CN108315492A - 一种鸟类多瘤病毒pcr诊断试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法，该鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV‑F上游引物、APV‑R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒。该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸟类多瘤病毒感染提供有力的技术手段，尤其在鹦鹉鸟类多瘤病毒感染快速诊断方面有重要作用。

Description

一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断技术领域，具体涉及一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术
鸟类多瘤病毒(Avian Polyoma Virus，APV)首先在虎皮鹦鹉感染病例中发现，又名法兰西斯掉羽症。感染的虎皮鹦鹉主要症状是腹部及背部长不出绒羽。后来又陆续发现金刚鹦鹉、锥尾鹦鹉、月轮、凯克、爱情鸟、吸蜜鹦鹉、亚马逊鹦鹉、灰鹦、鹰头、及巴丹等鹦鹉亦可感染，成为鹦鹉的一种重要病原。
APV为多瘤病毒属(Polyomavirus)，多瘤病毒科(Polyomaviridae)成员，20面体对称，环状双股DNA。病毒在患病鹦鹉的血液、羽屑、粪便、嗉囊分泌物中均可发现，其中羽屑为最重要的散布来源。幼龄鹦鹉发病死亡率高达30％～100％。5-16周龄感染出现厌食、精神沉郁、下痢、麻痹、嗉囊排空时间延长、呕吐、皮下出血等临床症状。由于本病对鹦鹉危害极大，羽毛发育不良严重影响鹦鹉的观赏性，因此是鹦鹉需要着重预防和检疫的传染病。目前，缺乏诊断技术对鸟类多瘤病毒感染进行快速诊断，无法快速控制疫情。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸟类多瘤病毒感染提供有力的技术手段，尤其在鹦鹉鸟类多瘤病毒感染快速诊断方面有重要作用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
(一)一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒。
优选的，所述APV-F上游引物的序列为：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列为：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。
优选的，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1APV-F上游引物、25μmol·L-1APV-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒，20个反应共计40.0μL，装成1管。
优选的，所述鸟类多瘤病毒为鹦鹉鸟类多瘤病毒。
(二)一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：
步骤1，DNA提取
子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管(EP管)，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液。
子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液。
步骤2，PCR扩增反应
子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物。
子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述阴性对照样品提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物。
子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入鸟类多瘤病毒阳性质粒，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物。
步骤3，电泳检测
通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断。
优选的，步骤2中，所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶。
优选的，所述APV-F上游引物的序列为：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列为：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。
优选的，步骤2中，所述多个循环为35个循环。
优选的，步骤3中，所述判断的标准为：阴性对照样品PCR扩增产物不出条带，阳性对照样品PCR扩增产物出306bp条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现306bp条带，即为鸟类多瘤病毒感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所得的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒可在短时间内确诊鹦鹉是否感染鸟类多瘤病毒，检测时间控制在2小时左右，该试剂盒的特异性好，能特异性诊断出鸟类多瘤病毒；灵敏度高，检测极限可达1.65×10-4ng·μL-1；稳定性高，试剂盒在在6个月内检测结果一致；田间试验证明试剂盒的实用性和适用性良好。其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为本发明鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法的特异性试验电泳图；
图中M为DL2000DNA分子质量标准，1为禽痘病毒，2为鸟类多瘤病毒，3为鹦鹉喙羽病病毒，4为腺病毒，5为支原体，6为传染性喉气管炎病毒；
图2为本发明鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法的灵敏度试验电泳图；
图中M为DL2000DNA分子质量标准，1～8为鸟类多瘤病毒样品DNA梯度稀释，浓度范围为165×10-1ng·μL-1～165×10-8ng·μL-1；
图3为本发明鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒对部分临床样品的电泳检测图；
图中M为DL2000DNA分子质量标准，N为阴性对照，P为阳性对照，1-9为部分羽髓、羽屑、血液、血清检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
实施例1
一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照，具体如下：
1)裂解液：成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶。
2)扩增反应混合液：灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1APV-F上游引物、25μmol·L-1APV-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；其中引物的设计与制备如下：
参考GenBank上公布的鸟类多瘤病毒基因组序列，经过综合分析比对，针对鸟类多瘤病毒基因设计了2条引物，引物的序列如下：
APV-F上游引物的序列为：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’；APV-R下游引物的序列为：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’，扩增片段306bp；
上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
3)为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶。
4)阳性对照：为鸟类多瘤病毒阳性质粒混合物，20个反应共计40.0μL，装成1管。
本发明鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒中裂解液为常温保存，扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照保存条件为-20℃。
上述鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：
步骤1，DNA提取
