CN110283944A - 一种特异检测猪瘟病毒野毒株的rt-lamp引物组及检测方法 - Google Patents

一种特异检测猪瘟病毒野毒株的rt-lamp引物组及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异检测猪瘟病毒野毒株的RT‑LAMP引物组及检测方法。本发明保护一套用于检测猪瘟病毒野毒株的引物组合，包括序列表的序列1至序列6所示的6条引物。上述引物组合能准确检测猪瘟病毒野毒株，与猪瘟病毒疫苗株无交叉反应，同时与猪其它种类病毒无交叉反应。经过分析，上述引物组合能覆盖NCBI数据库中约90条野毒株序列，高于目前现有技术的检测覆盖度。本发明采用一步法检测猪瘟病毒，1小时之内即可出结果，检测灵敏度可以达到100拷贝/μL。本发明建立的方法既具有简便、快速、灵敏、特异的优势，又避免了人为判定引起的误差以及开盖引起的环境污染。

Description

一种特异检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物组及检测方法
技术领域
本发明涉及一种特异检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物组及检测方法。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)引起的急性、热性、高度接触性传染病，有“猪霍乱”之俗称。猪瘟呈世界性分布，危害程度高，给养猪业带来了严重的经济损失，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病，并规定为国际重点检疫对象，我国将其列为一类传染病，是我国强制免疫的四大疫病之一。
CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员，基因组为单股正链RNA，长约12.3kb。基因组两端分别为非帽子结构的5′UTR(untranslated region，UTR)和无polyA结构的3′UTR，在二者中间包含一个较大的开放阅读框，编码3898个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白在宿主的信号肽酶和病毒的几个蛋白酶作用下被裂解为四种结构蛋白和八种非结构蛋白，按照从氨基端到羧基端的顺序分别是Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。CSFV的非编码区在病毒基因组复制和多聚蛋白翻译中发挥调控作用。
近年来，我国猪瘟发病特点呈散发性、温和性、多种病原混合感染、隐性感染和亚病毒感染，在病理剖检上也常出现非典型猪瘟的病理变化，不利于临床诊断。由于猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的大规模应用，使得野毒感染猪与疫苗免疫猪的鉴别变得困难。传统CSFV诊断方法要包括病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金试纸条、荧光抗体试验、常规RT-PCR等。但这些方法在敏感性、特异性、时效性上都存在一些问题。比如病毒分离鉴定，操作繁琐，费时费力，ELISA等血清实验存在交叉反映，且灵敏度低。胶体金试纸虽然方便，但是特异性、敏感性都差，易存在假阳性。
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。其反应结果可通过肉眼观察，但是肉眼观察存在人为误差，在病毒量少时不能够准确判定。也有研究者在LAMP反应结束后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但此过程必须开盖添加染料，极其容易污染环境；而在反应前加入荧光染色试剂，在紫外灯下观察，但此方法对弱阳性的判断不够准确。
现有技术中建立的CSFV检测的RT-LAMP方法存在如下缺陷：(1)设计的引物存在不能区分猪瘟病毒野毒株与疫苗株的情况，这样会造成未感染的免疫猪被误杀；(2)设计的引物进行BLAST分析，仅覆盖目前NCBI数据库中的42条野毒株序列，在检出率上较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种速度快、灵敏度高、特异性强的猪瘟病毒野毒株RT-LAMP检测用引物及检测方法。
本发明首先保护引物组合，由引物CSFV-F3、引物CSFV-B3、引物CSFV-FIP、引物CSFV-BIP、引物CSFV-LF和引物CSFV-LB组成；
所述引物CSFV-F3为如下(a1)或(a2)；
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述CSFV-B3为如下(a3)或(a4)；
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述CSFV-FIP为如下(a5)或(a6)；
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述CSFV-BIP为如下(a7)或(a8)；
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述CSFV-LF为如下(a9)或(a10)；
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述CSFV-LB为如下(a11)或(a12)；
(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合中，所述引物CSFV-F3、引物CSFV-B3、引物CSFV-FIP、引物CSFV-BIP、引物CSFV-LF和引物CSFV-LB的摩尔比为0.3：0.3：2.4：2.4：1：1。
