄 잔류물은 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 티오에테르, 카르보네이트, 카르바메이트, 설페이트, 설포네이트, 설파메이트, 설폰아미드, 설폰, 설파이트, 설폭시드, 설파이드, 히드록시아민, 메틸렌(메틸이미노), (MMI), 메톡시메틸(MOM), 메톡시에틸(MOE), 메틸렌옥시(메틸이미노)(MOMA), 메톡시메틸(MOM), 2'-O-메틸, 포스포라미데이트 및 C-5 치환된 (5-프로파인)잔류물 및 이들의 혼합물이 있다. 본 발명에서 사용되는 올리고는 원핵 혹은 진핵 벡터 같이 이미 널리 공지된 벡터에 연쇄된다. 본 발명의 방법은 mRNA의 생성이나 유용성을 축소시키거나 이의 분해를 증대시키거나, 혹은 폐 속에 존재하는 폴리펩티드의 양을 감소시키는데 효과적인 양의 항감지 올리고를 투여하는 것을 소개한다. 이 투여처리는 바람직하게는 그대로 즉 호흡계나 비강에 흡입법 혹은 호흡계 및 폐의 타겟에 대하여 폐속에 직접 투여하는 방식으로 실행한다. 항감지 올리고는 또한 뇌, 심장, 신장, 종양, 혀, 눈, 귀, 자궁경부, 비강, 두피, 구강, 근육, 인두, 식도, 장, 직장, 관절활액 조직, 난소 및 기타 국소의 조직에 대해 주사투여, 정위법, 혹은 체외적인 다른 방식을 통해 투여한다. 또한, 올리고는 타겟이 순환계 및 면역계의 일부나 그 합체인 경우 혈액을 통해 투여할 수 있다. 후자의 경우, 질병 혹은 그 상태가 면역학적 장애와 관련있으므로 타겟은 면역글로불린, 항체수체, 사이토킨, 사이토킨 수체, 유전자 및 이를 코드화 하는 상응하는 mRNA, 유전자 및 mRNA 측생부위 도한 인트론 및 엑손 경계부 등이 된다. 질병 혹은 그 상태가 악성물질 혹은 종양에 관련되는 경우 타겟은 성장조절 효소 및 다른 단백질, 면역글로불린 및 항체수체, 유전자 및 이를코드화하는 mRNA, 유전자 및 온코겐 관련 mRNA, 또한 게놈부위와 mRNA 측생부위 및 인트론과 엑손 경계부를 포함한다. 또한 혈관생성인자, 흡착분자와 메타스타제에 수반된 프로테아제 효소 및 기타물질 같이 종양과정에 수반되는 정상세포의 일부 유전자 역시 본 발명에 속한다. 이 방법은 예컨대, 조성물을 체외, 경구투여, 강내, 비강내, 항문내, 질내, 요도내, 피부전달식, 구강내, 두개내, 폐, 직장내, 관절내, 정맥내, 피하내, 근육내, 종양내, 한선내, 귀내 주사투여하거나 혹은 기관내, 혈관내, 포자내 주사할 수 있으며 또는 이식법, 흡입법, 피부내, 폐, 귀 혹은 심장속에 투입하거나 또는 저속 혹은 제한방출식 및 펌프를 이용하여 투여할 수도 있다. 타겟의 다른 예를 들면, 전사인자, 자극 및 활성화 인자, 사이토킨 및 그의 수체, 인터루킨, 인터루킨 수체, 케모카인, 케모카인 수체, 내부생성 특이적 및 비특이적 효소, 면역글로불린, 항체수체, 중추신경계(CNS) 및 말초신경계 및 무신경계 수체, CNS 및 말초신경과 무신경계 펩티드 전달물질, 흡착분자, 디펜사인, 성장인자, 혈관수축(확장) 펩티드, 펩티드 수체 및 결합단백질, 또한 온코겐에 대응하는 유전자 및 mRNA, G-단백질 결합수체 등으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 코드화 하는 유전자 및 mRNA이다.
항감지 올리고는 호흡곤란작용이나 악성물질, 가래분비 증대 혹은 감소, 기타의 작용을 포함한 폐의 기도에 관련된 질환 및 그 상태에 관여하는 폴리펩티드, 유전자 및 이를 코드화하는 mRNA, 게놈성 및 mRNA 측생부, 유전자 및 mRNA 인트론 및 엑손 경계부 등으로부터 타겟을 선별하고; 타겟 유전자 및 타겟 폴리펩티드를 코드화하는 mRNA에 상응하는 mRNA, 게놈성 및 mRNA 측생부, 유전자 및 mRNA 인트론 및 엑손 경계부 등으로부터 mRNA의 서열을 수득하고;선별된 mRNA 시그먼트에 대하여 항감지성을 나타내는 하나 이상의 올리고를 합성하고; 필요할 경우, 티미딘(T)에 교배될 수 있으나 반면 하나 이상의 A에 대하여, 아데노신 수체 위치에서의 길항제량이 적거나 없는 (아데노신 수체 활성이 적거나 없는) 대체염기로 치환하여 홀리고 내에 존재하는 A의 함량을 모든 뉴클레오티드에 대해서 최고 15%까지 출 수 있게 함으로써 생성된다. 앞서 지적한 바와 같이, 적절한 타겟은 타겟 단백질, 전사인자, 자극 및 활성인자, 인터루킨, 인터루킨 수체, 케모카인, 케모카인 수체, 내부생성된 특이적 및 비특이적 효소, 면역글로불린, 항체수체, 중추신경계(CNS) 및 말초신경과 무신경계 수체, CNS 및 말초신경과 무신경계 펩티드 전달물질과 그들의 수체, 흡착분자, 디펜사인, 성장인자, 혈관수축(확장) 펩티드, 펩티드 수체 및 결합단백질, 또한 온코겐에 대응하는 유전자 및 mRNA, 이들의 측생부 및 인트론과 엑손 경계부 등을 포함한다. 코드화 되는 폴리펩티드는 또한 NfkB 전사인자, 인터루킨-8 수체(IL-8R), 인터루킨 5 수체(IL-5R), 인터루킨 4 수체(IL-4R), 인터루킨 3 수체(IL-3R), 인터루킨1β(IL-1β), 인터루킨-1β수체 (IL-1βR), 이오택신, 트립타제, 기초단백질, β2-아드레날린 수체 키나제, 엔도텔린 수체A, 엔도텔린 수체B, 프로프로엔도텔린, 브래디키닌 B2 수체, IgE 고친화성 수체, 인터루킨1 (IL-1), 인터루킨 1 수체(IL-1R), 인터루킨9(IL-9), 인터루킨-9 수체(IL-9R), 인터루킨 11(IL-11), 인터루킨-11 수체(IL-11R), 유발성 질산산화물 합성효소, 시클로옥시제나제(COX), 세포간 흡착분자 1(CAM-1) 맥관세포 흡착분자(VCAM), 란테스, 내피 백혈구 흡착분자(ELAM-1), 단세포 활성인자, 뉴트로필 화학인자, 뉴트로필 엘라스타제, 디펜사인 1,2 및 3, 무스카린 아세틸콜린 수체, 혈소판 활성인자, 종양괴사인자α, 5-리폭시나제, 포스포디에스테라제 IV, P물질, P물질 수체, 히스타민 수체, 키마제, CCR-1 CC 케모카인 수체, CCR-2 CC 케모카인 수체, CCR-3 CC 케모카인 수체, CCR-4 CC 케모카인 수체, CCR-5 CC 케모카인 수체, 프로스타노이드 수체, GATA-3 전사인자, 뉴트로필 흡착수체, MAP 키나제, 인터루킨-9(IL-9), NFAT 전사인자, STAT 4, MIP-1α, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 시클로필린, 포스포리파제 A2, 염기성 섬유종 성장인자, 메탈로프로테나제, CSBP/p38 MAP 키나제, 트립토제 수체, PDG2, 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-1β (IL-1β), 시클로스포린 A-결합 단백질, FK5-결합 단백질, α4β1 셀렉틴, 피브로넥틴, α4β7 셀렉틴, Mad CAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), PECAM-1, LFA-1 셀렉틴, C3bi, PSGL-1, E-셀렉틴, P-셀렉틴, CD-34, L-셀렉틴, p150,95, Mac-1(CD11b/CD18), 푸코실 전달효소, VLA-4, CD-18/CD11a, CD11b/CD18, ICAM2 및 ICAM3, C5a, CCR3(이오택신 수체), CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, LTB-4, AP-1 전사인자, 단백질 키나제C, 시스테이닐 루코트리엔 수체, 타키치넨 수체(tach R), IkB 키나제 1&2, STAT6, c-mas 및 NF-인터루킨-6(NF-IL-6) 및 그의 측생부와 인트론 및 엑손 경계부 등이다. 그러나, 본 발명은 기본적으로 아직 공공의 데이타베이스에서 실용화 되지 못했던 유전자를 새롭게 발견하여 이들의 응용에 대해 소개하고자 한다. 이것은 타겟 유효화가 중요시되는유전자군에 대한 것으로써 이들이 질병에 대해 어떤 역할을 하는지는 아직 밝혀진 바가 없다.
표 3은 본 발명의 작용제가 효과적으로 응용되는 타겟의 간단한 목록을 제공하나 이것은 단지 예시를 위한 것이다. 이 방법은 타겟 유효화가 올리고뉴클레오티드 분해 과정중의 생체활성 아데노신 방출에 의하여 검토될 수 있는 계에 적용가능하다. 아데노신은 항염증성으로 그의 방출은 종양타겟 유효화 결과에 장애를 줄 수 있으므로 이는 매우 중요한 것이다.
표 3 종양 타겟
변형 온코겐치료 타겟
ras티미딜레이트 합성효소
src티미딜레이트 합성효소
myc디히드로폴레이트 환원효소
bcl-2티미딘 키나제
데옥시사이티딘 키나제
리보뉴클레오티드 환원효소
혈관생성인자흡착분자
온코겐폴레이트 경로효소
DNA회복유전자(1 탄소풀)
텔로머라제
HMG CoA 환원효소
파머실 전달효소
글루코스-6-포스페이트 전달효소
종양타겟의 유효화를 위한 바람직한 타겟군은 상이한 종류의 암에 관련된 유전자들 혹은 일반적으로 악성물질에 관련되는 것으로 공지된 것들이며 이들이 RNA및/또는 단백질의 생성에 수반되거하 혹은 조절형인지의 여부에 관계없다. 그 예는 상기의 표 3에서 보는 바와 같은 변형온코겐이다. 종양타겟 유효화 작용제가 직접 지항하는 다른 타겟은 각종 효소들로서 주로 특별히 이에 국한되는 것은 아니지만, 티미딜레이트 합성효소, 디히드로폴레이트 환원효소, 티미딘 키나제, 데옥시사이티딘 키나제, 리보뉴클레오티드 환원효소와 기타의, 정상세포보다는 종양세포에서 풍부하게 생성되는 유전자 생성물 등이 있다. 본 발명의 기술은 특히 전통적인 암치료법으로는 화학요법, 방사선요법 등의 치료에 수반되는 고통스러운 부작용으로부터 정상세포를 보호하면서 암세포를 선별적으로 죽이지 못하는 조건에서, 종양 타겟 유전자를 유효화/무효화하는데 특별히 유용하다. 즉, 현재의 암치료는 악성세포를 선별적으로 타겟화할 수가 없다. 본 발명에 의해 유효화된 타겟은 원하는 유전자 생성물을 선별적으로 약화시키고 및 그의 기능과 경로를 약화 혹은 강화시킬 수 있는 능력을 제공한다. 이러한 접근법은 계의 선별이 가능하고 및 계 내에서 복수의 타겟 즉, 대체로 정상세포에서는 동시에 발현되지 않고 개별로 및 서로 연계하여 유효화 할 수 있는 1차, 2차 및 가능한 3차까지의 타겟을 포함하는 경로를 선택할 수 있으므로 기존의 암치료법보다 훨씬 유리하다. 따라서 본 방법은 치료를 위한 타겟을 제공한다. 타겟이 본 발명에 의해 유효화되면, 타겟에 작용하는 선택성 작용제를 대상체에 투여하여 예컨대, 3개의 타겟을 발현하는 종양세포 내에서 선택적으로 독성을 증가시킬 수 있으며 반면에 1개 혹은 2개의 타겟만 발현하는 정상세포는 그 영향을 거의 받지 않게된다. 본 발명의 방법은 바람직하게 타겟 유전자 및/또는 이에 관련된 mRNA에 대해 항감지성으로 설계된 작용제를 투여대상체에 투여하는 것이다. 인체내에서의 타겟을 유효화 하기 위해 작용제는 인간 유전자 혹은 RNA에 대하여 항감지성으로 설계된다. 본 발명의 작용제는 자연발생 DNA 및/또는 RNA 서열에 대해 항감지성인 올리고뉴클레오티드, 또한 타겟서열보다 짧은 길이의 염기, 바람직하게는 약 7개의 뉴클레오티드 길이로 된 분할편, 또한 아데노신 함량이 약 0.1%, 1% 혹은 4% 내지 최고 약 5%, 10%, 15%, 30% 범위 내에 있거나, 혹은 사실상 아데노신이 함유되지 않은 올리고, 또한 하나 이상의 아데노신 뉴클레오티드이 소위 범용 혹은 대체염기로 대체된 올리고나 티미딘 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 한편 사실상 트리거 아데노신 수체 활성은 전혀 없는 올리고 등을 포함한다. 본 발명의 항감지 올리고뉴클레오티드의 인간 서열 및 분할편은 특별히 제한되지 않으나, 다음 같은 분할편 및 이들과 또한 완전길이의 유전자 혹은 mRNA코드화 서열의 짧은 시그먼트, 바람직하게는 각 서열에서 7, 10, 15, 18 내지 21, 24, 27, 30, n-1 뉴클레오티드를 포함하는 엑손 및 인트론-엑손 접합부 (여기서 n은 뉴클레오티드 서열의 총수를 말함) 등이 있다. 이들 분할편은 더 긴 올리고의 임의 부분 예컨대, 중간, 5'-말단, 3'-말단 혹은 본래의 서열의 다른 위치에서 시작하는 부분으로부터 선택된다. 특히, 저아데노신 뉴클레오티드 함량의 분할편이라는 점이 중요하며 이들은 약 30% 이하 바람직하게는, 15%, 10%, 5% 혹은 이보다 더욱 적은 량의 아데노신 뉴클레오티드를 함유하는 것으로써 본 발명에 따른 범용 혹은 대체염기로 대체할 수 있는 것이다. 본 발명의 작용제는 서열내에 존재하는 하나이상의 아데노신이 여기서 예시된 바와 같은 범용 혹은 대체염기(B)에 의해 대체되는 경우 가장 바람직한 그룹서열로써 및 그들의 분할편을 포함한다. 마찬가지로, 서열, 이의 분할편 혹은 시그먼트에 함유된 아데노신(A)을 B로 대체하여 설계된 짧은 길이의 B-함유 분할편도 여기에 포함된다.
