CN102925588B - 一种快速检测猪巨细胞病毒的lamp试剂盒 - Google Patents
一种快速检测猪巨细胞病毒的lamp试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102925588B CN102925588B CN201210271637.5A CN201210271637A CN102925588B CN 102925588 B CN102925588 B CN 102925588B CN 201210271637 A CN201210271637 A CN 201210271637A CN 102925588 B CN102925588 B CN 102925588B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lamp
- reaction
- primer
- reaction solution
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒，每个反应用量为23μL的LAMP反应液和1μL的BstDNA聚合酶，该23μL的LAMP反应液中各组分及浓度如下：2.5μL的聚合酶缓冲液，3mM的MgSO4，1M甜菜碱，0.4mMdNTP，0.25mM引物F3，0.25mM引物B3，2mM引物FIP，2mM引物BIP；其中，所述2.5μL的聚合酶缓冲液的组分及浓度为：20mM Tris-HCl、其pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，1％Triton X-100。本发明可以高效快速的对可疑PCMV感染进行检测，且检测手段简单，不需要昂贵的实验仪器，适合在临床疾病诊断中推广。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒。
背景技术
猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus，PCMV)是一种有囊膜的双链DNA病毒，隶属疱疹病毒科，β疱疹病毒亚科，巨细胞病毒属。1955年英国首次报道了本病毒的感染，1972年日本也报道了此病毒，并于1985年首次分离到病毒。目前该病毒广泛分布于世界各地，英国和日本猪群中血清抗体检测率分别达90％和98.4％.北美和澳大利亚也有报道，其中美国的发病率最高，抗体保有率为90％.我国河北、河南以及广西等地也先后报道了该病的发生。该病毒在体外增殖相对困难，据报道，仅猪肺泡巨噬细胞适宜病毒的首次分离，猪输暖管细胞和人成纤维细胞支持病毒的复制。猪巨细胞病毒的具体结构尚不清楚，仅见DNA聚合酶、gB、MCP等几个基因的研究。基于这些基因的研究，研究人员发现其同源性与人疱疹病毒6型和7型更相近，认为应将本病毒划入玫瑰疹病毒属更为恰当。另外，在异种器官移植方面，猪器官逐渐作为人类器官移植的主体，由此在进行移植时很有可能就将猪体内的潜在危险转移到人身上，猪巨细胞病毒有可能就是其中一个。
猪巨细胞病毒感染主要发生幼龄仔猪，在易感猪群中引起胚胎和仔猪死亡，表现为发育不良、鼻炎和肺炎等临床症状。成年猪多成隐形感染。猪巨细胞病毒感染的临床症状并不明显，并且无疫苗预防以及有效的治疗方法和商业化的检测试剂盒问世，因此研发检测PCMV病毒的LAMP试剂盒，对此病毒进行快速的检测，对PCMV的流行病学调查、临床诊治和疾病预防均有巨大意义。
环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本学者T.Notomi于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异性的引物针对目的序列的四个区域进行扩增，所运用的DNA聚合酶具有链置换功能，因此可以实现恒温扩增。由于其扩增依赖于目的序列的四个特异性区域，因此其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高，而且由于该反应在恒温条件下进行，因此不需要昂贵的仪器，而使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，另外在扩增反应可以在一个小时之内完成，所需时间短，且其反应产物易于观察，可以通过肉眼判定扩增样本是否为阳性。基于以上优点，LAMP至发明之日其，已被广泛用于病原的检测，如病毒性出血败血症、巨细胞病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、结核杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、禽流感、猪流感等病毒性疾病和细菌性疾病的检测。到目前为止，未发现运用LAMP方法检测PCMV病毒的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足提供一种用于检测PCMV的LAMP试剂盒，根据PCMV的基因序列设计四对特异性的引物对PCMV核酸进行恒温扩增，此扩增不需要昂贵的设备，可在一个小时内完成，具有高效的敏感性和特异性，并且仅需要通过观察反应管是否有沉淀产生即可判断扩增结果。
本发明采用如下技术方案：
一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒，每个反应用量为23μL的LAMP反应液和1μL的BstDNA聚合酶，该23μL的LAMP反应液中各组分及浓度如下：2.5μL的聚合酶缓冲液，3mM的MgSO4，1M甜菜碱，0.4mMdNTP，0.25mM引物F3，0.25mM引物B3，2mM引物FIP，2mM引物BIP；其中，所述2.5μL的聚合酶缓冲液的组分及浓度为：20mMTris-HCl、其pH 8.8，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，，1％Triton X-100；
