CN112442551A

CN112442551A - 一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物、试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN112442551A
Application number: CN201910804888.7A
Authority: CN
Inventors: 何非; 程玉琴; 王军; 豆军杰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-03-05

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物、试剂盒和检测方法。该检测引物包括SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物。本发明主要应用于葡萄卷叶伴随病毒三号的检测，提供了GLRaV‑3的特异性检测引物，解决了假阴性和假阳性的问题。本发明中提取葡萄叶柄韧皮部的RNA，使用裂解液和吸附柱可快速获得高质量的RNA，解决了传统方法提取RNA步骤繁琐，质量差的问题。

Description

一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

由于葡萄的病毒分布广，危害大，所以可靠的病毒检测技术对于生产无病毒苗木变得尤为重要。传统的检测是指示植物鉴定法，近几十年来随着生物科学的迅猛发展，免疫学方法和分子生物学方法大量应用于葡萄病毒病的检测，给葡萄无毒苗的生产带来更可靠更准确更快速的检测技术。近年来，随着病毒基因组的研究和核酸序列分析技术的深入，分子生物学检测病毒的应用越来越广泛。这种方法克服了指示植物检测法准确度不高的缺陷，同时也克服了血清学检测病毒需要有外壳蛋白的限制，除此之外，这种检测方法更加灵敏，更加准确，更加迅速。目前实验室用于检测葡萄病毒的分子生物学方法通常为逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好。RT-PCR是将病毒RNA的反转录(RT)和cDNA(complementary DNA)的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术，其过程由两部分组成：以病毒RNA为模板，加入反转录引物(Oligo dT、随机六核苷酸引物或特异的下游引物)和dNTP，在逆转录酶的作用下，合成cDNA序列。然后以合成的cDNA为模板，加入根据已知的病毒基因组序列设计合成的引物以及dNTP，在DNA聚合酶作用下进行PCR扩增。扩增的引物是根据病毒基因组3’端保守蛋白序列，按照引物设计原则所设计的。

用于检测葡萄卷叶伴随病毒三号的引物可根据病毒的基因组序列来设计合成，病毒的基因组很长，而所需要的上下游引物序列通常只需要15-30bp，因此，用于检测葡萄卷叶伴随病毒三号的引物可以有很多对，但是在实际应用中，由于病毒存在突变性差异，所以，如果用于检测的序列保守性差，在不同分离物之间存在较大差异，则会出现假阴性。

葡萄卷叶病(GLD)是葡萄最重要的病毒性疾病之一，其对全世界各葡萄主产区都造成了巨大的经济损失。GLD导致葡萄植株生长衰弱，果实成熟延迟，果粒大小不均，着色不良，含糖量减少，产量下降，对葡萄的生长发育有显著影响。与GLD相关的病原物是葡萄卷叶伴随病毒(GLRaVs)，属于长线型病毒科(Closteroviridae)，其中最主要病原物为GLRaV-3。根据我国行业标准“NYT 1843-2010葡萄无病毒母本树和苗木”的规定，对葡萄脱毒苗木应检对象中包含GLRaV-3。

当前防控葡萄病毒病的最主要措施是栽植脱毒苗，而灵敏可靠的病毒检测技术是培育脱病毒苗的关键。目前检测葡萄病毒最常用方法是逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-PCR,RT-PCR)。但RT-PCR检测方法仍然存在一些问题。一、用传统的方法如TRIZOL法提取植物总RNA步骤繁琐，毒性较大，同时对于操作人员的技术要求高，耗时长，这些原因均会导致提取的RNA质量差。二、由于病毒分离物存在突变性差异，通过基因组序列设计的同一病毒引物在不同分离物上的检测结果不同，个别碱基的突变可能会导致引物与模板碱基配对失败，检测不到存在的病毒。由于RT-PCR存在的问题，致使其难以大范围推广。

用于检测GLRaV-3的引物可根据病毒的基因组序列来设计合成，GLRaV-3的基因组有17900-18500nt，共有13个ORF。进行PCR的上下游引物序列通常只需要15-30bp，因此，用于检测GLRaV-3的引物可以有很多对，但是在实际应用中，由于病毒存在突变性差异，所以如果用于检测的序列保守性差，在不同分离物之间存在较大差异，则会出现假阴性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物、试剂盒和检测方法。该葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物可解决假阳性的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种葡萄卷叶伴随病毒三号(GLRaV-3)的检测引物，包括SEQ IDNO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物。