본 발명은 타겟 단백질의 발현을 감소시키는데 효과적인 양의 상기 항감지 올리고뉴클레오티드 자체 및 이를 포함하는 약제학적 조헝물 형태로서 활용될 수 있다. 항감지 올리고는 1차로 세포막을 통과하면서 세포내 단백질을 코드화 하는 mRNA과 특별히 결합하고 이것의 해석을 차단한다. 이러한 조성물은 적절한 약제학적 담체로서 예컨대, 멸균 발열물 무함유 염수액에 함유된 형태로 제공된다. 본 발명의 작용제는 세포막을 통과할 수 있는 소수성 담체 즉 약제학적 수용가능한 수성 담체 때로는 별도로 계면활성제나 지질에 담지된 리포좀과 함께 제형화 되기도 한다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 mRNA를 비활성화 하는 작용제로서 리보자임에 결합되어 더 완전한 해석저해 작용을 수행할 수 있다. 약제학적 제형은 또한 항감지 올리고가 세포에 의해 합체되는 것으로 알려진 분자들에 부착되는 키머릭 분자들을 포함하기도 한다. 이들 올리고뉴클레오티드 공액물은 세포성 흡수경로를 활용하여 올리고뉴클레오티드의 세포간 농축량을 증대시킨다. 이 방식으로 이용되는 분자의 예를 들면, 트랜스페린, 아시알로글리코프로테인(폴리리신을 통해 올리고뉴클레오티드에 결합된) 및 스트렙타비딘 등을 포함한 거대분자이다. 본 발명은 또한 지질입자 혹은 소포체 즉 리포좀이나 미세결정체 등 속에서 약제학적 제형에 함유된 항감지 화합물을 활용한다. 입자들은 단일 혹은 복수의 층상형 구조물이 바람직하다. 한가지 바람직한 구현예로써 항감지 올리고뉴클레오티드는 리포좀 속에 함유된다. 양전하형 지질로써 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄에틸설페이트 혹은 "DOTAP"은 특히 이러한 입자들 및 소포체에 바람직하다. 그러나, 그 밖에도 적절하게 사용되는 물질이 많다. 이러한 지질입자의 제조방법은 이미 공지되었으며 미국특허 제4,880,635호(Janoff et al.,), 제4,906,477호(Kurono et al.,), 제4,911,928호 (Wallach), 제4,917,951호(Wallach), 제4,920, 016호(Allen et al,) 및 제4,921,757호(Wheatley et al.) 등을 참조한다. 본 발명의 방법은 최소의 이동으로 즉, 뇌, 폐, 신장, 심장, 혀 등의 본래 위치에 임의의 방법으로 항감지 올리고를 투여하는 것이다.
폐에 작용제를 투여하는 것은 적절한 방법에 따르며 바람직하게는 호흡기관을 통해 흡입식 제형 더 바람직하게는 흡입형 입자를 함유한 에어로졸 같은 형태가 바람직하며 따라서, 대상체가 호흡 혹은 흡입할 수 있는 작용제를 함유하도록 한다. 이러한 호흡형 입자는 기체, 액상 혹은 고체상으로써 필요시 다른 치료제 성분 및 제형성분을 함유할 수도 있다. 본 발명의 입자는 바람직하게는 흡입시 구강과 후두를 통해 통과하여 기관지 및 폐포에 들어갈 수 있을 정도로 충분히 작은 크기의 입자로 되어있다. 일반적으로, 0.5-10 마이크론 정도의 직경을 갖는 입자가 호흡가능하다. 그러나, 이외의 크기로 되어도 좋다. 비호흡형 크기의 입자 즉 직경이 큰 입자는 호흡제형에 포함시켜 목구멍에 달라붙어 팽윤한다. 따라서 에어로졸에 함유될 비호흡형 입자는 그 양을 최소화할 필요가 있다. 비강 투여시, 입자크기는 10:500 마이크론 정도로서 비강속에 보유될 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명 작용제를 함유하는 액상 입자 에어로졸은 적절한 수단 즉 취분기(insufflator)나 약액분무기 등으로 제조한다. (미국특허 제4,501,729호 참조). 적절한 추진제는 클로로플루오로카본 화합물 즉, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 및/또는 그의 혼합물을 용매로서 함유한다. 특별한 응용분야에 적합한 다른 추진제도 바람직하게 사용할 수 있다. 제형은 추가로 하나이상의 공용매, 예컨대 에탄올, 또한 올레산이나 소르비탄 트리올레이트 같은 계면활성제, 항산화제 및 적절한 향제를 포함할 수 있다. 항감지 올리고는 정위법 혹은 CNS의 타겟 분리영역에 주사하는 방식으로 뇌에 투여할 수 있으며 그 밖의 공지된 방법에 딸기도 한다. 또는, 올리고를 혈액-뇌 경계부에 통과시키는 제형 형태로써 투여되기도 하며 예컨대, 공지된 바와 같이 스트렙타비딘과 트랜스페린 수체 지향형 단클론항체의 공액물을 뇌에 대하여 모노-바이오타이닐레이트 펩티드, 항감지 올리고(포스포디에스테르나 다른 유도체의 3'-바이오타이닐레이션 물질) 및 펩티드-올리고의 전달을 위한 범용의 담체로서 사용한다. 그 예는 Levy, R.M. et al., J. Neuroviral 3 Suppl: 574-75(1997); Wu-Pong 및 Gewirtz, BioPharm, pp.32-38(Jan.1999); Boado, R.J. et al.,J. Pharm. Sci.87(11); 1308-1315(1998)의 내용을 참조한다. 심장, 간 및 신장과 기타 장기에 대한 투여는 카테터법, 주입법 및 국소확산법 같은 투여기술에 따라 실행되며 이들은 모두 공지된 기술이다. 그 예는 Lewis, K.J. et al., J.Drug Target, 5(4): 291(1998); Ayrin, M.A. et al., Cathet. Cardiovasc. Dagn, 41(3):232-240(1997); Luft, F.C., J.Molec.Med. 76(2):75(1998) 의 내용을 참조한다. 이들 투여방법은 전형적으로 작용제의 액상, 고체상 혹은 기체상 약제학적 조성물에 대해 실행되며 이들은 항감지 올리고 및 적정량의 부형제 혹은 담체로서 멸균 발열체 무함유의 물, 지질 및/또는 다른 공지의약제학적 혹은 수의학적 수용가능한 담체와 조합하여 제조한 것이다. 다른 치료화합물을 공지의 다른 제형성분과 함께 포함시켜도 좋다. 무수입자로 된 본 발명의 소형 작용제를 함유하는 고형입상체 조성물은 무수 항감지 화합물을 모르타르 및 절굿공이로 갈아 마이크론 크기의 조성물로 만들고 이것을 400매쉬 크기의 스크린에 통과시킨 후 큰 덩어리를 분리하거나 분산제 및 다른 공지의 작용제로써, 연무 혹은 에어로졸 형성을 촉진시킬 수 있는 보조제를 더 포함할 수 있다. 적절한 분산제는 락토스이며 이것을 적절한 비율 즉 1:1 w/w로서 항감지 화합물에 혼합한다. 혼합비는 적절히 변화시킬 수 있으며 다른 약제학적 혹은 제형제를 더 포함시킬 수 있다. 본 발명과 관계된 공지문헌을 참조하면 본 발명의 다양한 측면을 이해하는데 도움이 될 것이다.
투여되는 항감지 화합물의 약량은 대체로 타겟, 그의 기능 및 증폭성, 조사대상이 되는 질환, 대상체의 상태, 특정 제형, 투여경로와 위치, 투여시기 등에 따라 달라진다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 세포간농도는 0.05 내지 50:M 혹은 더 구체적으로 0.2 내지 5:M인 것이 바람직하다. 그러나 확실한 응답성을 관측하기 위해 적정약량을 결정하기 위한 약량-응답곡선을 작성하는 것이 좋다. 약량은 변동이 있으나 대체로 0.001, 0.01, 또는 1mg/kg 내지 50, 100 및 150mg/kg 정도로 사용되는 것이 보통이다. 당해 분야의 전문가라면 특정 응용에 있어서 이보다 많거나 적은 약량으로 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 약량은 1회 혹은 일정기간 즉 24시간마다 투여해도 좋으며 또는 다른 투약규정에 따를 수도 있다. 다음의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로써 발명을 제한하지는 않는다. 이 실시예에서 :M은 마이크로몰, ml은 밀리리터, :m은 마이크로미터를 의미하며 또한 mm은 밀리미터, cm은 센티미터이다. 또한 EC는 ℃를 :g은 마이크로그램을, mg는 밀리그램을 g은 그램이며 kg은 킬로그램, M은 몰, 또한 hrs는 시간 단위를 의미한다.
