CN101696454B - 用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的rt-lamp引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一套用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物，所述RT-LAMP引物由一对外围引物和一对内引物组成，其中，这一对外围引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，一对内引物的序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。以本发明所设计的引物采用RT-LAMP检测方法对各种基因型CSFV野毒株进行检测，检测结果均为阳性，而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒检测结果均为阴性。应用本发明引物序列采用RT-LAMP检测方法，可以非常准确地区分CSFV野毒株和CSFV疫苗株，具有特异性强、灵敏性高、重复性好等优点。

Description

用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物

技术领域

本发明涉及一套检测毒株的引物，尤其涉及一套用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物，属于猪瘟病毒毒株的检测领域。

背景技术

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起猪的一种以高热和出血为主要特征的高度接触性传染病，是危害养猪业的重大传染病之一，被世界动物卫生组织(OIE)列入须申报OIE疾病名录。CSFV属于黄病毒科瘟病毒属，其基因组为线状单股正链RNA，长约12.3kb，含有单一的开放阅读框架(ORF)，编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，经蛋白酶裂解为4种结构蛋白(衣壳蛋白C和囊膜糖蛋白E^rns、E1、E2)以及8种非结构蛋白(N^pro、p7、NS2、NS 3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)，其中NS5B基因序列是可靠的CSFV基因型分类依据。

与CSFV同属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和绵羊边界病病毒(BDV)也可以感染猪，与CSFV存在血清学交叉反应，给猪瘟诊断带来很大困难(孙世琪，靳野，郭慧琛，等.我国近期猪瘟分子流行病学动态.动物医学进展，2004，25(6)：69-71；Paton DJ，Greiser-Wilke I.·Classical swinefever--an update.Res Vet Sci，2003，75(3)：169-178.)。另外，由于猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)在我国的大规模应用，使得CSFV野毒感染猪和疫苗接种猪的鉴别变得困难。目前猪瘟诊断方法有很多，包括病毒分离培养、动物接种试验、血清学诊断方法、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR等。其中病毒分离和动物试验不同程度的存在诊断周期长、操作繁琐、检出率低等不足；常规的血清学试验又都存在一定的血清学交叉反应，难以将CSFV与同属的BVDV和BDV感染区分开，也很难鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种，而实时荧光定量PCR方法对实验仪器的要求很高。虽然单克隆抗体技术用于诊断在一定程度上弥补了这一缺陷，但是基于抗原抗体反应的检测技术仍有一定的局限性(如敏感性不够高)，如胶体金检测技术。上述方法或多或少存在缺陷，不适合于基层实验室及现地的快速准确检测。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法是日本学者Notomi等在2000年发明的一项恒温核酸扩增新技术。该技术特异性强、灵敏度高、成本低廉，特别适合在现场和基层部门应用。由于反应产生副产物焦磷酸镁白色沉淀，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物。目前，日本已利用这种特性研制出专门用于LAMP检测的实时监控浊度仪，可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控。此外还可以向产物中加入荧光染料的方法进行判定。自从LAMP方法问世以来，已经应用于胚胎性别鉴定和不同病原体的检测。

文献报道表明，LAMP方法已经成功用于人、畜禽和水生动物的多种病原体的检测。如犬瘟热病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒等都已应用该技术建立了相应的检测方法。关于CSFV的RT-LAMP方法也有报道(陈蕾，范学政，王琴，等.猪瘟病毒RT-LAMP快速诊断方法的建立.动物传染病与兽医公共卫生，2008，209-213；Chen HT，Zhang J，Ma LN，et al.Rapid pre-clinicaldetection of classical swine fever by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification[J].Mol Cell Probes，2009，23(2)：71-74.)，但均不能用于CSFV野毒株和疫苗株的鉴别诊断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一套可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一套用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物，由一对外围引物和一对内引物组成；其中，一对外围引物的序列分别为SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示，一对内引物的序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

