CN106244725A - 一种诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途 - Google Patents

一种诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途。所述试剂盒包括一对引物和一条特异性荧光探针，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的试剂盒能够特异性的诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株，并具有较高的灵敏度，重复性优，可以精准评估和诊断母猪伪狂犬病毒带毒排毒、仔猪感染情况，还可开展伪狂犬疾病的净化和效果评估等，具有十分广泛的应用价值。同时本发明的试剂盒检测过程中需要仪器设备相对简单，检测过程简便，检测时间短；结果相对可靠，不易污染；技术操作要求低，可以在基层大量推广；可以相对容易质量控制，易于标准化。

Description

一种诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR 试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途。
背景技术
猪伪狂犬病毒(PRV)可以引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病(Pesudorabies,PR)。该病对猪的危害极其严重，主要临床症状为引起妊娠母猪流产、产生木乃伊胎、死胎及产弱仔等。对于哺乳仔猪及断奶期仔猪则会有高烧、呼吸困难并伴发明显中枢神经障碍的症状，感染后死亡率可达100％。
猪伪狂犬病当前常用的诊断方法：(1)血清中和试验(serum neutraliza-tiontest,SN)，是目前大多数国家检测伪狂犬病的主要方法之一。SN特异性很强，敏感性较低。SN的普及主要是基于其检测能力可以给血清样本的抗体量作一个大致的定量分析。(2)酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)。现在已经有商业化的ELISA诊断试剂盒在市场上销售，该方法敏感性高，且操作简单快捷，目前在世界上多个国家作为基础诊断方法。(3)乳胶凝集试验(latexagglutination test，LAT)。LAT的敏感性和特异性与ELISA方法一致，均可现场应用，可运用于进行快速的血清筛选检测，并可检查早期感染。(4)聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。PCR敏感性高、特异性强、检测速度快(24h出结果)，现在已经作为伪狂犬病原检测的常用方法之一。上述4种方法中，血清中和试验的特异性和敏感性均高于其他检测方法，但由于其要求高、周期长，故在大批量的样品检测上不如ELISA试验和乳胶凝集试验的操作简单快捷。同时血清学检测技术(SN、LAT和ELISA)存在以下缺点：(1)对猪群中存在的免疫耐受现象评估较难，相对不能更加有效、直观和高精准反映猪群的抗体水平。(2)血样采集需要多人协助，且需要特殊设备，采集过程相对比较费时。PCR技术快速敏感，但由于伪狂犬gE基因GC含量很高，相对比较难以扩增，且一般临床检测样品(脐带血中)无法检测到该基因，就无法使用普通PCR技术进行疾病诊断野毒株。另外PCR检测伪狂犬样品存在以下缺点：(1)需要复杂的仪器设备：核酸提取仪器、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统和分析软件。(2)操作复杂操作时间长：需要提取核酸、PCR试剂配置、PCR反应、电泳、凝集成像、分析结果等，做一次病原检测需要近一天时间。(3)结果相对不可靠：非常容易污染，即使是国内权威的实验室检测结果都存在假阳性结果。(4)环境要求高：很难在基层推广，猪场配备了设备但是没有人和时间使用。(5)每个实验室独立设计引物，检测灵敏性不一致，质量控制不到位，标准不统一，难以标准化和数据分析。(6)病毒的组织嗜性不同采样难度较大。
目前常用血清学(ELISA)方法诊断伪狂犬病毒野毒株，但是血清学检测方法是抗原和抗体反应，仅检测1次无法准确判断猪群的感染状况和排毒状况；血清学检测抗体，检测的抗体水平高低无法定量检测分析，血清学仅能评价机体体液免疫产生的水平；血清学评估猪群健康度、对无症状带毒和免疫耐受的猪群评估存在技术上的瓶颈；血清学需要采集前腔静脉血，血样采集相对费力、费时、且需要特殊设备辅助，多人协助。
胎盘(Placenta)通常是指尿膜绒毛膜与子宫黏膜发生联系所形成的结构，包括两部分，即尿膜绒毛膜的绒毛部分为胎儿胎盘，子宫黏膜部分为母体胎盘。胎儿的血管和子宫血管各自分布到自己的胎盘部分上去，但并不直接相通。脐带血通常是指胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。
在实际生产中，快速精准检测脐带血中的伪狂犬病毒野毒株难度相对很大，急需建立一种快速的脐带血伪狂犬病毒野毒株的诊断方法，不仅可以对母猪疫苗株的安全评价及仔猪疾病的快速准确诊断，及时制定防控计划，具有十分重要的临床意义，而且可根据脐带血检测结果评估猪群PRV野毒感染状况，开展伪狂犬疾病的净化，达到规模化猪场伪狂犬野毒感染为阴性。因此，亟待建立一种可以精准诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的方法。