실시예
실시예 1: 항감지 올리고뉴클레티드의 설계 및 합성
타겟 수체에 대항할 항감지 올리고뉴클레오티드의 설계은 타겟 수체 mRNA의 복합한 2차 구조의 해법을 필요로 한다. 이 구조를 생성한 후, 기능적 활성 혹은 mRNA에 대한 안정성을 부여하고 또한 초기코돈을 이상적으로 중복할 mRNA의 타겟영역이 되도록 항감지 뉴클레오티드를 설계한다. 다른 타겟 위치는 쉽게 이용할 수 있다. 항감지효과의 특이성을 보여주기 위해, 타겟 mRNA을 전적으로 보상하는 것이 아니라, w/w 기준으로 동일한 뉴클레오티드 조성물을 함유하는 다른 올리고뉴클레오티드가 항감지 실험에서 대조부로 제시된다. 예를 들어, 아데노신 A1수체의 mRNA 2차 구조를 분석하여 상기와 같이 포스포로티오에이트 항감지 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용하였다. 합성된 항감지 올리고뉴클레오티드는 HAdA1AS로 명명되고 이는 다음같은 서열을 갖는다: 5'-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3' (SEQ ID NO:1). 대조부으로서, 부적합된 포스포로티오에이트 항감지 뉴클레오티드인 HAdAlMM1을 합성하였고 이의 서열은 다음과 같다: 5'-GTA GCA GGC GGG GAT GGG GGC-3' (SEQ ID NO:2). 각 올리고뉴클레오티드는 동일한 염기함량 및 일반적인 서열구조를 갖는다. GENBANK (릴리즈 85.0)와 EMBL(릴리즈 40.0)의 상동성 검색결과 항감지 올리고뉴클레오티드는 인간 및 토끼의 아데노신 A1수체 유전자에 특이성이 있었고 부적합 대조부는 공지의 유전자 서열과의 교배 대상이 아니었다. 아데노신 A1수체 mRNA의 2차구조를 상기와 유사하게 분석하고 또한 2개의 포스포로티오에이트 항감지 올리고뉴클레오티드의 설계에 이용했다. 합성된 1차 항감지 올리고뉴클레오티드(HAdA3AS1)의 서열은 다음과 같았다: 5'-GTT GTT GGG CAT CTT GCC-3' (SEQ ID NO:3). 대조부으로써, 역시 부적합 포르포로티오에이트 항감지 올리고뉴클레오티드(HAdA3MM1)을 합성했고 이의 서열은 다음과 같았다: 5'-GTA CTT GCG GAT CAT GGC-3' (SEQ ID NO:4). 2차 포스포로티오에이트 항감지 올리고뉴클레오티드 (HAdA3AS2)는 또한 다음의 서열을 갖도록 설계 합성되었다.: 5'-GTG GGC CTA GCT CTC GCC-3' (SEQ ID NO:5). 이것의 대조부인 올리고뉴클레오티드(HAdA3MM2)의 서열은 다음과 같다: 5'-GTC GGG GTA CCT GTC GGC-3' (SEQ ID NO:6). 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 응용 바이오시스템 모델 396 올리고뉴클레오티드 합성기 상에서 합성되었으며 NENSOR 크로마토그래피 (DuPont, MD)를 이용하여 정제하였다.
실시예 2: 아데노신 A 1 수체 항감지 올리고의 체내 시험
상술한 인간 A1수체에 대한 항감지 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID NO:1)를 폐 아데노칼시노마 세포 HTB-54를 활용하는 체외모델에서의 효능을 시험했다. HTB-54 폐 아데노칼시노마 세포는 표준 노던블롯 분석법을 이용하여 A1아데노신 수체의 발현을 입증했으며 수체의 프로브를 실험실에서 설계 합성했다. HTB-54 인간 폐 아데노칼시노마 세포(106/100mm 조직배양접시)는 12시간 배양후 배지 및 올리고뉴클레오티드의 순수변화와 함께 24시간동안 5.0:M HAdA1AS 혹은 HAdALMM1에 노출시켰다. 올리고뉴클레오티드에 대한 24시간 노출 뒤, 세포를 수득하여 이의 RNA을 표준방법으로 추출했다. 항감지물(및 항감지물과 동일한 서열을 갖지만 포스포로티오에이트 되지 않은)에 의해 타겟화된 mRNA 부위에 상응하는 21-mer 프로브를 함성하고 HAdAlAS-처리, HAdAlMM1-처리 및 무처리된 HTB-54 세포로부터 제조된 RNA의 노던블롯을 검출하는데 사용되었다. 이들 블롯에서 HAdAlAS는 HAdAlMM1와 달리 효과적으로 인간 아데노신 수체 mRNA를 50% 이상 감소시켰음을 확인할 수 있었다. 이 결과는 HAdAlAS는 천식에 수반되는 아데노신 A1수체에 대한 세포간 mRNA을 소비하므로 항-천식 약제의 우수한 후보를 보여주었다.
실시예 3: 아데노신 A 1 수체 항감지 올리고의 체내 효능
초기코돈을 중복한 아데노신 A1유전자 내에 있는 토끼와 인간 DNA 서열간의 우연한 상동성 때문에 포르포로티오에이트 항감지 올리고뉴클레오티드를 토끼 모델의 인간 아데노신 A1수체에 대하여 사용할 목적으로 초기 설계하게 되었다. 네오나탈 뉴질랜드 백색 탈파스튜렐라 토끼를 생후 24시간 내에 312그램 유닛/ml 집먼지 진드기(D. farinae) 추출물(Berkeley Biological, Berkeley, CA)을 10% 카올린과 혼합한 물질을 복강주사하여 면역시켰다. 면역처리를 첫1개월간 매주 반복하고 다시 후속의 2개월간 2주 간격으로 반복하였다. 생후 3-4 개월이 지나서 8마리의 감지성화된 토끼들을 마취한 후 케타민 히드로클로라이드(44mg/kg) 및 아세프로마진 말레이트(0.4mg/kg)의 혼합물을 근육주사로 투여하여 완화시켰다. 토끼를 다시 소형 주조된 패드달린 애니멀 보드의 안전한 위치에 놓고 4.0mm 기관튜브를 삽관시켰다 (Mallinkrodt, Inc., Glens Fall, NY). 외경이 2.4mm이고 접착 라텍스 풍선이 달린 폴리에틸렌 카테터를 식도에 집어넣고 실험 내내 입으로부터 일정거리 상에 안치시켰다. 삽관튜브는 가열된 플래쉬 공압식 회전속도계 (크기 00; DOM Medical, Richmond, VA)에 부착했고 골드 캐리어 증폭기(모델 11-4113; 골드 일렉트로닉사, Cleveland, OH)에 의해 구동되는 발리다인 미분압 트랜스듀서(모델 DP-4516927; 발리다인 엔지니어사, Northridge, CA)를 이용하여 측정하였다. 식도풍선이 미분압 트랜스듀서 한 측면에 부착되고 기관내 튜브의 유출관을 반대편 압력 트랜스듀서에 연결하여 폐교환압을 기록할 수 있게 해주었다. 흐름은 합쳐져 연속 조수량을 제공해주고, 전체 폐 저항값(RL) 및 동적 순응값(Cdyn)을 자동호흡 분석기(모델 6:Buxco, Sharon, CT)을 이용하여 등용적 및 유동 제로점에서 각각 계산했다. 동물은 임의선택하고 제1일에 PC50에 대한 전처리값을 에어로졸형 아데노신에 대해 구하였다. 항감지(HAdAlAS) 혹은 부적합 대조부(HAdAlMM) 올리고뉴클레오티드를 멸균 생리염수에 5000:g (5mg)/1.0ml의 농도로 용해했다. 동물에 대해 계속해서 에어로졸형 항감지 및 부적합 올리고뉴클레오티드를 삽관튜브 (1.0ml 부피당 약 5000:g)를 통해 2일간 매일 2회씩 투여했다. 염수, 아데노신, 혹은 항감지나 부적합 올리고뉴클레오티드의 에어로졸은 모두 초음파 약액분무기(DeVilbiss, Somerset, PA)로제조하였고 이 분무기에서 분무되는 액적은 80% 이상이 5:m 이하 직경크기를 갖는다. 실험 첫날, 4마리의 임의 선택된 알레르기성 토끼에 항감지 올리고뉴클레오티드를 투여하고 또한 비정합 대조부 올리고뉴클레오티드를 투여하였다. 3일째 아침에, PC50값 (에어로졸형 아데노신의 mg/ml 농도는 기도의 동적 순응값이 기본값에서 50%로 감소하도록 하는데 필요한 정도로 한다)을 얻고 이들 동물을 올리고뉴클레오티드에 노출하기 전에 수득했던 PC50값과 비교하였다. 1주일동안, 부적합 대조부 올리고뉴클레오티드를 사전투여했던 동물들에게 다시 항감지 올리고뉴클레오티드를 또한 앞서서 항감지 올리고뉴클레오티드를 사전투여했던 동물들에 후속하여 대조부 올리고뉴클레오티드를 교차투여하였다. 처리방법 및 측정방법은 실험 첫날에 사용된 것과 동일하다. 항감지 올리고뉴클레오티드로 치료한 8마리의 동물중 6마리에게서는 아데노신-조절의 기관지수축이 아데노신 용해도 한계인 20mg/ml까지 나타나지 않았다. 계산의 목적에 있어서, 이들 동물의 PC50값은 20mg/ml 이다. 여기에서 주어진 값은 항감지 효율의 최소치를 나타내는 것이다. 실제 효율성은 더 높다. 이 실험결과를 다음의 표 4에 수록하였다.
표 4. 천식 토끼의 PC50 값에서의 아데노신 A1수체 항감지 올릭고의 영향
부적합 대조부 A 수체 항감지 올리고
전올리고 뉴클레오티드 후올리고 뉴클레오티드 전올리고 뉴클레오티드 후올리고 뉴클레오티드
3.56 ± 1.02 5.16 ± 1.03 2.36 ± 0.68 >19.5± 0.34**
결과는 평균치(n=8)± SEM 로 표시한다.
분산값(ANOVA)의 반복측정 분석 및 터키 방호시험으로 그 중요성을 결정하였다.
** 다른 모든 군과 크게 상이한 경우 (p<0.01).
양쪽 실험에서, 항감지 올리고뉴클레오티드를 수용한 동물은 폐의 동적 순응도를 낮추기 위해 필요한 에어로졸형 아데노신의 약량을 50% 까지 증가시킴을 보여준다. 부적합 대조부 올리고뉴클레오티드는 PC50에서 아무런 영향도 관측되지 않았다. 독성은 양측 올리고뉴클레오티드를 각각 투여한 동물에서 모두 관측되지 않았다. 이 결과는 폐질환의 경우 항감지 올리고뉴클레오티드에 기초한 치료조정의 타겟으로서의 가능성이 예외적으로 크다는 점을 명확히 보여주는 것이다. 이들은 또한 매우 유사한 인간 천식 모델에서 아데노신 A1수체의 다운조정이 천식기도의 아데노신 조절된 기관지 수축 현상을 크게 감소시키는 것을 보여준다. 인간천식의 알레르기 토끼 모델에서 기관지성 과응답성은 이 반응에 수반되는 조직이 에어로졸화 된 올리고뉴클레오티드와 접촉되는 부분에 가깝기 때문에 항감지 조정에 대한 최적의 종말점이 되며 이 모델은 중요한 인간 질병을 가깝게 모사한다.
실시예 4: 아데노신 A 1 수체 항감지 올리고의 특이성
실시예 3의 교차실험 결과, 토끼에서 취한 기도의 연조직을 아데노신 A1수체수의 정량분석에 사용했다. 항감지 올리고뉴클레오티드의 특이성에 관한 대조부로써 아무런 영향을 받지 않은 아데노신 A2수체 역시 정량분석하였다.
기도 연조직을 각 토끼로부터 절제하여 Kleinstein et al.의 방법에 따라 제조한 막성분(Kleinstein, J. 및 Glossmann, H., Naunyn-Schmiedeberg's Arch.Pharmacol. 305:191-200 (1978))으로부터 제조하였으며 상기 참조문헌의 방법을 본 발명에서 다소 변형하였다. 초기 플라즈마막 제조물은 분석때가지 70EC에서 보관했다. 단백질 함량은 브래드포드 법으로 측정했다 (M. 브래드포드, Ana. Biochem. 72, 240-254 (1976), 관련부분 참조). 냉동플라즈마막은 실온으로 해동하고 0.2U/ml 아데노신 탈아민효소로 37EC에서 30분간 배양하여 내인성 아데노신을 제거했다. [3H] DPCPX(A1수체 특이성) 혹은 [3H] CGS-21680 (A1수체 특이성)의 결합을 Ali et al.의 선행기술에 따라 측정했다 (Ali, S. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 268, Am. J. Physiol 266, L271-277 (1994), 관련부분 참조). 교차실험에서 아데노신 A1항감지 올리고뉴클레오티드로 처리한 동물은 A1특이성 길항제 DPCPX의 특이성결합을 분석한 결과, 대조부와 비교하여 거의 75% 까지 A1수체가 감소하였다. A1수체 특이성 길항근 2-[p-(2-카르복실에틸)-페네틸아미노]-5'-(N-에틸카르복사미도)아데노신(CGS-21680)의 특이성 결합을 분석한 결과, 아데노신 A1수체 수는 거의 변화가 없었다. 이것은 하기의 표5에서 나타내었다. 하기의 결과는 기도 질환을 치료할 때 항감지 올리고뉴클레오티드의 효능을 나타낸 것이다. 상술한 항감지 올리고는 아데노신-조절의 기관지수축에 대한 응답성이 있는 수체계을 제거하므로 이들로부터 아데노신을 제거해야할 필요성이 감소한다. 그러나, 이러한 올리고뉴클레오티드에서 아데노신을 제거하는 것은 유사한 효과를 얻기위해 필요한 약량을 감소시키므로 바람직한 것이다. 상술한 내용은 염증에 수반된 단백질의 mRNA를 타겟화할 다른 항감지 올리고뉴클레오티드에도 마찬가지이다. 아데노신은 분해시 유리되는 것을 방지하기 위해 이들 뉴클레오티드 함량으로부터 제거되었다.