本方法通过对GLRaV-3基因组序列进行保守性分析选出保守性高的P19.7蛋白序列作为检测目标，根据P19.7设计出保守性高的上下游引物，可以解决假阴性的问题。

本发明还提供了一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测试剂盒，包括PCR扩增试剂，PCR扩增试剂包括SEQ ID NO：1所示的上游引物、SEQ ID NO：2所示的下游引物、酶预混液。

作为优选，酶预混液为M5HIPer plus HIFI PCR MIX。

在本发明提供的实施例中，PCR扩增试剂还包括ddH₂O。

作为优选，该检测试剂盒还包括反转录试剂。

作为优选，反转录试剂包括缓冲液、MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo dt引物、Random 6 mers、dNTP、RNase Free dH₂O。

作为优选，缓冲液为Prime

Buffer。

本发明还提供了一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测方法，包括如下步骤：

取葡萄叶柄韧皮部组织，提取RNA；

将RNA反转录为cDNA；

采用SEQ ID NO：1所示的上游引物、SEQ ID NO：2所示的下游引物对cDNA进行PCR扩增，利用凝胶电泳检测目的条带。

作为优选，提取RNA具体为：在液氮中将葡萄叶柄韧皮部组织研磨成粉末；

将粉末与裂解液混合，在64～66℃条件下放置4～6min，离心，取上清液进行过滤，收集下滤液；

将下滤液与乙醇水溶液混合，转入吸附柱RA，离心，弃掉废液；

将吸附柱RA漂洗2～3次，加入64～66℃的RNase-free水，放置1.5～2.5min，离心收集RNA。

在具体实施例中，提取RNA具体为：

(1)取葡萄叶柄韧皮部组织，称取0.1g-0.2g放入研钵中，加入液氮将其研磨成粉末，将粉末转移到RNase free离心管。

(2)在RNase free离心管中加入1ml的裂解液PL，漩涡震荡混匀，在65℃金属浴孕育5分钟充分分解核蛋白体。

(3)室温条件下12000rpm离心10分钟，取上清液小心转入新的RNasefree过滤柱中，10000rpm离心45秒，收集下滤液。

(4)在收集管中加入1倍体积的70％乙醇，颠倒混匀，将得到的溶液转入吸附柱RA。10000rpm离心45秒，弃掉废液。

(5)加入500μL漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。

(6)将吸附柱RA放入空收集管，12000rpm离心2分钟以除去漂洗液，避免对下游反应产生影响。

(7)加入500μL漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。重复一次。

(8)将吸附柱RA放回收集管中，12000rpm离心2分钟除去漂洗液。

(9)取出吸附柱RA，放入新的RNase-free离心管中，加入事先在65℃水浴锅加热的50μL RNase-free water，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟收集产物。

作为优选，反转录体系为：

组分	加入量
		5×缓冲液	2.0μL
MLV反转录酶	0.25μL
		RNA酶抑制剂	0.25μL
Oligo dt引物	0.25μL
		Random 6 mers,100μM	0.25μL
dNTP	0.5μL
		RNA	5.0μL
RNase Free dH<sub>2</sub>O	1.5μL

。

作为优选，反转录反应为在40～45℃条件下孵育50～70min。

优选地，反转录反应为在42℃条件下孵育60min。

作为优选，PCR扩增体系为：

作为优选，PCR扩增反应程序为：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min。

本发明提供了一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物、试剂盒和检测方法。该检测引物包括SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物。本发明具有的技术效果为：

本发明主要应用于葡萄卷叶伴随病毒三号的检测，提供了GLRaV-3的特异性检测引物，解决了假阴性和假阳性的问题。

本发明中提取葡萄叶柄韧皮部的RNA，使用裂解液和吸附柱可快速获得高质量的RNA，解决了传统方法提取RNA步骤繁琐，质量差的问题。

附图说明

图1示GLRaV-3基因组序列；

图2为上下游引物保守性分析；2-1为上游引物保守性分析，2-2为下游引物保守性分析；

图3示植物总RNA提取产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图4示GLRaV-3扩增产物凝胶电泳结果；其中M为Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，1为本发明检测引物的扩增产物；

图5示本发明检测RNA提取方法与常规RNA提取方法的效果对比；从左往右依次是：1、3、5泳道为实施例1方法提取的RNA；2、4、6泳道为常规方法提取的RNA；

图6示不同引物对RNA的扩增效果，从左往右依次是：样品1、2、3、4用表5中HSP70引物检测的结果，Marker，样品5、6、7、8用实施例1引物检测的结果。

具体实施方式

本发明公开了一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物、试剂盒和检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

GLRaV-3基因组序列见图1。

上下游引物保守性分析结果见图2。

本发明提供的葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物、试剂盒和检测方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

