CN108472353A - 用于调节病毒感染的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了可用于治疗和/或预防黄病毒感染的组合物和方法。

Description

用于调节病毒感染的组合物和方法

相关申请

本申请要求2015年6月22日提交的美国临时专利申请62/183,018，以及2016年2月16日提交的美国临时专利申请62/295,635的优先权。这些申请的全部内容在此通过引用并入。

背景技术

黄病毒是病毒的一个属，其包括西尼罗河病毒、登革热病毒、黄热病毒、寨卡病毒和几种其它病毒。这些病毒大多数通过来自被感染的节肢动物(例如蚊、虱)的叮咬传播，并且在全世界引起广泛的发病率和致死率。一般没有可用于黄病毒感染的特定治疗。现有的治疗通常涉及住院治疗、静脉输液、呼吸支持和预防继发性感染。通常不存在针对黄病毒感染的疫苗。

例如，登革热病毒(DV)每年感染大约3亿9千万人，并且有25亿人生活在处于登革热传播风险的地区，使得DV成为最流行的节肢动物携带的病毒病原体。DV感染可以引起致人衰弱发热的疾病(称为登革热)，或者更加严重并且可能致命的登革出血热/登革热休克综合征(DHF/DSS)。DV有4个血清型，而且被一种血清型感染仅带来针对该特定血清型的长期免疫。目前没有FDA批准的DV疫苗。仅针对一种血清型进行免疫会导致个体在随后感染不同的血清型时出现DHF/DSS，因为有抗体依赖性的增强作用。候选的四价疫苗最近完成了两个III期临床试验，但针对广泛流行的DV血清2型(DV2)仅显示弱至中等的保护作用(Capeding等，Lancet 384,1358-1365(2014)；Villar等，N Engl J Med；372:113-123(2015))。

因此，本领域需要广泛有效的针对黄病毒的疫苗和抗病毒药。

发明概述

本申请提供了可用于治疗和/或预防黄病毒感染的方法和组合物。在一个方面，本申请提供了一种包含突变的NS3蛋白的突变黄病毒(例如登革热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒)。在一些实施方式中，所述突变的NS3蛋白有14-3-3ε结合缺陷。在一些实施方式中，与包含野生型NS3蛋白的病毒相比，包含所述突变的NS3蛋白的病毒引起增强的先天性免疫应答。在一些实施方式中，与包含野生型NS3蛋白的病毒相比，包含所述突变的NS3蛋白的病毒在个体中产生更强的炎性反应。在某些实施方式中，与包含野生型NS3蛋白的病毒相比，包含所述突变的NS3蛋白的病毒诱导更高水平的干扰素、干扰素刺激的基因，和/或促炎细胞因子。在某些实施方式中，与野生型NS3蛋白或野生型病毒相比，包含所述突变蛋白的突变的NS3蛋白或变体病毒具有降低的抑制RIG-I转移至线粒体/线粒体相关膜，以及RIG-I依赖性信号转导的能力。在一些实施方式中，与包含野生型NS3蛋白的病毒相比，包含所述突变的NS3蛋白的病毒在原代细胞中引起更强的适应性免疫应答。

在某些实施方式中，所述突变的NS3蛋白在相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间包含突变。在某些实施方式中，所述突变为氨基酸取代、插入、删除，或其组合。在某些实施方式中，所述突变包含在相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间将至少一个氨基酸取代为不同的氨基酸。在某些实施方式中，其中所述突变包含在相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间将至少一个氨基酸取代为赖氨酸，例如取代第64或66位氨基酸，或二者。在某些实施方式中，所述突变包含将相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的第64至66位氨基酸取代为氨基酸序列赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸。

在某些实施方式中，所述突变黄病毒为登革热病毒、西尼罗河病毒或寨卡病毒。在某些实施方式中，所述突变黄病毒为登革热病毒血清1型、登革热病毒血清2型、登革热病毒血清3型或登革热病毒血清4型，优选地为登革热病毒血清2型。

在另一个方面，本申请提供了包含本申请公开的突变病毒的药物组合物，以及药学上可接受的运载体。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含佐剂。

在再一个方面，本申请提供了包含本申请公开的突变登革热病毒的登革热病毒疫苗。在某些实施方式中，所述登革热病毒为活病毒。在某些实施方式中，所述疫苗进一步包含佐剂。

在又一个方面，本申请提供了一种突变NS3蛋白，其在相对于SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间包含突变。在某些实施方式中，所述突变为氨基酸取代、插入、删除，或其组合。在某些实施方式中，所述突变为在相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间将至少一个氨基酸取代为不同的氨基酸。在某些实施方式中，其中所述突变为在相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间将至少一个氨基酸取代为赖氨酸，例如取代第64或66位氨基酸，或二者。在某些实施方式中，所述突变对应于将相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的第64至66位氨基酸取代为氨基酸序列赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸。在一些实施方式中，所述蛋白包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在另一个方面，本申请提供了一种病毒，其包含本申请公开的NS3蛋白。

在另一个方面，本申请提供了一种核酸，其编码本申请公开的蛋白。在一些实施方式中，所述核酸具有如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的序列。在一些实施方式中，本申请提供了一种病毒，其包含本申请所述的核酸。在一些实施方式中，本申请提供了一种载体或一种表达载体，其包含所述核酸。在一些实施方式中，本申请提供了一种细胞(例如一种宿主细胞)，其包含本申请公开的载体、表达载体或核酸。在一些实施方式中，本申请提供了一种用于产生蛋白的方法。在一些实施方式中，所述方法包括在适于所述蛋白表达的条件下培养包含本申请公开的核酸的细胞。在一些实施方式中，所述方法包括从所述细胞中或从培养所述细胞的培养基中分离所述蛋白。在一些实施方式中，所述方法进一步包含分离所述蛋白。

在另一个方面，本申请提供了一种用于引起个体中针对黄病毒的免疫应答的方法，其包含向所述个体施用包含本申请公开的突变病毒的组合物。

在另一个方面，本申请提供了一种用于保护个体免于感染黄病毒的方法，其包括向所述个体施用本申请公开的突变病毒。

在另一个方面，本申请提供了一种治疗病毒感染的方法，所述方法包含向个体(例如需要其的个体)施用本申请公开的突变病毒、本申请公开的突变NS3蛋白、本申请公开的药物组合物、和/或本申请公开的疫苗。在某些实施方式中，所述个体为人。在某些实施方式中，所述个体暴露于登革热病毒。在某些实施方式中，所述个体暴露于包含所述登革热病毒的蚊子。在某些实施方式中，所述个体在最近6个月内、在最近一个月内、在最近两周内、在最近一周内、在最近72个小时内、在最近48个小时内、在最近24个小时内、在最近12个小时内、在最近6个小时内、在最近4个小时内、在最近2个小时内或在最近一个小时内暴露于登革热病毒或蚊子。

