CN110527747A - 一种检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒 - Google Patents

一种检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪瘟病毒野毒株的检测方法及其试剂盒，所述检测方法步骤如下1)、检测样本的获得：猪瘟病毒野毒RNA的提取，提取后将RNA浓度稀释到10拷贝/μL。2)、反应体系配制：取7μL恒温扩增缓冲液、1μL恒温扩增酶溶液、2μL步骤1)稀释的RNA溶液混合成10μL反应溶液，旋涡震荡混匀。3)、NASBA扩增与检测：置于实时荧光PCR仪中，使用NASBA引物组与探针组，设置温度为41℃，恒温扩增反应1h，并同时完成实时荧光扫描。4)、结果判定：检测结果有典型的到S型扩增曲线为阳性。

Description

一种检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒
技术领域：
本发明涉及病毒检测方法，特别涉及种猪瘟病毒野毒株的检测方法及其试剂盒。
背景技术：
猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV) 引起的急性、热性、高度接触性传染病，有“猪霍乱”之俗称。猪瘟呈世界性分布，危害程度高，给养猪业带来了严重的经济损失，世界动物卫生组织(OIE) 将其列为A类传染病，并规定为国际重点检疫对象，我国将其列为一类传染病，是我国强制免疫的四大疫病之一。
猪瘟病毒是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员，基因组为单股正链RNA，长约12.3kb。基因组两端分别为非帽子结构的5′UTR (untranslated region，UTR)和无poly A结构的3′UTR，在二者中间包含一个较大的开放阅读框，编码3898个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白在宿主的信号肽酶和病毒的几个蛋白酶作用下被裂解为四种结构蛋白和八种非结构蛋白，按照从氨基端到羧基端的顺序分别是Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、 NS4B、NS5A和NS5B。CSFV的非编码区在病毒基因组复制和多聚蛋白翻译中发挥调控作用。
近年来，我国猪瘟发病特点呈散发性、温和性、多种病原混合感染、隐性感染和亚病毒感染，在病理剖检上也常出现非典型猪瘟的病理变化，不利于临床诊断。由于猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的大规模应用，使得野毒感染猪与疫苗免疫猪的鉴别变得困难。传统CSFV诊断方法要包括病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金试纸条、荧光抗体试验、常规RT-PCR等。但这些方法在敏感性、特异性、时效性上都存在一些问题。比如病毒分离鉴定，操作繁琐，费时费力，ELISA等血清实验存在交叉反映，且灵敏度低。胶体金试纸虽然方便，但是特异性、敏感性都差，易存在假阳性。
常规PCR技术存在如下缺点：1)仪器价格昂贵；2)操作繁琐；3)耗时较长，因此限制了其在基层的推广使用。杂交芯片法，成本较高、操作比较复杂，依赖较多昂贵的仪器。
依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification),即NASBA 扩增技术是一种新型的，专门用来扩增单链RNA的技术。不需要模板的热变性、长时间循环扩增等过程。由一对带有T7启动子序列的引物介导，在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩增。PCR需要约20个循环可将DNA模板扩增109倍，而NASBA只需4～5个循环就可将RNA扩增109倍。此外，在灵敏度方面，NASBA可以检测到溶液中低于10copies/uL的痕量靶标的痕量靶标，而PCR的检测限在100copies/ul左右。由于NASBA对模板RNA的高效扩增，大大缩短了反应时间，从而降低了酶促反应过程中的核苷酸错配几率。因此， NASBA技术无论在扩增效率还是检测灵敏度都高于RT-PCR技术。特异性强，由于NASBA在反应中无需加热变性步骤，不受样品中DNA、肝素、EDTA、柠檬酸盐、血红蛋白、白蛋白和脂质等污染的影响，更适合粗提样品的直接扩增。此外，NASBA的反应条件为41℃的恒温，水浴锅即可满足，不需要复杂的升降温PCR设备，因此NASBA技术的仪器成本非常低廉。
将NASBA技术和本发明的高特异毗邻探针相结合，可以实现NASBA扩增产物的实时检测，具有操作简单、无需产物开盖环节，避免较差污染等优势。
本发明的高特异毗邻探针检测NASBA产物的原理是：处于上游的探针序列3’端标记有荧光报告基团，处于下游的探针序列5’端标记有荧光猝灭集团，当没有NASBA产物扩增时，两条探针核苷酸序列游离与体系中，发射荧光，可检测到强的荧光信号。当有NASBA扩增产物时，两条毗邻的核苷酸序列与NASBA 扩增产物结合后，3’端的荧光报告基团和5’端的荧光猝灭集团十分接近，荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收，并以热量形式散失，此时体系中荧光信号降低，实时监测显示数据为倒S形曲线。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种用于检测猪瘟病毒野毒株的2条引物与2条探针组合。
本发明所提供的用于检测猪瘟病毒野毒株的引物与探针如下表：
表1用于检测猪瘟病毒野毒株1套引物与探针组序列
所述两条探针3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。上游探针1的3’端标记有荧光报告集团可以为FAM、TET、HEX、 JOE、CY3、CY5、ROX、Texas、Red等，下游探针2的5’端标记有荧光猝灭集团TAMARA、BHQ1、BHQ2、CY5等。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测猪瘟病毒野毒株的检测方法。包括使用上述的NASBA引物组与探针组进行恒温扩增。
本发明所述的检测方法，步骤如下：
1)、检测样本的获得：猪瘟病毒野毒RNA的提取，提取后纯化并将RNA浓度稀释到10拷贝/μL；
2)、反应体系配制：取7μL恒温扩增缓冲液、1μL恒温扩增酶溶液、2μL步骤1) 稀释的RNA溶液混合成10μL反应溶液，旋涡震荡混匀；
3)、NASBA扩增与检测：置于实时荧光PCR仪中，使用NASBA引物组与探针组，设置温度为41℃，恒温扩增反应1h，并同时完成实时荧光扫描；
