CN107513585A - 一种鹅多瘤病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，属于动物传染病学领域。本发明包括特异性引物和探针序列的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和条件优化、检测结果判定和应用。本发明建立的检测鹅多瘤病毒的实时荧光定量PCR的方法，在检测鹅多瘤病毒上灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测35.4个拷贝，可用于检测临床样本中鹅多瘤病毒的感染检测。

Description

一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针

技术领域

本发明涉及一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，属于动物传染病学领域。

背景技术

鹅出血性多瘤病毒（goose hemorrhagic polyomavirus，GHPV）可导致鹅群发生鹅出血性肾炎和肠炎（hemorrhagic nephritis and enteritis of goose, HNEG），主要感染4-10周龄鹅群。鹅感染GHPV主要病变为出血性肠炎、出血性肾炎、腹水和水肿等症状，该病于1969年首次报道，随后在欧洲地区多地鹅群中发现存在该病感染。

GHPY属于无囊膜环状DNA病毒，全基因长度约为5.2 kb，编码5个主要的开放阅读框（open reading frame，ORF）：3个假定蛋白（VP1、VP2和VP3）与两个T抗原蛋白（大T抗原和小T抗原）。一般认为，鸭群对GHPY感染不敏感；但2008年首次报道GHPY可跨种感染番鸭和半番鸭；2012年姜甜甜等报道中国北京鸭可感染GHPY；2016年万春和（本专利发明人）等报道樱桃谷鸭可感染GHPY（樱桃谷鸭源鹅出血性多瘤病毒VP3基因的克隆与序列分析. 2017,44 (4): 980-985.）。因此，建立一种快速检测水禽（鸭和鹅）中GHPY感染的方法十分重要。

实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。常见的实时荧光定量PCR方法主要有两大类：SYBR GreenⅠ法和TaqMan探针法。SYBR GreenⅠ法是指在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

目前，国内外检测鹅多瘤病毒的方法有PCR方法（Guerin J, Gelfi J, Dubois L,et al. A novel polyomavirus (goose hemorrhagic polyomavirus) is the agent ofhemorrhagic nephritis enteritis of geese[J]. J Virol, 2000, 74(10): 4523-4529.）和基于SYBR GreenⅠ染料法（Leon O, Corrand L, Bich TN, et al. GooseHemorrhagic polyomavirus detection in geese using real-time PCR assay [J].Avian Dis, 2013,57(4): 797-799.）的实时荧光定量PCR方法的报道。但是，SYBR GreenⅠ法中的染料能够与双链结合，当扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样才能收集到信号，即SYBR GreenⅠ染料法特异性不强，只要和双链DNA结合都会发光，容易导致结果的假阳性和误判，给流行病学的监测造成一定的困扰。而TaqMan探针法较SYBR GreenⅠ染料法相比，除了引物另外设置一个特异性的探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团；当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。TaqMan探针法较SYBR GreenⅠ染料法在病原监测上结果更准确特异，已在多种病原的监测上被广泛应用。但当前尚未见基于TaqMan探针法检测鹅多瘤病毒的引物、探针及其方法相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是填补现有技术中尚未见实时荧光定量PCR检测鹅多瘤病毒的引物和探针的方法相关研究报道空白，提供一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针及其使用方法。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测35.4个拷贝，可用于对临床样本中鹅多瘤病毒的分子流行病学调查，为明确鹅多瘤病毒的分子流行病学特点提供检测方法和手段。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

上游引物GHPY-F：5’- GCTTCAGATGATGATATGG -3’，

下游引物GHPY-R：5’- CACCCGGAACAAATATTAC -3’；

所述探针序列GHPY-P为： 5’- AAGGATCTTGCACTTGCACGTTC -3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

所述引物和探针用于鹅多瘤病毒的实时荧光定量PCR检测方法为：

（1）定量标准质粒的构建与制备

以提取的鹅多瘤病毒核酸DNA为模板，用上游引物GHPY-F3（引物序列为：5’-TGAATGCCTGTTAATCTTGTA -3’）和下游引物GHPY-R3（引物序列为：5’-CTATACACAGGGTCAATCT -3’）进行PCR扩增含有靶序列的基因片段（目的片段大小为491bp）。上述引物均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液 25 μL、上下游引物(GHPY-F3和GHPY-R3)（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1μL、提取的核酸模板DNA 2 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95 ℃预变性5 min后进入循环，94℃变性50 s 、54℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环结束后，72℃终延伸10 min。

