CN103602729A - 水稻紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2在提高水稻抗光抑制能力中的应用 - Google Patents

水稻紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2在提高水稻抗光抑制能力中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2在水稻抗光抑制中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明通过T-DNA插入突变体的方法，研究了水稻紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2功能丧失后突变体的表型，验证了该基因在水稻中的生理功能，证明了在水稻中紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2能控制NPQ、qP、叶绿素含量等表型，对水稻的光保护发挥了重要作用。

Description

水稻紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2在提高水稻抗光抑制能力中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及水稻紫黄素脱环氧化酶(Violaxanthin de-epoxidase,VDE)基因OsVDE2的应用，具体涉及水稻紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2在提高水稻抗光抑制能力中的应用。
背景技术
光是植物光合作用所必需的，然而，当植物吸收的光能超过其所需时，过剩的光能会导致光抑制现象，从而明显降低光合效率。研究表明，当照射在叶片的光量子流量密度达到最大阳光辐射强度的1/4时，叶片光合速率A即已趋于饱和。不能用于光化学反应，也不能以荧光及热的形式耗散，激发能将转移到氧分子，产生对光合机构具高度破坏性的活性氧自由基。热耗散是以反馈去激发机制介导进行的，可以通过测量叶绿素荧光非光化淬灭(Non-photochemical quenching,NPQ)参数来衡量。非光化淬灭调节着光系统II的能量转换，保护植物免受或减轻光抑制。非光化淬灭由高光强诱导产生，随着关闭高光强而弛豫。根据其弛豫动力学特性，非光化淬灭可以分为至少3个组分：依赖能量的淬灭qE、状态转换淬灭qT及光抑制淬灭qI，其中qE是高等植物中的最主要组分。对模式植物拟南芥的研究表明，类囊体跨膜pH梯度、叶黄素循环中合成积累的玉米黄素、光系统ⅡPsbS蛋白及其表达量是控制非光化淬灭产生以及决定qE及整个NPQ容量大小的重要因子。现阶段认为qE的作用模式如下：当光合作用中光反应产生的化学能超过了同化反应如CO2固定的能力时，叶绿体类囊体腔内酸性逐渐增强。pH值不断下降激活了紫黄素脱环氧化酶，在强光下该酶促进紫黄素转变为玉米黄素。玉米黄素具双重功能，它一方面参与了非光化淬灭的形成，另外还具有直接的抗氧化剂功能。叶绿体类囊体腔pH值下降还促进了光系统ⅡPsbS蛋白的质子化，接着导致与叶绿素及类胡萝卜素结合的捕光蛋白复合体构象的改变。过剩激发能的耗散是通过类胡萝卜素自由基阳离子电荷传递机制以及叶绿素与类胡萝卜素之间的能量传递进行的。
水稻通常在高自然光强条件下生长，晴朗的中午光合光量子流量密度(PPFD)一般在2,000μmol m-2s-1以上，其光合作用在远低于最大光强时就已经饱和。qE在水稻大部分叶片中均会被强烈诱导，以安全耗散过剩激发能、避免或减轻光抑制，这对于水稻可持续健康生长非常重要。目前在水稻中仅克隆了控制qE值的基因OsPsbS1，该基因表达量与植株NPQ值呈显著正相关。
本发明证明了在水稻中紫黄素脱环氧化酶OsVDE2基因控制NPQ、叶绿素含量等表型，对水稻的光保护发挥了重要作用。
发明内容
本发明通过T-DNA插入突变体的方法，研究了水稻紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2功能丧失后突变体的表型，验证了该基因在水稻中的生理功能。该基因在NCBI注释号为NP_001052592，蛋白注释为hypotheticalprotein，CDS注释为Similar to Violaxanthin de-epoxidase precursor。