本发明根据GenBank中35株CSFV全基因序列及16株BVDV全基因组序列，设计针对CSFV NS5B区域的RT-LAMP引物(因为NS5B基因序列存在的差异是CSFV基因型分类依据，所以根据NS5B区域的碱基差异设计了专门针对CSFV野毒株的RT-LAMP引物)，包括一对外围引物F3/B3(SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2)，一对内引物FIP/BIP(SEQ ID NO：3和SEQID NO：4所示)，以样品的cDNA为模板，利用Bst DNA聚合酶，在62℃恒温条件下进行扩增，扩增产物中加入SYBR Green I染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果。该方法可检测出不同基因型的CSFV野毒株，其检出极限为2.5TCID₅₀的CSFV，与实时荧光定量RT-PCR方法的敏感性相当；特异性试验表明，该方法对猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应；通过对126份不同样品进行比对检测，该方法与实时荧光定量RT-PCR方法的符合率达100％，与引物-探针能量转移PCR方法的符合率为98.4％。该方法无需特殊仪器，是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法。

以本发明所设计的引物采用RT-LAMP检测方法对各种基因型CSFV野毒株进行检测，检测结果均为阳性，而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、BVDV-1株以及其它常见猪源病毒检测结果均为阴性，并且通过对大量的临床样品进行检测，其结果与本试验室已经建立的CSFV实时荧光定量RT-PCR方法的检出结果完全符合，而与PriPro-ET PCR方法的符合率为98.4％，经查证PriPro-ET PCR方法的敏感性为20拷贝，而CSFV实时荧光定量RT-PCR敏感性为41.8拷贝(ZhaoJJ，Cheng D，Li N，et al.Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR forquantitative and differential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine ofClassical swine fever virus.Vet Microbiol，2008，126(1-3)：1-10.)(相当于3.2TCID₅₀，Cheng D，Zhao JJ，Li N，et al.Simultaneous detection of Classical swinefever virus and North American genotype Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus using a duplex real-time RT-PCR.J Virol Methods，2008，151(2)：194-199.)，应用本发明引物序列采用RT-LAMP检测方法，可以非常准确的鉴别出CSFV野毒株，具有特异性强、灵敏性高(基本与实时荧光定量RT-PCR方法的敏感性相当)、重复性好等优点。本发明所设计的引物序列在猪瘟疾病的早期检测和快速诊断中具有重要意义。

附图说明

图1RT-LAMP的敏感性试验结果(2％琼脂糖凝胶电泳分析结果)。

图2RT-LAMP的敏感性试验结果(加入SYBR Green I后肉眼直接观察结果)。

图3RT-LAMP的敏感性试验结果(加入SYBR Green I在紫外灯下观察结果)。

图4RT-LAMP的特异性试验结果(2％琼脂糖凝胶电泳分析结果)

图5RT-LAMP的特异性试验结果(加入SYBR Green I后肉眼直接观察结果)。

图6RT-LAMP的特异性试验结果(加入SYBR Green I在紫外灯下观察结果)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例

1材料和方法

1.1病毒株和待检材料

CSFV石门系强毒株(Shimen)、2种不同基因亚型的CSFV野毒株[1.1基因亚型：HLJ-1(06)、HLJ-3(06)、HeN-5(06)和HeN-3(06)；2.1基因亚型：HuN1(06)、SH-7(06)、SH11-0701和SX-09]、猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1)BA株、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HuN4株、传染性胃肠炎病毒(TGEV)H16株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株、猪轮状病毒(PRV)OSU株、伪狂犬病病毒(PrV)HLJ株、猪细小病毒(PPV)BQ株和猪圆环病毒2型(PCV2)LG株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室保存并提供。

待检材料包括116份从东北地区不同养猪场送检的临床发热病例样品(包括19份扁桃体、淋巴结、脾脏、肾脏等和97份血清或全血)以及10份CSFV感染细胞培养物。

1.2引物设计与合成

参照GenBank中35株CSFV全基因序列及16株BVDV全基因组序列，设计针对CSFV在NS5B基因保守区的RT-LAMP引物，其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP(表1)。

表1 RT-LAMP引物序列和位置

^a Genomic positions corresponding to CSFV Shimen/HVRI(accession no.AY775178).

