KR970011310B1

KR970011310B1 - 핵산증폭용 프라이머를 이용한 바이러스 진단방법

Info

Publication number: KR970011310B1
Application number: KR1019930028158A
Authority: KR
Inventors: 김영태; 황영수; 박종석; 조강진; 박용환
Original assignee: 농촌진흥청; 이판석
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1993-12-17
Publication date: 1997-07-09
Also published as: KR950018483A

Abstract

요약없음

Description

핵산증폭용 프라이머를 이용한 바이러스 진단방법

제1도는 바이러스 핵산의 분리과정을 도식적으로 나타낸 그림.

제2도는 작물에서 추출한 즙액을 이용한 바이러스 정밀 측정농도를 결정하기 위한 전기영동 사진.

제3도는 본 발명의 바이러스 진단방법을 도식적으로 나타낸 그림.

제4도는 핵산 대량 증폭용 프라이머를 이용한 바이러스 진단결과를 나타내는 전기영동 사진.

본 발명은 작물의 바이러스 감염여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 핵산증폭용 프라이머를 이용하여 작물의 바이러스 이병여부를 신속히 진단할 수 있는 방법에 관한 것이다.

식물 바이러스는 작물의 품질저하와 수량 감소의 주요원인이 되고 있으며 그 피해 정도는 매우 심하게 나타나고 있으나, 현재까지 식물 바이러스병에 대한 치료수단이 없으므로 예방이 중요한 것으로 조기진단이 요구되었는 바, 조기진단은 간편성, 정확성 및 신속성 등이 고려되어 왔다.

종래의 작물 바이러스 진단법으로는 육안을 이용한 방법과 생물학적, 혈청학적 및 핵산 프로브법이 소개되어 왔다.

육안을 이용한 방버은 식물체의 이병여부를 경험에 의해 육안으로 판단하는 것으로, 이 방법은 고도의 경험이 축적되어야 함은 물론, 주관에 의한 오판의 가능성 또한 매우 높다는 문제점이 있었다.

한편, 생물학적인 방법은 지표식물을 이용한 것으로 온실 등의 시설과 식물의 재배기간 등 시간이 많이 요구된다는 단점이 지적되어 왔다.

혈청학적 방법은 바이러스의 외피 단백질 특성을 이용한 항원항체의 결합반응으로, 이 방법으로 ELISA(Enzyme Linked immunosorbent assary)법이 현재 널리 이용되고 있는데, 측정감도는 높으나 항체의 제작을 위해 동물사육을 별도로 해야 하므로, 장기간 소요되며 번거롭고, 또한, 바이러스의 외피 단백질의 특성을 이용하므로, 생물학적으로 뚜렷이 다른 균주(strain)나 복합감염시 정확한 판별이 곤란하며, 바이로이드(viroid)와 같은 외피 단백질이 없는 병원체는 그 이용이 제한적이라는 결정적 문제점이 있었다.

핵산 프로브법은 핵산 염기의 상보성 및 특정 염기서열에 대한 특이적 결합반응을 이용한 것으로, 특정 핵산단편을 프로브로 하여 매우 강력하게 검정하는 방법으로 그 감도가 매우 높고 계통이 많은 바이러스의 경우에도 특이적으로 검정할 수는 있으나, 핵산 프로브 제작에 따르는 복잡성과 방사성 동위원소 이용등 기술적인 문제가 요구되며 간혹 기대한 바 보다 낮은 감도를 나타내기도 한다는 단점이 있었다.

따라서, 최근에는 신속하고 간단한 방법으로 특정의 DNA 서열을 단시간에 증식할 수 있는 방법이 개발되어 분자생물학 분야에 널리 이용되고 있는 바, 식물바이러스의 진단가능성이 타진되고 있는 실정에 있다.

본 발명은 이러한 특정 DNA 서열을 증폭할 수 있는 특성을 이용하여 감자엽권, 감자 X, Y 바이러스 및 흑조위축병 바이러스를 특이적으로 검정해 낼 수 있는 핵산증폭용 프라이머 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 기존의 진단방법들이 지닌 문제점들을 극복하기 위하여 핵산증폭용 프라이머를 이용하여 상기한 바이러스들의 작물체 이병여부를 간단하고 신속히 진단할 수 있는 방법을 개발하고 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서는, 바이러스 핵산에 상보적인 핵산염기(cDNA)의 합성과 합성된 핵산염기의 대량증폭으로, 본 발명에서는 바이러스의 주형 염기 서열의 3'쪽과 5'쪽의 상보적 염기서열의 합성과 증폭용으로 2개의 올리고뉴크레오티드 프라이머를 사용하였다. 이 방법은 진단과정이 간단하며 프라이머 길이를 임의로 조정가능하고 증폭된 핵산의 단편을 프로브로 제작하여 핵산프로브법으로 진단할 수 있다는 장점이 있음은 물론, 아울러, 종래기술에 비추어진단에 필요한 소요시간이 기존의 진단방법에 비해 극히 단축(약 8시간)되었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하며 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명과 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 바이러스 핵산의 분리