在某些实施方式中，所述个体不具有黄病毒感染，但处于发展黄病毒感染的风险。在某些实施方式中，所述个体将前往流行黄病毒的地区。在某些实施方式中，所述地区在美国、阿根廷、澳大利亚、孟加拉、巴巴多斯、玻利维亚、伯利兹、巴西、柬埔寨、哥伦比亚、哥斯达黎加、古巴、多米尼加共和国、法属玻利尼西亚、瓜德罗普、萨尔瓦多、格拉纳达、危地马拉、圭亚那、海地、洪都拉斯、印度、印度尼西亚、牙买加、老挝、马来西亚、美拉尼西亚、墨西哥、密克罗尼西亚、尼加拉瓜、巴基斯坦、巴拿马、巴拉圭、菲律宾、波多黎各、萨摩亚、西沙特阿拉伯、新加坡、斯里兰卡、苏里南、台湾、泰国、特立尼达和多巴哥、委内瑞拉、越南和/或中国。

附图简述

图1包括8个板块(板块A-H)，其显示DV的NS3蛋白与14-3-3ε相互作用。板块A为14-3-3ε的氨基酸序列，以及对来自HEK293T细胞的FLAG-NS3-Pro(DV2，株NGC)亲和性纯化后通过MS识别的特定多肽。多肽覆盖率为约64.3％。数字指示氨基酸。板块B为免疫印迹图像，其显示HEK293T细胞用带有c-myc标签的14-3-3ε和带有FLAG标签的NS3-Pro或NS3-Hel转染。48小时后，将WCL进行FLAG下拉(FLAG-PD)，随后用抗-c-myc和抗-FLAG抗体进行免疫印迹(IB)。板块C为免疫印迹图像，其显示在293T细胞中通过GST-PD和IB，用抗-FLAG和抗-GST抗体评估的FLAG-14-3-3ε与GST、GST-NS5或GST-NS3结合。板块D为免疫印迹图像，其显示HEK293T细胞用带有HA标签的14-3-3ε转染的或用14-3-3ε连同GST或GST-NS3一起转染。将WCL进行GST-PD，随后用抗-HA和抗-GST抗体进行IB。板块E为免疫印迹图像，其显示通过GST-PD和IB，用抗-14-3-3ε抗体评估的内源14-3-3ε与GST，或者DV2(NGC)、YFV(株17D)或HCV(株Con1)的GST-NS3在转染的293T细胞中的结合。板块F为免疫印迹图像，其显示Huh7细胞被模拟感染或用DV2NGC(MOI 1)感染28小时。WCL用抗-14-3-3ε抗体进行免疫沉淀(IP)，然后用抗-NS3和抗-14-3-3ε进行IB。板块G为显示Huh7细胞用FLAG-14-3-3ε转染，并且随后模拟感染或用DV2(NGC)以MOI 1感染24小时的图像。细胞对FLAG(14-3-3ε；)、NS3和NS4A染色并通过共聚焦显微成像。细胞核用DAPI染色。板块H为免疫印迹图像，其显示通过IB用抗-14-3-3ε抗体确定的重组14-3-3ε与纯化的GST或GST-NS3的体外结合。

图2包括3个板块(板块A-C)，其显示14-3-3ε对于控制DV复制至关重要。板块A为柱状图，其显示Huh7细胞用空载体或带有c-myc标签的14-3-3ε转染，并随后用DV2NGC以指定的MOI感染。72小时后，对细胞内的DV prM进行细胞染色，并且通过流式细胞术分析。结果以均值±SD(n＝3)表示。*p<0.05；**p<0.005。板块B为柱状图，其显示Huh7细胞用载体或带有c-myc标签的14-3-3ε转染，并且随后用指定的DV血清型(MOI 0.05)或HSV-1(MOI 0.2)感染。感染的细胞在感染后72或24小时分别通过细胞内prM(DV)或ICP8(HSV-1)染色确定。各病毒的感染性做载体-转染细胞的归一化。结果以均值±SD(n＝3)表示。**p<0.005。板块C为柱状图，其显示K562细胞用14-3-3ε靶向的或非靶向的siRNA(si.C)转染，并且48小时后用DV2NGC(MOI 1)感染细胞。DV prM⁺细胞在感染后48小时通过流式细胞确定。结果以均值±SD(n＝3)表示。*p<0.05。14-3-3ε的敲低通过免疫印迹确定。

图3包括5个板块(板块A-E)，其表示NS2B/3不依赖于蛋白水解作用抑制RIG-I活化。板块A为柱状图，其描述在用GST或GST-RIG-I 2CARD连同载体、DV NS2B/3WT或S135A，或者HCV NS3/4A WT或S139A一起转染的293T细胞中的IFN-β荧光酶活性，其归一化至组成性的pGK-β-gal。病毒蛋白表达通过IB确定。结果以均值±SD(n＝3)表示。**p<0.005。n.s.；不显著。板块B为柱状图，其描述在用GST或GST-RIG-I 2CARD连同载体，或含量增加的DVNS2B/3WT、NS2B/3S135A或NS3一起转染的293T细胞中的IFN-β荧光酶活性，其归一化至组成性的pGK-β-gal。结果以均值±SD(n＝3)表示。*p<0.05；**p<0.005。板块C为柱状图，其描述在经过用载体、DV NS2B/3WT、NS2B/3S135A或NS3转导，随后用SeV(50HAU/ml)感染18小时的293T细胞。荧光酶和β-gal活性如板块A中确定。示出了代表性的病毒蛋白表达的免疫印迹。结果以均值±SD(n＝3)表示。*p<0.05；**p<0.005。板块D为显示GST或GST-NS3被转染至HEK293T细胞的免疫印迹图像。48小时后，细胞用SeV(50HAU/ml)感染16小时。将WCL进行非变性PAGE，随后用抗-IRF3抗体进行免疫印迹。WCL进一步用于SDS-PAGE，随后用于用指定的抗体的IB。板块E为与板块D相似的显示GST或GST-NS3被转染至HEK293T细胞的免疫印迹图像，只是WCL在用指定的抗体进行SeV感染22小时后通过IB分析。PP1γ(非ISG)的表达同样通过免疫印迹确定。

图4包括5个板块(板块A-E)，其显示NS3抑制RIG-I与14-3-3ε的结合，阻止活化的RIG-I转移至线粒体/MAM。板块A为免疫印迹图像，其显示HEK293T细胞用空载体或RIG-I-FLAG连同GST或GST-NS3一起转染。48小时后，细胞用SeV(50HAU/ml)感染19小时。将WCL进行FLAG-PD，随后用抗-泛素(Ub)和抗-FLAG抗体进行IB。板块B为免疫印迹图像，其显示Huh7细胞被模拟感染或用DV2NGC(MOI 1)或SeV(50HAU/ml)感染18小时。WCL用抗-RIG-I进行IP，随后用抗-Ub和抗-RIG-I进行IB。板块C为免疫印迹图像，其显示HEK293T细胞用GST或GST-NS3转染。48小时后，细胞用SeV(50HAU/ml)感染23小时。WCL用抗-RIG-I(左)或抗-TRIM25(右)进行IP，随后用抗-14-3-3ε、抗-TRIM25和抗-RIG-I抗体进行IB。板块D为免疫印迹，其显示Huh7细胞被模拟感染或用DV2NGC(MOI 1)或SeV(50HAU/ml)感染18小时。WCL用抗-RIG-I进行IP，随后用抗-14-3-3ε、抗-TRIM25和抗-RIG-I进行IB。板块E为免疫印迹，其显示Huh7细胞被模拟感染或用DV2NGC(MOI 1)或SeV(50HAU/ml)感染22小时。将WCL进行胞质/线粒体分馏，随后用抗-RIG-I、抗-MAVS和抗-GAPDH抗体进行IB。在WCL中进一步确定RIG-I和NS3的表达。