所述引物组合的用途为如下(b1)至(b4)中的任意一种：
(b1)鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒；
(b2)制备用于鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒的试剂盒；
(b3)鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒；
(b4)制备用于鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒的试剂盒。
所述引物组合的应用也属于本发明的保护范围。
所述引物组合的应用为如下(b1)至(b4)中的任意一种：
(b1)鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒；
(b2)制备用于鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒的试剂盒；
(b3)鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒；
(b4)制备用于鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒的试剂盒。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒；
(c2)鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的基因组RNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组RNA为模板，采用所述引物组合进行反转录-环介导等温扩增；如果采用所述引物组合可以实现对模板的阳性扩增，则所述病毒为或候选为猪瘟病毒，如果采用所述引物组合不能实现对模板的阳性扩增，则所述病毒不为或候选不为猪瘟病毒。
本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：检测待测病毒基因组RNA的反转录产物中是否含有所述引物组合的靶序列；如果所述反转录产物中含有所述引物组合的靶序列，则待测病毒为或候选为猪瘟病毒，如果所述反转录产物中不含有所述引物组合的靶序列，则待测病毒不为或候选不为猪瘟病毒。
本发明还保护一种鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总RNA；
(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用所述引物组合进行反转录-环介导等温扩增；如果采用所述引物组合可以实现对模板的阳性扩增，则所述待测样本中含有或疑似含有猪瘟病毒，如果采用所述引物组合不能实现对模板的阳性扩增，则所述待测样本中不含有或疑似不含有猪瘟病毒。
本发明还保护一种鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：检测待测样本总RNA的反转录产物中是否含有所述引物组合的靶序列；如果所述反转录产物中含有所述引物组合的靶序列，则待测样本含有或疑似含有猪瘟病毒，如果所述反转录产物中不含有所述引物组合的靶序列，则待测样本不含有或疑似不含有猪瘟病毒。
以上任一所述方法中，所述反转录-环介导等温扩增的反应体系中，引物CSFV-F3和CSFV-B3的浓度具体可为0.3mM，引物CSFV-FIP和CSFV-BIP的浓度具体可为2.4mM，引物CSFV-LF和CSFV-LB的浓度具体可为1mM。
以上任一所述方法中，所述反转录-环介导等温扩增的反应体系具体可为：反应液10μL，引物CSFV-F3和CSFV-B3各0.12μL，引物CSFV-FIP和CSFV-BIP各0.96μL，引物CSFV-LF和CSFV-LB各0.4μL，2μL模板RNA(5pg-50pg)，AMV逆转录酶0.5μL，无RNA酶的水补水至20μL。反应体系中，引物CSFV-F3和CSFV-B3的浓度均为0.3mM，引物CSFV-FIP和CSFV-BIP的浓度均为2.4mM，引物CSFV-LF和CSFV-LB的浓度均为1mM。
以上任一所述方法中，所述反转录-环介导等温扩增的反应程序为：60℃-65℃恒温50min。
所述反转录-环介导等温扩增的反应程序具体可为：65℃恒温50min。
以上任一所述方法中，所述阳性扩增的判断标准具体可为：在45min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。
以上任一所述待测病毒具体可为猪瘟病毒(CSFV)、猪瘟病毒疫苗、猪流感病毒(SIV)、高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)或伪狂犬病病毒(PRV)。
以上任一所述猪瘟病毒具体为猪瘟病毒野毒株，不包括猪瘟病毒疫苗株。
本发明提供的引物能准确检测猪瘟病毒野毒株，与猪瘟病毒疫苗株无交叉反应，防止未感染的免疫猪被误杀，同时与猪其它种类病毒(如流感病毒、高致病性猪蓝耳病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒和伪狂犬病毒等)无交叉反应。经过BLAST分析，本发明引物能覆盖NCBI数据库中约90条野毒株序列，高于目前现有技术的检测覆盖度，引物灵敏度高、特异性强。本发明在RT-LAMP反应体系中加入荧光染料，AMV逆转录酶，实现一步法检测猪瘟病毒，结合荧光定量实现全程实时监控，1小时之内即可出结果。检测灵敏度可以达到100拷贝/μL。该方法既具有简便、快速、灵敏、特异的优势，又避免了人为判定引起的误差以及开盖引起的环境污染。
附图说明
图1为实施例1中使用引物组合1进行反转录-环介导等温扩增的结果。