其中各引物序列为：
F3：AAAAATATAGTTCCGCACACT；
B3：TTTCTAATCTCGGCAGCG；
FIP：TGACATGAACGTCTCTATACGTCGTTTTTTTTTTGTTAGGACGTATACCA；
BIP：TGATAGGTCTTCATATAAAGTGCCCTTTTGACCATTCAAATTTATATATCCAGC。
本发明所述用于检测PCMV的LAMP试剂盒使用方法，其步骤为：
(1)运用无菌双蒸水配制上述23μL的LAMP反应液于反应管中；
(2)取1μL待检测基因组DNA于步骤(1)中23μL的LAMP反应液中，在95℃条件下作用10min使基因组DNA解链为单链状态，作用完成后将反应管置于冰，使其快速冷却；
(3)于步骤(2)的冷却反应管中加入1μL的BstDNA聚合酶，使终反应体积为25μL.上下颠倒混匀数次，再10000rpm瞬时离心10秒，使反应液全部沉到管底；
(4)取上述步骤(3)反应的试剂，置65℃反应1小时。反应完成后观察反应管中是否出现混浊以判定扩增结果，为方便观察，可在反应后将反应管置离心机内12000转/分离心1分钟，观察管低有无白色沉淀，如果观察到白色沉淀则判为阳性。或取4μl反应终产物于2％琼脂糖凝胶(含EB染料)中电泳30min后于紫外灯下观察电泳图像为梯状条带判为阳性。
本发明所述的用于检测PCMV的LAMP试剂盒具有以下优点：
(1)操作简单，而且不需要昂贵的设备：本发明没有繁琐的操作过程，仅需要一个恒温水浴锅，即可在等温条件下完成检测。
(2)高特异性和高敏感性：运用四条引物，针对PCMVgB基因序列的六个区域进行扩增，其特异性和敏感性均比同条件下的PCR和定量PCR高，参见实施例6、7和图1、2。
(3)反应时间短，扩增可以在一个小时内完成反应。
(4)结果判定简单，可以运用肉眼判定是否出现混浊以判断是否有特异性的扩增，而且扩增完成后可以在不开盖的情况下判定结果，避免了扩增产物对后续检测的污染。
附图说明
图1为敏感性实验电泳结果，图中M为DNA分子量标准，1～8分别为101～108倍稀释度扩增结果。
图2为特异性检测结果，图中M为DNA分子量标准，1为PCMV的扩增，2～10分别为猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒、圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒和猪流感病毒扩增结果。
图3为试剂盒扩增后结果，图中“+”为阳性扩增结果，可见底部的白色沉淀；“-”为阴性扩增结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明。下述实验中所使用的方法均为常规实验方法，所使用的试剂均为常规生化试剂。
实施例1PCMVLAMP引物设计与筛选
登录美国国立生物技术中心(NCBI)网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，查找Genbank公布的PCMVgB基因的序列(AF268039、AF268042、FJ870561、FJ870562、AF394056、AF268040、AF268041、FJ595497、FJ844360、FJ870563、FJ870564、HQ721832、HQ721831、HQ686080、HQ686081、AF394057)，运用DNAstar进行序列比对后，以PCMV病毒gB基因为模板，运用PrimerExplore V4(https://primerexplorer.jp/e/)在线引物设计软件进行LAMP反应引物设计，从设计的引物序列中选取如下4条引物进行特异性、敏感性的实验，并最终确认试剂盒使用的引物序列为以下两对：
F3：AAAAATATAGTTCCGCACACT；
B3：TTTCTAATCTCGGCAGCG；
FIP：TGACATGAACGTCTCTATACGTCGTTTTTTTTTTGTTAGGACGTATACCA；
BIP：TGATAGGTCTTCATATAAAGTGCCCTTTTGACCATTCAAATTTATATATCCAGC；
实施例2确定最优反应体系
运用正交实验进行各组分的优化，设置不同的内部引物(FIP，BIP)和外部引物(F3，B3)的浓度比例：2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1；不同浓度的dNTP：0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM；不同浓度的MgSO4：2mM、3mM、4mM、5mM、6mM；不同的反应温度：61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；不同的反应时间：30min、40min、50min、60min.最后确立LAMP的最优反应体系：Bst DNA聚合酶8U，2.5μL的聚合酶缓冲液(20mMTris-HCl、其pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，，1％Triton X-100)，3mM的MgSO4，1M甜菜碱，0.4mMdNTP，0.25mM引物F3，0.25mM引物B3，2mM引物FIP，2mM引物BIP；于65℃反应60min.
