CN109457054A - 特异检测猪伪狂犬病毒的lamp检测引物及其应用、检测试剂和方法 - Google Patents

特异检测猪伪狂犬病毒的lamp检测引物及其应用、检测试剂和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法。该LAMP检测引物的序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。本发明引物组可精确检测猪伪狂犬病毒野毒，与猪伪狂犬病毒疫苗、猪流行腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒等无交叉反应。利用本发明的检测方法进行灵敏度测试，发现该套引物灵敏度达到50拷贝/μL。本发明筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，不需中途开盖，避免污染。

Description

特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂 和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法。
背景技术
猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。该病对不同年龄的猪都有危害，成年猪耐过后成为长期的带毒、排毒污染源。仔猪病死率100％。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。一些专家认为，全世界由PR造成的损失每年可达几十亿美元，仅低于口蹄疫(FMD)和猪瘟(CSF)。PRV属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、水痘病毒属。PRV基因组为双股线状DNA，基因组大小约为150kb，G+C含量高达70％以上，包含的开放阅读框在70个以上，能够编码70～100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白质。已发现的11种糖蛋白中，gB、gD、gH、gL、gK为病毒增殖必需的糖蛋白；gE、gI、gG、gC、gM、gN为非必需糖蛋白此类蛋白为决定毒力因素的因子。其中gE基因是PRV的主要毒力决定因子，是至今发现的所有野毒株都表达的一种糖蛋白，也是世界动物卫生组织所规定基因缺失疫苗的缺失基因，因此可以通过检测gE基因来区分猪伪狂犬病毒疫苗与野毒感染。
目前PRV的常规检测方法包括：1)病原学诊断，即病毒分离﹑病毒接种及动物感染，被称为诊断PRV的黄金标准；2)血清学方法：琼脂免疫扩散试验(AGID)、中和试验(NT)、乳胶凝集试验(LAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)；3)聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR、taqman探针法等。但是病毒分离鉴定由于费时费力而不适于临床检测；由于病毒感染特异性抗体出现较晚，血清学方法也难以用于早期诊断，而且容易出现交叉反应。常规的PCR、巢式PCR等扩增反应后需要电泳检测，耗时较长；taqman探针法特异性高，灵敏度也很好，但是探针只能与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段进行结合，所以一旦病毒出现细微碱基变异，就很难被检测到。所以探针的覆盖度很难保证。只有多个探针检测一个指标才可以提高覆盖度，但是这样成本太高。
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。目前仅有一个利用LAMP技术检测猪伪狂犬病毒的专利被授权，该专利(用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒及其制备方法)在反应结束后的体系中加入SYBR Green I染料通过观察浊度和颜色变化的方法来检测扩增产物，但此过程必须开盖添加染料，极其容易污染环境，对弱阳性的判断不够准确；此外该专利反应产物还通过EB染色进行电泳观察结果，操作繁琐，耗时较长。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法。该LAMP检测引物可精确检测猪伪狂犬病毒野毒，与其它病毒无交叉反应，且具有灵敏度高、特异性强、准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了LAMP检测引物，该引物的序列如下：
外引物PRV-F3：序列如SEQ ID NO：1所示；
外引物PRV-B3：序列如SEQ ID NO：2所示；
内引物PRV-FIP：序列如SEQ ID NO：3所示；
内引物PRV-BIP：序列如SEQ ID NO：4所示；
环引物PRV-LF：序列如SEQ ID NO：5所示；