一、葡萄总RNA提取(按照bioteke植物RNA快速提取试剂盒RP3301型的操作步骤提取总RNA)

(1)取葡萄叶柄韧皮部组织(取样部位和时期见表1)，称取0.1g-0.2g放入研钵中，加入液氮将其研磨成粉末，将粉末转移到1.5mL RNase free离心管。

(2)在1.5mL RNase free离心管中加入1ml的裂解液PL，漩涡震荡混匀，在65℃金属浴孕育5分钟充分分解核蛋白体。

(5)加入500μL漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。

(8)将吸附柱RA放回收集管中，12000rpm离心2分钟除去漂洗液。

(10)琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA质量，用微量紫外/可见分光光度计测定RNA浓度。RNA提取结果见图3。

二、反转录合成cDNA第一链

反转录试剂盒为

RT reagent Kit，TaKaRa公司产品，使用试剂盒中的随机引物作为反转录引物。分别按照说明将各个组分(表2)加入1.5mL离心管，混匀，反应体系为10μL。将加入反应体系的离心管放在42℃恒温水浴锅中孵育1小时(h)，获得cDNA用于下游试验或置于-20℃保存。

三、PCR扩增

反转录后即进行PCR扩增。反应体系为15μL(PCR反应体系详见表4)，包含2×M5HIPer plus HIFI PCR MIX、正向引物(20μM)、反向引物(20μM)(葡萄病毒RT-PCR检测引物详见表3)、ddH₂O。混匀后将离心管放在PCR仪进行反应。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，根据引物退火温度退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min。反应结束后取出。阳性对照使用含病毒基因的质粒作为PCR扩增的DNA模板，阴性对照使用去离子水代替模板。

表1 取样部位和时期

病毒种类	适宜时期	取样部位
			GLRaV-3	生长期	叶柄韧皮部

表2 反转录反应体系

表3 葡萄卷叶伴随病毒三号RT-PCR检测引物

表4 PCR反应体系

组分	加入量
		2×M5 HIPer plus HIFI PCR MIX	7.5μL
正向引物(20μM)	0.3μL
		反向引物(20μM)	0.3μL
cDNA	2.0μL
		ddH<sub>2</sub>O	4.9μL

四、凝胶电泳检测目的条带

(1)制备琼脂糖凝胶溶液(浓度为1.0％)：称取琼脂糖0.2g放入三角瓶中，将50×TAE电泳缓冲液(2MTris-醋酸，100mM EDTA；配制100mL：Tris24.2g，0.5M EDTA(PH 8.0)10mL，冰乙酸5.7mL，去离子水定容到100mL)稀释50倍，然后将1×TAE电泳缓冲液20mL加到盛有琼脂糖三角瓶中，盖上封口膜，振荡后置微波炉中将琼脂糖充分融化，取出后加入适量GoldView^TM核酸染料(每100mL凝胶中加入2-5μL核酸染料)并轻摇混匀。

(2)凝胶的制备：将凝胶板置于制胶架中，插上加样梳，待胶溶液稍微冷却后，缓慢倒入凝胶板上，除掉气泡。待凝胶冷却凝固后，小心地垂直拔出梳子，将凝胶与托盘放入电泳槽内，加入1×TAE电泳缓冲液，电泳缓冲液的液面需要略高出琼脂糖凝胶面。

(3)加样：在薄膜上混合PCR产物(5μL，约0.5-1μg)和上样缓冲液(1μL)。用微量移液器分别将样品和DNA Marker加入琼脂糖凝胶的加样孔内，每加完一个样品，应更换一个Tip头，以防污染，加样时勿碰坏加样孔周围的凝胶。

(4)电泳：加样后，将电泳槽立即通电进行电泳，调节到合适电压(5V/cm)。当电泳前端移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

(5)观察和拍照：将完成电泳的凝胶取出，在凝胶成像仪下观察，结果见图4，观察到与阳性对照位置相同的目的条带的样品为阳性，携带所检测病毒；与阴性对照一样，未观察到目的条带的样品为阴性，不携带所检测病毒。

对比例1常规方法

1、常规方法：

1.1实验准备

1.1.1配制DEPC水：在去离子水中加入DEPC至终浓度0.1％，搅拌器上搅拌3h，油状物充分溶解后37℃过夜，高压灭菌30min。

1.1.2所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下至少6h。

1.1.3塑料器皿可用0.1％DEPC水浸泡。

1.1.4电泳槽等有机玻璃器具可用3％过氧化氢室温处理10min，然后用0.1％DEPC水冲洗，晾干。

1.1.5配制的溶液应尽可能的用0.1％DEPC，在37℃处理12h以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能用高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。