표 5: 아데노신 A1수체 항감지 올리고뉴클레오티드의 작용 특이성
부적합 대조부 올리고뉴클레오티드 A1항감지 올리고뉴클레오티드
A1특이성 결합 1105 ± 48** 293 ± 18
A1특이성 결합 302 ± 22 442 ± 171
결과는 평균치(n=8)± SEM 로 표시한다.
분산값(ANOVA)의 반복측정 분석 및 터키 방호시험으로 그 중요성을 결정하였다.
** 부적합 대조부와 크게 상이한 경우 (p<0.01).
실시예 5: 다른 타겟 핵산을 지향하는 항감지 올리고
이 실험은 본발명이 핵산 타겟에 광범위한 특이성을 갖는 항감지 올리고뉴클레오티드("올리고")에 폭넓게 응용되는 것을 보여준다. 다음의 실험연구는 본 발명의 방법이 이 분야에서 설명한 바와 같이 설계된 항감지 올리고와 함께 사용하기에 적절하다는 것을 입증하기 위해 실시되었다. 이 목적으로서, 각종 항감지 올리고가 아데노신 A1, A2b및 A3수체 mRNA으로 예시되는 아데노신 mRNA로 제조되었다. 항감지 올리고 I는 상술한 바와 같다(SEQ ID NO:1). 5개의 추가 항감지 포스포로티오에이트 올리고가 상술한 바와 같이 설계 및 합성되었다:
1 - 올리고 II (SEQ ID NO: 7) 역시 아데노신 A1수체를 타겟화 하나 올리고I 가 아닌 다른 부위를 타겟화 한다.
2 - 올리고 V (SEQ ID NO: 10) 는 아데노신 A2b수체를 타겟화한다.
3 - 올리고 III (SEQ ID NO: 8) 및 올리고 IV (SEQ ID NO: 9) 는 아데노신 A3수체의 다른 부위를 타겟화 한다.
4 - 올리고 I-PD (SEQ ID NO: 11) (올리고 I와 동일한 서열의 포스포디에스테르 올리고)
이들 항감지 올리고는 상술한 바와 같은 선별된 종류에서 치료 용도로 설계되었으며 일반적으로 다른 종류의 타겟 mRNA의 시그먼트가 유사 서열을 함유하는 일이 없는 한 해당 종류에 대한 특이성을 갖는다. 항감지 올리고는 하기와 같이 제조되고, 상술한 응용분아에서와 같이 천식 같은 가벼운 질병의 경우 등 호흡곤란 및 폐의 기도에 가해지는 질환으로서 기관지수축, 염증 및 알레르기 등에 있어서 토끼모델의 체내시험에 사용되었다.
실시예 6: 기타 항감지 올리고의 설계 및 서열
토끼 모델의 6개의 올리고 및 그의 영향을 연구했고 그 연구결과는 하기에서 검토 보고하는 바와 같다. 이들 올리고 중 5가지는 실시예 1 내지 4에서 소개한 올리고 I (SEQ ID NO: 1)에 대한 데이터를 보상하기 위해 이 연구에서 채택되었다.
이 올리고는 아데노신 A1수체 mRNA의 한 영역에 대하여 항감지성이다. 시험올리고는 아데노신 A1수체 mRNA의 또다른 영역에 타겟화되는 항감지 올리고 I(SEQ ID NO:1) 및 II(SEQ ID NO:7); 아데노신 A2b수체 mRNA에 타겟화되는 올리고 V(SEQ ID NO: 8), 또한 아데노신 A3수체 mRNA의 다른 두 영역에 타겟화되는 항감지 올리고 III 및 IV(SEQ ID NOS: 9 및 10)으로 확인식별된다. 6번째 올리고(올리고 I-PD)는 올리고 I(SEQ ID NO: 1)의 포스포디에스테르 부분이다. 항감지 올리고의 설계 및 합성은 상기 실시예 1에 따라 시행된다.
(I) 항감지 올리고 I
실시예 1 내지 4에 관련한 항감지 올리고뉴클레오티드 I는 인간 A1아데노신 수체 mRNA (EPI 2010)에 타겟화된다. 항감지 올리고 I는 21개 뉴클레오티드 길이이고 초기코돈에 겹치며 다음의 서열을 갖는다: 5'-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3' (:SEQ ID NO: 1). 올리고 I는 Nyce, J.W.& Metzger, W.J., Nature, 385:721(1977) 에서 참조하는 바와 같이, 알레르기 토끼의 아데노신 유발 기관지수축을 제거하고 알레르기 유발성 기도장애 및 기관지 과민증(BHR)을 감소시키는 것으로 이미 밝혀졌다.
(II) 항감지 올리고 II
포스포로티오에이트 항감지 올리고(SEQ ID NO: 7)은 초기코돈 (개시위치)에 대해 토끼 아데노신 A1수체 mRNA 부위 +936 내지 +956을 타겟화 하기 위해 본 발명에 따라 설계된 것이다. 항감지 올리고 II는 21 뉴클레오티드 길이이고, 다음의 서열: 5'-CTC GTC GCC GTC GCC GGC GGG-3' (SEQ ID NO: 7)을 갖는다.
(III) 항감지 올리고 III
상기 실시예 1에서와 다른 포스포로티오에이트 항감지 올리고 (SEQ ID NO: 8)을 초기코돈 (개시위치)에 대해 항감지 A3수체 mRNA 부위 +3 내지 +22을 타겟화 하기 위해 본 발명에 따라 설계되었다. 항감지 올리고 III는 20 뉴클레오티드 길이이고, 다음의 서열: 5'-GGG TGG TGC TAT TGT CGG GC-3' (SEQ ID NO: 8)을 갖는다.
(IV) 항감지 올리고 IV
또다른 포스포로티오에이트 항감지 올리고 (SEQ ID NO: 9)를 초기코돈 (개시위치)에 대해 아데노신 A3수체 mRNA 부위 +386 내지 +401을 타겟화 하기 위해 본 발명에 따라 설계되었다. 항감지 올리고 IV는 15 뉴클레오티드 길이이고, 다음의 서열: 5'-GGC CCA GGG CCA CCC-3' (SEQ ID NO: 9)을 갖는다.
(V) 항감지 올리고 V
포스포로티오에이트 항감지 올리고 (SEQ ID NO: 10)를 초기코돈 (개시위치)에 대해 아데노신 A2b수체 mRNA 부위 -21 내지 -1을 타겟화 하기 위해 본 발명에 따라 설계되었다. 항감지 올리고 V는 21 뉴클레오티드 길이이고, 다음의 서열: 5'-GGC CGG GCC AGC CGG GCC CGG-3' (SEQ ID NO: 10)을 갖는다.
(VI) A1부적합 올리고
다음 서열을 가진 2개의 다른 부적합 올리고뉴클레오티드를 상기 실시예 5에서 설명한 항감지 올리고 I (SEQ ID NO: 1)의 대조부로 사용하였다: A2MM2 5'-GTA GGT GGC GGG CAA GGC GGG-3'(SEQ ID NO: 12) 및 A1MM3 5'-GAT GGA GGC GGG CAT GGC GGG-3' (SEQ ID NO: 13). 항감지 올리고 I 및 2개의 부적합 항감지 올리고는 동일한 염기함량 및 일반 서열구조를 갖는다. GENBANK(릴리즈 85.0) 및 EMBL(릴리즈 40.0)의 상동성 검색 결과 항감지 올리고 I가 인간은 물론 토끼에 대해서도 특이성이 있는 아데노신 A1수체 유전자이고 부적합 대조부는 어떤 공지된 인간 혹은 동물 유전자 서열과도 교배 후보가 되지 않았음을 확인하였다.
(VII) 항감지 올리고 A1-PD (올리고 VI)
올리고 I와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 포스포디에스테르 항감지 올리고(올리고 VI; SEQ ID NO: 11)는 상기 출원에서 개시된 바와 같이 설계하였다. 항감지 올리고 I-PD는 21 뉴클레오티드 길이이며 초기코돈에 겹치고 다음의 서열을 갖는다: 5'-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3' (SEQ ID NO: 11).
(VIII) 대조부
각 토끼에 5.0ml 에어로졸 멸균염수를 항감지 올리고 (II), (III) 및 (IV)의 순서에 따라 투여하였다. 그러나, 아데노신 감소 방법은 일반적으로 생체활성적 아데노신의 방출이 아데노신 수체의 현실화를 위한 실험데이타에 장애가 될 수 있는 어떤 유전자 및 타겟 유효화 시스템에나 응용가능하다.
실시예 7: 항감지 올리고의 합성
상술한 서열을 갖는 포스포로티오에이트 항감지 올리고는 응용 바이오시스템모델 396 올리고뉴클레오티드 합성기에서 합성했으며 NENSORB 크로마토그래피(DuPont, DE)으로 정제했다. TETD(테트라에틸티우람 디설파이드)가 합성과정에서 황화제로 사용되었다. 항감지 올리고뉴클레오티드 II(SEQ ID NO: 7), 항감지 올리고뉴클레오티드 III(SEQ ID NO: 8) 및 항감지 올리고뉴클레오티드 IV(SEQ ID NO: 9)는 각각 이 방식대로 합성 및 정제되었다.
실시예 8: 알레르기성 토끼의 준비
새끼 뉴질랜드 백색 탈파스튜렐라 토끼에게 생후 24시간 내에 0.5ml의 312 항원 유닛/ml 집먼지진드기 (D. farinae) 추출물 (Berkeley Biologicals, Berkeley, CA)을 상술한 바와 같이 10% 카올린 (Metzger, W.J., in Late Phase Allergic Reactions, Dorsch, W., Ed., CRC Handbook, pp.347-362, CRC Press, Boca Raton (1990); Ali, S., Metzger, W.J. and Mustafa, S.J., Am.J.Resp.Crit. Care Med. 149:908 (1994))과 혼합하여 얻은 물질을 복강주사하여 면역시켰다. 상기 참조문헌의 내용을 참조한다. 면역화는 첫달은 매주 및 그 후는 격주로 4개월간 반복했다. 이 토끼는 우선적으로 알레르겐-특이성 IgE 항체를 생성하며 정상적으로 초기 및 말기 천식 응답 모두를 통해 공기 알레르겐 챌린지에 응답하며 기관지 과민성(BHR)을 보인다. 매월 알레르겐을 복강주사하여(312 유닛 집먼지 진드기 알레르겐, 상기참조) 자극하고 또한 알레르겐-특이성 IgE 항체 및 BHR을 유지한다. 생후 4개월째, 감지성이 된 토끼에게 Ali et al.이 설명한 바와 같은 에어로졸을 투여한다 (Ali, S., Metzger, W.J. and Mustafa, S.J., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 149 (1994) 문헌참조).
약량-응답 연구
실시예 9: 실험 준비
아데노신(0-20mg/ml), 항감지 혹은 2개의 부적합 올리고뉴클레오티드 (5mg/ml)중 하나의 에어로졸을 초음파 약액분무기 (모델 646, DeVilbiss, Somerset, PA)를 이용하여 각각 별도로 제조하였다. 에어로졸의 액적 중 80% 는 5:m 이하의 직경크기를 갖는다. 등용적의 에어로졸을 삽관튜브를 통해 폐에 직접 투여하였다. 동물을 임의선별하여 에어로졸형 아데노신을 투여하였다. 아데노신 감지도에 대한 제1일의 전처리값은 50% 의 순응도 상실을 일으키는 아데노신 약량(PC50아데노신)으로 계산했다. 계속해서 동물에게 에어로졸화된 항감지 올리고 또는 부적합 항감지 올리고 중 하나를 2일동안 매일 2회씩 2분에 걸쳐 (총약량, 20mg) 삽관을 통해 투여했다. 3일째의 아침에 후처리 PC50값을 기록했다 (후처리 챌린지). 이 시험결과는 하기 실시예 21에서 나타낸다.