图5包括7个板块(板块A-G)，其表示NS3使用仿磷酸化的RxEP基序与14-3-3ε结合。板块A为免疫印迹图像，其显示293T细胞用指定的GST融合的NS3截短构建体转染。48小时后，将WCL进行GST-PD，随后用抗-14-3-3ε和抗-GST抗体进行IB。板块B为包含来自DV(血清型1-4)和WNV、YFV、HCV的14-3-3结合基序(绿色)的NS3区的氨基酸序列的序列比对。板块C(左)为DV4NS3蛋白的晶体结构的带状表示。示出了蛋白酶结构域以及接头和解旋酶结构域。表明了RLEP基序(箭头)。板块C(右)为RLEP基序的近距离视图。板块D为柱状图，其显示3280个已知的DV NS3蛋白序列的生物信息分析。各位置最常见的残基作为共有序列示出(底部)，并且在柱状图中用蓝色代表。用不同颜色代表各位置的多态性。如括号中所示，标识出了E⁶⁶或P⁶⁷各自的一个多态性。板块E和F为免疫印迹，其显示293T细胞用GST、GST-NS3或指定的GST-NS3突变体转染。48小时后，将WCL进行GST-PD，随后用抗-14-3-3ε和抗-GST进行IB。板块G为柱状图，其显示HEK293T细胞用GST、GST-NS3WT或GST-NS3KIKP转染。48小时后，细胞用SeV(50HAU/ml)感染。20小时后收获细胞，用于WCL或进行线粒体分馏试验，随后进行免疫印迹分析。

图6包括5个板块(板块A-E)，其表示编码NS3_KIKP突变蛋白的重组DV病毒在复制中弱化，并且引起增强的抗病毒免疫应答。板块A为柱状图，其显示Huh7或Huh7.5细胞用DV2_WT或DV2_KIKP以MOI 0.01感染。72小时后收获细胞，用于细胞内prM染色和流式细胞术分析。结果以均值±SD(n＝3)表示。**p<0.005。板块B为一系列柱状图，其显示Huh7细胞用DV2_WT(MOI0.3)或DV2_KIKP(MOI 1)感染，造成对二者的约75％的感染率，如通过细胞内prM染色所确定(未示出)。48小时后，提取总RNA，并且通过定量实时PCR确定指定基因的转录水平。转录水平对GAPDH归一化，并且以相比于模拟感染的细胞的倍数示出。结果以均值±SD(n＝3)表示。*p<0.05；**p<0.005。板块C为显示Huh7或Huh7.5细胞用DV2_KIKP以MOI 1感染，并且在感染后48小时收获用于qRT-PCR的柱状图，如在板块B中所述的那样。结果以均值±SD(n＝3)表示。**p<0.005。板块D为免疫印迹图像，其显示Huh7细胞用DV2_WT或DV2_KIKP以MOI 0.8模拟感染或感染。20小时后收获细胞，用于WCL或进行线粒体分馏，随后进行免疫印迹分析。

图7包括3个板块(板块A-C)，其表示DV_KIKP在拮抗原代人单核细胞中的先天性免疫应答方面有缺陷。板块A为柱状图，其显示原代CD14⁺单核细胞用DV2_WT或DV2_KIKP以MOI 1感染24小时。RNA转录水平通过qRT-PCR确定。结果以均值±SD(n＝3)表示。*p<0.05；**p<0.005。板块B为柱状图，其显示原代CD14⁺单核细胞如(A)中一样被感染。收获上清，并且通过ELISA对IL-6分析。结果以均值±SD(n＝4)表示。**p<0.005。板块C为柱状图，其显示原代PBMC如板块A中一样被感染，并且随后用布雷菲德菌素A处理6小时。收获细胞用于细胞内IFN-β和prM染色，并且通过流式细胞术分析。结果表明prM⁺单核细胞中IFN-β的平均荧光强度(MFI)。结果以均值±SD(n＝3)表示。*p<0.05。

图8包括2个板块(板块A和B)。板块A为免疫印迹图像，其显示NS2B/3不切割RIG-I、TRIM25或14-3-3ε。HEK293T细胞用TRIM25-FLAG、RIG-I-FLAG、FLAG-14-3-3ε或HA-STING连同空载体或带有HA标签的NS2B/3一起转染。48小时后，WCL用抗-HA和抗-FLAG抗体进行IB分析。板块A为免疫印迹图像，其显示WT NS2B/3有催化活性，而NS2B/3S135A突变体或单独表达的NS3无催化活性。HEK293T细胞用带有HA标签的NS2B/3、NS2B/3S135A或NS3，连同STING-HA一起转染。WCL用抗-HA和抗-肌动蛋白抗体通过IB分析。

图9包括2个板块(板块A和B)。板块A为免疫印迹图像，其显示RIG-I，而非TRIM25，直接与14-3-3ε结合。通过将细菌纯化的重组(r)人14-3-3ε与纯化的TRIM25-FLAG或RIG-I-FLAG孵育，进行体外结合试验。用抗-14-3-3ε和抗-FLAG抗体通过IB确定结合。板块B为免疫印迹图像，其显示DV NS3的异位表达抑制病毒诱导的内源RIG-I由胞质至线粒体的重定位。HEK293T细胞用GST或GST-NS3转导。48小时后，细胞用SeV(50HAU/ml)感染20小时，随后进行线粒体分馏试验和IB分析。

图10为NS3以及GST融合的NS3截短突变体的域结构的示意性表示。还表明了64RxEP67基序，以及来自14-3-3ε结合研究的结果的概述。数字指示氨基酸。

图11包括3个板块(板块A-C)，其显示NS3KIKP突变蛋白在抑制RIG-I-14-3-3ε相互作用和RIG-I转移至线粒体方面受损。板块A为免疫印迹图像，其显示GST、GST-NS3WT或GST-NS3KIKP转染至HEK293T细胞中。48小时后，细胞用SeV(50HAU/ml0感染22小时。ISG(ISG54或RIG-I)在WCL中的蛋白表达用指定的抗体通过IB确定。板块B为免疫印迹图像，其显示HEK293T细胞用GST、GST-NS3WT或GST-NS3KIKP转染。48小时后，细胞用SeV(50HAU/ml)感染20小时。WCL用抗-RIG-I抗体进行IP，随后用抗-14-3-3ε和抗-RIG-I抗体进行IB。板块C为免疫印迹图像，其显示HEK293T细胞用GST、GST-NS3WT或GST-NS3KIKP转染。48小时后，细胞用SeV(50HAU/ml0感染。20小时后收获细胞，用于WCL或进行线粒体分馏试验，随后进行IB分析。