바이러스에 감염된 이병주 잎 약 1g에 액체질소를 넣고 잘게 마쇄하고, 시료무게의 약 2배 부피량의 STE 완충액(0.05M 트리스-HCl, pH 7.2, 0.1M MaClm, 1mM EDTA)을 혼합하여 10분간 교반하였다. 그런다음, 12,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취하고, 단백질을 제거하기 위하여 페놀 : 클로로포름(1 : 1, v/v) 혼합액을 가하여 5분간 교반하였다. 이어, 12,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취하고 클로로포름 : 이소아밀알콜(24 : 1, v/v) 혼압액을 처리한 다음, 12,000rpm에서 5분간 원심분리한 상등액을 취하여 -20℃ 또는 -70℃에서 에탄올으로 핵산을 침전시켰다. 침전물을 TE완충액(10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해시켜 일정량을 분취하여 TE완충액으로 희석하고 cDNA 합성의 주형으로 사용하였다. 바이러스 핵산의 분리과정은 제1도에 나타내었다.

실시예 2 : 핵산 증폭용 프라이머 염기서열의 제작

핵산 대량증폭용 프라이머를 제작하기 이하여, 바이러스 균주(strain)와 분리 바이러스(isolate)의 염기서열 각각의 상동성을 상호 비교하여, 5'쪽과 3'쪽 각각의 공통염기서열에 대한 올리고뉴크레오티드 프라이머를 제작 하였는 바, 프라이머의 상보성을 인식하여 프라이머 자체가 대량 증폭되는 것을 방지하기 위하여 프라이머 상호간의 상보성이 낮도록 하였다. 또한 3' 쪽의 프라이머는 바이러스 염기서열에 상보적인 것으로 하였으며, 5'쪽의 프라이머는 바이러스 염기서열과 동일한 염기서열이 되도록 (3'쪽 프라이머에 의해 합성된 cDNA와 상보적)한 프라이머를 인공합성하였다. 인공합성한 프라이머들을 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법(PAGE)이나 올리고뉴크레오티드 정제 카트리지(OPC : oligonucleotide purification catridge, Applied Biosystems Inc., U.S.A)법으로 정제하였다. 인공합성 한 각 프라이머들의 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다. 표 1은 감자엽권, 감자 X,Y 및 흑조위축병 바이러스 등 4종에 대한 핵산 대량증폭용 프라이머들의 염기서열을 나타낸다.

[표 1]

실시예 3 : 바이러스 정밀농도의 결정

진단에 있어서 그 정확도와 감도(측정한계)는 측정방법의 우수성을 나타낼 수 있다. 따라서, 바이러스의 최저 진단가능 농도를 정밀 측정하기 위해 프라이머 농도를 일정하게 유지하고, 실시예 1에서 분리한 시료를 순차적으로 희석하여 하기 실시예 4와 같은 방법으로 측정하였다. 그 결과, 제2도에 나타낸 바와같이 10ng까지 검출이 가능하였다. 제2도에서 제1레인은 DNA 분자량 마커이며, 제2,3,4,5 및 6레인은 250,100,50,10 및 1ng의 RNA를 나타낸다. 그러나, 본 발명에 사용된 시료는 바이러스 RNA 뿐만 아니라 작물체 핵산이 포함된 농도이므로, 실질적으로 프라이머와 반응한 바이러스 RNA는 ng 이하의 수준일 것으로 추정되었다. 따라서, 바이러스 핵산의 분리 상태에 따라 피코그램(pg)까지도 가능하리라 예상되었다.

실시예 4 : 바이러스 이병 여부의 진단

상기 표 1에 나타낸 본 발명의 핵산 증폭용 프라이머로 작물의 바이러스 이병여부를 진단하기 위하여, 실시예 1에서 분리한 바이러스 RNA와 실시예 2에서 인공합성한 프라이머 각각을 준비하여, 아래와 같은 각 단계를 거쳐 진단하였다.

1. cDNA 합성단계

cDNA를 합성하기 위해 역전사 효소 완충액, 1mM MnCl₂, 200μM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP와 γTth DNA 중합효소 5단위(unit)와 3'쪽 프라이머 일정량 및 바이러스 RNA 일정량을 넣고, 멸균수를 가하여 20μl의 반응액을 70℃에서 15 내지 30분 동안 역전사 반응시켜 cDNA를 합성시켰다. 단, 흑조위축병 바이러스 시료는 100℃에서 5분간 단선화 시킨후, 상기 방법으로 cDNA를 합성하였다.

