CN104342501A - 一种检测猪水泡病病毒的引物、检测试剂盒和制备方法 - Google Patents

一种检测猪水泡病病毒的引物、检测试剂盒和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种检测猪水泡病病毒的引物、检测试剂盒和制备方法。本发明用于检测猪水泡病病毒的引物基因序列为SEQIDNo.1（SVDV-F）、SEQIDNo.2（SVDV-R）、SEQIDNo.3（UWD-F）、和SEQIDNo.4（UEV-R）。相关的实验表明，本发明的引物序列可特异性快速扩增水疱性口炎病毒的核酸，通过核酸电泳检测到特异性条带，并具有特异性。本发明可在制备快速鉴别猪水泡病病毒的GeXP诊断中的应用，并在猪水泡病流行病学研究中应用。

Description

一种检测猪水泡病病毒的引物、检测试剂盒和制备方法
技术领域
本发明涉及一种检测猪水泡病病毒的引物、检测试剂盒和制备方法。 
背景技术
猪水泡病是由小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）的猪水泡病病毒（Swine vesicular disease virus , SVDV）引起的一种猪的急性高度接触性传染病，且该病流行性强、发病率高，严重的妨碍了猪产品的交流和国际贸易，并能造成严重的公共卫生问题，因此世界动物卫生组织（IOE）将其列为动物的A类传染病。该病可以引起感染动物舌部、口腔、蹄部和乳房出现水泡以及溃疡，并使患处丧失生产力，且该病很难在临床症状上和口蹄疫进行区别。该病于1966年首先在意大利发生，并且该病毒在两年后被提取和鉴定。随后又有许多国家和地区相继出现了此病，引起了国际肉食市场的混乱。因此，世界动物卫生组织于1973年专门召开会议，研究其防控措施，并制定了相关的条例，将该病正式定名为“猪水泡病”。该病依然存在于意大利地区，2006年意大利一些已无猪水泡病毒病毒的地区再次爆发了该病。随着我国加入世界贸易组织，猪以及产品进出口贸易的不断扩大，该病的防控和检疫问题显得尤为重要。 
传统检测病毒的方法主要有动物接种、病毒分离、血清学试验等，这些方法普遍存在耗时长、操作繁琐、灵敏度不高等缺点，特别是对于未见水泡只有疑似斑痕残留，或无明显症状的亚临床感染及康复动物是否带毒情况用传统方法很难准确判断(钟金栋,花群义, 夏雪山, 杨云庆,周晓黎,董俊. 猪水泡病病毒 RT-PCR 检测方法的建立.中国农学通报, 2006,22(12):25-27.)。目前，猪水泡病的检测大多都集中在酶联免疫吸附试验（ELISA）上。在R.M.Armstrong 等(Armstrong R M, Barnett T R. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection and quantification of antibodies against swine vesicular disease virus [J]. Journal of Virological Methods, 1989, 25:71~80.)建立了利用 ELISA 进行快速检测猪水泡病病毒的方法。Dekker 等(Dekker A, van Hemert-Kluitenberg F, Baara C, et al. Isotype specific ELISAs to detect anti- bodies against seine vesicular disease virus and their use in epidemiolog [J]. Epidemiol infect, 2002,128(2): 277~284.)建立了型特异性ELISAs (Isotype specific ELISAs)，用于监测猪群是否感染水泡病。E.Brocchi 等(Brocchi E, Berlinzani A, Gamba D, et al. Development of two novel monoclonal antibody- based ELISAs for the detection of antibodies and the identification of swine isotypes against vesicular disease virus[J]. Journal of Virological Methods, 1995, 52:155~167.)