4)、结果判定：检测结果有典型的倒S型扩增曲线为阳性。
其中，所述猪瘟病毒野毒RNA的提取方法如下：
用天根病毒DNA/RNA提取试剂盒(DP315)提取病毒核酸，步骤如下：
1.用移液器将20uL Proteinase K加入一个干净的1.5mL离心管中。
2.向离心管中加入200uL血浆/血清/淋巴液(样品需平衡至室温)。
3.加入200u L Carrier RNA工作液(为缓冲液GB与Carrier RNA溶液的混合液，)。
盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀。
注意：为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀。
4.在56℃孵育15min。简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
5.加入250uL无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀。盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀。在室温(15-25℃)放置5min。
注意：如果周围环境高于25℃，乙醇需要再在冰上预冷后再加入。
6.简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
7.仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8000rpm(～6000g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
注意：如果吸附柱上的液体未能全部离心至收集管中，请加大转速，延长离心时间至液体完全转移到收集管中。
8.小心打开吸附柱盖子，加入500uL溶液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，8000rpm(～6000g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
9.小心打开吸附柱盖子，加入600uL溶液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，静置2min,8000rpm(～6000g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
10.重复步骤9
11.小心打开吸附柱盖子，加入500uL无水乙醇，盖上管盖，8000rpm(～6000g) 离心1min，弃废液。
注意：乙醇的残留可能会对后续实验造成影响。
12.将吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400g)离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。
13.将吸附柱放入一个RNase-Free离心管(1.5mL)中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150uL RNase-FreeddH2O,盖上管盖，室温放置5min。12000rpm(～13400g)离心1min。得到提取并纯化的猪瘟病毒RNA。
其中，所述NASBA引物组与探针组为序列表中序列1-20的序列。
优选的，所述NASBA引物组与探针组为序列表中序列3,序列8，序列13，序列18的序列。
所述探针组中，两条探针3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。
所述探针组中，上游探针1的3’端标记有荧光报告集团可以为FAM、TET、HEX、 JOE、CY3、CY5、ROX、Texas、Red等，下游探针2的5’端标记有荧光猝灭集团TAMARA、BHQ1、BHQ2、CY5等。
本发明进一步提供一种用于检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒，所述试剂盒中包含序列表中序列1-20的NASBA引物组与探针组。优选的所述试剂盒中包含序列表中序列3,序列8，序列13，序列18的序列。
本发明所述试剂盒中含有恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液；其中，恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM Tris-HCL(pH8.0)，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.1μM上游探针，0.1μM下游探针，50mM DTT，10mM dNTP， 10mMrNTP，80mM MgCl2,450mMKCl，15％DMSO，1M山梨糖醇，20mM四甲基氯化铵。
所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/μL，T7 RNA聚合酶5U/μL，核糖核酸酶H 0.5U/μL，RNA酶抑制剂5U/μL，BSA0.5μg/μL。本发明的NASBA检测方法中，可以在实时荧光PCR仪上通过出峰时间以及扩增曲线判定检测结果。
本发明所述检测方法和检测试剂盒可以在1h内完成检测，且检测结果具有较高的特异性，与猪瘟病毒疫苗株以及其它病毒无交叉反应。
本发明的关键点及保护点在于筛选到的灵敏度高、特异性强、重复性好的NASBA恒温扩增引物以及检测试剂盒。
专门针对RNA进行扩增；扩增产物为单链RNA，不易造成交叉污染而出现假阳性；结合博奥生物集团有限公司发明的毗邻法高特异探针，检测灵敏度高，特异性和重复性好。
本发明的方法可以用于非诊断目的，也可以用于诊断。
附图说明：
图1引物探针组筛选结果，1：CSFV-1引物探针组；2：CSFV-2引物探针组；3：CSFV-3引物探针组；4：CSFV-4引物探针组；5：CSFV-5引物探针组。
图2引物探针组合CSFV-3特异性测试结果
图3引物探针组合CSFV-3灵敏度测试结果，其中1:105拷贝/μL；2：104拷贝/μL； 3：103拷贝/μL；4：102拷贝/μL；5：10拷贝/μL；
图4.引物探针组合CSFV-3重复性测试结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
猪瘟病毒野毒株(CSFV)、猪瘟病毒疫苗株(CSFV-C)、高致病猪蓝耳病毒 (HP-PRRSV)、猪蓝耳病毒经典株(PRRSV)由北京农学院提供
用天根病毒DNA/RNA提取试剂盒(DP315)提取病毒核酸，步骤如下：