发明内容
本发明的目的在于提出一种诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能同时反映母、仔猪猪伪狂犬病毒带毒和排毒状况，评估母猪猪伪狂犬疫苗的免疫效果，侧面反映母猪的健康状况水平，有益于对群体猪伪狂犬病毒感染的净化和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的预警、防控工作。
基于上述目的，本发明提供的一种诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：
上游扩增引物：5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’，其为SEQ ID NO:1序列；
下游扩增引物：5’-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’，其为SEQ ID NO:2序列；
特异性荧光探针：FAM-5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’-TAMARA，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。
合理的引物设计和荧光探针设计是成功应用实时荧光PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。
利用本发明的引物和探针建立的实时荧光PCR方法能鉴别猪脐带血中的伪狂犬病毒疫苗株和野毒株。采用实时荧光PCR方法鉴别猪脐带血中的伪狂犬病毒疫苗株和野毒株，关键是需要针对两者所存在的序列差异片段，设计得到特异性的引物和探针。
PRV基因组全长约150kb，GC含量可以高达73％，至少含70多个基因，编码约100种病毒蛋白。PRV gE基因是病毒增殖非必需基因。目前很多商业疫苗均缺失了PRV的gE基因，所以猪体内的PRV疫苗毒一般不存在gE基因，而PRV野毒有gE基因。伪狂犬病毒的gE基因中GC含量很高，高达74.4％，导致野毒株gE基因的扩增难度很大，且对酶和缓冲体系要求较高，设计检测范围更广泛、特异性更强的引物和探针难度就更大。
本发明引物和探针设计在PRV-gE基因上，参考NCBI已公布的212条伪狂犬gE基因设计引物和探针，该引物和探针的广泛性和特异性强，用于扩增gE2基因，检测结果能特异性区分PRV疫苗毒和PRV野毒。
另外，结合猪胎盘的生理结构，猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，即使母源抗体(如IgG，12nm)都不能通过此胎盘屏障，所以成熟的PRV粒子的直径为150-180nm，就很难直接穿越胎盘屏障感染胎儿，也是一道天然的保护屏障。
总之，采用从仔猪脐带血中检测PRV-gE基因来评价母猪伪狂犬野毒带毒和排毒状况，仔猪在母体内感染状况和反馈母猪的健康状况，是一种更加科学、直接和有效的诊断伪狂犬疾病、评估伪狂犬疫苗保护力水平和疾病预警方面的方法之一，在规模化猪场的伪狂犬疾病的净化过程中起到更加可靠的技术支撑。
在本发明中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为3:3:2。
在本发明中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.1～5μM。
在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×荧光定量Mixture。
在本发明中，优选的，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O；所述阳性对照为含有猪伪狂犬病毒gE2基因序列的克隆质粒pEASY-T1-gE2，克隆质粒pEASY-T1-gE2的终浓度为1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。
在本发明中，优选的，所述猪伪狂犬病毒gE2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明中，优选的，所述克隆质粒采用以下方法制备得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增猪伪狂犬病毒gE2基因序列，猪伪狂犬病毒gE2基因序列酶切后与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-gE2。
进一步的，本发明还提供了一种所述的诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)使用所述的实时荧光PCR试剂盒进行PCR扩增，PCR的反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性15s，59℃退火延伸和荧光采集30s，共45个循环；然后25℃延伸10s，最后4℃保护，结束反应；
(2)结果分析：
根据扩增结果判定：阴性对照扩增无Ct值，阳性对照扩增Ct值≤30时，则结果判定成立；Ct值≤40，则判断为猪伪狂犬病毒阳性；无Ct值显示，则判断为猪伪狂犬病毒阴性，猪伪狂犬病毒疫苗免疫成功。
在本发明中，优选的，实时荧光PCR反应体系以20μL计为：
0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6μL；