图2为实施例1中使用引物组合2进行反转录-环介导等温扩增的结果。
图3为实施例1中使用引物组合3进行反转录-环介导等温扩增的结果。
图4为实施例1中使用引物组合4进行反转录-环介导等温扩增的结果。
图5为实施例1中使用引物组合5进行反转录-环介导等温扩增的结果。
图6为实施例1中使用引物组合6进行反转录-环介导等温扩增的结果。
图7为实施例1中使用引物组合7进行反转录-环介导等温扩增的结果。
图8为实施例1中使用引物组合8进行反转录-环介导等温扩增的结果。
图9为实施例1中使用引物组合9进行反转录-环介导等温扩增的结果。
图10为实施例1中使用引物组合10进行反转录-环介导等温扩增的结果。
图11为实施例2的特异性检测结果。
图12为实施例3中使用反应体系1的检测结果。
图13为实施例3中使用反应体系2的检测结果。
图14为实施例3中使用反应体系3的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
反转录-环介导等温扩增中使用的反应液为博奥生物集团有限公司的产品，产品目录号为CP.440020。
猪瘟病毒(CSFV)为猪瘟病毒石门株AV1411(04/08/87)，购自中国兽药监察所。
猪瘟病毒疫苗为猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株(CSFV C株)，购自中牧实业股份有限公司。
猪流感病毒(SIV)购自ATCC，产品号为 VR-333TM。
高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)为高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-JXA1)，购自中国兽药监察所。
猪细小病毒(PPV)购自北纳生物BNCC，产品号为BNCC124946。
猪圆环病毒(PCV2)为猪圆环病毒2型，购自北纳生物BNCC，产品号为BNCC128527。
伪狂犬病病毒(PRV)购自北纳生物BNCC，产品号为BNCC 129649。
拷贝数计算公式如下：
(6.02×1023copies/摩尔)×(x ng/μl×10-9)/(RNA碱基数×340)＝copies/μl。
其中，x ng/μl＝(OD260)×(稀释倍数)×(40)。
实施例1、引物组合的筛选和制备
一、引物组合的筛选
1、设计合成如表1所示的10个候选的引物组合。
表1候选的引物组合序列
2、提取猪瘟病毒(CSFV)的RNA，分别采用表1中的10个引物组合进行反转录-环介导等温扩增检测。
反转录-环介导等温扩增的反应体系(20μL)：反应液10μL，引物F3和B3各0.12μL，引物FIP和BIP各0.96μL，引物LF和LB各0.4μL，2μL模板RNA(50pg)，AMV逆转录酶0.5μL，无RNA酶的水补水至20μL。反应体系中，引物F3和B3的浓度均为0.3mM，引物FIP和BIP的浓度均为2.4mM，引物LF和LB的浓度均为1mM。
反转录-环介导等温扩增的反应程序：65℃恒温50min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
每个反应体系设置3次重复。
如果在45min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的猪瘟病毒(CSFV)可以被检测出来。
如果在45min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的猪瘟病毒(CSFV)不能被检测出来。
检测结果如图1至图10所示。图1至图10依次对应采用引物组合1至引物组合10进行检测的结果，其中，每张图中的三条扩增曲线为三次重组实验的结果。
结果显示，引物组合1最好，三次重复出峰时间段，重复性好。
二、引物组合的制备
用于检测猪瘟病毒(CSFV)的引物组合由如下所示的引物CSFV-F3、引物CSFV-B3、引物CSFV-FIP、引物CSFV-BIP、引物CSFV-LF和引物CSFV-LB组成。
CSFV-F3：5'-CCACAGTGGAAAATGAAGAT-3'(序列表的序列1)；
CSFV-B3：5'-CTGTAACCTGTCTCATTTGC-3'(序列表的序列2)；
CSFV-FIP：5'-TGCCCCCCTGTGTAGACCACTGTAAGTTGGGGGGCA-3'(序列表的序列3)；
CSFV-BIP：5'-CAAGTAAAACAATGCAAATGGTGTGCAAAATGCACTTACCTATGGG-3'(序列表的序列4)；
CSFV-LF：5'-GGTTCACCTTTCACACATGTCC-3'(序列表的序列5)；
CSFV-LB：5'-TCGACTTCAACGAGCCTGA-3'(序列表的序列6)。
所述引物组合中，引物CSFV-F3、引物CSFV-B3、引物CSFV-FIP、引物CSFV-BIP、引物CSFV-LF和引物CSFV-LB的摩尔比为0.3：0.3：2.4：2.4：1：1。
经过BLAST分析，所述引物组合能覆盖NCBI数据库中约90条猪瘟病毒野毒株序列。
实施例2、特异性
待测样本：猪瘟病毒(CSFV)、猪瘟病毒疫苗、猪流感病毒(SIV)、高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)。
1、提取猪瘟病毒(CSFV)、猪瘟病毒疫苗、猪流感病毒(SIV)和高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的病毒基因组RNA。
2、提取猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)的病毒基因组DNA。
3、以步骤1和2中得到的病毒基因组核酸为模板，采用实施例1的步骤二制备的引物组合进行反转录-环介导等温扩增检测。