图12包括5个板块(板块A-E)。板块A为免疫印迹图像，其显示NS2B/3KIKP突变蛋白有催化活性。HEK293T细胞用带有HA标签的STING连同空载体或带有HA标签的NS2B/3、NS2B/3S135A或NS2B/3KIKP一起转染。48小时后，WCL用抗-HA和抗-肌动蛋白抗体通过IB分析。板块B和C为柱状图，其显示DV2_WT和DV2_KIKP在Vero细胞中的复制。Vero细胞用DV2_WT或DV2_KIKP以0.02的MOI感染。收获细胞用于在指定时间点的细胞内prM染色，并且通过流式细胞术分析(板块B)。此外，病毒滴度在上清中确定(板块C)。结果以均值±SD(n＝3)表示。*p<0.05。**p<0.005。板块D为柱状图，其显示DV2_WT和DV2_KIKP在Huh7和Huh7.5细胞中的复制。Huh7或Huh7.5细胞用DV2_WT或DV2_KIKP以0.01的MOI感染。收获细胞用于细胞内prM染色，并且通过流式细胞术分析。结果来自2个独立的实验，并且以均值±SD(n＝6)表示。(E)DV2_KIKP而非DV_WT强烈诱导ISG蛋白表达。A549细胞用DV2_WT或DV2_KIKP(MOI均为0.2)感染24小时，并且进行内源ISG54或RIG-I、NS3和DAPI的免疫荧光染色。

图13包括2个板块(板块A和B)。板块A为柱状图，其显示与DV2_KIKP感染的moDC共培养的T细胞中增加的STAT1活化。原代moDC用DV2WT或DV2KIKP以MOI 1感染，并且与同系初始pan T细胞以1：1的比例共培养。72小时后收获T细胞，并且对细胞内磷酸化STAT1(pY701)染色分析。结果以均值±SD(n＝3)表示。*p<0.05。板块B为柱状图，其显示与DV2_KIKP感染的moDC共培养的T细胞中增强的IFN-γ分泌。原代moDC用DV2_WT或DV2_KIKP以MOI 1感染，并且与同系初始pan T细胞以1：1的比例共培养。96小时后收获上清，并且通过ELISA对IFN-γ分析。结果以均值±SD(n＝3每供体)表示。*p<0.05.

图14示出了包含来自DV(血清型1-4)、西尼罗河病毒(WNV)、黄热病病毒(YFV)以及HCV的14-3-3-结合基序的NS3区域的氨基酸序列。

图15为免疫印迹，其示出由GST-PD和IB，用抗-14-3-3ε抗体评估的GST、DV(DV2NGC)、YFV(17D)或WNV(NY99或kunjin)的GST_NS3在经感染的HEK293T细胞中的结合。

图16示出了用GST-RIG-I 2CARD连同GST或DV(DV2NGC)或WNV(NY99或Kunjin)的GST-NS3一起转染的HEK293T细胞中的IFN-荧光酶活性，其归一化至组成性的pGK-b-gal。病毒的NS3表达用抗-GST抗体通过免疫印迹确定。结果以均值±SD(n＝3)表示。*p<0.05。

图17为免疫印迹，其示出由GST-PD和IB，用抗-14-3-3ε抗体评估的GST、WNVGST-NS3WT(NY99)或其突变体(GST-NS3KIKP)，以及内源14-3-3ε在经感染的HEK293T细胞中的结合。

发明详述

在某些方面，本申请提供了涉及治疗和/或预防黄病毒感染(如DV感染、WNV感染或寨卡病毒(ZV)感染)的方法和组合物。在一些实施方式中，本申请公开了蛋白(例如变体多肽及其片段)、编码所述蛋白的核酸、用于产生蛋白的方法，以及在各种应用中使用包含该蛋白的病毒的方法，如用于治疗和/或针对多种情况(包括但不限于黄病毒感染，如登革热病毒)的疫苗。下面描述了示例性的变体蛋白、核酸以及用于制造和使用任意前述内容的方法，但这些并非意在限制。

黄病毒是病毒的一个属，其包括但不限于阿布塞塔罗夫病毒、Alkhurma病毒(ALKV)、鹿蜱病毒(DT)、加德格兹谷病毒(GGYV)、卡达姆病毒(KADV)、喀什病毒、科萨努森林病毒(KFDV)、兰加特病毒(LGTV)、绵羊跳跃病毒(LIV)、蒙吉安娜蜱病毒(MGTV)、纳戈耶病毒(NGOV)、鄂木斯克出血热病毒(OHFV)、波瓦桑病毒(POWV)、皇家农场病毒(RFV)、Sokuluk病毒(SOKV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、土耳其绵羊脑炎病毒(TSE)、卡玛病毒(KAMV)、米班病毒(MEAV)、索马里兹礁病毒(SREV)、秋列尼病毒(TYUV)、伊蚊黄病毒、Barkedji病毒、Calbertado病毒、细胞融合因子病毒、朝阳病毒、库蚊黄病毒、纹腿库蚊黄病毒、脉毛蚊黄病毒、东港病毒、汉口病毒、伊洛曼齐病毒、卡密河病毒、Lammi病毒、马里斯玛蚊病毒、纳基沃戈病毒、Nounané病毒、Nhumirim病毒、Nienokoue病毒、棕榈溪病毒(PCV)、西班牙库蚊黄病毒、西班牙黄蚊黄病毒、广平病毒、阿罗阿病毒(AROAV)、布苏夸拉病毒(BSQV)、伊瓜佩病毒(IGUV)、登革热病毒(DENV)、凯杜古病毒(KEDV)、布苏夸拉病毒、卡西帕科利病毒(CPCV)、库坦戈病毒(KOUV)、伊列乌斯病毒(ILHV)、日本脑炎病毒(JEV)、墨雷谷脑炎病毒(MVEV)、阿尔弗病毒、罗西奥病毒(ROCV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、乌苏图病毒(USUV)、西尼罗河病毒(WNV)、雅温得病毒(YAOV)、科科百拉病毒(KOKV)、新马篷病毒(NMV)、斯特拉特福病毒(STRV)、巴加扎病毒(BAGV)、白洋淀病毒(BYDV)、鸭减蛋综合症病毒(BYDV)、伊列乌斯病毒(ILHV)、江苏病毒(JSV)、以色列火鸡脑膜脑脊髓炎病毒(ITV)、恩塔亚病毒(NTAV)、坦布苏病毒(TMUV)、斯庞德温尼病毒(SPOV)、寨卡病毒(ZIKV)、班齐病毒(BANV)、博博衣病毒(BOUV)、边山病毒(EHV)、朱格拉病毒(JUGV)、萨沃亚病毒(SABV)、塞皮克病毒(SEPV)、乌干达S病毒(UGSV)、韦塞尔斯布朗病毒(WESSV)、黄热病病毒(YFV)、塔马纳蝙蝠病毒(TABV)、恩德培蝙蝠病毒(ENTV)、索科卢克病毒、横须贺病毒(YOKV)、阿波依病毒(APOIV)、牛骨山脊病毒(CRV)、胡蒂亚帕病毒(JUTV)、摩多克病毒(MODV)、萨尔别霍病毒(SVV)、圣帕利塔病毒(SPV)、布卡拉沙蝙蝠病毒(BBV)、凯里岛病毒(CIV)、达卡尔蝙蝠病毒(DBV)、蒙大拿鼠耳蝙蝠白细胞脑炎病毒(MMLV)、金边蝙蝠病毒(PPBV)、里约布拉沃病毒(RBV)、大豆孢囊线虫病毒5、伊蚊黄病毒、灰色伊蚊黄病毒、刺扰伊蚊黄病毒、纹腿库蚊黄病毒。