0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6μL；
0.2μM的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.4μL；
2×荧光定量Mixture：10μL；
200ng/μL的DNA模板：2μL；
ddH2O：补足至20μL。
更进一步的，本发明还提供了所述的试剂盒在制备诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株试剂中的用途。
本发明应用实时荧光PCR(qPCR)方法鉴别猪脐带血中给的伪狂犬病毒疫苗株和野毒株的工作原理：PRV疫苗毒一般不存在gE基因，而PRV野毒有gE基因，针对PRV gE基因设计引物和探针序列，根据有无Ct值和Ct值的大小来鉴别仔猪脐带血中的伪狂犬病毒疫苗株和野毒株；同时由于猪属于上皮绒毛胎盘，母猪和胎儿独立血液循环系统，之间存在血胎盘屏障的缘故，正常的“脐带血”是不含病原体和抗体物质的即无存在任何各种病原的相关的基因片段，因此可通过检测“脐带血”中是否存在猪伪狂犬病毒来判断带毒不发病母猪的情况，评价母猪的免疫水平及带毒情况，评估仔猪感染猪伪狂犬病毒情况。
与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下有益效果：
(1)采用本发明设计的引物和探针所建立的实时荧光PCR方法可对仔猪脐带血中的猪伪狂犬病毒野毒感染情况做诊断，从而可以评价母猪伪狂犬疫苗的保护力，而且可以预测和预警仔猪感染伪狂犬病毒野毒的状况，为疾病防控提供有效的科学依据。
(2)本发明的的实时荧光PCR方法更能直接，有效、综合评价疫苗免疫母猪后的效果，与传统的血清学抗体检测评估相比更具有优势，该法也是血清学抗体评估疫苗效果的有效的补充，是非常好的疫苗评估质量、免疫效果和免疫程序优化的有力工具，可进一步推广和临床应用。
(3)使用本发明的的实时荧光PCR方法进行仔猪脐带血检测，即可鉴别伪狂犬病毒野毒株和伪狂犬病毒疫苗株，根据鉴别结果制定相应的防控策略，最终达到最终净化该病的目的。
(4)本发明的实时荧光PCR方法具有特异性强、灵敏度高、可重复性好等优点。该方法检测过程中需要仪器设备相对简单，不需要电泳仪、凝胶成像系统及其分析软件；检测过程简便，检测时间短，做一次病原检测仅需要3小时；结果相对可靠，不需要电泳，空气中气溶胶相对较少，不易污染；技术操作要求低，可以在基层大量推广；可以相对容易质量控制，易于标准化。
附图说明
图1为本发明诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的流程图；
图2为本发明gE1基因和gE2基因的荧光曲线；
图3为本发明阳性对照10倍稀释的梯度标准曲线；
图4为本发明采用不同厂家的酶和不同退火温度扩增gE2基因的电泳图；其中，1-4泳道为57℃退火，5-6泳道为59℃退火，1-6号泳道均采用天恩泽的酶；7-8泳道为57℃退火，9-10泳道为59℃退火，7-10号泳道均采用Biotools的酶；11-12泳道为59℃退火，13-14号泳道57℃退火，11-14号泳道均采用TaKaRa的酶；
图5为本发明敏感性检测结果图；
图6为本发明特异性检测结果图；
图7为本发明重复性检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
本发明诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的流程图如图1所示。具体包括以下步骤：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)DNA提取：按商业试剂盒说明书操作；(4)qPCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行qPCR反应；(5)判定结果。
1.样品采集
(1)脐带血样品采集
a.取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；
b.当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可，将其“脐带血”挤到青霉素瓶，密封；
注意事项：①必须要采集同窝母猪产的所有的仔猪，避免同窝母猪所产仔猪的个体差异造成漏检；②可以双人操作，也可以单独操作，若仔猪脐带血不便挤出，可以将脐带剪成几段再操作即可；③若母猪分娩出现木乃伊，死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；④弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；
c.脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；
d.将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。
(2)病料样品(扁桃体、肾脏、肺脏和淋巴结等)
A、剖解取内脏：将患病猪剖解，取出完整的上述内脏，放置在同一个干净塑料袋内。
B、记录：将装有内脏的塑料袋密封，贴标签并记录发病猪的日龄、体重、品种、临床症状等信息。
C、将采集的病料样品集中送至实验室，并附上所记录的信息。
2.样品中模板DNA提取
(1)取200μL待检脐带血样品，加入0.5mL红细胞裂解液，吹打混匀，使样本充分裂解3-5分钟。