环引物PRV-LB：序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明在LAMP反应前的体系中加入荧光染料，结合荧光定量实现全程实时监控，1小时之内即可出结果。检测灵敏度可以达到50拷贝/μL。该方法既具有简便、快速、灵敏、特异的优势，又避免了人为判定引起的误差以及开盖引起的环境污染。众所周知LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。PRV基因组GC含量70％左右，常规PCR扩增难度大，对于需要4-6条的LAMP体系难度更大。而且利用引物设计软件设计不出符合要求的LAMP引物，所以通过人工比对分析猪伪狂犬病毒的gE基因的保守区段，手动设计多套LAMP引物，最终筛选出一套特异性好，灵敏度高的引物。该套引物不仅可区分猪流感病毒(SIV)、高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)等病毒，也可区分猪伪狂犬病毒疫苗，防止未感染的免疫猪被误杀。
本发明还提供了该LAMP检测引物在制备猪伪狂犬病毒检测试剂中的应用。
本发明还提供了一种猪伪狂犬病毒检测试剂，包括本发明提供的LAMP检测引物。
作为优选，该猪伪狂犬病毒检测试剂还包括反应缓冲液、模板DNA、、不含RNA酶的水。
作为优选，猪伪狂犬病毒检测试剂的反应体系为：
外引物：各0.10～0.15μL；
内引物：各0.9～1.0μL；
环引物：各0.35～0.45μL；
反应缓冲液：10μL；
模板DNA：2μL；
不含RNA酶的水：补足至20μL。
优选地，猪伪狂犬病毒检测试剂的反应体系为：
外引物：各0.12μL；
内引物：各0.96μL；
环引物：各0.4μL；
反应缓冲液：10μL；
模板DNA：2μL；
不含RNA酶的水：补足至20μL。
作为优选，外引物的浓度为0.25～0.35mM，内引物的浓度为2.2～2.6mM，环引物的浓度为0.9～1.1mM。
优选地，外引物的浓度为0.3mM，内引物的浓度为2.4mM，环引物的浓度为1mM。
作为优选，反应缓冲液为2×反应缓冲液。
作为优选，猪伪狂犬病毒检测试剂的检测反应条件为：60℃～65℃恒温反应50min。
优选地，猪伪狂犬病毒检测试剂的检测反应条件为：65℃恒温反应50min。
本发明还提供了一种以非诊断目的的检测猪伪狂犬病毒的方法，使用本发明LAMP检测引物或者猪伪狂犬病毒检测试剂进行LAMP扩增。
作为优选，检测猪伪狂犬病毒的方法的反应体系为：
外引物：各0.10～0.15μL；
内引物：各0.9～1.0μL；
环引物：各0.35～0.45μL；
反应缓冲液：10μL；
模板DNA：2μL；
不含RNA酶的水：补足至20μL。
优选地，检测猪伪狂犬病毒的方法的反应体系为：
外引物：各0.12μL；
内引物：各0.96μL；
环引物：各0.4μL；
反应缓冲液：10μL；
模板DNA：2μL；
不含RNA酶的水：补足至20μL。
作为优选，外引物的浓度为0.25～0.35mM，内引物的浓度为2.2～2.6mM，环引物的浓度为0.9～1.1mM。
优选地，外引物的浓度为0.3mM，内引物的浓度为2.4mM，环引物的浓度为1mM。
作为优选，反应缓冲液为2×反应缓冲液。
作为优选，检测猪伪狂犬病毒的检测反应条件为：60℃～65℃恒温反应50min。
优选地，检测猪伪狂犬病毒的检测反应条件为：65℃恒温反应50min。
上述的LAMP检测方法中，检测结果通过观察实时荧光PCR仪出峰时间。
本发明提供了特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法。该LAMP检测引物的序列如下：外引物PRV-F3序列如SEQ ID NO：1所示；外引物PRV-B3序列如SEQ ID NO：2所示；内引物PRV-FIP序列如SEQ ID NO：3所示；内引物PRV-BIP序列如SEQID NO：4所示；环引物PRV-LF序列如SEQ ID NO：5所示；环引物PRV-LB序列如SEQ ID NO：6所示。本发明具有的技术效果为：
本发明使用LAMP技术在实时荧光PCR仪中实时检测样品中的猪伪狂犬病毒。该引物组可精确检测猪伪狂犬病毒野毒，与猪伪狂犬病毒疫苗、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)等无交叉反应。
本发明筛选到的引物灵敏度高(检测最低限为50拷贝/μL)、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，不需中途开盖，避免污染。
附图说明
图1～10分别为实施例1中引物组合1～10的扩增曲线；
图11为实施例2中引物组PRV的扩增曲线；
图12～14分别为在基因组拷贝数1×102、5×101、101时采用引物组PRV的扩增曲线；
图15～17分别为在基因组拷贝数1×102、5×101、101时采用CN101775443A中引物的扩增曲线；
图中A-H为每个反应池对应的荧光曲线颜色。
具体实施方式
本发明公开了特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。2×反应液为博奥生物集团有限公司的产品，产品目录号为CP.440020。
猪伪狂犬病毒HeN1株(CGMCC NO.6656)、猪伪狂犬病毒疫苗株C株(CCTCC.No:V201114)、猪瘟病毒石门株AV1411(04/08/87)购自中国兽药监察所。猪流感病毒(VR-333TM)、高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV-HuN4)、猪细小病毒(PPV，CCTCC NO：V201618)、猪圆环病毒2型SD株(CGMCC NO.7707)。
DNA拷贝数的计算方法如下：
1A260吸光度值＝dsDNA 50μg/mL；