如本申请所公开，DV的NS3蛋白通过不依赖于蛋白水解的机制拮抗RIG-I(维甲酸可诱导基因I)介导的IFN反应。本公开内容不受限于任何特定的理论或作用机制，NS3与运输分子14-3-3ε结合，阻止RIG-I转移至线粒体/MAM，并因而抑制抗病毒信号转导。NS3与14-3-3ε的结合是使用一个高度保守的四氨基酸序列，其模拟在14-3-3蛋白的细胞相互作用伴侣中存在的典型的磷酸丝氨酸/苏氨酸(pS/pT)基序。因而，重组DV编码有14-3-3ε结合缺陷的突变NS3蛋白时，其拮抗RIG-I的能力降低，并且引起增强的先天性免疫应答。

因而，在某些实施方式中，本申请公开了一种突变登革热病毒，其包含突变的NS3蛋白，其中所述突变的NS3蛋白有14-3-3ε结合缺陷。在一些实施方式中，突变的NS3蛋白在个体中产生更强的炎症反应。在某些实施方式中，突变的NS3蛋白或包含所述突变蛋白的突变病毒诱导更高水平的干扰素、干扰素刺激的基因和促炎细胞因子。在某些实施方式中，突变NS3蛋白或包含所述突变蛋白的突变病毒具有降低的抑制RIG-I转移至线粒体/线粒体相关膜，以及RIG-I依赖性信号转导的能力。

突变NS3蛋白

在某些方面，本申请提供了突变的黄病毒NS3蛋白。在一些实施方式中，所述蛋白为由登革热病毒表达的NS3蛋白的变体。来自登革热病毒血清2型的野生型NS3蛋白的示例性氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

在一些实施方式中，所述蛋白为由西尼罗河病毒表达的NS3蛋白的变体。西尼罗河病毒野生型NS3蛋白的示例性氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

在一些实施方式中，所述蛋白为由寨卡病毒表达的NS3蛋白的变体。寨卡病毒野生型NS3蛋白的示例性氨基酸序列如下(SEQ ID NO:3)：

在一些实施方式中，所述变体NS3蛋白有14-3-3ε结合缺陷。在一些实施方式中，包含所述变体NS3蛋白的病毒与野生型病毒相比，在个体中产生更强的炎性反应。在某些实施方式中，包含所述变体NS3蛋白的病毒与野生型病毒相比，诱导更高水平的干扰素、干扰素刺激的基因，和/或促炎细胞因子。在某些实施方式中，变体NS3蛋白与野生型NS3蛋白相比，具有降低的抑制RIG-I转移至线粒体/线粒体相关膜，以及RIG-I依赖性信号转导的能力。在一些实施方式中，包含所述变体NS3蛋白的病毒与野生型病毒相比，在原代细胞中引起更强的适应性免疫应答。

本申请所述的变体蛋白包含相对于其来源的野生型NS3蛋白的一个或多个氨基酸取代、插入或删除。在一些实施方式中，变体蛋白包含相对于其来源的野生型全长NS3蛋白的至少一个(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或超过100个)氨基酸取代、删除或插入。在一些实施方式中，变体蛋白包含相对于其来源的野生型全长NS3蛋白的不超过150个(例如不超过145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)氨基酸取代、删除或插入。

“多肽”、“肽”和“蛋白”可以互换使用，并且表示任何由肽键连接的氨基酸的链，无论长度或翻译后修饰。

在一些实施方式中，本申请所述的变体蛋白或其片段包括相对于SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的第30位氨基酸和第90位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的第40位氨基酸和第80位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的第50位氨基酸和第80位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的第50位氨基酸和第75位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的第55位氨基酸和第75位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的第60位氨基酸和第75位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的第60位氨基酸和第70位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的第61位氨基酸和第70位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的第61位氨基酸和第69位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的第62位氨基酸和第69位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的第62位氨基酸和第68位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的第63位氨基酸和第68位氨基酸之间的氨基酸取代；相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的第63位氨基酸和第67位氨基酸之间的氨基酸取代。

在某些实施方式中，本申请所述的变体蛋白包括在相对于SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间将至少一个氨基酸取代为不同的氨基酸，例如将第64或66位氨基酸取代为赖氨酸。相对于SEQ ID NO:1的第64和66位氨基酸是在登革热病毒NS3蛋白中高度保守的几种氨基酸中的两种(RxEP)(图6，板块B)。然而，这些氨基酸残基在给定多肽中的确切位置在不同的物种中有所不同，并且随着对天然存在的序列的截短或延伸而有所不同。在一些实施方式中，变体蛋白包括将第64至66位氨基酸取代为赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸序列。

在一些实施方式中，本申请所述的变体蛋白包含在具有以下氨基酸序列(SEQ IDNO:4)的第64位的取代：

在一些实施方式中，本申请所述的变体蛋白包含在具有以下氨基酸序列(SEQ IDNO:5)的第66位的取代：

在一些实施方式中，本申请所述的变体蛋白包含在具有以下氨基酸序列(SEQ IDNO:6)的第64位和第66位的取代：

用于本申请的术语“保守取代”是指将存在于给定的多肽中的天然序列中的氨基酸替换为具有相似空间性质的天然或非天然存在的氨基酸。如果替换的天然氨基酸的侧链为极性的或疏水性的，则所述保守取代应当取代为天然存在的氨基酸、同样为极性的或疏水性的，并且可选地具有与被取代的氨基酸的侧链相同或相似的空间性质的非天然存在的氨基酸。保守取代通常包括下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。单字母的氨基酸缩写如下：丙氨酸(A)；精氨酸(R)；天冬酰胺(N)；天冬氨酸(D)；半胱氨酸(C)；甘氨酸(G)；谷氨酰胺(Q)；谷氨酸(E)；组氨酸(H)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；赖氨酸(K)；蛋氨酸(M)；苯丙氨酸(F)；脯氨酸(P)；丝氨酸(S)；苏氨酸(T)；色氨酸(W)；酪氨酸(Y)；以及缬氨酸(V)。

用于本申请的用语“非保守取代”是指将如母序列中存在的氨基酸替换为具有不同的电化学和/或空间性质的另一个天然或非天然存在的氨基酸。因而，取代氨基酸的侧链可以显著地大于(或小于)被取代的天然氨基酸的侧链，和/或可以具有电子性质与被取代的氨基酸显著不同的官能团。

在一些实施方式中，本申请所述的变体蛋白或其片段具有与(i)SEQ ID NO:2的氨基酸；(ii)SEQ ID NO:3的氨基酸；或(iii)SEQ ID NO:4的氨基酸至少80(例如至少81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99)％相同的氨基酸序列，条件是所述变体蛋白或其片段包含第64位上的氨基酸取代、第66位上的氨基酸取代或其组合。

在一些实施方式中，本申请所述的变体蛋白或其片段具有与(i)SEQ ID NO:4的氨基酸；(ii)SEQ ID NO:5的氨基酸；或(iii)SEQ ID NO:6的氨基酸至少80(例如至少81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99)％相同的氨基酸序列。

