CN102912034A

CN102912034A - 一种检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN102912034A
Application number: CN2011102232601A
Authority: CN
Inventors: 李帅伟; 于宾宾
Original assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-08-04
Filing date: 2011-08-04
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明涉及一种检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包含运用无菌双蒸水配制的RT-LAMP反应液，其中LAMP反应液24μL包含的组分及浓度分别为：10U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液，10UAMV反转率酶，150mmol的MgSO₄，25mmol的甜菜碱，30mmol的dNTP，4.5pmol的引物P1，4.5pmol的引物P2，45pmol的引物P3，以及45pmol的引物P4。本发明的有益效果为：本发明可以高效快速的对猪Kobu病毒进行检测，且检测手段简单，不需要昂贵的实验仪器，适合在临床疾病诊断中推广。

Description

一种检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法。

背景技术

猪Kobu病毒是一种无包膜的正链RNA病毒，隶属于小RNA病毒科Kobu病毒属，目前公认的Kobu病毒属有四个成员，分别为Aichi病毒，牛、猪和羊Kobu病毒。Aichi病毒于1991年从一个急性胃肠炎的日本病人中分离到，而牛的Kobu病毒则于2003从日本的牛群排泄物中检测到。2007年在匈牙利猪群排泄物中分离到猪的kobu病毒，次年在匈牙利的羊排泄物中分离到羊的Kobu病毒。在正常猪群中，Kobu病毒阳性率较高，匈牙利为65％，日本为45％，而我国正常猪群中检测阳性率为30％，另有报道在泰国对急性腹泻猪群的检测时发现Kobu病毒的阳性率高达99％。

自2010年4月至今，韩国、泰国；我国的广东、福建、广西、江西、湖北、河北和山东规模化猪场的仔猪陆续发生严重腹泻：哺乳仔猪多在出生后2-3天发生呕吐，随后发生剧烈腹泻，死亡率较高，有的地区出现腹泻后死亡率达到100％。而母猪和育肥猪无明显症状。按照流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒感染时的处理措施，基本无显著效果。临床解剖主要症状为胃肠道的严重出血。对严重腹泻仔猪采集的样本分析发现，流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒检测阳性率较低，阳性率不足5％，而猪博卡病毒(porcine bocavirus，PBoV)和Kobu病毒检测阳性率达到86.6％。由此可见，PBoV和Kobu病毒是这次仔猪腹泻的罪魁祸首。但到目前为止，由于对该两种病毒的认识还不够深入，尚无有效的疫苗和防治措施以及商业化的检测试剂盒问世，因此研制Kobu病毒检测试剂盒能对该病进行快速诊断，对临床治疗和疾病控制有巨大的意义。

环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由T.Notomi于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异性的引物针对目的序列的四个区域进行扩增，所运用的DNA聚合酶具有链置换功能，因此可以实现恒温扩增。由于其扩增依赖于目的序列的四个特异性区域，因此其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高，而且由于该反应在恒温条件下进行，因此不需要昂贵的仪器，而使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，另外在扩增反应可以在一个小时之内完成，所需时间短，且其反应产物易于观察，可以通过肉眼判定扩增样本是否为阳性。基于以上优点，LAMP至发明之日起，已被广泛用于病原的检测，如病毒性出血败血症、巨细胞病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、结核杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、禽流感、猪流感等病毒性疾病和细菌性疾病的检测。到目前为止，未发现运用LAMP方法检测Kobu病毒的报道。

发明内容

本发明的目的是一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法，可以高效快速的对猪Kobu病毒进行检测，且检测手段简单，不需要昂贵的实验仪器，适合在临床疾病诊断中推广。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒，其包含以下组分：

RT-LAMP反应试剂：该试剂运用无菌双蒸水配制，每个反应加入24μLLAMP反应液，其中LAMP反应液24μL包含的组分及浓度分别为：10U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，1％Triton X-100)，10U AMV反转率酶，150mmol的MgSO₄，25mmol的甜菜碱，30mmol的dNTP，4.5pmol的引物P1，4.5pmol的引物P2，45pmol的引物P3，45pmol的引物P4，其中各引物序列分别为：

P1：TGCCTTCCGCATTGTTGAG，

P2：GGAAAAGTCAGGGTGTTGGA，

P3：CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGA，

P4：CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA。

一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)从NCBI数据库Genbank中查找Kobu病毒序列，运用序列比对软件DNAstar进行同源性分析，获得Kobu病毒的保守靶序列；

2)根据步骤1)获得的序列运用PrimerExplore V4在线引物设计软件进行引物设计，选取保守序列区作为构建试剂盒所使用引物，引物序列分别为：

P1：TGCCTTCCGCATTGTTGAG

P2：GGAAAAGTCAGGGTGTTGGA

P3：CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGA

P4：CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA；

3)将步骤2)所设计的引物进行合成，运用无菌双蒸水配制LAMP反应试剂，其中LAMP反应液24μL包含的组分及浓度分别为：10U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，1％Triton X-100)，10U AMV反转率酶，150mmol的MgSO₄，25mmol的甜菜碱，30mmol的dNTP，4.5pmol的引物P1，4.5pmol的引物P2，45pmol的引物P3，45pmol的引物P4；