反转录-环介导等温扩增的反应体系(20μL)：反应液10μL，引物F3和B3各0.12μL，引物FIP和BIP各0.96μL，引物LF和LB各0.4μL，2μL病毒基因组核酸(50pg)，AMV逆转录酶0.5μL(病毒基因组核酸为RNA时添加)，无RNA酶的水补水至20μL。反应体系中，引物F3和B3的浓度均为0.3mM，引物FIP和BIP的浓度均为2.4mM，引物LF和LB的浓度均为1mM。
反转录-环介导等温扩增的反应程序：65℃恒温50min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
如果在45min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中存在猪瘟病毒(CSFV)。
如果在45min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中不存在猪瘟病毒(CSFV)。
结果如图11所示。结果表明，当待测样本为猪瘟病毒时显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为猪瘟病毒疫苗、猪流感病毒(SIV)、高致病猪蓝耳病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)的时候均不显示阳性扩增曲线。
上述结果说明，本发明提供的引物组对其靶标基因具有很高的特异性，能准确检测猪瘟病毒野毒株，与猪瘟病毒疫苗株无交叉反应。
实施例3、灵敏性
待测样本：猪瘟病毒(CSFV)。
1、提取猪瘟病毒(CSFV)的病毒基因组RNA。
2、以步骤1得到的病毒基因组RNA为模板，采用实施例1的步骤二制备的引物组合进行反转录-环介导等温扩增检测。
反转录-环介导等温扩增的反应体系(20μL)：反应液10μL，引物F3和B3各0.12μL，引物FIP和BIP各0.96μL，引物LF和LB各0.4μL，2μL病毒基因组核酸稀释液，AMV逆转录酶0.5μL，无RNA酶的水补水至20μL。反应体系中，引物F3和B3的浓度均为0.3mM，引物FIP和BIP的浓度均为2.4mM，引物LF和LB的浓度均为1mM。
建立如下反应体系：
反应体系1中，1μL病毒基因组核酸酸稀释液含有的基因组拷贝数为103；
反应体系2中，1μL病毒基因组核酸酸稀释液含有的基因组拷贝数为102；
反应体系3中，1μL病毒基因组核酸酸稀释液含有的基因组拷贝数为101；
每个反应体系设置20次重复。
反转录-环介导等温扩增的反应程序：65℃恒温50min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
如果在45min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系能够检测到猪瘟病毒(CSFV)。
如果在45min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系不能够检测到猪瘟病毒(CSFV)。
结果如图12-14所示。图12至图14依次对应采用反应体系1至反应体系3进行检测的结果，其中，每张图中的20条扩增曲线为20次重组实验的结果。
结果表明，本发明的引物组合检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103和102时，20个检测均可检测出来且重复性好，拷贝数为101时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组合的灵敏度为102个拷贝数/反应体系。
序列表
<110> 博奥生物集团有限公司
<120> 一种特异检测猪瘟病毒野毒株的RT-LAMP引物组及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccacagtgga aaatgaagat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtaacctg tctcatttgc 20
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcccccctg tgtagaccac tgtaagttgg ggggca 36
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagtaaaac aatgcaaatg gtgtgcaaaa tgcacttacc tatggg 46
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttcacctt tcacacatgt cc 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgacttcaa cgagcctga 19

Claims (9)

1.引物组合，由引物CSFV-F3、引物CSFV-B3、引物CSFV-FIP、引物CSFV-BIP、引物CSFV-LF和引物CSFV-LB组成；
所述引物CSFV-F3为如下(a1)或(a2)；
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述CSFV-B3为如下(a3)或(a4)；
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述CSFV-FIP为如下(a5)或(a6)；
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述CSFV-BIP为如下(a7)或(a8)；
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述CSFV-LF为如下(a9)或(a10)；