实施例3试剂盒的组装(以50个反应为例)
本发明所述试剂盒由LAMP反应液和BstDNA聚合酶(8U/μL)构成，该LAMP反应液由灭菌双蒸水配制，其中规格为50个反应的试剂盒中含有：
(1)酶的配制：取浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶大片段50μl，装置无核酸酶的塑料瓶中。
(2)缓冲液的配制：取125μl聚合酶缓冲液(20mM Tris-HCl、其pH 8.8，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，，1％Triton X-100)，装于无核酸酶的塑料瓶中。
(3)引物的配制：取浓度为12.5mM的F325μl，取浓度为12.5mM的B325μ1，取浓度为25mM的FIP 100μl，取浓度为25mM的BIP 100μl，分别装于4个无核酸酶的塑料瓶中。
(4)dNTP的配制：取浓度为2.5mM的dNTP 200μl，装于无核酸酶的塑料瓶中。
(5)MgSO4的配制：取浓度为25mM的MgSO4150μl，装于无核酸酶的塑料瓶中。
(6)甜菜碱的配制：取浓度为5mM的甜菜碱250μl，装于无核酸酶的塑料瓶中。
将配制好的LAMP反应液置-20℃或-80℃冷冻保存运输，尽量避免反复冻融。
实施例4病毒基因组DNA的提取
运用酚-氯仿法提取病毒基因组DNA，其步骤为：
(1)取约0.5mg感染PCMV病猪肺、淋巴结等组织病料于研钵中，加入1ml无菌水研磨破碎组织；
(2)取步骤(1)中病料研磨于1ml反应管中，反复冻融3次使组织细胞破碎释放病毒，后12000rpm离心5min；
(3)取步骤(2)中上清液400μl，加入500μl饱和酚，上下颠倒混匀，静置5min后12000rpm离心5min；
(4)取步骤(3)中上清液，加入饱和酚、氯仿各200μl，上下颠倒混匀，静置5min后12000rpm离心5min；(可重复此步骤，效果会更佳)；
(5)吸取步骤(4)中上清液(注：不要吸到中间层蛋白)，加入500μl氯仿，上下颠倒混匀，静置5min后12000rpm离心5min；
(6)吸取步骤(5)中上清液，加入约750μl异丙醇，轻摇约2min，室温静置10～20min，12000rpm离心5min；
(7)弃掉步骤(6)中上清液，用1ml冰冻的75％的乙醇洗涤沉淀和管壁，静置5min后12000rpm离心5min；
(8)弃掉步骤(7)中上清液，室温干燥沉淀至无乙醇味即可；
(9)于步骤(8)的干燥反应管中加入30～50μl灭菌双蒸水溶解基因组DNA，-20℃保存备用。
实施例5PCMV LAMP试剂盒的使用及结果判定
取23μL的LAMP反应液，加入到0.2ml薄壁PCR反应管中，随后加入1μL提取的基因组DNA样品，轻微混匀，于95℃反应5到10分钟。后加入1μL的BstDNA聚合酶，置水浴锅中，65℃反应60分钟。反应完毕后取出PCR管，12000转/分离心1分钟，然后观察PCR反应管底部有无白色沉淀，如有沉淀产生则判定为阳性(如图3所示)，或取4μl反应终产物于2％琼脂糖凝胶(含EB染料)中电泳30min后于紫外灯下观察电泳图像，其图像为梯状条带即为阳性。
实施例6试剂盒的敏感性实验
用酚-氯仿法提取PCMV阳性病料DNA，进行10倍系列稀释，选取101～8等8个稀释度，用该发明制备的试剂盒进行敏感性实验，对反应结果运用凝胶电泳和肉眼观察沉淀等方法进行验证。电泳结果如图1显示，随着模板浓度的降低，其电泳结果和离心观察沉淀量有所差异，但不显著。101倍～108倍稀释均可检测到PCMV核酸。
实施例7试剂盒的特异性实验验证
分别运用常规DNA和RNA提取方法提取猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒、圆环病毒、猪细小病毒等病毒的DNA或者RNA，将提取的RNA运用常规方法反转录为cDNA后，以灭菌双蒸水作为阴性对照，与提取的DNA一同运用该试剂盒进行检测。检测结果如图2所示，发现PCMV呈阳性，其它均成阴性。该结果表明，本发明制备的检测PCMV的试剂盒具有特异性。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.一种快速检测猪巨细胞病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，每个反应用量为23μL的LAMP反应液和1μL的BstDNA聚合酶，该23μL的LAMP反应液中各组分及浓度如下：2.5μL的聚合酶缓冲液，3mM的MgSO4，1M甜菜碱，0.4mMdNTP，0.25mM引物F3，0.25mM引物B3，2mM引物FIP，2mM引物BIP；其中，所述2.5μL的聚合酶缓冲液的组分及浓度为：20mM Tris-HCl、其pH8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，1％Triton X-100；
其中各引物序列为：
F3：AAAAATATAGTTCCGCACACT；
B3：TTTCTAATCTCGGCAGCG；
FIP：TGACATGAACGTCTCTATACGTCGTTTTTTTTTTGTTAGGACGTATACCA；