실시예 10: 교차 실험
항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1) 및 이에 상응하는 부적합 대조부 올리고뉴클레오티드 A1MM2를 이용하는 실험에서, 2주 간격으로 동물에 대해 교차 실험하였다. 즉, 부적합 대조부 A1MM2를 먼저 투여했던 동물에게 항감지 올리고 I를 제공하고 반면에 항감지 올리고 I를 먼저 투여했던 동물에게는 상기 부적합 대조부 A1MM2를 투여했다. 각 실험군의 동물의 수는는 다음과 같았다. 부적합 A1MM2(대조부 1)의 경우기술적인 난점으로 인해 실험의 두번째 대조군에서 1마리를 잃었으므로 n이 7이고, 반면 A1MM3 은 n=4 (대조부 2)이며 AAS 항감지 올리고 I는 n=8 이다. A1MM3 올리고처리된 동물을 개별적으로 분석하였으며 이는 교차 실험의 일부가 아니다. 교차 실험에 이용된 처리방법 및 측정값은 실험 제1군에서 사용된 것과 동일하다. 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)로 처리된 8마리 중 6마리에게서는 아데노신 용해도 한계값인 20mg/ml 까지의 아데노신 약량에 대해 PC50값을 수득할 수 없었다. 따라서, 이들 동물에 대한 PC50값은 계산을 위해 20mg/ml 라고 가정하였다. 주어진 값은 따라서 본 발명의 항감지 올리고뉴클레오티드의 효용성을 최소한으로 보여준다. 다른 알레르기 토끼군 (각 군에서 n=4)에 대해 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1) 혹은 A1MM2 올리고를 상술한 실험절차 및 방식에 따라 (총약량 2.0 혹은 0.2mg) 0.5 혹은 0.05mg 의 약량으로 투여했다. 이 실험연구 결과는 하기의 실시예 22에서 보는 바와 같다.
실시예 11: 항감지 올리고 제형
항감지 올리고 각각을 수용액에 용해시켜 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)에 대한 상기 설명과 같이 4개의 5mg 분취액 (총약량 20mg)을 약액분무기를 이용하여 삽관튜브를 통해 투여했다. 항감지 올리고 I 및 그의 부적합 대조부에 대해 수득된 결과는 하기의 실시예 19 및 표1에서 설명한 바와 같이 (Nyce & Metzger, Nature 385, 721-725 (1997) 참조) 부적합 대조부가 염수와 균등한 것임을 확인해주었다. 이 발견 때문에 염수를 항감지 올리고 II, III 및 IV (SEQ ID NOS: 7, 8 및 9)를이용하는 폐기능 연구의 대조부로서 사용하였다.
실시예 12: 아데노신 A 1 수체에 대한 올리고 I의 특이성 (수체 결합연구)
20mg 올리고 I (SEQ ID NO: 1)를 4개로 나누어 상기와 같이 총 48시간 동안 투여했던 토끼의 1차, 2차 및 3차 기관지에서 취한 기도 연근육의 조직을 해부하였다. Ali et al.의 방법으로 막부분편을 얻었다 이에 대해서는 공지문헌을 참조한다. (Ali, S., et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. 149:908 (1994)). 단백질 함량은 브래드포드법으로 측정하고 혈장막은 37EC 에서 30분간 0.2U/ml 아데노신 탕아민효소로 배양시켜 내인성 아데노신을 제거하였다. (Bradford, M.M.Anal. Biochem. 72, 240-254 (1976) 문헌참조). [3H]DPCPX, [3H]NPC17731 혹은 [3H]CGS-21680 의 결합은 Jarvis et al.의 설명과 같이 측정했다 (Jarvis, M.F., et al., Pharmacol. Exptl. Ther. 251, 881-893 (1989) 문헌참조). 브래디키닌 수체 5'-GGTGATGTTGCATTTCGGC-3' (SEQ ID NO: 14)를 또다른 동물군에 투여했다. 이 연구결과는 하기의 표 6 및 실시예 20에 나와있다.
실시예 13: 폐기능 측정 (순응도 cDYN 및 내성)
생후 4개윌째, 면역된 동물을 마취시키고 케타민 HCl (35mg/kg) 및 아세프로마진 말레이트 (1.5mg/kg)의 혼합물 1.5ml를 근육주사로 투여하여 완화시켰다. 거조되지 않도록 눈에 연고를 바르고 감겼다. Zavala 및 Rhodes의 방법에 따라 4.0mm 중간 고-저 커프스형 머피1 삽관튜브 (Mallinckrodt, Glen Falls, NY)를 동물에 끼운다. 이 방법은 공지문헌을 참조한다.(Zavala and Rhodes, Proc. Soc. Exp. Biol.Med. 144:509-512 (1973)). 박막벽 라텍스 풍선을 장착한 OD 2.4mm의 폴리에틸렌 카테터 (Becton Dickinson,Clay Admas, Parsippany NJ)를 식도에 삽입하여 실험기간 내내 구강으로부터 동일한 거리(약 16cm)로 유지하였다. 삽관튜브는 고온 플레쉬 공기유속계 (크기 00: DEM Medical, Richmond, VA)에 부착하고 골드 담체 증폭기(모델 11-4113, Gould Electronics, Cleveland, OH)에 의해 구동된 발리다인 차동압 트랜스듀서 (모델 DP-45-16-1927, Validyne Engineering, Northridge, CA)를 이용하여 유속(v)을 측정하였다. 삽관 풍선은 발리다인 차동압 트랜스듀서의 한 측면에 부착했고 다른 측면은 폐전달압(Pψ)을 구하기 위해 삽관튜브의 출구에 부착되었다. 유동흐름은 누적되어 연속의 주기량을 제공하며 전체 폐저항값(Rt) 및 동적순응값 (Cdyn)의 전체 측정값은 등가부피 및 제로유동점에서 구하였다. 유동, 부피 및 압력은 8채널 골드 2000 W 고주파수 기록계에 기록되었고 Cdyn는 전체 부피 및 제로유동점에서의 Pψ차이값을 이용하여 계산했다. Rt은 중간주기의 폐용적에서 Ptp 및 V의 비율로 계산되었다. 이 계산은 Giles et al.이 소개한 바와 같이 Buxco 자동 폐호흡계 분석기 (모델 6, Buxco Electronics, Sharon, CT)에 의해 자동으로 실시되었다. 이에 관한 공지문헌을 참조한다 (Giles et al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 194:213-232 (1971)). 알레르기성 토끼에 대한 올리고 II 투여로 수득된 결과는 하기 표 26에서 검토한 바와 같다.
실시예 14: 기관지 과민성(BHR) 측정
각 알레르기성 토끼에 에어로졸로 히스타민을 투여하여 과민도 기저값을 측정했다. 살린 혹은 히스타민의 에어로졸은 DeVilbiss 약액분무기(DeVilbiss, Somerset, PA)을 이용하여 30초간 및 다시 사용되는 각 약량당 2분동안 발생되었다. 초음파 약액분무기로 에어로졸 액적을 생성하였고 그 중 80%는 5마이크론 직경을 갖는다. 히스타민 에어로졸을 농도증가와 함께 투여하고 (0.156 내지 80mg/ml) 매 약량 투여시에 폐기능을 측정했다. B4R은 기저치로부터 Cdyn50% 감소시키기에 필요한 히스타민 농도(mg/ml)(PC50 Histamine)를 계산함으로써 결정하였다.
실시예 15: 항감지 올리고 I의 심장혈관에 대한 영향
카르디오맥스J를 이용하여 심장출력 및 기타 심장혈관 변수들을 측정할 때 일정량의 냉염수를 정맥주사한 후 심장에서 배출되는 혈액의 온도변화를 관측하는 열희석원리를 활용한다. 냉염수가 우측 경정맥 캐뉼러관 삽입을 통해 우측심방 속으로 고속주입되었고 이에, 주입물과 대동맥 아치내의 혈액 혼합물의 온도변화를 온도감지 소식자에 의해 경동맥 캐뉼러관을 통해 기록하였다. 알레르기성 토끼를 상기 (d)에서 언급한 바와 같이 올리고 I의 에어로졸로 처리하고 24시간 지난후, 80% 케타민 및 20% 크실라진으로 된 0.3ml/kg 혼합액으로 마취시켰다. 이 시점은 공지기술에서와 같이 SEQ ID NO:1에 대한 효능을 입증하는 과거 데이타와 동일하다 (Nyce & Metzger, (1997) 상기 참조). 서모커플을 각 토끼마다 좌측 경동맥에 삽입하여 6.5cm 진행시켜 실크매듭으로 고정했다. 우측 경정맥에 다시 캐뉼러 처리하고 일정길이의 폴리에틸렌관을 삽입했다. 서모커플 프로브의 위치지정의 정확도를 측정하기 위하여 카르디오맥스J II (Columbus Instruments, Ohio) 상에서 멸균염수를 20EC 에서 주사하여 열희석 곡선을 제작했다. 서모커플의 위치 정확도를 설정한 후, 대퇴부 동맥과 정맥을 분리했다. 정맥은 약물주입구로 이용되며 대퇴부 동맥은 혈암과 심박수 측정을 위한 장소이다. 심장혈관의 일정한 기저변수를 설정하면 혈압, 심박수, 심장출력, 말초내성, 심장수축력 등에 대하여 카르디오맥스J 측정을 할 수 있다.
실시예 16: 올리고 I(SEQ ID NO: 1)의 활동기간
50%(PC50 Adenosine)에 의해 순응도가 감소하여 기저값을 형성할 때까지, 8마리의 알레르기성 토끼에게 상기 (f)에서 설명한 바와 같이 1차로 기관튜브를 통해 약액분무기를 이용하여 아데노신의 투약량을 0.156mg/ml로 시작하여 점차 증가시켰다. 2마리에게는 대조부로써 동일량의 염수부형제를 공급했다. 마지막 처리뒤 18시간후에, PC50 Adenosine값을 다시 시험했다. 이 시점부터 매일 모든 동물에 대해 10일간 계속 측정했다. 그 결과는 하기 실시예 25에서 검토하는 바와 같다.
실시예 17: 항감지 올리고 V에 의한 아데노신 A 2b 수체 수의 감소
스프라그 다울리 래트에 대해 2.0mg 호흡형 항감지 올리고 V(SEQ ID NO: 10)을 상술한 흡입챔버를 이용하여 2일간 3회에 걸쳐 투여하였다. 마지막 투여 뒤 24시간이 지나면, 폐실질조직을 해부하고 공지방법(Nyce & Metzger(1997) 상기참조)에 따라 [311]-NECA를 이용하여 아데노신 A2b수체를 분석하였다. 대조실험은 등량의 염수를 투여하여 실행했다. 학부생이 쌍을 이룬 t 실험에서 p<0.05 인 점은 특히중요한 결과이며 다음의 실시예 28 에서 검토한 바와 같다.
실시예 18: 올리고 I & 상응하는 포스포디에스테르 올리고 VI (SEQ ID NO: 11)의 비교.
올리고 I(SEQ ID NO: 1)은 아데노신의 영향을 평가하고 20mg 아데노신/5.0ml (아데노신 용해도 한계치)까지의 아데노신 양에 대하여 이에 대한 민감성을 없앴다. 올리고 VI(SEQ ID NO: 11)은 올리고뉴클레오티드 서열의 포스포디에스테르 부분으로써 동일 방식으로 시험했을 때 전혀 영향이 없었다. 양측 화합물은 동일한 서열을 갖고 올리고 I(SEQ ID NO: 1)에 포스포로티오에이트 잔류물이 존재한 점만 상이하였으며 상술한 바와 같이 에어로졸 형태로 전달되었다. (Nyce & Metzger (1997) 상기참조). 특별히 다른 점은 학부생이 쌍을 이룬 t 시험에서 p<0.001 인 점이다. 이 결과는 하기 실시예 29에서 검토한 바와 같다.
항감지 올리고 I (SEQ ID NO: 1)에 대하여 수득한 결과
실시예 19: 선행 실험의 결과
아데노신 A1수체에 대한 특이성이 있는 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)에 대한 뉴클레오티드 서열 및 기타 데이타는 상기에서 제공되었다. 수체의 수 및 활성을 하향조정함에 있어서 올리고 I의 효용성을 증명하는 실험데이타도 제공하였다. 항감지 올리고 I의 특징 및 활성에 대한 추가의 정보는 공지문헌을 참조한다 (Nyce, J.W. and Metzger, W.J., Nature 385:721 (1997) 참조). Nyce & Metzger (1997)의 문헌은 항감지 올리고 I (SEQ ID NO: 1)에 대하여 다음과 같은 사실을 입증하는 데이타를 제공해주었다.:
(1) 항감지 올리고 I는 하기의 표 6에서 보는 바와 같은 약량 의존 방식으로 알레르기성 토끼의 기관지 연근육 내의 아데노신 A1수체의 수를 감소시킨다.
(2) 항감지 올리고 I는 아데노신-유발 기관지수축 및 알레르기성 기관지수축을 약화시킨다.