(2)4℃，4000-6,000rpm离心5分钟，小心倾去上清。再短暂离心半分钟，吸弃残留的液体。此步有利于后面的细胞裂解，但一般可以省略。
(3)向有沉淀的离心管内加入0.5mL溶液A(溶液A有少量晶体沉淀，用前需要摇晃均匀)，用移液枪吹打使沉淀充分悬浮起来。此步目的是裂解细胞，释放DNA，所以吹打越充分越好。
(4)静置2分钟待溶液变清亮后，将液体转移到离心吸附柱中并静置2-5分钟，以使DNA与膜充分结合。
(5)12,000rpm离心30秒，DNA将吸附到膜上，弃收集管中的废液。
(6)加入0.7mL的通用洗柱液，12,000rpm离心30秒，弃收集管中的废液。
(7)加入0.3mL的通用洗柱液，12,000rpm离心30秒，弃收集管中的废液。
(8)12,000rpm离心1分钟，甩干残留液体。此步很重要，以去除膜上残留洗涤液，否则会影响后续反应。
(9)将离心吸附柱置于一新的1.5mL塑料离心管(自备)中，加入30μL DNA洗脱液(DNA洗脱液在56-65℃提前水浴10分钟，可提高洗脱效率)，放置2分钟。
(10)12,000rpm离心30秒，离心管底溶液即DNA溶液。可以立即使用或放置-20℃保存。
注：为监测提取过程中的污染，建议在提取样本的同时提取一管水作为阴性对照。
3.引物和荧光探针的的筛选
采用实时荧光PCR方法诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株，其引物和探针设计是关键。PRV疫苗毒一般不存在gE基因，而PRV野毒有gE基因，可针对PRV的gE基因设计引物和探针序列，但由于gE基因的GC含量很高，高达74.4％，因此从众多的引物和探针序列中筛选出特异性引物和特异性探针序列具有相当大的难度。
发明人根据荧光PCR扩增结果，首先从众多设计的引物和探针序列中筛选出两组引物和探针序列，具体序列见表1。
表1
第一组引物和探针序列用于扩增gE1基因，第二组引物和探针序列用于扩增gE2基因。比较两组引物和探针序列分别扩增gE1基因和gE2基因的荧光曲线和敏感性。具体步骤如下：
3.1荧光曲线
(1)采用实时荧光PCR反应体系(20μL)为：0.3μM的上游扩增引物：0.6μL；0.3μM的下游扩增引物：0.6μL；0.2μM的特异性荧光探针：0.4μL；2×荧光定量Mixture：10μL；200ng/μL的DNA模板：2μL；ddH2O：补足至20μL。
其中，2×荧光定量Mixture购自湖南圣湘生物科技有限公司。
(2)实时荧光PCR的反应条件：95℃预变性1min；94℃变性15s，59℃退火延伸和荧光采集30s，共45个循环；然后25℃延伸10s，最后4℃保护，结束反应。gE1基因和gE2基因的扩增结果见图2。
3.2敏感性的检测
构建分别包含猪伪狂犬病毒gE1和gE2基因序列的克隆质粒，并对克隆质粒进行10倍梯度稀释，使其为：107-10-1copies/μl，具体构建步骤参见“4.阳性对照质粒的构建与制备”，采用上述步骤进行gE1和gE2基因序列敏感性的检测。猪伪狂犬病毒gE1和gE2基因序列的敏感性检测结果见表2。
表2猪伪狂犬病毒gE1和gE2基因序列的敏感性检测结果
由图2和表2中可以看出，采用第二组引物和探针序列扩增猪伪狂犬病毒gE2基因序列的荧光曲线和敏感性更佳。因此，最终筛选到的特异性引物和特异性荧光探针序列如下：
上游扩增引物：5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’(SEQ ID NO:1)；
下游扩增引物：5’-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’(SEQ ID NO:2)；
特异性荧光探针：FAM-5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’-TAMARA(SEQ ID NO:3)，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。
上述引物和特异性荧光探针由华大基因合成并进行标记，用于扩增猪伪狂犬病毒gE2基因，目的片段为152bp左右，猪伪狂犬病毒gE2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.阳性对照质粒的构建与制备
(1)按照天恩泽柱式血液DNAout试剂盒操作说明书提取猪伪狂犬病毒基因组DNA；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为特异性引物扩增猪伪狂犬病毒gE2基因序列，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸10min，4℃保温5min。PCR产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；
(2)PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA GelExcraction Kit胶回收试剂盒回收，然后酶切后与同样酶切的pEASY-T1克隆载体进行连接，连接后转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h。经蓝白斑筛选后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1质粒提取试剂盒提取质粒，然后用引物进行扩增和测序，测序后比对成功的克隆质粒命名pEASY-T1-gE2。