2. cDNA 대량증폭 단계

1차 합성된 cDNA에 킬레이트완충액, MgCl₂1.5mM, 일정량의 5'쪽 프라이머의 멸균수를 가하여 80μl로 반응액을 조제하여 혼합하고, 95℃/1분 : 단선화, 60℃/2분 : 어닐링(annealing) 및 72℃/2분 : 중합조건으로 35회 반복 처리하여 cDNA를 대량증폭 하였다.

3. 진단 단계

작물체의 바이러스 이병 여부를 진단하기 위하여, 대량 증폭된 cDNA를 TAE 완충용액(0.04M 트리스 염기, 0.02M 빙초산, 0.001M EDTA, pH8.0)을 사용하여, 1% 아가로스 겔에 100V, 1시간 전기영동하여 예상되는 단편크기의 밴드 형성유무로 바이러스 여병여부를 진단하였다. 진단방법 체계도를 제3도에 나타내었다.

실시예 5 : 핵산증폭용 프라이머를 이용한 바이러스 진단 결과

감자와 옥수수의 이병주와 건전주 잎으로 부터 분리한 RNA를 진단용시료로 사용하여 바이러스 이병 여부를 진단하였다. 그 결과, 이병주에서는 모두 예상되는 바이러스 특이적 단편의 밴드를 형성하였으나, 건전주에서는 밴드가 전혀 형성되지 않았다. 제4도의 감자엽권바이러스(PLRV)에서 나타난 바와 같이, 동일 바이러스를 진단할 경우에도 프라이머의 설계에 따라 진단결과를 다양하게 나타낼 수 있음을 확인하였다. 제4도에서 M레인은 분자량 마커를 나타내고, H는 건전주, I는 이병주를 각각 나타내며, RBSDV는 흑조위축병 바이러스, PVX는 감자 X바이러스, PVY는 감자 Y바이러스, PLRV는 감자엽권바이러스를 각각 나타낸다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 특정 DNA 서열을 증폭할 수 있는 특성을 이용하여 감자엽권, 감자 X,Y 및 흑조 위축병 바이러스를 특이적으로 검정해낼 수 있는 핵산증폭용 프라이머를 제공하며, 아울러 이를 이용한 작물의 바이러스 이병여부의 진단방법을 제공한다.

Claims

하기와 같은 염기서열로 구성된, 감자엽권 바이러스 핵산증폭용 프라이머.
하기와 같은 염기서열로 구성된, 감자 X 바이러스 핵산증폭용 프라이머.
하기와 같은 염기서열로 구성된, 감자 Y 바이러스 핵산증폭용 프라이머.
하기와 같은 염기서열로 구성된, 흑조위축병 바이러스 핵산증폭용 프라이머.
감자엽권 바이러스로 감염된 식물체로부터 바이러스 RNA를 추출하고, 제1항에 기재의 3'쪽 프라이머를 사용하여 역전자 반응시켜, 전기 바이러스 RNA로부터 단일가락의 cDNA를 합성한 다음, 이 cDNA를 주형으로 하고 제1항 기재의 3'쪽 프라이머 및 5'쪽 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)시키고, 이PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동하여 바이러스 특이적인, DNA 단편의 밴드를 확인함으로써, 식물체의 감자엽권 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법.
감자 X 바이러스로 감염된 식물체로부터 바이러스 RNA를 추출하고, 제2항 기재의 3' 쪽 프라이머를 사용하여 역전자 반응시켜, 전기 바이러스 RNA로부터 단일가닥의 cDNA를 합성한 다음, 이 cDNA를 주형으로 하고 제2항 기재의 3'쪽 프라이머 및 5'쪽 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)시키고, 이 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동하여 바이러스 특이적인 DNA 단편의 밴드를 확인함으로써, 식물체의 감자 X 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법.
감자 Y 바이러스로 감염된 식물체로부터 바이러스 RNA를 추출하고, 제3항 기재의 3' 쪽 프라이머를 사용하여 역전사 반응시켜, 전기 바이러스 RNA로부터 단일가닥의 cDNA를 합성한 다음, 이 cDNA를 주형으로 하고 제3항 기재의 3'쪽 프라이머 및 5'쪽 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)시키고, 이 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동하여 바이러스 특이적인 DNA 단편의 밴드를 확인함으로써, 식물체의 감자 Y 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법.
혹조위축병 바이러스로 감염된 식물체로부터 바이러스 RNA를 추출하고, 제4항 기재의 3' 쪽 프라이머를 사용하여 역전사 반응시켜, 전기 바이러스 RNA로부터 단일가닥의 cDNA를 합성한 다음, 이 cDNA를 주형으로 하고 제4항 기재의 3'쪽 프라이머 및 5'쪽 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)시키고, 이 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동하여 바이러스 특이적인 DNA 단편의 밴드를 확인함으로써, 식물체의 흑조위축병 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법.