(3) 올리고 I는 기관지 과민성을 평가하는 표준방법으로써 PC50히스타민으로 측정했을 때 기관지 과민성을 감소시킨다.
(4) 예상과 같이, 이것은 타겟화를 위해 설계되었으므로 항감지 올리고 I는 아데노신 A1수체에 대해 전제적으로 특이성을 갖고, 또한 밀접하게 관련된 아데노신 A2수체 혹은 관련된 브래디키닌 B2수체 어는 쪽에 대해서도 투약량에 관계없이 전혀 영향을 미치지 않는다.
(5) 올리고 I의 상기 효과와 대조적으로, 부적합 대조분자 MM2 및 MM3(SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13)은 이것과 똑같은 염기조성 및 분자량을 갖고 있으나 각각 6 및 2 부적합물 때문에 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)과 상이하다. 이 부적합물은 최소한이기는 하나 여전히 동일한 염기조성을 유지하면서도 임의의 타겟 수체(A1, A2혹은 B2) 상에서 전혀 영향을 미치지 않았다.
이러한 결과는 올리고 I 같은 항감지 올리고뉴클레오티드의 사용에 관한 공지기술의 부족에 비추어볼 때 예상치 못한 것이다. 본 발명에서는 목적하는 용도에잇어서, 작용제를 이용하는 유효화 방법의 효과를 입증하고 또한 폐기능 혹은 이에 관련된 종료점으로써 예컨대 기도막힘, 기관지수축, 폐렴 및 알레르기 등에 관계하는 유전자 혹은 mRNA를 타겟화 하는 것에 관계한다.
실시예 20: 올리고 I는 아데노신 챌린지에 대한 응답을 크게 감소시킨다
수체 결합실험은 상기 실시예 12에서 설명하는 바와 같고 하기의 표 6에서 나타낸 결과는, A1아데노신 수체 및 B2브래디키닌 수체 항감지 및 부적합 처리된 알레르기성 토끼의 기도 연근육으로부터 분리된 막에 존재하는 아데노신 A-선택성 리간드 [3H]DPCPX 및 브래디키닌 B-선택성 리간드 [3H]NPC 17731의 결합특성을 보여준다.
표 6: 3개의 항감지 올리고의 결합특성
처리1 A1수체 B2수체
Kd BMAX Kd BMAX
아데노신 A1 수체
20mg 0.36±0.029 nM 19±1.52fmoles* 0.39±0.031 nM 14.8±0.99fmoles
2mg 0.38±0.030 nM 32±2.56fmoles* 0.41±0.028 nM 15.5±1.08fmoles
0.2mg 0.37±0.030 nM 49±3.43fmoles 0.34±0.024 nM 15.0±1.06fmoles
A1MM1 (대조부)
20mg 0.34±0.027 nM 52.0±3.64fmoles 0.35±0.024 nM 14.0±1.0fmoles
2mg 0.37±0.033 nM 51.8±3.88fmoles 0.38±0.028 nM 14.6±1.02fmoles
B2A (브래디키닌 수체)
20mg 0.36±0.028 nM 45.0±3.15fmoles 0.38±0.027 nM 8.7±0.62fmoles*
2mg 0.39±0.035 nM 44.3±2.90fmoles 0.34±0.024 nM 11.9±0.76fmoles*
0.2mg 0.40±0.028 nM 47.0±3.76fmoles 0.35±0.028 nM 15.1±1.05fmoles
B2MM (대조부)
20mg 0.39±0.031 nM 42.0±2.92fmoles 0.41±0.029 nM 14.0±0.98fmoles
2mg 0.41±0.035 nM 40.0±3.20fmoles 0.37±0.030 nM 14.8±0.99fmoles
0.2mg 0.37±0.029 nM 43.0±3.14fmoles 0.36±0.025 nM 15.1±1.35moles
염수 대조부 0.37±0.029 46.0±5.21 0.39±0.047 nM 14.2±1.35moles
1은 총 48시간 동안 4개의 균등분할된 약량으로 투여된 총 올리고를 뜻한다.
처리 및 분석은 각 방법에 대해 설명한 바와 같이 실행되었다. 반복식 분산값 분석(ANOVA) 및 Tukey 예방 t 시험법을 통해 중요한 특징을 확인하였다. 모든 실험군에서 n=4-6.
*은 부적합 대조부와 염수처리군에 대비한 차이값, p<0.001;
**은 부적합 대조부와 염수처리군에 대비한 차이값, p<0.05.
실시예 21: 올리고 I의 약량 응답효과
항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)은 하기의 표 7에서 보는 바와 같은 약량범위에 걸쳐 약량의존 방식으로 동물에 대한 아데노신 투여효과를 감소시키는 것으로 발견되었다.
표 7: 항감지 올리고 I에 대한 약량-응답성
총 약랑(mg) PC50 Adenosine(아데노신 mg)
항감지 올리고 I
0.2 8.32"7.2
2.0 14.0"7.2
20 19.5"0.34
A1MM2 올리고 (대조부)
0.2 2.51±0.46
2.0 3.13±0.71
20 3.25±0.34
상기 결과는 스튜던트 페어 t 시험으로 얻은 것이며 통계적으로 상이함이 밝혀졌다, p=0.05
항감지 아데노신 A1수체 올리고로서의 올리고 I(SEQ ID NO: 1)는 아데노신A1수체에 대해서는 특이작용이 있으나 아데노신 A2수체에 대해서는 없다. 이 결과는 상기 실시예 9에서 설명하고 공지문헌에서 언급한 바와 같이 (Nyce & Metzger (1997) 상기참조) 삽관튜브를 통해 약액분무기로 8 내지 12시간 간격으로 5mg씩 총 4회 투여하는 방식에 따라 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1) 혹은 부적합 대조 올리고(SEQ ID NO: 12; A1MM2)를 토끼에 투여하여 처리하는 것을 근거로 한다. 기관지 연근육 조직에 대해 실험하고 아데노신 A 및 아데노신 A 수체의 수를 측정한 결과는 상기 공지문헌에서 보고된 바와 같았다 (Nyce & Metzger (1997) 상기참조).
실시예 22: 올리고 I의 약량 응답효과
올리고 I(SEQ ID NO: 1)은 아데노신 A1수체에 대해 특이성을 갖지만 이의 부적합 대조부는 활성을 전혀 갖지 않았다. 도 1은 상기 실시예 10 및 Nyce & Metzger (1997) (상기 참조)에서 설명한 교차 실험으로부터 수득된 결과를 도시한다. 2개의 부적합 대조부(SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 13)는 PC50 Adenosine값에 영향을 미치지 않는 것으로 입증되었다. 반대로, 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)는 PC50 Adenosine값의 7배 정도가 증가한 것으로 나타났다. 이 결과는 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)이 염수 대조부와 비교할 때 외부투입된 아데노신에 대한 응답을 감소시키는 (민감도를 악화시키는) 것을 명확하게 보여주는 것이다. 상기 표 6의 결과에서 항감지 올리고 I의 효과가 약량의존적임을 알 수 있다 (표 6의 3행 참조). 올리고 I는 또한 아데노신 A1수체에 대해 전체적으로 특이성을 갖는 것으로나타났으며 (표 6의 상부 3행 참조) 또한 근접하게 관련된 아데노신 A2수체나 브래디키닌 B2수체 어디에서도 (표 6의 8-10줄 참조) 활성이 일어나지 않았다. 또한, 표 6에서의 결과는 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)가 약량 의존방식으로 아데노신에 대한 민감성을 감소시키는 것을 보여주며 또한 2개의 부적합 제어부 올리고뉴클레오티드 (A1MM2: SEQ ID NO: 12 및 A1MM3: SEQ ID NO: 13) 중 어느 쪽도 PC50 Adenosine값 혹은 아데노신 A 수체의 약화에 대하여 영향을 미치지 않기 때문에 결국 항감지 올리고 의존방식으로 실행하는 것을 증명하는 것이다.
실시예 23: 공기알레르겐-유발성 기관지수축 및 염증에 대한 효과
올리고 I(SEQ ID NO: 1)는 부적합 올리고와 비교할 때 토끼 모델에서 히스타민 유발 영향을 크게 축소시키는 것으로 나타났다. 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1) 및 부적합 올리고(A1MM2, SEQ ID NO: 12 및 A1MM3, SEQ ID NO: 23)가 알레르기-유발 기도장애 및 기관지 과민성에 미치는 영향을 알레르기성 토끼에 대해서 평가했다. 알레르기-유발 기도장애에 대한 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)의 영향을 평가했다. 도시된 그래프곡선 아래의 면적으로 계산할 때 항감지 올리고 I는 부적합 대조부 (55%, p<0.55; ANOVA 및 Tukey t 실험에서 반복 측정)와 비교할 때 알레르기 유발 기도장애에 대하여 훨씬 큰 저해 효과를 나타냈다. 알레르기 유발 기도장애에 대하여 부적합 올리고 A1MM2(대조부)는 전혀 영향을 미치지 않았다. 알레르기-유발 BHR 에 대한 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)의 영향을 상기와 같이 측정했다. PC50Adenosine값에서 계산할 때, 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)은 부적합 대조부 (61%, p<0.05; ANOVA 및 Tukey t 실험에서 반복 측정)과 비교할 때 알레르기성 토끼에 대하여 알레르기-유발 BHR을 크게 저해하였다. 알레르기-유발 BHR 에 대한 A1MM 부적합 대조부의 영향은 전혀 없는 것으로 나타났다. 이 결과는 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)가 공기알레르겐-유발 기관지수축 (집먼지 진드기)에 대한 예방효과가 있음을 가리킨다. 또한, 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)는 집먼지 진드기-유발 기관지 과민성에 대한 억제능을 갖는 저해제로도 공지되었으며, 이는 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)를 위한 항-염증활성을 나타내는 히스타민 민감도에 대한 영향으로 입증되었다.
실시예 24: 저 A 1 함량 항감지 올리고 I는 유해한 부작용이 없다.
올리고 I (SEQ ID NO: 1)은 수용자에 대해 독성을 일으킬 수도 있는 부작용을 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 2.0 내지 20 mg 올리고 I(SEQ ID NO:1) 투여에 따른 동맥혈압, 심장출력, 맥박크기, 심박수, 총 말단내성 혹은 심장수축성(dPdT) 등에 있어서 아무런 변화도 관측되지 않았다. 또한, 심장출력(CO), 맥박크기(SV), 평균 동맥혈압(MAP), 심박수(HR), 총 말단내성치(TPR) 및 수축력(dPdT) 등을 카르보이오맥스J 장치 (컬럼버스 인스트루먼트사, 오하이오)를 이용하여 측정한 결과는 심각한 심장혈관 변수 상에서 뚜렷한 영향은 나타내지 않았다. 더 구체적으로, 이 올리고는 저혈압을 일으키지 않는다. 이 발견은 특히 다른 포스포로티오에이트 항감지 올리고뉴클레오티드가 과거에는 일부 모델계에서 저혈압증을 유발하기도 한다는 사실 때문에 특히 중요하다. 또한, 아데노신 A1수체는 심잔내 동방전달에서 중요한 역할을 한다. 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)에 의한 아데노신 A1수체의 약화는 수체의 하향조정에 응답하여 해로운 과잉폐활동을 가져올 것으로 예상된다. 이것은 그러한 경우가 아니다. 항감지 올리고 (SEQ ID NO:1)은 해로운 폐내 영향을 일으키지 않고 예상외 혹은 바람직하지 않은 부작용이 없는 저약량의 본 발명의 항감지 올리고를 투여할 수 있게 해준다. 이것은 올리고 I(SEQ ID NO: 1)을 직접 폐에 투여할 때 심장에 과다하게 도달하지 않아 해로운 영향을 일으키지 않는다. 이것은 폐를 빠져나와 유해한 영향을 미치고 심지어 생명에 위협을 줄 수 있는 테오필린 같은 종래의 아데노신 수체 길항제와 크게 다른 점이다.
