CN109136410A - 猫泛白细胞减少症病毒lamp检测引物组、试剂盒以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组，以及应用该引物组的试剂盒和检测方法，具有以下优点：(1)扩增效率高、产量大，反应稳定、可重复性好，产物的种间特异性良好，可靠性高；检测的灵敏度达到5.01×102拷贝/uL，比传统PCR高一个数量级；(2)反应条件简单，只需要设置一个反应温度和一个终止温度即可；(3)实验设备要求较低，恒温水浴锅即可满足；(4)普通PCR方法检测至少需要2～3个小时，LAMP检测只需要60min可得到检测结果，监测更加快速、高效；(5)借助荧光染料，可目测扩增结果，检测结果直观、清晰。本发明可为FPV的早期诊断提供一种灵敏、快速的检测方法，适用于一线动物医疗或检疫人员进行大规模病原检测。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域，特别涉及一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法。
背景技术
猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus，FPV)，又称猫瘟热病毒，属于细小病毒科细小病毒属，该病毒为单链DNA病毒，基因组全长约5200nt，编码VP1、VP2两种结构蛋白，其中VP2蛋白为主要衣壳蛋白，是FPV的主要免疫保护性抗原蛋白。FPV感染范围较广，可感染猫科、鼬科及浣熊科动物，如猫、狮、虎、豹等；该病毒传播较快，可通过感染动物的粪便、尿液及呕吐物进行水平传播，妊娠母猫可垂直传播给胎儿；FPV致病性较强，可导致妊娠母猫流产或产畸形胎，死亡率高且无任何病前征兆。目前该病的检测主要依赖于病毒分离及血清学诊断，这些方法耗时长，成本高，不适用于临床样品的快速检测。随着动物园猫科动物及宠物猫的养殖量增多，疫病监测及防控需高度重视，建立一种适于临床检测FPV的快速检测方法迫在眉睫。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新型的核酸扩增技术，该技术依赖具有链置换活性的BstDNA聚合酶，利用4条特异性引物在等温条件下扩增出LAMP特有的梯状条带。LAMP技术特异性好、检测快速、操作简单，已在禽流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及猪流行性腹泻病毒等方面成功建立了快速检测方法。本研究旨在利用LAMP技术建立一种检测FPV的高效、快速、特异性的检测方法，用于FPV的早期诊断和防控。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明一方面提供了一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组，包括如下引物序列：
F3:5’-TGCATCATTGATGGTTGC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
B3:5’-AGTAAGTGTACTGGCACAG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
FIP:5’-GGTTGGTTTCCATGGATAAAAACCTATGCCATTTACTCCAGCAG-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
BIP:5’-CATCTCATACTGGAACTAGTGGCATGAACATCATCTGGATCTGTAC-3’(如SEQ IDNO.4所示)。
上述引物能特异性地识别FPV病毒DNA上VP2基因(长度约468bp)保守序列两端的6个位点，并使VP2基因在LAMP扩增过程中产生茎环结构，扩增效率高，且种间特异性良好，可以准确识别FPV病毒。
本发明另一方面提供了一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括上述LAMP检测引物组，还包括LAMP反应液，所述LAMP反应液包括如下成分：
Tris-HCl 20mM、(NH4)2SO4 10mM、KCl 10mM、Triton X-100 0.1％、MgSO4 6mM、dNTP Mix 10mM、FIP引物1.6μM、BIP引物1.6μM、F3引物0.2μM、B3引物0.2μM、Bst DNA聚合酶9～12U、甜菜碱1mM以及可视化染料指示剂。
上述反应液性质温和、稳定性好，可以为LAMP反应提供适宜的反应条件，并能有效避免引物二聚体的形成，得到的反应产物特异性好、杂质少，可以提高后续分析结果的精确度。
进一步地，所述可视化染料指示剂包括钙黄绿素20μM以及氯化锰300μM。
荧光染料中含有钙黄绿素，在LAMP反应初期因与锰离子结合而处于荧光淬灭状态；随着LAMP反应的进行，钙黄绿素逐渐恢复游离、发出荧光，从而可以实时进行肉眼观察，阳性呈绿色、阴性呈橘黄色；或将扩增产物置于凝胶成像系统下观察，阳性由明亮的荧光、阴性为透明或颜色较浅。通过添加荧光染料，可以将LAMP反应结果以可视化的形式进行呈现，从而获取直观的定性结果。