具体来说，本发明利用水稻功能基因组研究的一种有效途径，即T-DNA插入导致基因突变，不能正常转录及表达相应的蛋白，突变体表现为NPQ值显著下降、植株叶片黄化等现象。
附图说明
图1是利用双引物法鉴定OsVDE2基因部分突变体的基因型。
图2是OsVDE2基因在各家系突变体植株中的表达量分析。
图3是生长期突变体植株M2-2与野生型Dongjin的照片。
图4是生长期突变体植株M2-2与野生型Dongjin的叶片照片。
具体实施方式
1.突变体基因型分析
抽提突变体植株的小样DNA，实施方法如下：
取约2cm长的水稻叶片置于1.5ml（或2ml）离心管中；在研钵中加入800μl 1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min中颠倒混匀一次；加入800μl氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒混匀，持续10min；10000rpm离心，10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰镇的95%乙醇，-20℃冰镇20min；12000rpm离心，15min；弃上清，加入500μl 75%乙醇，12000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μl ddH2O溶解。
对每一株突变体进行鉴定，采用双引物法扩增目标片段。PCR扩增所用到的三条引物分别为：
LP:ACATATGGAAAAATCGGGGG
RP：AACAATGGCATGTGGTGTTG
2715-LB：CTCTAGAGTCGAGAATTCAGTACA
其中扩增基因组条带所用到的引物组合为LP+RP，可以扩增出大约1Kb左右的条带；扩增载体带所用到的引物组合为RP+LB，可以扩增出大约500bp左右的条带。
PCR标准程序参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社介绍的方法。
PCR采用20μl的反应体系，包含：20-50ng DNA模板,10mM Tris-HCl,50mM KCl,0.1%Triton X-100,1.8mM MgCl2,0.1mM dNTP,0.2μM引物和1U Taq DNA polymerase。PCR扩增的条件为：94℃预变性4min；94℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 1min，34个循环；72℃延伸10min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，25min后在凝胶成像分析仪上分析条带的大小。
利用双引物法鉴定OsVDE2基因部分突变体的基因型，结果见图1，从图中可以看出，M2-2和M2-10为纯合阳性植株，M2-3、M2-5、M2-7、M2-8、M2-9为杂合基因型植株，M2-4和M2-6为纯合阴性植株，即野生型植株。
2.表达量分析
对突变体植株进行OsVDE2基因的表达量检测，首先要抽提突变体材料抽穗期剑叶中总RNA，再将RNA反转录成cDNA，最后进行表达量检测。所用到的仪器为ABI公司生产的7500实时荧光定量PCR仪，所采用的方法如下：
准备cDNA，并用内参基因Ubiquitin对cDNA进行常规RT-PCR扩增，确保cDNA浓度和质量基本一致；用到的引物为：
RT-F1：AACTTTGTACAACTGTTCCA
RT-R1：ATTGCCATAAAGTACCGAAG。
反应体系，cDNA 2μl和ddH2O 4μl组成一个mix1进行分装，RT-F1和RT-R1各0.5μl，ddH2O5μl组成mix2进行分装；SYBR Green I（2×）和ROXReference Dye II组成mix3进行分装。
运行程序，预变性95℃ 10s，扩增反应95℃ 5s，60℃34s，40～45cycles，溶解曲线（第一次做检测必须做溶解曲线，要求溶解曲线为单峰）95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。最后生成文件，以CT值进行表达量的计算。
OsVDE2基因在各家系突变体植株中的表达量分析结果见图2，从图中可以看出，纯合阳性植株，如M2-2、M2-10、M2-11、M2-12等纯合阳性植株的表达量明显低于其他植株，而M2-3、M2-5等杂合植株的表达量低于野生型植株的正常水平。