실시예 25: 올리고 I의 장기 잔류효과
올리고 I (SEQ ID NO: 1)는 아데노신 챌린지 전에 투여하여 수득되는 PC50값 및 저항값으로 확인되는 바와 같이 장기 잔류효과를 갖는다. 효과의 지속성은 상술한 바와 같이 삽관튜브를 통해 약액분무기로 각각 5mg씩 4회 투여했을 때 아데노신 항감지 올리고 I의 PC50값에 대하여 측정되었다. 작용제의 효과는 투여후 1 내지 8일까지가 크다. 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)의 효과가 사라지면 동물에게 염수 에어로졸(대조부)를 투여하고 및 PC50 Adenosine값을 다시 측정했다. 염수처리된 동물에게서는 PC50기저값(n=6)을 확인했다. 효과의 지속기간(저항값에 관련한)은 상술한 바와 같이 20mg의 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)를 투여했던 알레르기성 토끼 6마리에 대해 역시 상술한 바와 같이 측정된 기도저항값에 관련하여 결정되었다. 효과 지속기간 평균치는 PC50아데노신(p<0.05) 및 저항값(p<0.05)에 대해 8.3일이었다. 이 결과 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)이 매우 긴 활동지속기간을 갖는다는 사실을 안 것은 예상치 못한 일이다.
실시예 26: 항감지 올리고 I 보다 우수한 탈아데노신 항감지 올리고 II
아데노신 A1수체 mRNA의 다른 부위에 타겟화 된 항감지 올리고 II는 아데노신 A1-조절 효과에 대해 큰 활성을 갖는 것으로 나타났다. 실험을 통해 20mg 항감지 올리고 II 혹은 염수(대조부)를 상술한 바와 같이 2개로 나눈 알레르기성 토끼군에게 투여했을 때 순응도 및 저항값에 관련하여 항감지 올리고 II(SEQ ID NO: 7) 투여의 효과를 측정했다. 순응도 및 저항값은 실시예 13에서 설명된 바와 같이 아데노신 혹은 염수의 투여 뒤에 측정했다. 본 발명의 항감지 올리고의 효과는 통계방식에 따를때 대조부와 상이했고, 쌍으로된 t 실험시 순응도에 대해 p<0.05; 저항값에 대해 p<0.01 로 나타났다.
이 결과는 아데노신 A1수체를 타겟으로 하고 아데노신을 함유하지 않은 항감지 올리고 II(SEQ ID NO: 7)이 아데노신 챌린지에서 순응도를 유지 및 저항값을 효과적으로 감소시키는 것을 보여주었다. 실제로 탈아데노신 항감지 올리고 II는 저아데노신 함량의 항감지 올리고 I(SEQ ID NO: 1)보다 더욱 효능이 우수하다. 아데노신을 전혀 함유하지 않으므로, 분해시 아데노신의 유리가 없으며 따라서 아데노신 수체의 활성화에 기여하지 않게 된다.
실시예 27: 항감지 올리고 III 및 IV
올리고 III(SEQ ID NO: 8) 및 IV(SEQ ID NO: 9)는 실제로 상술한 바와 같이 알레르기성 토끼에게 20mg의 항감지 올리고 III(SEQ ID NO: 8) 및 IV(SEQ ID NO: 9)를 각각 투여할 때 일어나는 염증 감소 및 염증세포수 감소에 대한 이들의 영향 때문에 아데노신 A3수체를 특별히 타겟화 하는 것으로 나타났다. 염증세포수는 3시간 후의 기관지 세척액 내에서 매회 세척시 적어도 100개의 생존세포를 계수항 측정했다. 항감지 올리고 III(SEQ ID NO: 8) 및 IV(SEQ ID NO: 9)의 영향을 집먼지 진드기 알레르겐에 대한 노출뒤 과립구 및 기관지 세척액 내 전체 세포를 대상으로 평가했다. 이결과, 항감지 올리고 IV(SEQ ID NO: 9) 및 III(SEQ ID NO: 8)은 모두 집먼지 진드기 알레르겐에 대한 노출후 천식증이 있는 폐에서 매우 우수한 항염증 작용제임을 확인했다. 공지된 바와 같이, 과립구 특히 호산구는 천식의 1차염증세포이며 항감지 올리고 III(SEQ ID NO: 8) 및 IV(SEQ ID NO: 9)의 투여로 각각 그 숫자가 40% 과 66% 만큼 감소한다. 이것은 또한 본 발명의 항아데노신 A3작용제의 항염증 활성을 가리키는 중요한 표시체이다. 염증은 천식에서 기관지 과민성 및 알레르기-유발 기관지수축 증세의 근거가 된다. 항감지 올리고뉴클레오티드 III(SEQ ID NO: 8) 및 IV(SEQ ID NO: 9)는 모두 아데노신 A3수체에 대해 타겟화 되며 폐의 각종 수체류를 특별히 타겟화 하도록 설계되는 중요한 대표적인 항염증 작용제 종류이다.
실시예 28: 항감지 올리고 V
항감지 올리고 V(SEQ ID NO: 10) 아데노신 A2b아데노신 수체 mRNA에 타겟화 되는 것으로 아데노신 A2b-조절 효과를 계수하고 A2b수체의 수를 절반 이하로 감소시킬 때 아주 효과적으로 나타났다.
실시예 29: 포스포디에스테르-잔류 올리고 I-DS(SEQ ID NO: 11)에 대한 예상밖의 고치환효과
올리고 I(SEQ ID NO: 1) 및 I-DS(SEQ ID NO: 11)는 상술한 바와 같은 알레르기성 토끼에 각각 투여했고 이 토끼는 그후 아데노신으로 챌린지 했다. 포스포디에스테르 올리고 I-DAS(SEQ ID NO: 11)는 통계적으로 아데노신의 효과를 계수하는데 에는 큰 효과가 없었으나 반면 올리고 I(SEQ ID NO: 1)은 PC50 Adenosine20mg 정도의 우수한 효율성을 나타냈다.
실시예 30: 아데노신 함유 모노뉴클레오티드는 아데노신 수체 활성을 갖는다.
이 실시예는 항감지 올리고뉴클레오티드 즉 리보뉴클레오시드 모노포스페이트 즉 dAMP의 체내 분해생성물이 아데노신 수체 역할을 하는 것을 보여준다. 아데노신 및 아데노신 모노포스페이트(dAMP)을 각각 별도로 다른 약량으로써 최고 10mg/ml까지 투여했을 때 양측 화합물은 도 1에서 보는 바와 같이 순응율%의 감소와 유사한 효과를 갖는다. 양측 경우의 효과는 약량과 함께 증가하며 반면 염수 대조부는 거의 영향이 없었다. 이 결과에서 아데노신 뉴클레오시드와 아데노신 자체는 아데노신 수체와 상호반응함을 알 수 있다.
실시예 31: 아데노신 함유 핵산의 분해시 아데노신수체 활성이 생성된다.
또다른 추가 실험으로써, 임의 포스포로티오에이트 항감지 올리고뉴클레오티드를 토끼에게 투여하여 이들이 체내 분해 및 아데노신 수체와 상호반응할 수 있는 아데노신 뉴클레오시드를 방출했는지를 측정했다. 천식증 토끼에게 염수(대조부), 아데노신 함유 임의물질(?) 및 탈아데노신 임의물질(C)을 각각 투여했다. 임의물질은 구아닌, 시토신 및 티미딘의 임의 서열로된 탈아데노신 임의물질과 또한 구아닌, 시토신 및 아데노신으로 된 아데노신 함유 임의물질이었다. 도 2에 나타낸 결과에서 아데노신 함유 올리고뉴클레오티드가 아데노신 및/또는 아데노신 뉴클레오시드를 분해과정에서 방출하는 것을 알 수 있으며 또한 아데노신 화합물이 아데노신 수체와 반응하는 반면 탈아데노신 올리고뉴클레오티드는 반응하지 않는 것으로 확인되었다. 항감지 올리고뉴클레오티드의 분해생성물인 이러한 아데노신 뉴클레오시드 방출은 타겟 유효화에 관련한 항감지 녹아웃(knock out)시험의 영향을 평가할 때 실험결과에 혼란을 주게된다. 이 실험은 탈아데노신 항감지 (무A 혹은 저A 함량의) 올리고뉴클레오티드가 타겟 유효화 연구에 필요함을 보여준다.
상술한 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며 이를 한정하기 위한 것은 아니다. 본 발명은 첨부된 특허청구범위 및 이의 등가물에 의하여 한정된다.
본 발명에 의하여, 타겟 유전자 즉 저아데노신(저A) 혹은 무아데노신(탈A) 함량의 항감지 올리고 뉴클레오타이드를 이용함으로써 CNS 드의 유전자를 유효화할 수 있다.

Claims (41)

  1. 질병이나 그 상태의 기능과 이러한 질병이나 그 상태에 관련되는 것으로 추정되는 타겟 폴리펩티드를 코드화 할 유전자나 mRNA 간의 상호관계의 존재를 결정하는 방법으로서,
    최고 약 15% 아데노신(A)의 함량을 갖고 타겟 유전자 및 이의 상응하는 mRNA, 3' 및 5' 인트론-엑손 경계부와 또한 코드화 및 비코드화 영역 사이의 근접부위로 구성된 군에서 선택되는 게놈성 및 mRNA 측생부위, 또한 사전선택된 질병이나 그의 상태에 관계하는 폴리펩티드를 코드화 할 모든 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 한 타겟에 대하여 항감지성인 올리고뉴클레오티드 (올리고)를 수득하고;
    상기 올리고 중에서 타겟 mRNA에 대해 체외 교배시 mRNA에 의하여 폴리펩티드의 발현을 크게 저해 혹은 제거하는 올리고를 선택하고;
    타겟 mRNA에 대해 체내 교배에 효과적인 양의 선택된 올리고를 대상체에 투여하고; 및
    올리고 투여 전후 질병이나 그 상태에 관련된 대상체의 기능을 평가하는 단계로 구성되고; 한편 기능의 수치가 70% 이상이면 상호관계성이 양성이고, 40 내지 70% 이면 잠재적으로 양성이며, 또한 30% 이하이면 상호관계성이 음성인 것으로 표시되는 것을 특징으로 하는 상호관계 결정방법.
  2. 제1항에 있어서,
    항감지 올리고는, G 및 C로 구성된 군에서 선택되는 적어도 4개의 연속형 핵산을 함유한 타겟 분할편을 선택하고; 선택된 분할편을 포함하고 최고 약 15%까지의 C 및 G 함량을 갖는 1차 올리고뉴클레오티드 4 내지 60 뉴클레오티드 길이를 수득함으로써 구성되고 또한 원하는 형태 및/또는 활성크기를 갖는 것임을 특징으로 하는 결정방법.
  3. 제1항에 있어서,
    항감지 분할편이 적어도 하나의 A를 함유할 때 적어도 하나의 A를 티미딘(T)에 결합하는 한편 약 0.3 이하의 A의 아데노신 A1, A2a, A2b및 A3수체 길항근 혹은 길항제 활성도를 갖는 헤테로방향족 염기로 구성된 군에서 선택된 또다른 염기(B)로 치환하는 단계을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  4. 제3항에 있어서,
    헤테로방향족 염기는, O, 할로, NH2, SH, SO, SO2, SO3, COOH, 측쇄 및 융해된 1차 및 2차 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 알케녹시, 아실, 시클로아실, 아릴아실, 알키녹시, 시클로알콕시, 아로일, 아릴티오, 아릴설폭실, 할로시클로알킬, 알킬시클로알킬, 알케닐시클로알킬, 알키닐시클로알킬, 할로아릴, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 아릴시클로알킬에 의해 치환가능하고, 또한 O,할로, NH2, 1차, 2차 및 3차 아민, SH, SO, SO2, SO3, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬 및 헤테로아릴에 의해 더 치환될 수 있는 피리미딘 및 퓨린으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  5. 제4항에 있어서,
    피리미딘 및 퓨린은 제1, 2, 3, 4, 7 및 8 위치에서 치환되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  6. 제4항에 있어서,
    피리미딘 및 퓨린은 다음의 화학식으로 표현되는 테오필린, 카페인, 다이필린, 에토필린, 아세필린 피페라진, 바미필린, 엔프로필린 및 크산틴 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
    여기서 R1및 R2은 독립적으로 H, 알킬, 알케닐 혹은 알키닐이며 R3은 H, 아릴, 디시클로알킬, 디시클로알케닐, 디시클로알키닐, 시클로알케닐, 시클로알키닐, O-시클로알킬, O-시클로알케닐, O-시클로알키닐, NH2-알킬아미노-케톡시알킬옥시-아릴 및 모노 및 디알킬아미노알킬-N-알킬아미노-SO2아릴이다.
  7. 제1항에 있어서,
    항감지 올리고는 0 내지 12%의 아데노신 함량을 갖는 것임을 특징으로 하는 결정방법.
  8. 제7항에 있어서,
    올리고는 최고 약 5% A로 구성된 것을 특징으로 하는 결정방법.
  9. 제8항에 있어서,
    올리고는 A가 무함유된 것임을 특징으로 하는 결정방법.