氨基酸序列同一性百分比定义为，将序列进行比对并且在必要时引入缺口以得到最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参照序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。为了确定序列同一性百分比的目的而进行的比对可以用多种本技术领域内的方式实现，例如使用公共可用的电脑软件，如BLAST软件或ClustalW2。可以通过已知方法确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较的序列的全长实现最大比对所需的任何算法。

可以使用本领域的任何合适的技术产生本申请公开的蛋白(例如突变NS3蛋白)。例如，编码融合蛋白的核酸可以插入到含有转录和翻译调控序列(其包括例如启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和停止序列、转录起始和停止序列、转录终止子信号、多聚腺苷酸化信号，以及增加子或激活序列)的表达载体。所述调控序列包括启动子以及转录起始和停止序列。另外，所述表达载体可以包括一个以上的复制体系，使其可以在两种不同的生物体中维持，例如在哺乳动物或昆虫细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。

几种可能的载体体系可供在哺乳动物细胞中从核酸表达重组蛋白。一类载体依赖将所需的基因序列整合至宿主细胞基因组。通过同时引入耐药性基因，如大肠杆菌gpt(Mulligan和Berg(1981)Proc Natl Acad Sci USA 78:2072)或Tn5neo(Southern和Berg(1982)Mol Appl Genet 1:327)，可以选择具有被稳定整合的DNA的细胞。可选择标记基因可以与DNA基因序列连接以被表达，或者通过共转染引入同一细胞(Wigler等(1979)Cell16:77)。第二类载体利用将自动复制能力赋予染色体外质粒的DNA元件。这些载体可以来源于动物病毒，如牛乳头瘤病毒(Sarver等(1982)Proc Natl Acad Sci USA,79:7147)、巨细胞病毒、多瘤病毒(Deans等(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:1292)、或SV40病毒(Lusky和Botchan (1981)Nature 293:79)。

所述表达载体可以以适于所述核酸后续表达的方式引入细胞。如以下所讨论，引入的方式主要由靶向的细胞类型所决定。示例性的方法包括CaPO₄沉淀、脂质体融合、阳离子脂质体、电穿孔、病毒感染、葡聚糖介导的转染、凝聚胺介导的转染、原生质体融合和直接显微注射。

用于重组蛋白表达的合适的宿主细胞包括酵母、昆虫、植物以及哺乳动物细胞(例如啮齿类细胞系，如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞)。值得特别关注的是细菌(如大肠杆菌)、真菌(如酿酒酵母和毕氏酵母)、昆虫细胞(如SF9)、哺乳动物细胞系(例如人细胞系)和灵长类细胞系。

通过以足以使得所述蛋白表达的条件和时间，培养用含有编码所述多肽的核酸的表达载体转化的宿主细胞，蛋白可以自所述细胞产生。该用于蛋白表达的条件将随着对所述表达载体和宿主细胞的选择而变化，并且将容易地被本领域技术人员通过常规实验确定。例如，在大肠杆菌中表达的蛋白可以自包涵体复性(参见例如Hou等(1998)Cytokine10:319-30)。细菌表达体系及其使用方法是本领域熟知的(参见Current Protocols inMolecular Biology，Wiley&Sons，以及Molecular Cloning–A Laboratory Manual–第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约(2001))。对密码子、适宜的表达载体和适宜的宿主细胞的选择将依赖于多种因素而变化，并且根据需要可以容易地优化。本申请所述的融合蛋白可以在哺乳动物细胞中表达，或者在其它表达体系中表达，包括但不限于酵母、杆状病毒和体外表达体系(参见例如Kaszubska等(2000)Protein Expression andPurification 18:213-220)。

表达之后可以分离所述重组蛋白。应用于本申请所述的任何蛋白的术语“纯化的”或“分离的”是指已经从其天然伴随的成分(例如蛋白或其它天然存在的生物或有机分子)，例如表达所述蛋白的原核或真核细胞中的其它蛋白、脂质和核酸中分离或纯化的多肽。通常，多肽在构成样品中总蛋白重量的至少60(例如至少65、70、75、80、85、90、92、95、97或99)％时为纯化的。

取决于样品中存在何种其它成分，可以以本领域技术人员公知的多种方式分离或纯化重组蛋白。标准的纯化方法包括电泳、分子、免疫和色谱技术，包括离子交换、疏水、亲和性和反相HPLC色谱。例如，可以使用标准的抗-抗体柱纯化抗体(例如蛋白-A或蛋白-G柱)。还可以使用与蛋白浓缩结合的超滤和渗滤技术。参见例如Scopes(1994)“ProteinPurification，第三版”Springer-Verlag，纽约纽约市。必要的纯化程度将根据所需的用途不同而变化。在一些情况下，表达的蛋白不必纯化。

用于确定纯化的蛋白的产率或纯度的方法也是本领域公知的，并且包括例如Bradford试验、紫外光谱、Biuret蛋白试验、Lowry蛋白试验、氨基黑蛋白试验、高压液相色谱(HPLC)、质谱(MS)和凝胶电泳法(例如使用蛋白染色，如考马斯亮蓝或胶银染色)。

蛋白(例如本申请公开的突变NS3蛋白)的表达还可以通过检测和/或测量蛋白的表达来确定。确定蛋白表达的方法通常涉及使用特异性针对所关注的目标蛋白的抗体。例如，确定蛋白表达的方法包括但不限于蛋白印迹杂交(western blot)或斑点印迹分析、免疫组织化学(例如定量免疫组织化学)、免疫细胞化学、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫吸附斑点试验(ELISPOT；Coligan等编(1995)Current Protocols inImmunology.Wiley，纽约)，或抗体阵列分析(参见例如美国专利申请公开号20030013208和2004171068，其各自的公开内容通过引用整体并入本申请)。对上述多种方法以及用于检测蛋白表达的其它方法的进一步描述可见于例如Sambrook等(同上)。

作为一个示例，蛋白表达的存在或含量可以使用western blot技术确定。例如，制备自生物样品的裂解物或生物样品本身可以与Laemmli缓冲液接触并且进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。随后可以将按大小分开的经SDS-PAGE处理的蛋白转移至过滤膜(例如硝化纤维)，并进行免疫印迹技术，其使用可检测标记的特异于所关注蛋白的抗体。被结合的可检测标记的抗体的存在或含量指示生物样品中蛋白的存在或含量。

作为另一个示例，免疫试验可以用于检测和/或测量蛋白的蛋白表达。如上文，为了检测的目的，可以用带有检测部分(例如荧光剂或酶)的抗体进行免疫试验。来自生物样品的蛋白可以直接缀合至固相基质(例如多孔试验板、硝化纤维、琼脂糖、琼脂糖凝胶、编码化微粒或磁珠)，或者其可以在与特异结合对的第二部分(例如链霉亲和素或生物素)结合后缀合到与固相基质附接的所述特异结合对的第一部分(例如生物素或链霉亲和素)。这种与固相基质的附接使得蛋白可以在与检测抗体接触之前被纯化，与生物样品的其它干扰或无关成分分开，并且允许后续洗脱未结合的抗体。这里如上文所述，结合的可检测标记的抗体的存在或含量指示生物样品中蛋白的存在或含量。