1.2试验步骤

RNA的提取

1.2.1称取0.1g新鲜的葡萄叶片放入用液氮预冷的研钵中，边加液氮边研磨直至样本呈现非常细的粉末状。

1.2.2迅速用药匙取研磨好的细粉加入到含1mlTRizol的离心管中(以50-100mg组织加入1mlTRizol液，注意样品总体积不能超过所用TRizol体积的10％)。

1.2.3立即用振荡器震荡2min使之快速溶解于裂解液中。

1.2.4室温10min期间不断震荡，让组织充分裂解。

1.2.5静止数秒。

1.2.6 4℃12000rpm离心5min。

1.2.7取上清液，迅速加入200μl氯仿，快速震荡2min(以每1mlTRizol液加入200μl的比例加入氯仿)。

1.2.8室温静置5min.

1.2.9 4℃12000rpm离心10min。

1.2.10重复步骤7-8。

1.2.11 4℃12000rpm离心10min。

1.2.12取上清液，迅速加入预冷的等体积异丙醇，缓慢颠倒离心管混匀(可按每1mlTRizol液加500μl异丙醇的比例加入异丙醇)。

1.2.13-20℃沉淀至少1h。

1.2.14 4℃12000rpm离心20min。

1.2.15小心弃上清

1.2.16加入1ml预冷的75％乙醇。

1.2.17缓慢颠倒离心管，4℃12000rpm离心2min，小心弃上清。

1.2.18短暂离心，吸取残留的乙醇。

1.2.19超净台中自然干燥5min。

1.2.20加入20μlDEPC处理的重蒸水溶解。

DNA的消化

1.2.21取10μgRNA，按下述体系混合：

10×DNase buffer: 5μl

RNA: 10μl

RNase inhibitor: 0.5μl

加去离子水至46μl，混匀，短暂离心。

DNase: 4μl

轻轻混匀，37℃水浴1h。

1.2.22短暂离心，加入50μl去离子水，再加500μlTRizol，震荡2min。

1.2.23室温静置5min。

1.2.24 4℃12000rpm离心5min。

1.2.25取上清液，迅速加入100μl氯仿，震荡2min，室温静置5min。

1.2.26 4℃12000rpm离心10min。

1.2.27取上清液，迅速加入预冷的等体积异丙醇，缓慢颠倒离心管混匀。

1.2.28冰上沉淀15min。

1.2.29 4℃12000rpm离心20min。

1.2.30小心弃上清。

1.2.31加入1ml预冷的75％乙醇。

1.2.32缓慢颠倒离心管，4℃12000rpm离心2min，小心弃上清。

1.2.33短暂离心，吸取残余的乙醇。

1.2.34超净台中自然干燥5min。

1.2.35加入20μlDEPC处理的重蒸水溶解。

1.2.36琼脂糖电泳检测RNA质量。

试验例1电泳检测

检测实施例1和对比例1的方法得到的RNA，试验结果见图5。1、3、5泳道为实施例1方法提取的RNA；2、4、6泳道为对比例1方法提取的RNA。

试验例2其它引物的对照

采用通过软件设计的其它引物对提取的RNA进行PCR反应，检测引物的特异性。其它引物序列见下表，电泳结果见图6。

表5 引物序列及其它信息

结果显示：

样品1、2、3、4用表5中HSP70引物检测，其条带弥散，表明引物的特异性不好。

样品5、6、7、8用实施例1引物检测，其条带清晰可见，表明引物的特异性好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物、试剂盒和检测方法

<130> MP1915561

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggacctat cgtttattat cgtgca 26

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctacagcgct ccgcaacaaa 20

Claims

1.一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测引物，其特征在于，包括SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物。

2.一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包括SEQ ID NO：1所示的上游引物、SEQ ID NO：2所示的下游引物、酶预混液。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括反转录试剂。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反转录试剂包括缓冲液、MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo dt引物、Random 6mers、dNTP、RNase Free dH₂O。

5.一种葡萄卷叶伴随病毒三号的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

取葡萄叶柄韧皮部组织，提取RNA；

将RNA反转录为cDNA；

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述提取RNA具体为：在液氮中将葡萄叶柄韧皮部组织研磨成粉末；

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述反转录体系为：

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述反转录反应为在40～45℃条件下孵育50～70min。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：

组分加入量 2×酶预混液 7.5μL 正向引物，20μM 0.3μL 反向引物，20μM 0.3μL cDNA 2.0μL ddH<sub>2</sub>O 4.9μL

。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：