  10. 제1항에 있어서,
    1개의 A는 티미딘 염기에 결합되는 한편 아데노신 A1, A2a, A2b및 A3수체에서 0.5 이하의 아데노신 염기 길항근 혹은 길항제 활성을 갖는 헤테로방향족 염기로 구성된 군에서 선택된 또다른 염기에 의해 치환됨을 특징으로 하는 결정방법.
  11. 제10항에 있어서,
    A는 모두, 티미딘 염기에 결합되는 한편 아데노신 A1, A2a, A2b및 A3수체에서 0.3 이하의 아데노신 염기 길항근 혹은 길항제 활성을 갖는 헤테로방향족 염기로 구성된 군에서 선택된 또다른 염기에 의해 치환됨을 특징으로 하는 결정방법.
  12. 제6항에 있어서,
    범용 염기가 3-니트로피롤-2'-데옥시뉴클레오시드, 5-니트로-인돌, 2-데옥시리보실-(5-니트로인돌), 2-데옥시리보푸라노실-(5-니트로인돌), 2-데옥시이노신, 2'-데옥시네벌아린, 6H,8H-3,4-디히드로피리미도 [4,5-c] 옥사진-7-온 혹은 2-아미노-6-메톡시아미노퓨린으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  13. 제1항에 있어서,
    메틸화 사이토신(mC)은 올리고에 존재할 경우 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드에서 C를 대신하여 치환되는 것임을 특징으로 하는 결정방법.
  14. 제1항에 있어서,
    항감지 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔류물은 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보라노포스페이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 티오에테르, 카르보네이트, 카르바메이트, 설페이트, 설포네이트, 설파메이트, 설폰아미드, 설폰, 설파이트, 설폭시드, 설파이드, 히드록실아민, 2'-메틸렌(메틸이미노), (MMI), 2'-메톡시메틸(MOM),2'-메톡시에틸(MOE), 2'-메틸렌옥시(메틸이미노)(MOMA), 2'-메톡시메틸(MOM), 2'-O-메틸, 포스포라미데이트 및 C-5 치환 잔류물로 구성된 군에서 선택된 잔류물인 것을 특징으로 하는 결정방법.
  15. 제14항에 있어서,
    모든 뉴클레오티드 연쇄 잔류물은 치환되는 것임을 특징으로 하는 결정방법.
  16. 제1항에 있어서,
    항감지 올리고는 약 7 내지 60개의 모노뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  17. 제1항에 있어서,
    항감지 올리고는 세포 합체 혹은 흡수제와 세포 타겟화 작용제로 구성된 군에서 선택된 작용제에 연쇄되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  18. 제17항에 있어서,
    세포 합체 혹은 흡수제는 트린스페린, 아시알로글리코프로테인 및 스트렙타비딘으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  19. 제18항에 있어서,
    핵산은 벡터에 연쇄되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  20. 제19항에 있어서,
    벡터는 원핵벡터 혹은 진핵벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  21. 제1항에 있어서,
    항감지 올리고는 폐, 뇌, 심장, 신장, 종양, 혈액, 피부, 눈, 두피, 비강, 혀, 자궁경부, 구강, 인두, 식도, 소장이나 대장, 난소, 이도 혹은 체외적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  22. 제1항에 있어서,
    질병이나 그 상태는 폐, 뇌, 심장, 신장, 종양, 혈액, 면역계, 피부, 눈, 두피, 비강, 혀, 자궁경부, 구강, 인두, 식도, 소장이나 대장, 활막조직, 근육조직, 난소 및 이도에 관련된 질병이나 그 상태임을 특징으로 하는 결정방법.
  23. 제22항에 있어서,
    질병이나 그 상태는 폐 관련 질병이나 그 상태임을 특징으로 하는 결정방법.
  24. 제22항에 있어서,
    질병이나 그 상태는 기관지수축, 폐렴 및/또는 알레르기에 관련된 것임을 특징으로 하는 결정방법.
  25. 제22항에 있어서,
    질병이나 그 상태는 뇌 혹은 뇌의 활동에 관련된 질병이나 그 상태임을 특징으로 하는 결정방법.
  26. 제22항에 있어서,
    질병이나 그 상태는 면역 장애에 관련되는 것임을 특징으로 하는 결정방법.
  27. 제26항에 있어서,
    타겟이 면역글로부린, 항체수체, 사이토킨, 사이토킨 수체, 유전자 및 리를 코딩하는 상응하는 mRNA, 유전자 및 mRNA 측생부, 인트론 및 엑손 경계부로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 결정방법.
  28. 제22항에 있어서,
    질병이나 그 상태는 심장혈관계 관련 질병이나 그 상태임을 특징으로 하는 결정방법.
  29. 제22항에 있어서,
    질병이나 그 상태는 위장계에 관련된 질병이나 그 상태임을 특징으로 하는결정방법.
  30. 제22항에 있어서,
    질병이나 그 상태는 악성물질 혹은 암에 관련된 것임을 특징으로 하는 결정방법.
  31. 제30항에 있어서,
    타겟은 면역글로부린 및 항체수체, 유전자 및 이를 코드화하는 mRNA, 온코겐 유전자 및 이에 관련된 mRNA, 또한 게놈성 및 mRNA 측생부와 엑손 및 인트론 경계부로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  32. 제1항에 있어서,
    조성물이 체외, 경구, 혈관내, 비강내, 직장내, 질내, 자궁내, 두개골내, 폐, 신장내, 결절내, 관절내, 귀내, 임파선내, 피부내, 구강내, 정맥내, 피하내, 근육내, 종양내, 한샘내, 안구내, 뇌내, 기관내, 맥관내, 포자내 주사로 투여하거나, 이식 혹은 흡입법, 피부내, 폐내, 귀내, 피부, 심장내, 저속방출식, 제한 방출 및 펌프 이용방법에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  33. 제1항에 있어서,
    타겟은 전사인자, 자극 및 활성화 인자, 사이토킨 및 그의 수체, 인터루킨,인터루킨 수체, 케모카인, 케모카인 수체, 내인성 특이 및 비특이적 효소, 면역글로부린, 항체수체, 중추신경계(CNS) 및 말초신경계와 무신경계 수체, CNS 및 말초신경계와 무신경계 펩티드 전달체, 흡착분자, 디펜사인, 성장인자, 혈관활성 펩티드, 펩티드 수체 및 결합단백질로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드 코드화 유전자 및 mRNA와 또한 온코겐에 상응하는 유전자 및 mRNA 로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  34. 제1항에 있어서,
    항감지 올리고는, 폐의 기도에 생긴 질병 및/또는 그 상태에 연관된 폴리펩티드, 이를 코드화하는 유전자 및 RNA, 게놈성 mRNA 측생부와 유전자, mRNA 인트론 및 엑손 경계부로 구성된 군에서 타겟을 선택하고;
    타겟 유전자와 타겟 유전자 폴리펩티드를 코드화하는 mRNA, 게놈성 및 mRNA 측생부와 유전자 mRNA 인트론 및 엑손 경계부로 구성된 군에서 선택된 mRNA의 서열을 수득하고; mRNA의 적어도 하나의 시그먼트를 선별하고;
    선별된 mRNA 시그먼트에 대하여 항감지성인 하나 이상의 올리고를 합성하고; 및 필요시 올리고에 존재는 A의 함량을 뉴클레오티드의 최고 15% 까지 감소시키기 위해 하나 이상의 A를 또다른 염기로 치환하는 단계에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  35. 제1항에 있어서,
    타겟 유전자는 전사인자, 자극 및 활성화 인자, 사이토킨 및 그의 수체, 인터루킨, 인터루킨 수체, 케모카인, 케모카인 수체, 내인성 특이 및 비특이적 효소, 면역글로부린, 항체수체, 중추신경계(CNS) 및 말초신경계와 무신경계 수체, CNS 및 말초신경계와 무신경계 펩티드 전달체, 흡착분자, 디펜사인, 성장인자, 혈관활성 펩티드, 펩티드 수체 및 결합단백질로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드 코드화 유전자 및 mRNA와 또한 온코겐에 상응하는 타겟유전자 및 mRNA, 이들의 측생부와 또한 인트론 및 엑손 경계부로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  36. 제35항에 있어서,
    코드화된 폴리펩티드는 NfkB 전사인자, 인터루킨-8 수체(IL-8R), 인터루킨 5 수체(IL-5R), 인터루킨 4 수체(IL-4R), 인터루킨 3 수체(IL-3R), 인터루킨1β(IL-1β), 인터루킨-1β수체 (IL-1βR), 이오택신, 트립타제, 기초단백질, β2-아드레날린 수체 키나제, 엔도텔린 수체A, 엔도텔린 수체B, 프로프로엔도텔린, 브래디키닌 B2 수체, IgE 고친화성 수체, 인터루킨1 (IL-1), 인터루킨 1 수체(IL-1R), 인터루킨9(IL-9), 인터루킨-9 수체(IL-9R), 인터루킨 11(IL-11), 인터루킨-11 수체(IL-11R), 유발성 질산산화물 합성효소, 시클로옥시제나제(COX), 세포간 흡착분자 1(CAM-1) 맥관세포 흡착분자(VCAM), 란테스, 내피 백혈구 흡착분자(ELAM-1), 단세포 활성인자, 뉴트로필 화학인자, 뉴트로필 엘라스타제, 디펜사인 1,2 및 3, 무스카린 아세틸콜린 수체, 혈소판 활성인자, 종양괴사인자α, 5-리폭시나제, 포스포디에스테라제 IV, P물질, P물질 수체, 히스타민 수체, 키마제, CCR-1 CC 케모카인 수체, CCR-2 CC 케모카인 수체, CCR-3 CC 케모카인 수체, CCR-4 CC 케모카인 수체, CCR-5 CC 케모카인 수체, 프로스타노이드 수체, GATA-3 전사인자, 뉴트로필 흡착수체, MAP 키나제, 인터루킨-9(IL-9), NFAT 전사인자, STAT 4, MIP-1α, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 시클로필린, 포스포리파제 A2, 염기성 섬유종 성장인자, 메탈로프로테나제, CSBP/p38 MAP 키나제, 트립토제 수체, PDG2, 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-1β (IL-1β), 시클로스포린 A-결합 단백질, FK5-결합 단백질, α4β1 셀렉틴, 피브로넥틴, α4β7 셀렉틴, Mad CAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), PECAM-1, LFA-1 셀렉틴, C3bi, PSGL-1, E-셀렉틴, P-셀렉틴, CD-34, L-셀렉틴, p150,95, Mac-1(CD11b/CD18), 푸코실 전달효소, VLA-4, CD-18/CD11a, CD11b/CD18, ICAM2 및 ICAM3, C5a, CCR3(이오택신 수체), CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, LTB-4, AP-1 전사인자, 단백질 키나제C, 시스테이닐 루코트리엔 수체, 타키치넨 수체(tach R), IkB 키나제 1&2, STAT6, c-mas 및 NF-인터루킨-6(NF-IL-6) 및 그의 측생부와 인트론 및 엑손 경계부로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  37. 제1항에 있어서,
    타겟 유전자는 G-단백질 혹은 G-단백질 결합 수체를 코드화하는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  38. 제1항에 있어서,
    타겟 유전자는 칼슘 채널 단백질이나 수체, 나트륨 채널 단백질이나 수체, 칼륨 채널 단백질이나 수체 또는 염화물 채널 단백질이나 수체를 코드화하는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  39. 제1항에 있어서,
    타겟 유전자는 신경전달물질 수체 혹은 신경호르몬 수체를 코드화하는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  40. 제1항에 있어서,
    타겟 유전자는 뉴로펩티드 혹은 뉴로펩티드 수체를 코드화하는 것을 특징으로 하는 결정방법.
  41. 제1항에 있어서,
    제1 타겟에 관련되는 것으로 추정되는 기능을 가진 추가의 타겟에 대하여 항감지성인 또다른 올리고를 별도로 투여하기 위해 모든 단계을 다시 반복하고; 제1 및 상기 추가의 타겟에 대해 타겟화된 공동 투여 올리고에 대하여 투여 및 평가 단계을 반복하며; 또한 각 타겟에 대해 각각 수득한 결과를 서로 비교하는 단계을 더 포함하고; 한편, 복합적인 올리고의 효과가 각각의 올리고 보다 20% 이상 클 경우 제1 및 또다른 올리고 간의 양성관계이 성립되고 반면에 그 결과가 20% 정도인 경우 상기 올리고 간에 아무런 관계도 성립하지 않으며, 또한 20% 미만인 경우 상기올리고 간에 음성관계이 성립하는 것임을 특징으로 하는 결정방법.
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