取上述步骤(3)配制的试剂加入1μL待检测模板混匀后，置65℃反应1小时，反应完成后观察反应管中是否出现混浊以判定扩增结果，为方便观察，可在反应后将反应管置离心机内12000转/分离心1分钟，观察管底有无白色沉淀，如果观察到白色沉淀则判为阳性。

本发明的有益效果为：高特异性和高敏感性，运用四条引物，针对Kobu病毒序列的四个保守区域进行扩增，其特异性和敏感性均比同条件下的PCR和定量PCR高；操作简单，易于判定，扩增反应只需要一个恒温水浴锅即可，而且可以在一个小时内完成扩增反应；结果判定简单，可以运用肉眼判定是否出现混浊以判断是否有特异性的扩增，与普通PCR和定量PCR相比较而言，不需要昂贵的仪器设备，而且扩增完成后可以在不开盖的情况下判定结果，避免了扩增产物对后续检测的污染。

具体实施方式

Kobu病毒RT-LAMP引物设计与筛选：

登录NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，查找Genbank公布的Kobu病毒的序列，运用DNAstar进行序列比对后，以猪博卡病毒基因组序列GU292559为模板，运用PrimerExplore V4在线引物设计软件进行LAMP反应引物设计，从设计的引物序列中选取如下4条引物进行特异性、敏感性的实验并最终确认试剂盒使用的引物组分，

P1：TGCCTTCCGCATTGTTGAG，

P2：GGAAAAGTCAGGGTGTTGGA，

P3：CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGA，

P4：CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA，

运用正交实验进行各组分的优化，确立以上所述引物在LAMP试剂盒中使用的比例及其反应浓度，每个反应体系中各引物的反应浓度为：4.5pmol的引物P1，4.5pmol的引物P2，45pmol的引物P3，45pmol的引物P4。

试剂盒的组装(以50个反应为例)：

本发明所述试剂盒仅由LAMP反应液构成，该反应液由灭菌双蒸水配制，其中规格为50个反应的试剂盒中含有1.2ml LAMP反应液，每个反应用量为24μL，该24μL反应液中各组分及浓度如下：10U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH₄) ₂SO₄，1％Triton X-100)，10U AMV反转率酶，150mmol的MgSO₄，25mmol的甜菜碱，30mmol的dNTP，4.5pmol的引物P1，4.5pmol的引物P2，45pmol 的引物P3，45pmol的引物P4，然后组装成试剂盒。

Kobu病毒RT-LAMP试剂盒的使用：

按照常规方法提取RNA，然后取1μL所提取的RNA样品，加入到0.2ml薄壁PCR反应管中，随后加入24μL RT-LAMP反应液，轻微混匀，置水浴锅中，65℃反应45-60分钟。反应完毕后取出PCR管，12000转/分离心1分钟，然后观察PCR反应管底部有无白色沉淀，如有沉淀产生则判定为阳性。

试剂盒的敏感性实验：

按照常规RNA提取方法，提取Kobu阳性病料总RNA，进行10倍系列稀释，选取10^1～7等7个稀释度，用该发明制备的试剂盒进行敏感性实验，对反应结果运用凝胶电泳和肉眼观察沉淀等方法进行验证。电泳结果显示，随着模板浓度的降低，其电泳结果差异不显著，离心观察沉淀量亦无显著差异。10¹倍～10⁵倍稀释均可检测到Kobu病毒核酸。

试剂盒的特异性实验验证：

分别运用常规DNA和RNA提取方法提取猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒、圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒等病毒的DNA或者RNA，以灭菌双蒸水作为阴性对照，Kobu病毒RNA作为阳性对照，运用试剂盒进行检测。检测结果发现Kobu病毒呈阳性，其它均成阴性。该结果表明，本发明制备的检测Kobu病毒的试剂盒具有特异性。

Claims

1.一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于：其包含运用无菌双蒸水配制的RT-LAMP反应液，其中LAMP反应液24μL包含的组分及浓度分别为：10U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液，10U AMV反转率酶，150mmol的MgSO₄，25mmol的甜菜碱，30mmol的dNTP，4.5pmol的引物P1，4.5pmol的引物P2，45pmol的引物P3，以及45pmol的引物P4，其中各引物序列分别为：

P1：TGCCTTCCGCATTGTTGAG，

P2：GGAAAAGTCAGGGTGTTGGA，

P3：CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGA，

P4：CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA。

2.根据权利要求1所述的用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述聚合酶缓冲液由以下组分制成：pH 8.8的200mM Tris-HCl，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，，以及1％Triton X-100。

3.一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)根据步骤1)获得的序列运用PrimerExplore V4在线引物设计软件进行引物设计，选取保守序列区作为构建试剂盒所使用引物；

3)将步骤2)所设计的引物进行合成，运用无菌双蒸水配制LAMP反应试剂，其中LAMP反应液24μL包含的组分及浓度分别为：10U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液，10UAMV反转率酶，150mmol的MgSO₄，25mmol的甜菜碱，30mmol的dNTP，4.5pmol的引物P1，4.5pmol的引物P2，45pmol的引物P3，以及45pmol的引物P4，其中各引物序列分别为：

P1：TGCCTTCCGCATTGTTGAG，

P2：GGAAAAGTCAGGGTGTTGGA，

P3：CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGA，

P4：CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA。

4.根据权利要求1所述的用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒的制备方法，其特征在于，所述聚合酶缓冲液由以下组分制成：pH 8.8的200mMTris-HCl，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，，以及1％Triton X-100。