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述CSFV-LB为如下(a11)或(a12)；
(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述引物CSFV-F3、引物CSFV-B3、引物CSFV-FIP、引物CSFV-BIP、引物CSFV-LF和引物CSFV-LB的摩尔比为0.3：0.3：2.4：2.4：1：1。
3.权利要求1或2所述的引物组合的应用，为如下(b1)至(b4)中的任意一种：
(b1)鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒；
(b2)制备用于鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒的试剂盒；
(b3)鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒；
(b4)制备用于鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒的试剂盒。
4.含有权利要求1或2所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒；
(c2)鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒。
5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
6.一种鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测病毒的基因组RNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组RNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物组合进行反转录-环介导等温扩增；如果采用所述引物组合可以实现对模板的阳性扩增，则所述病毒为或候选为猪瘟病毒，如果采用所述引物组合不能实现对模板的阳性扩增，则所述病毒不为或候选不为猪瘟病毒。
7.一种鉴定待测病毒是否为猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：检测待测病毒基因组RNA的反转录产物中是否含有权利要求1或2所述引物组合的靶序列；如果所述反转录产物中含有权利要求1或2所述引物组合的靶序列，则待测病毒为或候选为猪瘟病毒，如果所述反转录产物中不含有权利要求1或2所述引物组合的靶序列，则待测病毒不为或候选不为猪瘟病毒。
8.一种鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总RNA；
(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物组合进行反转录-环介导等温扩增；如果采用所述引物组合可以实现对模板的阳性扩增，则所述待测样本中含有或疑似含有猪瘟病毒，如果采用所述引物组合不能实现对模板的阳性扩增，则所述待测样本中不含有或疑似不含有猪瘟病毒。
9.一种鉴定待测样本是否含有猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：检测待测样本总RNA的反转录产物中是否含有权利要求1或2所述引物组合的靶序列；如果所述反转录产物中含有权利要求1或2所述引物组合的靶序列，则待测样本含有或疑似含有猪瘟病毒，如果所述反转录产物中不含有权利要求1或2所述引物组合的靶序列，则待测样本不含有或疑似不含有猪瘟病毒。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101696454A (zh) * 2009-10-22 2010-04-21 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的rt-lamp引物
CN108315485A (zh) * 2018-04-11 2018-07-24 张薇 一种用于检测猪瘟病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒
CN109207644A (zh) * 2018-11-14 2019-01-15 南阳师范学院 用于鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的引物对及rt-pcr检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101696454A (zh) * 2009-10-22 2010-04-21 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 用于可视化检测猪瘟病毒野毒株的rt-lamp引物
CN108315485A (zh) * 2018-04-11 2018-07-24 张薇 一种用于检测猪瘟病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒
CN109207644A (zh) * 2018-11-14 2019-01-15 南阳师范学院 用于鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的引物对及rt-pcr检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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