子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取100μL待检样品置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL8mmol·L-1NaOH溶解，得待检样品DNA提取液。
子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取100μL灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L-1NaOH溶解，得阴性对照样品提取液。
步骤2，PCR扩增反应
子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入待检样品DNA提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物。
子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物。
子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入鸟类多瘤病毒阳性质粒2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物。
步骤3，电泳检测
通过10g·L-1琼脂糖凝胶电泳分别对待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断；判断的标准为：阴性对照不出条带，阳性对照出306bp条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现306bp条带，即为鸟类多瘤病毒感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。
对实施例1所得的一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法的特异性、稳定性、灵敏性进行试验，并通过田间试验对本发明所得鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的实用性和适用性进行验证，具体如下：
(1)特异性试验
使用实施例1所得的一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法分别提取禽痘病毒、鸟类多瘤病毒、鹦鹉喙羽病病毒、腺病毒、支原体、传染性喉气管炎病毒等病毒的DNA模板，用试剂盒的扩增混合液进行PCR扩增，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图1所示。
由图1可知，鸟类多瘤病毒出现306bp一个条带，禽痘病毒、鹦鹉喙羽病病毒、腺病毒、支原体、传染性喉气管炎病毒均没有出现条带。
回收阳性样本的条带，纯化后连接pMD18-T载体，转化DH5ɑ感受态细胞，取PCR鉴定为阳性菌液，提取质粒进行测序，将测得的序列与所用毒株基因序列进行比较，发现序列完全一致。结果证实本发明所得的鸟类多瘤病毒PCR试剂盒及检测方法具有很高的特异性，能准确扩增鸟类多瘤病毒基因片段。
(2)灵敏度试验
使用本发明提供的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，提取鸟类多瘤病毒样本DNA，紫外分光光度计测定浓度为165ng·μL-1，按照10倍浓度梯度稀释至10-8，用试剂盒提供的扩增混合液进行PCR扩增，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图2所示。
由图2可知，本发明的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测极限为1.65×10-4ng·μL-1，表明本发明的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒具有很高的检测灵敏度。
(3)稳定性试验
本发明提供的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒保存条件为-20℃，每月1次用鸟类多瘤病毒及对照进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定性。
结果显示，6个月内鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒检测结果完全一致，说明鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒具有良好的稳定性。
(4)田间试验
采集疑似感染鸟类多瘤病毒发病鹦鹉羽髓、羽屑、血液、血清共30份，用本发明的试剂盒及检测方法进行诊断，具体如下：
实施例2
1、DNA提取
1.1羽髓样品的处理与DNA提取
拔取疑似病例翅羽3-5根，剪碎羽髓，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，4℃、12000r/min离心10min，吸取600μL上清液置入另一离心管，再加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L-1NaOH溶解，得羽髓样品DNA提取液。
1.2阴性对照样品提取：吸取100μL灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L-1NaOH溶解，得阴性对照样品提取液。
2、PCR扩增反应
2.1羽髓样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入羽髓样品DNA提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得羽髓样品PCR扩增产物。
2.2阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物。
2.3阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入鸟类多瘤病毒阳性质粒2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物。
3、电泳检测
将所得的羽髓样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物通过10g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行检查诊断，具体如下：
3.1称取1.0g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液中，微波炉中加热融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待冷却凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液淹没胶面，得琼脂糖缓冲溶液。
3.2分别取5μL羽髓样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物和琼脂糖缓冲液混匀，加入加样孔中，同时加5μL DL2000DNA分子量标准。
3.3电压80V～100V，或电流40mA～50mA，电泳30min。
3.4取出凝胶，置入紫外分析仪中观察，或置入凝胶成像系统中观察照相。
3.5以DL2000DNA分子质量标准作为参照，阴性对照不出条带，阳性对照出306bp条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现306bp条带，即为鸟类多瘤病毒感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。
实施例3
1、血清样品的处理
对疑似病例鹦鹉进行翅静脉采血，自然凝固，待血清析出后分离血清，备用。
2、DNA提取
2.1血清样品DNA提取：吸取100μL所得上清液置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L-1NaOH溶解，得血清样品DNA提取液。
2.2阴性对照样品提取：吸取100μL灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L-1NaOH溶解，得阴性对照样品提取液。
3、PCR扩增反应
3.1血清样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入血清样品DNA提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得血清样品PCR扩增产物。
3.2阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物。
3.3阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入鸟类多瘤病毒阳性质粒2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物。