1.3病毒RNA提取和cDNA合成

1.3.1RNA的提取

取140μL样品，用QI Aamp Viral RNA Kit提取试剂盒(QIAgen公司)提取病毒RNA，具体操作方法参照说明书进行。提取的病毒RNA用60μL AVE洗脱液洗脱溶解，用于cDNA的合成。

1.3.2cDNA的合成

取1μL病毒RNA，加入到20μL反转录反应体系中，内含4μL 5×RT Buffer、2μL dNTP Mixture(各10mM)、50pmol 9-mer随机引物、10U禽源反转录酶(AMV RT XL)和20U RNA酶抑制剂(HPRI)，42℃水浴1h，最后70℃15min灭活反转录酶。

1.4RT-LAMP方法的优化

1.4.1镁离子浓度的优化

以CSFV石门株全长cDNA为模板，镁离子的浓度在2.5-6.5mM，以0.5mM递增，每个反应重复3次。反应条件为62℃扩增60min，80℃扩增2min，产物于2％琼脂糖凝胶电泳中观察。

1.4.2引物浓度的优化

由于外引物对实验结果影响很小，所以实验中固定外引物浓度，对内引物浓度进行梯度稀释(0.8μM、1.2μM、1.6μM和2.0μM)，每个浓度的引物重复3个反应，产物于2％琼脂糖凝胶电泳中观察。

1.4.3反应温度的优化

在完成以上所有条件优化基础上进行反应温度优化。反应温度从61℃-65℃，以1℃依次递增，每个温度重复3次反应，产物于2％琼脂糖凝胶电泳中观察。

1.5扩增产物的检测

反应结束后，加入1μL的SYBR Green I染料，观察LAMP反应液是否发生颜色变化，再将PCR反应管置于紫外灯下照射，观察是否有强烈的荧光产生。取6μL RT-LAMP扩增产物，于2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

1.6RT-LAMP的敏感性试验

将10^4.8TCID₅₀的石门血毒用灭菌的去离子水进行连续5倍或10倍梯度稀释，分别提取RNA反转录后，运用优化的RT-LAMP方法和荧光定量RT-PCR方法同时进行检测，进而对两者的敏感性做出比较。并在RT-LAMP反应管中加入1μL SYBR Green I观察各管颜色变化。

1.7RT-LAMP的特异性试验

提取CSFV Shimen株、HCLV株、1.1和2.1基因亚型的CSFV野毒株、BVDV-1、PRRSV、TGEV、PEDV、PRV、PrY、PPV和PCV2等病毒核酸，按照所建立的猪瘟RT-LAMP检测方法进行特异性试验，待反应结束后于各反应管中加入1μL SYBR GreenI观察颜色变化。同时把猪瘟石门株F3和B3之间的扩增条带切胶回收，插入pMD18-T载体，然后测序验证。应用DNAS tar软件对序列进行分析，并在GenBank中对序列进行BLAST分析，用以验证扩增产物的特异性。

1.8重复性试验

取等量的4份不同代次的CSFV石门株细胞培养物，对每份样品同时提取RNA三份，反转录后，进行RT-LAMP检测，用以检测批内重复性。

取等量的4份不同代次的CSFV石门株细胞培养物，先后分3次在不同时间提取病毒RNA，反转录后，在同一反应条件下进行3次独立的RT-LAMP，用以检测批间重复性。

1.9RT-LAMP与其它方法的符合性试验

对10份CSFV接毒细胞培养物、116份各地临床样品，总共126份样品按上述方法提取RNA和反转录后，各取1μL cDNA作为模板，分别应用引物-探针能量转移PCR方法(PriPro-ET PCR)(Liu L，Xia H，Belák S，et al.Development of a primer-probe energy transfer real-time PCR assayfor the improved detection of classical swine fever virus.J VirolMethods，2009，160(1-2)：69-73.)、本实验室已建立的猪瘟实时荧光定量RT-PCR检测方法和以上优化的RT-LAMP的方法进行检测，分别计算两者的符合率。