用于生成特异性针对蛋白的抗体或抗体片段的方法可以通过免疫(例如使用动物)，或者通过体外方法(如噬菌体展示)形成。可以使用包括目标蛋白的全部或部分的多肽以生成抗体或抗体片段。所述抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体的制剂。

用于检测或测量基因表达的方法可以可选地以允许快速制备、处理和对多个样品的分析的形式进行。这可以在例如多孔试验板(例如96孔或386孔)或阵列(例如核酸芯片或蛋白芯片)中进行。多种试剂的母液可以人工或由机器提供，并且后续的样品制备(例如RT-PCR、标记或细胞固定)、移液、稀释、混合、分配、洗涤、孵育(例如杂交)、样品读取、数据采集(光学数据)和/或分析(计算机辅助图像分析)可以由机器使用能够检测从试验中生成的信号的市售分析软件、机器人技术和检测仪器进行。该检测器的实例包括但不限于分光光度仪、冷光仪、荧光仪和测量放射性同位素衰减的设备。示例性的基于细胞的高通量试验(例如检测细胞中目标蛋白的存在或水平)可以利用 VTIHCS读数仪或 HCS读数仪技术(Cellomics Inc.，宾夕法尼亚州匹兹堡)。

用于产生、表达和分离NS3蛋白的示例性的方法列举于工作实施例中。

突变病毒

在某些方面，本申请提供重组病毒，其包含本申请公开的突变NS3蛋白。在某些实施方式中，本申请公开登革热病毒的cDNA，所述登革热病毒包含编码所述突变NS3蛋白的核酸序列突变。

适用于重组登革热病毒增殖的细胞系包括哺乳动物细胞(如Vero细胞、AGMK细胞、BHK-21细胞、COS-I或COS-7细胞、MDCK细胞、CV-I细胞、LLC-MK2细胞)、灵长类细胞系(如胚胎恒河猴肺(FRhL-2)细胞、BSC-I细胞和MRC-5细胞)，或人二倍体成纤维细胞)，以及禽类细胞、来源于鸡或鸭胚胎的细胞系(例如AGEl细胞)和灵长类、鸡胚胎成纤维细胞和蚊细胞系(如C6/36)。为在细胞培养中增殖病毒，使用重组登革热病毒来感染宿主细胞(例如选自以上列举的适宜细胞类型中)。在病毒吸收之后，向培养细胞提供能够支持细胞生长的培养基。宿主细胞继续培养直到获得所需的病毒滴度。

为了回收病毒，通过本领域公知的常规方法(包括低速离心)，或者通过经过孔径为0.45μm的过滤膜的过滤来收获病毒。用于浓缩回收的病毒的方法在本领域普通技术人员所知的范围之内，并且包括例如超滤(例如用孔径不超过300kDa的膜)，或用聚乙二醇(PEG)8000沉淀。用于纯化病毒的方法是本领域普通技术人员已知的，并且包括连续的或多层不连续蔗糖梯度，通过使用尺寸排阻、离子交换、吸附的柱层析或亲和柱的纯化，或通过在聚合物二相或多相体系中分隔的纯化，以及其任意组合。用于病毒阳性馏分试验的方法包括瘟疫试验、血凝试验(HA)和/或抗原试验，如免疫试验。

突变核酸分子

本申请提供了编码本申请所述的突变NS3蛋白的核酸分子。所述核酸可存在于例如完整细胞中、细胞裂解物中或以部分纯化的或基本纯的形式存在。

在一些实施方式中，所述核酸具有如SEQ ID NO:7所示的序列：

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在一些实施方式中，所述核酸具有如SEQ ID NO:8所示的序列：

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在一些实施方式中，所述核酸具有如SEQ ID NO:9所示的序列：

gcgggcgtgctgtgggatgtgccgagcccgccgccgatgggcaaagcggaactggaagatggcgcgtatcgcattaaacagaaaggcattctgggctatagccagattggcgcgggcgtgtataaagaaggcacctttcataccatgtggcatgtgacccgcggcgcggtgctgatgcataaaggcaaaaaaattaaaccgagctgggcggatgtgaaaaaagatctgattagctatggcggcggctggaaactggaaggcgaatggaaagaaggcgaagaagtgcaggtgctggcgctggaaccgggcaaaaacccgcgcgcggtgcagaccaaaccgggcctgtttaaaaccaacgcgggcaccattggcgcggtgagcctggattttagcccgggcaccagcggcagcccgattattgataaaaaaggcaaagtggtgggcctgtatggcaacggcgtggtgacccgcagcggcgcgtatgtgagcgcgattgcgcagaccgaaaaaagcattgaagataacccggaaattgaagatgatatttttcgcaaacgccgcctgaccattatggatctgcatccgggcgcgggcaaaaccaaacgctatctgccggcgattgtgcgcgaagcgattaaacgcggcctgcgcaccctgattctggcgccgacccgcgtggtggcggcggaaatggaagaagcgctgcgcggcctgccgattcgctatcagaccccggcgattcgcgcggaacataccggccgcgaaattgtggatctgatgtgccatgcgacctttaccatgcgcctgctgagcccggtgcgcgtgccgaactataacctgattattatggatgaagcgcattttaccgatccggcgagcattgcggcgcgcggctatattagcacccgcgtggaaatgggcgaagcggcgggcatttttatgaccgcgaccccgccgggcagccgcgatccgtttccgcagagcaacgcgccgattattgatgaagaacgcgaaattccggaacgcagctggaacagcggccatgaatgggtgaccgattttaaaggcaaaaccgtgtggtttgtgccgagcattaaagcgggcaacgatattgcggcgtgcctgagcaaaaacggcaaaaaagtgattcagctgagccgcaaaacctttgatagcgaatatgcgaaaacccgcaccaacgattgggattttgtggtgaccaccgatattagcgaaatgggcgcgaactttaaagcggaacgcgtgattgatccgcgccgctgcatgaaaccggtgattctgaccgatggcgaagaacgcgtgattctggcgggcccgatgccggtgacccatagcagcgcggcgcagcgccgcggccgcattggccgcaacccgaaaaacgaaaacgatcagtatatttatatgggcgaaccgctggaaaacgatgaagattgcgcgcattggaaagaagcgaaaatgctgctggataacattaacaccccggaaggcattattccgagcatgtttgaaccggaacgcgaaaaagtggatgcgattgatggcgaatatcgcctgcgcggcgaagcgcgcaccacctttgtggatctgatgcgccgcggcgatctgccggtgtggctggcgtatcgcgtggcggcggaaggcattaactatgcggatcgccgctggtgctttgatggcgtgaaaaacaaccagattctggaagaaaacgtggaagtggaaatttggaccaaagaaggcgaacgcaaaaaactgaaaccgcgctggctggatgcgcgcatttatagcgatccgctggcgctgaaagaatttaaagaatttgcggcgggccgcaaa

本申请提供的核酸分子可以使用标准分子生物技术获取。例如，本申请所述的核酸分子可以使用标准PCR技术克隆或化学合成。对于编码杂交瘤表达的抗体的核酸，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获取编码由所述杂交瘤得到的抗体的轻和/或重链的cDNA。