4、电泳检测
将所得的血清样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物通过10g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行检查诊断，具体如下：
4.1称取1.0g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液中，微波炉中加热融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待冷却凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液淹没胶面，得琼脂糖缓冲溶液。
4.2分别取5μL血清样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物和琼脂糖缓冲液混匀，加入加样孔中，同时加5μL DL2000DNA分子量标准。
4.3电压80V～100V，或电流40mA～50mA，电泳30min。
4.4取出凝胶，置入紫外分析仪中观察，或置入凝胶成像系统中观察照相。
4.5以DL2000DNA分子质量标准作为参照，阴性对照不出条带，阳性对照出306bp条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现306bp条带，即为鸟类多瘤病毒感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。
实施例4
1、全血样品的处理
对疑似病例鹦鹉进行翅静脉采血，加入抗凝剂，混合均匀后即得到全血样品，备用。
2、DNA提取
2.1全血样品DNA提取：吸取100μL所得上清液置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L-1NaOH溶解，得全血样品DNA提取液。
2.2阴性对照样品提取：吸取100μL灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L-1NaOH溶解，得阴性对照样品提取液。
3、PCR扩增反应
3.1全血样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入全血样品DNA提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得全血样品PCR扩增产物。
3.2阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物。
3.3阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入鸟类多瘤病毒阳性质粒2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物。
4、电泳检测
将所得的全血样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物通过10g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行检查诊断，具体如下：
4.1称取1.0g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液中，微波炉中加热融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待冷却凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液淹没胶面，得琼脂糖缓冲溶液。
4.2分别取5μL全血样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物和琼脂糖缓冲液混匀，加入加样孔中，同时加5μL DL2000DNA分子量标准。
4.3电压80V～100V，或电流40mA～50mA，电泳30min。
4.4取出凝胶，置入紫外分析仪中观察，或置入凝胶成像系统中观察照相。
4.5以DL2000DNA分子质量标准作为参照，阴性对照不出条带，阳性对照出306bp条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现306bp条带，即为鸟类多瘤病毒感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。
电泳检测结果发现30份临床样品中疑似感染鸟类多瘤病毒有9份，阳性率为30％。其中，图3为部分临床样品的电泳检测结果，由图3可知，1/4/5/6/7为鸟类多瘤病毒感染阳性结果；2/3/8/9为阴性结果。田间试验证明本发明所得的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒实用性和适用性良好。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒。
2.根据权利要求1所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述APV-F上游引物的序列为：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列为：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。
3.根据权利要求1所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1APV-F上游引物、25μmol·L-1APV-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为鸟类多瘤病毒阳性质粒，20个反应共计40.0μL，装成1管。
4.根据权利要求1所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述鸟类多瘤病毒为鹦鹉鸟类多瘤病毒。
5.一种鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：
步骤1，DNA提取
子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；
子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；
步骤2，PCR扩增反应
子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物；
子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述阴性对照样品提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；
子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入鸟类多瘤病毒阳性质粒，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应30s、54℃反应40s、72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；
步骤3，电泳检测
通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断。
6.根据权利要求5所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤2中，所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、APV-F上游引物、APV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶。
7.根据权利要求6所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，所述APV-F上游引物的序列为：5’-GTATGTATGACCCATAGAA-3’，所述APV-R下游引物的序列为：5’-GCAGCAGGAGAAGCCTCAGGG-3’。
8.根据权利要求5所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤2中，所述多个循环为35个循环。
9.根据权利要求5所述的鸟类多瘤病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤3中，所述判断的标准为：阴性对照样品PCR扩增产物不出条带，阳性对照样品PCR扩增产物出306bp条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现306bp条带，即为鸟类多瘤病毒感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。
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