BIP：TGATAGGTCTTCATATAAAGTGCCCTTTTGACCATTCAAATTTATATATCCAGC。
2.权利要求1中LAMP试剂盒的非诊断目的的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)运用无菌双蒸水配制权利要求1所述的23μL的LAMP反应液于反应管中；
(2)取1μL待检测基因组DNA于步骤(1)中23μL的LAMP反应液中，在95℃条件下作用10min使基因组DNA解链为单链状态，作用完成后将反应管置于冰上，使其快速冷却；
(3)于步骤(2)冷却的反应管中加入1μL的BstDNA聚合酶，使终反应体积为25μL上下颠倒混匀数次，再10000rpm瞬时离心0.5min，使反应液全部沉到管底；
(4)将步骤(3)中所得反应物于65℃恒温水浴锅中，反应60min；
(5)反应完毕后取出反应管12000rpm离心1min，通过观察管底是否有沉淀，或取4μl反应终产物于2％琼脂糖凝胶中电泳30min后于紫外灯下观察电泳图像来判断阴阳性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210271637.5A CN102925588B (zh) | 2012-08-02 | 2012-08-02 | 一种快速检测猪巨细胞病毒的lamp试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210271637.5A CN102925588B (zh) | 2012-08-02 | 2012-08-02 | 一种快速检测猪巨细胞病毒的lamp试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102925588A CN102925588A (zh) | 2013-02-13 |
| CN102925588B true CN102925588B (zh) | 2014-04-23 |
Family
ID=47640511
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210271637.5A Expired - Fee Related CN102925588B (zh) | 2012-08-02 | 2012-08-02 | 一种快速检测猪巨细胞病毒的lamp试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102925588B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111073955B (zh) * | 2015-09-02 | 2022-10-21 | 上海产业技术研究院 | 霍乱弧菌o1群的核酸快速恒温检测方法及应用 |
| CN105504029A (zh) * | 2016-01-04 | 2016-04-20 | 中国科学院微生物研究所 | 一种检测猪巨细胞病毒抗体的方法及其专用试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102260748A (zh) * | 2010-05-26 | 2011-11-30 | 浙江省血液中心 | 环介导等温扩增检测人巨细胞病毒的方法、检测用试剂盒和引物组 |
-
2012
- 2012-08-02 CN CN201210271637.5A patent/CN102925588B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102260748A (zh) * | 2010-05-26 | 2011-11-30 | 浙江省血液中心 | 环介导等温扩增检测人巨细胞病毒的方法、检测用试剂盒和引物组 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 刘兴彩 等.猪巨细胞病毒(porcine Cytomegalovirus)PCR诊断技术的建立.《中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七界全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会会议论文集》.2009,810－812. |
| 刘红亮 等.猪巨细胞病毒PCR检测方法的建立及应用.《动物医学进展》.2011,第32卷(第7期),5－8. |
| 李晶 等.猪巨细胞病毒的PCR检测及其gB 基因特征分析.《湖南农业大学学报》.2009,第35卷(第5期),521－525. |
| 杨志雄 等.环介导等温扩增检测孕妇血清中巨细胞病毒方法的建立.《江苏医药》.2010,第36卷(第5期),500－502. |
| 猪巨细胞病毒(porcine Cytomegalovirus)PCR诊断技术的建立;刘兴彩 等;《中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七界全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会会议论文集》;20091231;810－812 * |