反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用Universal DNA 纯化回收试剂盒将符合实验扩增预期的目的条带割胶回收，利用克隆载体（pEASY-T1 Simple CloningKit）将胶回收片段进行克隆。转化DH5α克隆感受态细胞后涂布平板过夜，随机挑取12份单菌落，摇菌14h后，提取相应的质粒，进行双酶切鉴定符合预期后，送由上海博尚生物技术有限公司进行序列测定，将序列测定结果经BLAST分析明确其为鹅多瘤病毒序列，将该阳性重组质粒作为标准品质粒（T-GHPY）。

(2)实时荧光定量PCR反应体系和程序：

以鹅多瘤病毒阳性标准品（T-GHPY）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为3.54×10⁶、3.54×10⁵、3.54×10⁴、3.54×10³、3.54×10²和3.54×10¹拷贝/μL），在不同退火温度（54、56、58、60、62和64℃）、引物（GHPY-F、GHPY-R）浓度（2.5，5.0，10和20μmol/L）和探针（GHPY-P）浓度（1.25、2.5、5和10μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。结果判定，观察FAM信号有关阳性荧光信号扩增，有阳性荧光信号即可判定待检样品为鹅多瘤病毒感染阳性。

建立的鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法优化出的25 μL 最佳反应体系为：Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)混合液12.5 μL、上/下游引物（GHPY-F、GHPY-R）（10 μmol/L）各0.5 μL、探针（GHPY-P）（5 μmol/L）1 μL、模板2 μL、补足灭菌去离子水（8.5μL）至25 μL。优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为：95 ℃预变性180 s；95℃ 5 s，56℃退火10 s，72℃延伸10 s，40个循环。

用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。

从图1可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为35.4拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR标准曲线（图2），所获得标准曲线斜率为-3.38，相关系数为0.998，扩增效率为99.9%，符合实验预期。

本发明具有以下优点和效果：

1、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中鹅多瘤病毒的Ct值，直接对其感染鹅多瘤病毒进行准确定量。

2、特异性强：和水禽中的常见传染病病原（如鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鹅圆环病毒和鸭瘟病毒）均无反应信号，仅对鹅多瘤病毒检测出现荧光信号。

3、检测快速、高效，灵敏度高：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需70min，且一次可以同时进行96个样品检测。最低可检测35.4个拷贝/μL，较常规PCR检测灵敏度提高100倍。对临床收集的86份病料（其中鸭源病料59份，鹅源病料27份）进行检测后发现，检测到6份（阳性率为6.98%）（其中鸭源病料检测到阳性4份，鹅源病料检测到阳性2份）鹅多瘤病毒感染阳性。

4、重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行鹅多瘤病毒检测的组内变异系数为0.39-1.69%，组间变异系数0.53-2.21%，表明建立的基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

附图说明

图1实时荧光定量检测鹅多瘤病毒的PCR方法的扩增曲线。

图2实时荧光定量检测鹅多瘤病毒的PCR方法的标准曲线。

图3实时荧光定量检测鹅多瘤病毒的PCR方法的特异性。其中1：鹅多瘤病毒；2：鹅鹅细小病毒；3：番鸭细小病毒；4：番鸭细小病毒；5：鹅圆环病毒；6：鸭瘟病毒。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、引物和探针的设计与合成

参考GenBank数据库中的鹅多瘤病毒基因组序列，利用分子生物学分析软件Lasergene比对分析，明确其基因组序列特征，设计实时荧光定量检测鹅多瘤病毒的PCR方法的特异性引物（GHPY-F和GHPY-R）和探针（GHPY-P），相关引物序列为：

上游引物GHPY-F：5’- GCTTCAGATGATGATATGG -3’，

下游引物GHPY-R：5’- CACCCGGAACAAATATTAC -3’；

所述探针序列GHPY-P为： 5’- AAGGATCTTGCACTTGCACGTTC -3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。引物和探针由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

1、标准品的构建

根据鹅多瘤病毒基因组特征，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：GHPY-F3：5′- TGAATGCCTGTTAATCTTGTA-3′和GHPY-R3：5′-CTATACACAGGGTCAATCT-3′，用于扩增约491 bp的鹅多瘤病毒基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鹅多瘤病毒（GHPY-FJ201601株）核酸DNA为模板，使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液 25μL、上下游引物(GHPY-F3和GHPY-R3)（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸模板DNA 2 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95 ℃预变性5 min后进入循环，94℃变性50 s 、54℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环结束后，72℃终延伸10 min。