3.叶绿素荧光参数的测定
NPQ等荧光相关值的测定是采用德国Walz公司生产的PAM-2500叶绿素荧光仪，测量方法如下：
在实验室配制0.01%的Triton X-100或0.1%的琼脂糖溶液作为叶片存放缓冲液，该浓度的缓冲液可以使叶片尽量保持远驰状态而不受胁迫；田间取样，取剑叶10-20cm放于缓冲液中，立即放入黑色塑料袋中以保持避光状态；将样品放于暗室内避光保存，暗处理2h以上；避光过程中用2030-B叶夹夹住叶片中部，用PAM-2500进行测量。
该突变体各个家系植株的NPQ值见表1，Y(II)为PSII的最大量子产量，在未受到胁迫的高等植物中的产量值在0.8～0.83之间；NPQ为非光化学淬灭。
表1突变体各个家系植株的NPQ值
名称 Y(II) NPQ
M2-1 0.810 1.0125
M2-2 0.810 0.0564
M2-3 0.816 0.5006
M2-4 0.803 0.9652
M2-5 0.815 0.5514
M2-6 0.806 1.0008
M2-7 0.801 0.5388
M2-8 0.800 0.5257
M2-9 0.806 0.5596
M2-10 0.809 0.0692
M2-11 0.810 0.0317
M2-12 0.811 0.0696
M2-13 0.815 1.1326
M2-14 0.803 0.0799
M2-15 0.812 0.0513
4.叶绿素含量测定
田间取样，回室称量0.02g叶片，放于2ml离心管内，用抽提液进行抽提（抽提液为丙酮：乙醇：水=4.5:4.5:1），抽提时间为2-3天，待叶片完全漂白之后用分光光度计DU640测量波长663nm和645nm下的吸光度。最后计算叶绿素值所用到的公式为：
叶绿素a=(12.72A663-2.59A645)×v/w×1000
叶绿素b=(22.88A645-4.67A663)×v/w×1000
叶绿素总含量=(20.29A645+8.05A663)×v/w×1000
叶绿素含量相关表型值见表2，Chla代表植物叶绿素a含量，Chlb代表叶绿素b含量，Total Chl代表总叶绿素含量，Chla/b代表叶绿素a与b的含量比值。
表2.叶绿素含量相关表型值
名称 Chla Chlb Total Chl Chl a/b
M2-1 2.3312 0.7062 3.0374 3.3009
M2-2 1.2805 0.0659 1.3464 19.4348
M2-3 2.0857 0.5024 2.5881 4.1512
M2-4 2.2951 0.6981 2.9932 3.2879
M2-5 1.8996 0.4666 2.3663 4.0707
M2-6 2.3503 0.7179 3.0682 3.2737
M2-7 1.9311 0.4814 2.4125 4.0113
M2-8 2.1570 0.5302 2.6872 4.0684
M2-9 2.4705 0.6939 3.1644 3.5603
M2-10 1.3063 0.0619 1.3682 21.1055
M2-11 1.1063 0.0479 1.1482 23.0991
M2-12 1.2690 0.0533 1.3222 23.8221
M2-13 2.3813 0.7212 3.1024 3.3020
M2-14 1.2845 0.0601 1.3447 21.3623
M2-15 1.2563 0.0579 1.3142 21.7001
对纯合阳性材料与杂合材料的NPQ值、Chla和Chlb进行统计分析，其P-value<0.01，存在极显著差异；对杂合材料与纯合阴性材料的NPQ值、Chla和Chlb进行统计分析，其P-valu<0.03，存在差异显著；而将纯合阳性材料与纯合阴性材料的NPQ值、Chla和Chlb进行统计分析，其P-value<0.01,存在极显著差异。
生长期突变体植株以M2-2植株为例，将M2-2与野生型Dongjin进行对照见图3，左边为野生型Dongjin，右边为突变体M2-2。叶片对照图见图4，左边为野生型Dongjin，右边为突变体M2-2。从图3、图4中的对比可以看出，突变体M2-2叶色明显没有野生型Dongjin植株绿，这是由于插入T-DNA导致该基因功能丧失，从而使得叶绿素含量明显降低。

Claims (1)

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