1.用移液器将20uL Proteinase K加入一个干净的1.5mL离心管中。
2.向离心管中加入200uL血浆/血清/淋巴液(样品需平衡至室温)。
3.加入200ul Carrier RNA工作液(为缓冲液GB与Carrier RNA溶液的混合液，)。盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀。
注意：为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀。
4.在56℃孵育15min。简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
5.加入250uL无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀。盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀。在室温(15-25℃)放置5min。
注意：如果周围环境高于25℃，乙醇需要再在冰上预冷后再加入。
6.简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
7.仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8000rpm(～6000g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
注意：如果吸附柱上的液体未能全部离心至收集管中，请加大转速，延长离心时间至液体完全转移到收集管中。
8.小心打开吸附柱盖子，加入500uL溶液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，8000rpm(～6000g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
9.小心打开吸附柱盖子，加入600uL溶液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，静置2min,8000rpm(～6000g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
10.重复步骤9
11.小心打开吸附柱盖子，加入500uL无水乙醇，盖上管盖，8000rpm(～6000g) 离心1min，弃废液。
注意：乙醇的残留可能会对后续实验造成影响。
12.将吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400g)离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。
13.将吸附柱放入一个RNase-Free离心管(1.5mL)中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150uL RNase-FreeddH2O,盖上管盖，室温放置5min。12000rpm(～13400g)离心1min。
实施例1、引物组合的筛选与制备
1.针对猪瘟病毒野毒株囊膜糖蛋白E2基因设计多组引物与探针组合，通过试验筛选出CSFV-5引物与探针组合为检测效果最优的一组，所用引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表2用于检测猪瘟病毒野毒株的5套引物与探针组序列
上述的引物与探针组合中，各单链DNA均各自独立包装。
上述的引物与探针组合中，引物、探针、琼脂糖的终浓度为0.2μM、50nM、0.1％ (质量百分比)。
2、以猪瘟病毒野毒株RNA为模板，分别采用步骤1制备的引物与探针组对模板进NASBA导等温扩增检测。
取7μL恒温扩增缓冲液、1μL恒温扩增酶溶液、2μL待测样本RNA溶液混合成 10μL反应溶液，旋涡震荡混匀后置于实时荧光PCR仪中，设置41℃，恒温扩增反应1h，并同时完成实时荧光扫描。
3、结果判断
扩增结果如图1所示，若扩增曲线为典型的倒S形曲线，则表示扩增结果为阳性，若出现直线，则表示扩增结果为阴性。
猪瘟病毒野毒株引物筛选实验结果显示，引物组合CSFV-3检测猪瘟病毒野毒株效果最好。
实施例2、用于检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒特异性分析
以猪瘟病毒野毒株(CSFV)、猪瘟病毒疫苗株(CSFV-C)、高致病猪蓝耳病毒 (HP-PRRSV)、猪蓝耳病毒经典株(PRRSV)为模板，用筛选到的CSFV-3引物探针组进行检测。
取7μL恒温扩增缓冲液、1μL恒温扩增酶溶液、2μL待测样本RNA溶液混合成 10μL反应溶液，旋涡震荡混匀后置于实时荧光PCR仪中，设置41℃，恒温扩增反应1h，并同时完成实时荧光扫描。
如果在45min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的倒“S型”扩增曲线)，表明反应体系中存在猪瘟病毒(CSFV)。
如果在45min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的倒“S型”扩增曲线)，表明反应体系中不存在猪瘟病毒(CSFV)。
结果如图2所示。结果表明，当待测样本为猪瘟病毒时显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为猪瘟病毒疫苗(CSFV-C)、高致病猪蓝耳病毒(HP-PRRSV)、经典猪蓝耳病毒(PRRSV)均不显示阳性扩增曲线。上述结果说明，本发明提供的引物探针组对其靶标基因具有很高的特异性，能准确检测猪瘟病毒野毒株，与猪瘟病毒疫苗株及其它猪RNA病毒无交叉反应。
实施例3、用于检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒灵敏度分析
1、不同浓度的参考品模板制备
将上述纯化后的猪瘟病毒野毒RNA模板定量，并梯度稀释，得到105拷贝/μL、 104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、10拷贝/μL的模板稀释液。
拷贝数计算公式如下：
(6.02×1023copies/摩尔)×(x ng/μl×10-9)/(RNA碱基数×340)＝copies/μl。
其中，x ng/μl＝(OD260)×(稀释倍数)×(40)。
2、反应体系配制
取7μL恒温扩增缓冲液、1μL恒温扩增酶溶液、2μL待测样本RNA溶液(已稀释的模板)混合成10μL反应溶液，旋涡震荡混匀。
3、恒温扩增反应与检测
置于实时荧光PCR仪中，设置41℃，恒温扩增反应1h，并同时完成实时荧光扫描。