反应结束后用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用Universal DNA纯化回收试剂盒将符合实验扩增预期的目的条带割胶回收，利用克隆载体（pEASY-T1Simple Cloning Kit）将胶回收片段进行克隆。转化DH5α克隆感受态细胞后涂布平板过夜，随机挑取12份单菌落，摇菌14h后，提取相应的质粒，采用PCR扩增时的引物（GHPY-F3和GHPY-R3）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- GHPY），分装后置于-20 ℃保存备用。

3、实时荧光定量PCR反应条件

以鹅多瘤病毒阳性标准品（T-GHPY）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为3.54×10⁶、3.54×10⁵、3.54×10⁴、3.54×10³、3.54×10²和3.54×10¹拷贝/μL），在不同退火温度（54、56、58、60、62和64℃）、引物（GHPY-F、GHPY-R）浓度（2.5、5.0、10和20μmol/L）和探针（GHPY-P）浓度（1.25、2.5、5和10μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。建立的鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法优化出的25μL 最佳反应体系为：Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)混合液12.5 μL、上/下游引物（GHPY-F和GHPY-R）（10μmol/L） 各0.5 μL、探针（GHPY-P）（5 μmol/L）1 μL、模板2 μL、灭菌去离子水（8.5μL）补足至25 μL。最佳反应条件为：95℃预变性180 s；95℃ 5 s，56℃退火10 s，72℃延伸10 s，40个循环。

4、特异性检测

和水禽常见传染病（如鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鹅圆环病毒和鸭瘟病毒）均无反应信号，仅对鹅多瘤病毒检测出现荧光信号，特异性强。

5、重复性试验

实时荧光定量PCR方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.39-1.69%，组间变异系数0.53-2.21%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

6、临床应用

对临床收集的86份病料（其中鸭源病料59份，鹅源病料27份）进行检测后发现，检测到6份（阳性率为6.98%）（其中鸭源病料检测到阳性4份，鹅源病料检测到阳性2份）鹅多瘤病毒感染阳性。

对相关样品分别利用已经发表的文献的PCR方法（Guerin J, Gelfi J, DuboisL, et al. A novel polyomavirus (goose hemorrhagic polyomavirus) is the agentof hemorrhagic nephritis enteritis of geese[J]. J Virol, 2000, 74(10): 4523-4529.）进行检测。结果可见，利用PCR方法检测到5份（鸭源病料检测到阳性3份，鹅源病料检测到阳性2份）鹅多瘤病毒感染阳性，且这5份病料经本发明建立的基于TaqMan方法的实时荧光定量PCR方法检测均为阳性，符合率为100%。需要指出的是，利用本发明建立的基于TaqMan方法的实时荧光定量PCR方法较常规PCR相比敏感性更高。原因可能是，已经发表的文献的PCR方法（Guerin J, Gelfi J, Dubois L, et al. A novel polyomavirus (goosehemorrhagic polyomavirus) is the agent of hemorrhagic nephritis enteritis ofgeese[J]. J Virol, 2000, 74(10): 4523-4529.）较本发明检测方法的敏感性差的原因导致。

对相关样品分别利用已经发表基于SYBR GreenⅠ染料法的文献（Leon O, CorrandL, Bich TN, et al. Goose Hemorrhagic polyomavirus detection in geese usingreal-time PCR assay [J]. Avian Dis, 2013,57(4): 797-799.）进行检测。结果可见，利用PCR方法检测到6份（鸭源病料检测到阳性4份，鹅源病料检测到阳性2份）鹅多瘤病毒感染阳性，且这6份病料经本发明建立的基于TaqMan方法的实时荧光定量PCR方法检测均为阳性，符合率为100%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcttcagatg atgatatgg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacccggaac aaatattac 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaggatcttg cacttgcacg ttc 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgaatgcctg ttaatcttgt a 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctatacacag ggtcaatct 19

Claims (2)

1.一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物序列如下：

上游引物GHPY-F：5’- GCTTCAGATGATGATATGG -3’，

下游引物GHPY-R：5’- CACCCGGAACAAATATTAC -3’；

所述探针序列GHPY-P为： 5’- AAGGATCTTGCACTTGCACGTTC -3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

2.一种鹅多瘤病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。