| 猪巨细胞病毒PCR检测方法的建立及应用;刘红亮 等;《动物医学进展》;20110731;第32卷(第7期);5－8 * |
| 猪巨细胞病毒的PCR检测及其gB 基因特征分析;李晶 等;《湖南农业大学学报》;20091031;第35卷(第5期);521－525 * |
| 环介导等温扩增检测孕妇血清中巨细胞病毒方法的建立;杨志雄 等;《江苏医药》;20100331;第36卷(第5期);500－502 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102925588A (zh) | 2013-02-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109487008B (zh) | 呼吸道病原体的多重pcr检测试剂盒、用途及其使用方法 | |
| CN103572378A (zh) | 基于Ion ProtonTM测序平台的小片段DNA文库的构建方法及其应用 | |
| CN101712973B (zh) | 常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法 | |
| CN102796727B (zh) | 革兰氏阳性细菌核酸提取方法 | |
| CN104726614A (zh) | 牛传染性鼻气管炎病毒的检测引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN110669870B (zh) | 一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN103484571B (zh) | 传染性皮下及造血组织坏死病毒的lamp检测引物组、检测试剂盒及检测方法 | |
| US20190225958A1 (en) | Method for enrichment and purification of cell-free dna from body fluid for high-throughput processing | |
| CN106399585A (zh) | 检测ⅰ群禽腺病毒的通用pcr引物、方法及检测试剂盒 | |
| CN103789277A (zh) | 一种包含hcv和hiv核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法 | |
| CN113249517A (zh) | 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒 | |
| CN102925588B (zh) | 一种快速检测猪巨细胞病毒的lamp试剂盒 | |
| CN108034741A (zh) | 一种双芽巴贝斯虫巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法 | |
| Wei et al. | Development of efficient, sensitive, and specific detection method for Encephalomyocarditis virus based on CRISPR/Cas13a | |
| CN106702020A (zh) | 一种针对患病鸡群j亚型禽白血病的诊断方法 | |
| CN103146846A (zh) | 一种基于单一标准品的四色荧光定量pcr方法和试剂盒 | |
| CN110643740B (zh) | 帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN102618661B (zh) | 一种转基因大米Bt63检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN1978664A (zh) | 通过pcr鉴定山羊早期胚胎性别的方法 | |
| CN116479189A (zh) | 一种合胞病毒b亚型的全基因捕获方法、引物组合和试剂盒 | |
| CN103131797A (zh) | 一种博卡病毒实时荧光pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN115786587A (zh) | 一种用于同时检测4种病原体的多重pcr的引物组及其检测方法、试剂盒 | |
| KR101912488B1 (ko) | 분자 검출 분석법 | |
| CN103103261A (zh) | 检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性试剂盒及制备方法 | |
| CN102559939B (zh) | 鉴别71型和非71型肠道病毒的单管二重一步法rt-pcr引物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140423 |