本发明还提供了一种应用上述试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，包括如下步骤：
S1：对待检样品的DNA进行提取，作为模板添加到LAMP反应液中，进行LAMP扩增；
S2：通过琼脂糖凝胶电泳以及肉眼判断，对得到的LAMP扩增产物进行分析。
进一步地，LAMP扩增的反应体系中，模板DNA的拷贝数不少于100个拷贝。
进一步地，LAMP扩增的反应条件如下：
将所述反应体系置于60～65℃的恒温水浴中反应30～60min。
进一步地，LAMP扩增反应中，恒温水浴结束后，将所述反应体系取出、置于80℃水浴中10min，终止反应。
进一步地，肉眼判断的方法如下：样品呈黄绿色则为阳性，呈橘黄色则为阴性。
应用上述反应体系、通过上述反应条件对VP2基因进行LAMP扩增，操作简便，反应灵敏、快速，终止反应后可直接通过荧光染料目测颜色反应，也可以通过2％琼脂糖凝胶电泳进行进一步验证，检测方便、准确性好。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组，以及应用该引物组的试剂盒和检测方法，应用上述试剂盒和方法对猫泛白细胞减少症病毒进行检测时，具有以下优点：(1)扩增效率高、产量大，反应稳定、可重复性好，产物的种间特异性良好；检测的灵敏度达到5.01×102拷贝/uL，比传统PCR高一个数量级；(2)不需要设置一系列温度，只需要设置一个反应温度和一个终止温度即可；(3)实验设备要求较低，恒温水浴锅即可满足；(4)普通PCR方法检测至少需要2～3个小时，LAMP检测只需要60min可得到检测结果，能在更短的时间内完成对FPV的检测；(5)借助荧光染料，可目测扩增结果，检测结果直观、清晰。本发明可为FPV的早期诊断提供一种灵敏、快速的检测方法，适用于一线动物医疗或检疫人员进行大规模病原检测。
附图说明
图1为实验例1中不同反应温度下的LAMP结果比较；
其中：1：60℃；2：63℃；3：64℃；4：65℃；5：阳性对照；6：阴性对照；M：DL2000Marker；
图2为实验例1中不同反应时间下的LAMP结果比较；
其中：7：30min；8：45min；9：60min；M：DL 2000Marker；
图3为实验例2中PCR与LAMP的敏感性实验的凝胶电泳结果比较；
其中：1：106；2：105；3：104；4：103；5：102；6：101；7：阴性对照；M：DL 2000Marker；
图4为实验例2中LAMP的荧光成像结果：
其中：1：106；2：105；3：104；4：103；5：102；6：101；7：阴性对照；M：DL 2000Marker；
图5为实验例3中LAMP的特异性实验的凝胶电泳结果；
其中：1：FPV；2：FHV；3：CAV；4：CPV；5：阴性对照；M：DL 2000Marker；
图6为实验例3中LAMP的特异性试验的荧光成像结果；
其中：1：FPV；2：FHV；3：CAV；4：CPV；5：阴性对照；M：DL 2000Marker；
图7为实验例4中临床样品的特异性实验的凝胶电泳结果；
图8为实验例4中LAMP的特异性试验的荧光成像结果。
具体实施方式
下面结合附图和以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组，其特征在于，包括如下引物序列：
F3:5’-TGCATCATTGATGGTTGC-3’；
B3:5’-AGTAAGTGTACTGGCACAG-3’；
FIP:5’-GGTTGGTTTCCATGGATAAAAACCTATGCCATTTACTCCAGCAG-3’；
BIP:5’-CATCTCATACTGGAACTAGTGGCATGAACATCATCTGGATCTGT AC-3’。
实施例2
一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测试剂盒，包括实施例1提供的LAMP检测引物组，还包括LAMP反应液，LAMP反应液包括如下成分：
Tris-HCl 20mM、(NH4)2SO4 10mM、KCl 10mM、Triton X-100 0.1％、MgSO4 6mM、dNTP Mix 10mM、FIP引物1.6μM、BIP引物1.6μM、F3引物0.2μM、B3引物0.2μM、Bst DNA聚合酶9～12U、甜菜碱1mM以及可视化染料指示剂。
实施例3
一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测试剂盒，包括实施例1提供的LAMP检测引物组以及实施例2提供的LAMP反应液，其中可视化染料指示剂包括钙黄绿素20μM以及氯化锰300μM。
实施例4
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，包括如下步骤：
S1：对待检样品的DNA进行提取，作为模板添加到LAMP反应液中，构建25μL的LAMP反应体系，进行LAMP扩增，反应体系中模板DNA的浓度为0.2μM；LAMP扩增的反应条件如下：
将LAMP反应体系置于60℃的恒温水浴中反应60min，恒温水浴结束后，将所述反应体系取出、置于80℃水浴中10min，终止反应；
S4：通过琼脂糖凝胶电泳以及肉眼判断，对得到的LAMP扩增产物进行分析。
实施例5
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，包括实施例4提供的各步骤；其中LAMP的反应条件为：将LAMP反应体系置于63℃的恒温水浴中反应60min。