使用 MAC-ELISA 和Isotype-specific ELISA 两种方法来诊断猪水泡病，用MAC-ELISA对猪水泡病与口蹄疫、水泡性口炎进行鉴定，用Isotype-specific ELISA对猪水泡病感染的程度进行鉴定。以上的这些方法均是建立在 ELISA 技术的基础上，常规 RT-PCR对SVDV病毒的检测和特异性诊断进一步丰富、改进和提高了日常的诊断方法(Lin F, Mackay D K, Knowles N J. Detection of swine vesicular disease virus RNA by reverse transcription- polymerase chain reaction[J]. Journal of Virological Methods, 1997, 65:111~121)。 
根据 PCR 原理建立的 RT- PCR 方法用于猪水泡病病毒的检测，有效地弥补了传统方法的不足，可望为畜产品及活畜带毒的检测提供一种有效的新方法。国内目前已有检测猪水疱病的相关报道(钟金栋,花群义, 夏雪山, 杨云庆,周晓黎,董俊. 猪水泡病病毒 RT-PCR 检测方法的建立.中国农学通报, 2006,22(12):25-27.)，从试验结果来看，RT- PCR 方法检测所需的病料少，对病料的采集方法、保存及运输等要求不高，对于因保存不当失活的病毒仍可得到客观可靠的结果，而且该RT-PCR方法所需时间短，传统方法检测猪水泡病毒需几天甚至几周，而RT-PCR方法只要10h左右。但是毕竟作为一种常规普通的方法，在灵敏度方面，对SVDV RNA 进行 10 倍系列稀释后检测，结果 SVDV RNA 只能达到10-4稀释度以上才能检测到阳性，说明灵敏性相对ELISA较好，但是相比于更加灵敏的技术而言，灵敏度依然不够高。因此在临床使用上也容易和出现漏检，并且由于需要进行琼脂糖凝胶电泳分析，规模化操作较难。 
因此急需开发新的检测方法，以便于适应于高通量、规模化、快速准确地进行猪水泡病的流行病学监测。 
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足的检测猪水泡病病毒的技术，包括：可用于检测猪水泡病病毒引物，用于检测猪水泡病病毒试剂盒和制备方法。 
本发明用于检测猪水泡病病毒的引物基因序列为SEQ ID No.1（SVDV-F）、SEQ ID No.2（SVDV-R）、SEQ ID No.3（UWD-F）、和SEQ ID No.4（UEV-R）。 
本发明的猪水泡病病毒的检测试剂盒中包括有四条用于GeXP多重基因分析系统的扩增引物SEQ ID No.1（SVDV-F）、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4，其中SEQ ID No.3的5’端添加有Cy5荧光标签。 
本发明的试剂盒非疾病诊断目的的使用方法是以被检样品的RNA为模板，用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4引物进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图中195bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的阴阳性。 
GeXP多重基因分析系统（GeXP Genetic Analysis System)是美国Beckman Coulter公司研发的用于多基因表达定量分析的平台。该系统将毛细管电泳分离技术和高灵敏的激光诱导荧光技术相结合，使基因表达定量分析实现了更高的灵敏度和更快的速度。该系统以mRNA为模版，在同一PCR反应体系中由荧光标记的通用引物和特异性嵌合引物引发的多种PCR反应，随后经毛细管电泳分离技术进行分析。该方法具有高通量、高准确性、高灵敏度等优点，目前已被逐步应用于各种疾病病原的检测中。在我国已经先后建立了水泡带状疱疹病毒、流感病毒、呼吸道病毒、手足口病以及乳头瘤病毒的GeXP多重PCR检测体系，但是目前国内外尚无基于GeXP鉴别诊断猪水泡病病毒试剂盒和检测方法的报道，同样单独或者联合使用可以鉴别检测口猪水泡病病毒的GeXP方法也尚无报道。 