核酸浓度＝(OD260)×(稀释倍数)×(50)＝x ng/μL；
平均分子量(MW)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1dolton＝1g/mol；
摩尔＝6.02×1023；
平均分子量(MW)：dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；
拷贝数计算公式：
(6.02×1023copies/摩尔)×(x ng/μL×10-9)/(DNA长度×660)＝copies/μL。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1、引物组合的筛选
1.引物的制备
所用引物序列由生工公司合成。针对猪伪狂犬病毒gE基因设计LAMP引物，筛选出最优的引物组合如表1所示，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)和两条环引物(LF和LB)。
以猪伪狂犬病毒基因组DNA为模板，分别采用设计的LAMP引物组对模板进行环介导等温扩增检测。
LAMP检测体系的具体配置为0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL；2×反应缓冲液10μL；2μL的模板DNA，加灭菌纯化水至20μL体系。
所述LAMP检测反应条件为：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
每个反应体系设置3次重复。反应时间为50min，观察实时荧光曲线的出峰时间。以灭菌纯化水做阴性对照试验，阴性对照试验结果应为阴性。
1)若Ct≤30，判定LAMP测试结果为阳性；
2)若Ct＞45，未出现1)中所述现象，判定LAMP测试结果为阴性；
3)若30＜Ct≤45，出现1)中所述现象，判定LAMP测试结果为可疑，需要重新实验；
4)对可疑结果重新实验后，若Ct≤45，出现1)中所述现象，判定LAMP测试结果为阳性，否则判断为阴性。
猪伪狂犬病毒引物筛选实验结果：引物组1的检测结果如图1，引物组2的检测结果如图2，引物组组3如图3，引物组合4如图4，引物组合5如图5，引物组合6如图6，引物组合7如图7，引物组合8如图8，引物组合9如图9，引物组合10如图10。结果显示，引物组合10最好，三次重复出峰时间短(大约在15min出峰)，重复性好。
表1.环介导等温扩增技术所用引物信息
实施例2、特异性试验
猪伪狂犬病毒(PRV)、猪伪狂犬病毒疫苗株、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)各个待测样本分别进行如下步骤：
1、利用天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取待测样本的基因组DNA或RNA。
2、以步骤1提取的病毒基因组核酸为模板，采用实施例1筛选的引物组进行环介导等温扩增。
反应体系(20μL)：10.0μL 2×反应液、2.96μL引物混合物、2μL基因组DNA/RNA(5pg-50pg)，0.5μL AMV逆转录酶(RNA模板体系中加入)，补RNase-free water至20μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号
如果在45min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在45min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
采用引物组PRV的结果见图11，只有当待测样本为猪伪狂犬病毒野毒的DNA时显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为猪伪狂犬病毒疫苗、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)的时候均不显示阳性扩增曲线。以上结果表明，本发明提供的引物组对其靶标基因具有很高的特异性。
实施例3、灵敏度试验
待测样本：实施例2中猪伪狂犬病毒野毒基因组DNA。
1、提取猪伪狂犬病毒基因组DNA，用纯水进行梯度稀释，得到各个稀释液。
2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1制备的引物组合以及专利CN101775443A中的引物进行环介导等温扩增。
反应体系(20μL)：10.0μL 2×反应液、2.96μL引物混合物、2μL模板稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为102、5×101或101)，补灭菌纯水至20μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号；
根据稀释液中基因组拷贝数的不同，共如下3个反应体系：
反应体系1：1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为102；
反应体系2：1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5×101；
反应体系3：1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为101；