2实验结果

2.1优化的RT-LAMP反应条件

通过对RT-LAMP反应条件的优化，确定最佳的反应体系为：反应体系为25μL：10μM引物F3和B3各0.5μL，10μM引物FIP和BIP各5μL，2.5mM dNTPs 2.5μL，25mM MgCl₂ 5μL，5M Betaine 2.5μL，10×Thermo Buffer 2.5μL，Bst DNA聚合酶12U，模板2μL，用去离子水补足25μL。反应条件为：62℃1h；80℃2min。

2.2RT-LAMP的敏感性

运用优化的RT-LAMP方法和荧光定量RT-PCR同时进行检测，2种方法检测为阳性的最低稀释度为10^0.4(2.5)TCID₅₀。琼脂糖凝胶电泳检测后，结果阳性管有特异性的梯状条带，阴性对照管则无条带出现(图1)；加入SYBRGreen I后，阳性管呈现翠绿色，而阴性对照管则为淡橙色(图2)；将加入染料后的各反应管置紫外灯下照射，阳性管发出强烈的绿色荧光，而阴性无特异性荧光(图3)。

2.3RT-LAMP的特异性

所建立的CSFV RT-LAMP检测方法可以检测出不同基因型的CSFV野毒株，而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、BVDV-1、PRRSV、TGEV、PEDV、PRV、PrY、PPV和PCV2检测结果均为阴性。琼脂糖凝胶电泳检测后，阳性管有特异性的梯状条带，其它管则无条带出现(图4)。于各反应管中加入SYBR Green I后，阳性管呈现明显的翠绿色，而阴性对照管则为淡橙色(图5)；将加入染料后的各反应管置紫外灯下照射，阳性管发射出强烈的绿色荧光(图6)。测序结果分析表明，扩增的209bp的片段与CSFV Shimen/HVRI的NS5B序列(AY775178)同源性为100％。

2.4RT-LAMP的重复性

2.4.1批间重复性

取等量的4份不同代次的石门株细胞培养物，先后分3次不同时间提取RNA，反转录后，在同一反应条件下进行3次独立的RT-LAMP检测，3次检测结果无明显差异。

2.4.2批内重复性

各取4份不同代次的石门株细胞培养物，每份样品做3个重复，提取RNA，反转录后，进行一次RT-LAMP检测，3个重复结果无明显差异。

2.5RT-LAMP与其它方法的符合率

对126份样品分别应用以上优化的RT-LAMP方法以及已报道的CSFV实时荧光定量RT-PCR和PriPro-ET PCR方法分别进行检测，RT-LAMP与荧光定量RT-PCR和与PriPro-ET PCR的符合率分别为100％和98.4％(表2)。

表2 RT-LAMP与荧光定量RT-PCR和PriPro-ET PCR的符合率

递交的序列表

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物

<130>KLPIO8067

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>1

ccctgaccat gcatatgwca g                                 21

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>2

catccccgca cacatgaat                                    19

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>3

aggttgtccr ctgcctcttt gcccgtaatc wgtgccga               38

<210>4

<211>42

<212>DNA

递交的序列表

<213>artifical sequence

<400>4

acacaagcgc aggcaatagc atctcttgta gggtactccc gt        42

Claims (1)

1.一套用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物，其特征在于：所述RT-LAMP引物由一对外围引物和一对内引物组成；其中，所述外围引物的序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述内引物的序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

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