实施例6
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，包括实施例4提供的各步骤；其中LAMP的反应条件为：将LAMP反应体系置于64℃的恒温水浴中反应60min。
实施例7
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，包括实施例4提供的各步骤；其中LAMP的反应条件为：将LAMP反应体系置于65℃的恒温水浴中反应60min。
实施例8
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，包括实施例4提供的各步骤；其中LAMP的反应条件为：将LAMP反应体系置于65℃的恒温水浴中反应30min。
实施例9
一种应用实施例3提供的试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，包括实施例4提供的各步骤；其中LAMP的反应条件为：将LAMP反应体系置于65℃的恒温水浴中反应45min。
实验例1
LAMP扩增条件的优化
分别采用实施例4～7提供的方法对同一批次的FPV病毒样品的保守序列VP2片段进行LAMP扩增，以去离子水作为阴性对照，并以PCDNA作为阳性对照。用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，比较各组扩增情况。结果如图1所示，除阴性对照(第6泳道)以外的所有泳道均可见典型的“梯形”条带，表明本发明提供的LAMP反应体系成立。根据条带形状和颜色，判定泳道5的条带效果最好，即最佳反应温度为65℃。
分别采用实施例7～9提供的方法对同一批次的FPV病毒样品的保守序列VP2片段进行LAMP扩增，并以去离子水作为阴性对照。用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，比较各组扩增情况。结果如图2所示，除阴性对照以外的所有泳道均可见典型的“梯形”条带，根据条带形状和颜色，判定泳道9的条带效果最好，即最佳反应时间为60min。
实验例2
LAMP扩增敏感性实验
将FPV病毒VP2片段的PCR扩增产物亚克隆到pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)上，构建阳性重组质粒，测序鉴定后，用紫外分光光度计测定阳性质粒的浓度，并换算成拷贝数，得到原始阳性质粒的拷贝数为5.01×1010拷贝/μL。对于原始阳性质粒进行10倍梯度稀释，分别以5.01×106拷贝/μL、5.01×105拷贝/μL、5.01×104拷贝/μL、5.01×103拷贝/μL、5.01×102拷贝/μL以及5.01×101拷贝/μL的阳性质粒作为模板，并以去离子水作为阴性对照，采用实施例7提供的方法进行LAMP扩增。同时采用如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：模板DNA 0.2μM、引物FPV-F 0.5μM、引物FPV-R 0.5μM以及20μL的2×PCR反应液(优选为购自于TransGene Biological Science&Technology Company的2×EasyTap SuperMix)，余量为ddH20；PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，46℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；循环结束后72℃延伸10min，最后4℃终止反应。
用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，比较各组PCR扩增和LAMP扩增效果。结果如图3所示，PCR能够扩增出清晰条带的对滴拷贝数为5.01×103拷贝/μL，而LAMP能够扩增出清晰条带的最低拷贝数为5.01×102拷贝/μL，仅有5.01×101拷贝/μL以及阴性对照(第7泳道)没有荧光。表明LAMP检测的灵敏度比PCR的灵敏度高。
另外，同时对LAMP扩增产物进行肉眼观察，结果如图4所示，在凝胶成像系统下，发出荧光的的LAMP样品的最小浓度为5.01×102拷贝/μL，仅有5.01×101拷贝/μL以及阴性对照(7号样品)没有荧光。由此可见，LAMP方法的目视检测下限为5.01×102拷贝/μL。
综上所述，LAMP方法的检测下限为5.01×102拷贝/μL。由此可见，LAMP检测的灵敏度比PCR的灵敏度高出一个数量级，表明LAMP法相比于PCR更适用于少量样品的检测。
实验例3
LAMP扩增特异性实验
采用实施例7提供的方法，分别对FPV、FHV(猫疱疹病毒)、CAV(犬腺病毒)以及CPV(猫细小病毒)四种临床上猫易感的病毒进行LAMP扩增，并以去离子水作为阴性对照。分别以2％琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统对扩增产物进行检测，比较扩增结果。
琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，只有泳道1(FPV)出现条带，包括阴性对照(第5泳道)在内的其他泳道均为出现条带。荧光成像结果如图6所示，只有FPV样品发出明显的荧光，包括阴性对照(5号样品)在内的其他样品均未出现荧光。表明本发明提供的LAMP检测方法对FPV病毒具有良好的特异性、不易产生假阳性结果。
实验例4
临床样品检测
采集10份疑似FPV病毒感染猫血清临床样品，提取病毒DNA样品，利用实施例7提供的LAMP检测方法以及实验例2提供的PCR方法同时对10份样品进行检测，比较实验结果。琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示，其中1号、7号以及11号泳道在PCR方法和LAMP方法中均出现明显条带；荧光成像结果如图8所示，其中1号、7号以及11号样品发出明显的荧光。综上所述，根据PCR和LAMP的检测结果均能确定1号、7号以及11号样品为FPV阳性，表明LAMP检测方法与PCR检测方法同样具有高度的可靠性。同时LAMP电泳图中，5号样品也可隐约观察到梯形条带，表明LAMP检测方法可能比PCR方法灵敏度更高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120> 猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组、试剂盒以及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tgcatcattg atggttgc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
agtaagtgta ctggcacag 19
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ggttggtttc catggataaa aacctatgcc atttactcca gcag 44
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
catctcatac tggaactagt ggcatgaaca tcatctggat ctgtac 46
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tgtaacacct tggtcatt 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
attcatcacc tgttctta 18
Claims (8)
1.一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测引物组，其特征在于，包括如下引物序列：
F3:5’-TGCATCATTGATGGTTGC-3’；
B3:5’-AGTAAGTGTACTGGCACAG-3’；
FIP:5’-GGTTGGTTTCCATGGATAAAAACCTATGCCATTTACTCCAGCAG-3’；
BIP:5’-CATCTCATACTGGAACTAGTGGCATGAACATCATCTGGATCTGTAC-3’。
2.一种猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的LAMP检测引物组，还包括LAMP反应液，所述LAMP反应液包括如下成分：
Tris-HCl 20mM、(NH4)2SO4 10mM、KCl 10mM、Triton X-100 0.1％、MgSO4 6mM、dNTP Mix10mM、FIP引物1.6μM、BIP引物1.6μM、F3引物0.2μM、B3引物0.2μM、Bst DNA聚合酶9～12U、甜菜碱1mM以及可视化染料指示剂。
3.如权利要求2所述的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述可视化染料指示剂包括钙黄绿素20μM以及氯化锰300μM。
4.一种应用权利要求2～3中任一项所述试剂盒的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：对待检样品的DNA进行提取，作为模板添加到LAMP反应液中，进行LAMP扩增；
S2：通过琼脂糖凝胶电泳以及肉眼判断，对得到的LAMP扩增产物进行分析。
5.如权利要求4所述的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，其特征在于，LAMP扩增的反应体系中，模板DNA的拷贝数不少于100个拷贝。
6.如权利要求4所述的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，其特征在于，LAMP扩增的反应条件如下：
将所述反应体系置于60～65℃的恒温水浴中反应30～60min。
7.如权利要求6所述的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，其特征在于，LAMP扩增反应中，恒温水浴结束后，将所述反应体系取出、置于80℃水浴中10min，终止反应。
8.如权利要求4所述的猫泛白细胞减少症病毒LAMP检测方法，其特征在于，肉眼判断的方法如下：样品呈黄绿色则为阳性，呈橘黄色则为阴性。
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