每个反应体系设置20次重复。
如果在45min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的猪伪狂犬病病毒基因组含量可以被检测出来。如果在45min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的猪伪狂犬病病毒基因组含量不能被检测出来。
引物组PRV检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为102(图12)和5×101(图13)时，20个检测均可检测出来且重复性好，拷贝数为101(图14)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组合的灵敏度为50个拷贝数/μL。
专利CN101775443A中引物检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为102(图15))时，20个检测均可检测出来且重复性好，拷贝数为5×101(图16)和101(图17)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组合的灵敏度为100个拷贝数/μL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 博奥生物集团有限公司
<120> 特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法
<130> MP1832070
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ggaccggtgg ctga 14
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ccgtcagctc cttgatg 17
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tacagccccg actcgtcccc ccttcgacgc ctt 33
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cgtgctcgtg atgacccatg acgtactcgg ccgc 34
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
cgttcgtgtg cacctcct 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
acctgggact acacgctcg 19

Claims (10)

1.LAMP检测引物，其特征在于，所述引物的序列如下：
外引物PRV-F3：序列如SEQ ID NO：1所示；
外引物PRV-B3：序列如SEQ ID NO：2所示；
内引物PRV-FIP：序列如SEQ ID NO：3所示；
内引物PRV-BIP：序列如SEQ ID NO：4所示；
环引物PRV-LF：序列如SEQ ID NO：5所示；
环引物PRV-LB：序列如SEQ ID NO：6所示。
2.如权利要求1所述LAMP检测引物在制备猪伪狂犬病毒检测试剂中的应用。
3.一种猪伪狂犬病毒检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述LAMP检测引物。
4.根据权利要求3所述的猪伪狂犬病毒检测试剂，其特征在于，还包括反应缓冲液、模板DNA、不含RNA酶的水。
5.根据权利要求4所述的猪伪狂犬病毒检测试剂，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒检测试剂的反应体系为：
外引物：各0.10～0.15μL；
内引物：各0.9～1.0μL；
环引物：各0.35～0.45μL；
反应缓冲液：10μL；
模板DNA：2μL；
不含RNA酶的水：补足至20μL。
6.根据权利要求5所述的猪伪狂犬病毒检测试剂，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒检测试剂的反应体系为：
外引物：各0.12μL；
内引物：各0.96μL；
环引物：各0.4μL；
反应缓冲液：10μL；
模板DNA：2μL；
不含RNA酶的水：补足至20μL。
7.根据权利要求5所述的猪伪狂犬病毒检测试剂，其特征在于，所述外引物的浓度为0.25～0.35mM，内引物的浓度为2.2～2.6mM，环引物的浓度为0.9～1.1mM。
8.根据权利要求7所述的猪伪狂犬病毒检测试剂，其特征在于，所述外引物的浓度为0.3mM，内引物的浓度为2.4mM，环引物的浓度为1mM。
9.根据权利要求3所述的猪伪狂犬病毒检测试剂，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒检测试剂的检测反应条件为：60℃～65℃恒温反应50min。
10.一种以非诊断目的的检测猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，使用权利要求1所述LAMP检测引物或者权利要求3至9中任一项所述猪伪狂犬病毒检测试剂进行LAMP扩增。
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