本发明的SVDV引物及扩增片段位于VP1片段区域，该片段在SVDV中十分的保守。与口蹄疫病毒一样VP1，该片段编码的蛋白质也参与SVDV的吸附。入侵和免疫反应，因此该区域的核苷酸序列常常被用来进行猪水泡病病毒亚型的分型和进化分析。因此，本发明选择猪水泡病病毒VP1序列作为靶基因的区域，根据GeXP多重PCR检测体系引物的要求设计猪水泡病病毒的特异性引物。 
相关的实验表明，本发明的引物序列SEQ ID No.1（SVDV-F）和SEQ ID No.2（SVDV-R）可特异性快速扩增水疱性口炎病毒的核酸，通过核酸电泳检测到特异性条带，但同等条件下不能扩增口蹄疫A型病毒、口蹄疫病毒Asia 1病毒、口蹄疫O型病毒和水疱性口炎病毒的核酸。 
相关的实验提示本发明的序列可在制备快速鉴别猪水泡病病毒的GeXP诊断试剂盒中的应用，并在猪水泡病流行病学研究中应用。 
附图说明
图1为猪水泡病病毒引物特异性验证的核酸电泳检测结果。其中猪水泡病病毒引物可以特异性地扩增出猪水泡病病毒的基因组片段，而水疱性口炎病毒、口蹄疫A型病毒、口蹄疫O型病毒和口蹄疫Asia 1型病毒均无特异性条带产生，说明猪水泡病病毒的GeXP引物的特异性非常高。 
图2为猪水泡病病毒引物PCR灵敏性验证的核酸电泳检测结果。其中M为DL2000 Marker；1为109个拷贝；2为108个拷贝；3为107个拷贝；4为106个拷贝；5为105个拷贝；6为104个拷贝；7为103个拷贝。由图可见109~104个拷贝的模板均由特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。从图可以看出本发明所设计的猪水泡病病毒GeXP引物在58℃条件下PCR反应最少可以检出104个拷贝的模板。 
图3为猪水泡病病毒GeXP引物的GeXP-PCR特异性检测结果。从图可以看出在195bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时用猪水泡病病毒的引物对口蹄疫A型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫O型病毒和水疱性口炎病毒基因组进行GeXP反应时没有任何信号峰出现，这说明猪水泡病病毒病毒的GeXP引物具有非常好的特异性。 
图4至图7为本发明的猪水泡病病毒GeXP引物的GeXP-PCR灵敏性检测结果，其中图4为104copies/μL，图5为103copies/μL，图6为102copies/μL，图7为10copies/μL。结果显示104copies/μL~102 copies/μL的模板均可以检测到特异性的峰值，随着模板量的检测，峰值的信号强度也不断的减弱，在10 copies/μL时检测不到特异性的信号峰值。从图中可以看出本发明中所设计的猪水泡病病毒GeXP引物在本发明检测体系中可以检测出102 copies/μL的模板。 
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细解说. 
1. 序列的制备
根据GeXP引物设计要求和NCBI公布的SVDV的基因组，选择保守区域设计特异性引物，并通过添加通用引物形成特异性嵌合引物，而通用引物序列属于非生物源性的核苷酸序列，此外合成通用引物序列，并在上游通用引物的5’端添加Cy5荧光标签。本发明的可特异性扩增猪水泡病病毒核酸的引物序列为：AGGTGACACTATAGAATATTCAGAATGATTGCATATGGGG，在本发明中被命名为SVDV-F；GTACGACTCACTATAGGGATCACGTTTGTCCAGGTTACC，在本发明中被命名为SVDV-R。用于本发明的通用引物：Cy5 AGGTGACACTATAGAATA，在本发明中被命名为UWD-F；GTACGACTCACTATAGGGA，本发明中被命名为UEV-R。
  