克隆质粒用质粒小提试剂盒进行提纯，获得定量标准质粒。根据紫外分光光度计测定0D260和OD280值计算质粒浓度，并换算为质粒拷贝数，克隆质粒终浓度为1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。
5.本发明试剂盒的成分
上游扩增引物：5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’(SEQ ID NO:1)；
下游扩增引物：5’-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’(SEQ ID NO:2)；
特异性荧光探针：FAM-5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’-TAMARA(SEQ ID NO:3)，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因；
阳性对照：含有猪伪狂犬病毒gE2基因序列的克隆质粒pEASY-T1-gE2；
阴性对照：无DNA酶的ddH2O；
2×荧光定量Mixture。
6.标准曲线的制作
对克隆质粒进行10倍梯度稀释，使其为：108-101copies/μl，每个梯度重复三次进行实时荧光定量PCR。根据扩增结果制作标准曲线。图3为本发明阳性对照10倍稀释的梯度制作标准曲线图，其中该标准曲线的参数如下：斜率：-3.39593，截距：40.82791，相关系数：-0.99879，扩增效率：0.97002。制作标准曲线的相关系数R2大于0.99，斜率位于-3.9－-4.0之间，PCR扩增效率E位于0.9－1.1之间。
7.诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株
本发明对实时荧光PCR反应体系中的酶和实时荧光PCR反应条件中的退火温度进行优化，优化条件如下：
扩增结果见图4，退火温度在59℃时，使用Biotools的酶能消除阴性的非特异性扩增，天恩泽的次之。
本发明最终确定的实时荧光PCR反应体系和实时荧光PCR的反应条件如下：
(1)实时荧光PCR反应体系以20μL计为：
0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6μL；
0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6μL；
0.2μM的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.4μL；
2×荧光定量Mixture：10μL；
200ng/μL的DNA模板：2μL；
ddH2O：补足至20μL。
2×荧光定量Mixture中包括Biotools的酶。同时设有阳性对照和阴性对照，阳性对照克隆质粒：2μL，其余组分相同；阴性对照无DNA酶的ddH2O：2μL，其余组分相同。
(2)实时荧光PCR的反应条件
95℃预变性1min；94℃变性15s，59℃退火延伸和荧光采集30s，共45个循环；然后25℃延伸10s，最后4℃保护，结束反应。
8.结果分析：
根据扩增结果判定：每次试验的过程都要加入阳性对照及阴性对照。在阴性对照扩增无Ct值，阳性对照扩增Ct值≤30时，则结果判定成立，即阳性结果出现典型的扩增曲线；并且制作的标准曲线如图3所示，相关系数R2大于0.99，斜率位于-3.9－-4.0之间，PCR扩增效率E位于0.9－1.1之间。
若Ct值≤40，则判断为猪伪狂犬病毒阳性，即仔猪脐带血中感染猪伪狂犬病毒野毒，表明母猪存在排毒现象，疫苗保护力存在一定不足，建议加强免疫接种或调整免疫程序；若无Ct值显示，则判断为猪伪狂犬病毒阴性，即仔猪脐带血中没有感染猪伪狂犬病毒野毒，表明猪伪狂犬疫苗免疫母猪保护力很好，且仔猪无感染猪伪狂犬病毒，疫苗免疫效果和免疫程序很到位。若阳性对照Ct值>30或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。
实施例2灵敏度研究
以阳性对照克隆质粒评价本发明的试剂盒的灵敏度，将克隆质粒进行10倍梯度稀释，检测范围为108-101copies/μl。结果表明，该方法的检测范围为108-101copies/μl，在此范围的猪伪狂犬病毒含量可以得到可靠的结果，即该方法的灵敏度可以检测到10个拷贝的猪伪狂犬病毒病毒含量的样品。检测结果见图5。
实施例3特异性研究
为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测蓝耳经典株，猪细小病毒，猪轮状病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪圆环病毒，猪流行性腹泻，乙型脑炎，猪瘟病毒等8种病毒。
检测结果表明：本发明的试剂盒仅对仔猪脐带血中猪伪狂犬病毒进行扩增，表明本发明试剂盒能特异性扩增猪伪狂犬病毒，而不与其它核酸发生交叉反应。检测结果见图6。
实施例4重复性研究
选用阳性对照克隆质粒106、105、104个copies/μl,对每个浓度的样本做3个重复，结果不同核酸浓度的检测Ct值标准差≤0.10和≤0.06，变异系数≤10％，具有较好的重复性。检测结果见表3和图7。
表3实时荧光PCR检测猪伪狂犬病毒的重复性试验
质粒拷贝数(copies/μl) 106 105 104
Ct1 20.12 23.69 26.9
Ct2 20.15 23.59 27.1