4、结果
扩增结果如图3所示，对105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、 10拷贝/μL模板的检测结果均为阳性，获得明显的倒S形扩增曲线。因此，该试剂盒具有较高的检测灵敏度。
实施例4、用于检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒重复性分析
1.检测样本：猪瘟病毒野毒RNA，浓度稀释到1002拷贝/μ。
2、反应体系配制
取7μL恒温扩增缓冲液、1μL恒温扩增酶溶液、2μL待测样本RNA溶液(已稀释的模板)混合成10μL反应溶液，旋涡震荡混匀，做3次重复。
3、恒温扩增反应与检测
置于实时荧光PCR仪中，设置41℃，恒温扩增反应1h，并同时完成实时荧光扫描。
4、结果
扩增结果如图4所示，引物探针组合CSFV-3的3次重复检测有典型的到S型扩增曲线，并且3次重复CV％值为：5.9％。表明重复性很好。
序 列 表
<110>北京农学院
<120>一种猪瘟病毒野毒株的检测方法及其试剂盒
<140>
<141>
<160>20
<170>
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ggcatagggc ccagtctt 18
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
gccgatcaag cactcatga 19
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
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<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
cgttgaagtc gaagccacac c 21
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
aacttacagt agaatagatc 20
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<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
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<210>7
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
aattctaata cgactcacta tagggtcaac ggactgtaac agag 44
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<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
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<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
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<210>12
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
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Claims (8)

1.一种猪瘟病毒野毒株的检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤如下：
1)、检测样本的获得：猪瘟病毒野毒RNA的提取，提取后纯化并将RNA浓度稀释到10拷贝/μL；
2)、反应体系配制：取7μL恒温扩增缓冲液、1μL恒温扩增酶溶液、2μL步骤1)稀释的RNA溶液混合成10μL反应溶液，旋涡震荡混匀；
3)、NASBA扩增与检测：置于实时荧光PCR仪中，使用NASBA引物组与探针组，设置温度为41℃，恒温扩增反应1h，并同时完成实时荧光扫描；
4)、结果判定：检测结果有典型的倒S型扩增曲线为阳性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NASBA引物组与探针组为序列表中序列1-20的序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NASBA引物组与探针组为序列表中序列3,序列8，序列13，序列18的序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针组中，两条探针3’端第1-4位碱基均为核糖核苷酸碱基，其余碱基均为脱氧核糖核苷酸碱基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针组中，上游探针1的3’端标记有荧光报告集团可以为FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX、Texas、Red等，下游探针2的5’端标记有荧光猝灭集团TAMARA、BHQ1、BHQ2、CY5等。
6.一种用于检测猪瘟病毒野毒株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含序列表中序列1-20的NASBA引物组与探针组。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含序列表中序列3,序列8，序列13，序列18的序列。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液；其中，恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM Tris-HCL(pH8.0)，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.1μM上游探针，0.1μM下游探针，50mM DTT，10mMdNTP，10mMrNTP，80mM MgCl2,450mM KCl，15％DMSO，1M山梨糖醇，20mM四甲基氯化铵。
所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/μL，T7 RNA聚合酶5U/μL，核糖核酸酶H0.5U/μL，RNA酶抑制剂5U/μL，BSA0.5μg/μL。
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