2．病毒基因组提取
单层BHK细胞长至80%以上融合后，接种病毒，37℃孵育30min后弃去毒液。加入细胞维持液，37℃ 5% CO2培养，定期观察细胞病变（CPE），待90%以上细胞出现CPE后收毒。将病毒反复冻融3次，置-20℃冰箱保存备用。使用TaKaRa 公司DNA提取试剂盒提取细胞毒株中的RNA。
3. 猪水泡病病毒引物特异性验证 
以提取纯化的病毒RNA为模板进行扩增，实验体系如下：
反应条件如下：
各取5μL 的PCR产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。检测结果表明，猪水泡病病毒的GeXP引物在58℃的条件下能特异性地扩增出水疱性口炎病毒基因组片段，而口蹄疫A型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫O型病毒和水疱性口炎病毒均无特异性条带产生，说明猪水泡病病毒的GeXP引物的特异性非常高。
4. 猪水泡病病毒的GeXP引物单重PCR灵敏性验证 
利用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计测定SVDV型基因组的浓度，根据SVDV型基因组的分子量和浓度计算其相应的拷贝数。对SVDV型基因组进行梯度稀释，各取1μL作为模板，检测单重PCR的敏感性，PCR反应体系为：
各取5μL 的PCR产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。检测结果表明，109~104个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。从图可看出本发明所设计的猪水泡病病毒的GeXP引物在58℃下，可检出反应体系中104个拷贝的模板。
5. 猪水泡病病毒GeXP-PCR的特异性检测 
根据Beckman Coulter公司的GenomeLab片段分析策略，建立25μL的PCR反应体系，反应体系为：
RT-PCR反应：
PCR产物的毛细管电泳分析：
用甲酰胺（Sample Loading Solution, SLS）对PCR产物进行10倍的稀释；配置上样反应体系（40μl），包含38.5μl的甲酰胺（Sample Loading Solution, SLS），0.5μl的DSS 400（分子量内标-400），1μl的PCR产物稀释液；在漩涡器上震荡30s混匀，或用枪头混匀，并做简易离心以除去气泡，每孔加一滴石蜡油防止样品挥发；在缓冲液板与上样板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；进入GeXP的Set Up程序，输入样品名称，对每个样品指定Frag-3分离方法，指定默认的GeXP分析方法，开始运行样本。
毛细管电泳结束，导出实验数据并对实验结果进行分析，从图可以看出在268bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时用猪水泡病病毒的引物对口蹄疫A型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫O型病毒和水疱性口炎病毒基因组进行GeXP反应时没有任何信号峰出现，这说明水疱性口炎病毒的GeXP引物具有非常好的特异性。 
6. 猪水泡病病毒GeXP-PCR灵敏性检测 
利用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计测定猪水泡病病毒RNA的浓度，根据病毒RNA的分子量和浓度计算其相应的拷贝数。对病毒RNA进行梯度稀释，稀释至106copies/μL~10 copies/μL，各取1μl作为模板，检测猪水泡病病毒GeXP-PCR的灵敏性。
    结果显示，猪水泡病病毒GeXP引物在58℃下对不同浓度基因组进行GeXP-PCR后的检测结果。结果显示104copies/μL~102 copies/μL的模板均可以检测到特异性的峰值，随着模板量的检测，峰值的信号强度也不断的减弱，在10 copies/μL时检测不到特异性的信号峰值。从图中可以看出本发明中所设计的猪水泡病病毒GeXP引物在本发明检测体系中可以检测出102 copies/μL的模板。 
综上可见，本发明设计合成的4个基因序列以及其形成的GeXP方法可以单独在使用快速检测猪水泡病病毒。 
 
<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>  一种检测猪水泡病病毒的引物、检测试剂盒和制备方法
<160>  4
 
<210>  1
<211>  40
<212>  DNA
<213>  人工序列（SVDV-F）
<400> 
aggtgacact atagaatatt cagaatgatt gcatatgggg                            40
 
<210>  2
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列（SVDV-R）
<400>
gtacgactca ctatagggat cacgtttgtc caggttacc                             39
 
<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列（UWD-F）
<400>
aggtgacact atagaata                                                    18
 
<210>  4
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列（UEV-R）
<400>
gtacgactca ctataggga                                                   19

Claims (3)

1.用于检测猪水泡病病毒的引物，其特征在于引物基因序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4。
2.一种猪水泡病病毒的检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有四条用于GeXP多重基因分析系统的扩增引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4，其中SEQ ID No.3的5’端添加有Cy5荧光标签。
3.权利要求2所述试剂盒非疾病诊断目的使用方法，其特征在于以被检样品的RNA为模板，用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4引物进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图中195bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的阴阳性。
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