Ct3 20.26 23.68 27.03
Ct mean 20.18 23.65 27.01
SD 0.07 0.06 0.10
CV 0.37％ 0.23％ 0.38％
实施例5准确性研究
同时采用本发明的试剂盒以及普通PCR对各10份已知阳性和阴性样品进行检测以及对未知的临床48份仔猪脐带血进行检测，检测结果见表4和表5。
(1)已知阳性和阴性样品各10份的临床验证
表4采用本发明试剂盒以及普通PCR对临床样品进行检测结果的比较
方法 本发明试剂盒 普通PCR
10份阳性样品 10份阳性 10份阳性
10份阴性样品 10份阴性 10份阴性
(2)未知的临床48份脐带血检测结果
表5采用本发明试剂盒以及普通PCR对临床样品进行检测结果的比较
从表4和表5中可以看出：本发明实时荧光PCR检测阳性样品与普通PCR检测阳性样品的结果100％符合，但实时荧光PCR检测比普通PCR检测更敏感，且临床症状表现是一致的。
综上可见，本发明设计的一对特异性引物和一条荧光探针以及构成的试剂盒可以快速诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株，并能鉴别伪狂犬病毒疫苗株和野毒株，而且该检测方法简单、快速、特异性好、灵敏度高、可重复性好，检测结果真实可靠。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：
上游扩增引物：5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’，其为SEQ ID NO:1序列；
下游扩增引物：5’-CTCCTTCGTGATGACGTG-3’，其为SEQ ID NO:2序列；
特异性荧光探针：FAM-5’-CTGGCTCTGCGTGCTGTGCTC-3’-TAMARA，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。
2.根据权利要求1所述的诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为3:3:2。
3.根据权利要求2所述的诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.1～5μM。
4.根据权利要求1所述的诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×荧光定量Mixture。
5.根据权利要求4所述的诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O；所述阳性对照为含有猪伪狂犬病毒gE2基因序列的克隆质粒pEASY-T1-gE2，克隆质粒pEASY-T1-gE2的终浓度为1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。
6.根据权利要求5所述的诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒gE2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
7.根据权利要求6所述的诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述克隆质粒采用以下方法制备得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增猪伪狂犬病毒gE2基因序列，猪伪狂犬病毒gE2基因序列酶切后与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-gE2。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用权利要求1-7任一项所述的实时荧光PCR试剂盒进行PCR扩增，PCR的反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性15s，59℃退火延伸和荧光采集30s，共45个循环；然后25℃延伸10s，最后4℃保护，结束反应；
(2)结果分析：
根据扩增结果判定：阴性对照扩增无Ct值，阳性对照扩增Ct值≤30时，则结果判定成立；Ct值≤40，则判断为猪伪狂犬病毒阳性；无Ct值显示，则判断为猪伪狂犬病毒阴性，猪伪狂犬病毒疫苗免疫成功。
9.根据权利要求8所述的诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒的使用方法，其特征在于，实时荧光PCR反应体系以20μL计为：
0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6μL；
0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6μL；
0.2μM的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.4μL；
2×荧光定量Mixture：10μL；
200ng/μL的DNA模板：2μL；
ddH2O：补足至20μL。
10.权利要求1-7任一项所述的试剂盒在制备诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒试剂中的用途。
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