在某些实施方式中，本申请提供了含有本申请所述的分离的核酸分子的载体。用于本申请的术语“载体”是指一种核酸分子，其能够运送已与其连接的另一核酸。一类载体为“质粒”，其是指一种环形双链DNA环，其中可连接另外的DNA片段。另一类载体为病毒载体，其中另外的DNA段可连接至病毒基因组。某些载体能够在其引入至的宿主细胞中自动复制(例如具有细菌复制源的细菌载体，以及游离的哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离的哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞之后整合至宿主细胞的基因组中，并且从而连同宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能够指导基因的表达。此类载体在本申请中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。

在某些实施方式中，本申请提供了含有本申请所述的核酸的细胞(例如编码本申请所述的NS3蛋白的核酸)。所述细胞可以为例如原核、真核、哺乳动物、禽类、小鼠和/或人的。在某些实施方式中，所述细胞为杂交瘤。在某些实施方式中，本申请所述的核酸可操作地连接至转录控制元件，如启动子。在一些实施方式中，所述细胞转录本申请提供的核酸，并且从而表达本申请所述的蛋白。核酸分子可以整合至细胞的基因组中，或者其可以在染色体外。

药物组合物和疫苗

在某些方面，本申请提供了药物组合物和/或疫苗，其包含本申请所述的突变登革热病毒。

在一些实施方式中，本申请所述的药物组合物和/或疫苗包括包含突变NS3蛋白的病毒与一种或多种赋形剂和/或佐剂。在一些实施方式中，本申请所述的药物组合物和/或疫苗包含突变黄病毒(例如DV、WNV或ZV)病毒基因组和/或编码突变NS3的突变基因。所述药物组合物和/或疫苗可以含有基因材料，如表达所述突变蛋白的异源基因插入。在这种情况下，所述突变NS3可以在用含有突变DV、WNV或ZV，和/或突变NS3的疫苗免疫过的易感物种的细胞中表达。由此在通常易受DV、WNV或ZV感染的物种和/或组织中，可以赋予针对野生型DV、WNV或ZV的免疫。

因此，在一些实施方式中，所述突变NS3病毒具有降低的与运输分子14-3-3ε结合的能力，以及降低的阻止RIG-I转移至线粒体/MAM的能力。因而，在一些实施方式中，编码本申请所述的有14-3-3ε结合缺陷的突变NS3蛋白的突变黄病毒(例如DV、WNV或ZV)具有降低的拮抗RIG-I的能力并且引起增强的先天性免疫应答。本公开提供了一种药物组合物和/或疫苗，其治疗和/或预防黄病毒感染，或与黄病毒感染相关或由黄病毒感染引起的其它疾病状况，例如登革热、黄热、寨卡热、小头畸形。在一些实施方式中，所述突变黄病毒能引起个体中的免疫应答，其导致被治疗的个体的免疫系统可以抵抗野生型黄病毒。在一些实施方式中，已被黄病毒感染的个体接受具有所述突变黄病毒和/或突变NS3的药物组合物和/或疫苗，以改善针对野生型黄病毒的免疫应答。

在一些实施方式中，所述药物组合物和/或疫苗可进一步包含可以通过增加抗原递送、刺激细胞因子产生和/或刺激抗原呈递细胞增强免疫应答的佐剂。在一些实施方式中，所述佐剂可以与本申请公开的药物组合物和/或疫苗同时施用，例如在相同的组合物中或在不同的组合物中。例如，佐剂可以在本申请公开的药物组合物和/或疫苗之前或之后施用。此类佐剂包括但不限于：铝盐、非毒性细菌片段、霍乱毒素(及其去毒性的馏分)、几丁聚糖、大肠杆菌的同源不耐热型(及其去毒性的馏分)、丙交酯/乙交酯同聚物和共聚物(PLA/GA)、聚酸酐(例如偏苯三酸亚胺-L-酪氨酸、DEAE-葡聚糖、复合至膜蛋白抗原的皂苷(免疫刺激复合物—ISCOMS)、细菌产物(如脂多糖(LPS)和胞壁酰二肽(MDP))、脂质体、共螯合物、类蛋白、细胞因子(白细胞介素、干扰素)、基因改造的活体微生物载体、非感染性的百日咳突变毒素、神经氨酸酶/半乳糖氧化酶，以及来源于突变株的减毒细菌和病毒毒素。

在一些实施方式中，所述突变DV能够引起个体中针对所述登革热病毒的1、2、3或全部4个血清型(例如登革热病毒血清1型、登革热病毒血清2型、登革热病毒血清3型或登革热病毒血清4型)的免疫应答。在一些实施方式中，所述药物组合物和/或疫苗可包含来自所述登革热病毒的2、3或全部4个血清型的突变蛋白的组合。在一些实施方式中，所述突变DV为登革热病毒血清2型。

在某些实施方式中，可以使用部分依赖于施用途径的多种方法向个体(例如人类个体)施用所述药物组合物、疫苗和/或佐剂。所述途径可以为例如静脉内注射或输液(IV)、皮下注射(SC)、腹腔内(IP)注射或肌内注射(IM)。

治疗方法

在某些方面，本申请提供了一种用于引起个体中针对黄病毒的免疫应答的方法，其包含向所述个体施用本申请公开的组合物(例如疫苗组合物)。在一些实施方式中，本申请提供了一种用于保护个体免于感染黄病毒的方法，其包含施用本申请公开的组合物。在一些实施方式中，本申请提供了一种治疗个体黄病毒感染的方法，其包含向所述个体施用本申请所述的组合物。

用于本申请的“个体”可以是任何哺乳动物。例如，个体可以是人、非人灵长类(例如猴、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠或小鼠。在一些实施方式中，所述个体是新生儿(例如人类新生儿)。

在某些实施方式中，所述个体由于其暴露于包含黄病毒的蚊子而暴露于所述黄病毒。所述个体可暴露于伊蚊，特别是生活在北纬35°和南纬35°之间，海拔1,000米(3,300英尺)以下的埃及伊蚊。该个体可处于发展黄病毒感染，以及与该感染相关或由该感染引起的疾病状况的风险。

在某些实施方式中，所述个体不具有登革热病毒感染，但处于发展登革热病毒感染的风险。“处于……风险”的个体可以或可以不具有可检测的疾病，并且在本申请所述的治疗方法之前可以已显示或可以未显示可检测的疾病。“处于……风险”表示，根据传统的风险评估方法确定为更有可能发展症状的，或者具有一个或多个与特定病况的发展相关的风险因素个体。具有这些风险因素的一个或多个的个体与不具有这些风险因素的个体相比，具有更高的发展病况的可能性。风险群组的实例(即类别)是本领域熟知的，并且在本申请中讨论，如将前往世界上流行黄病毒的地区的个体。例如，在一些实施方式中，所述地区在美国、阿根廷、澳大利亚、孟加拉、巴巴多斯、玻利维亚、伯利兹、巴西、柬埔寨、哥伦比亚、哥斯达黎加、古巴、多米尼加共和国、法属玻利尼西亚、瓜德罗普、萨尔瓦多、格拉纳达、危地马拉、圭亚那、海地、洪都拉斯、印度、印度尼西亚、牙买加、老挝、马来西亚、美拉尼西亚、墨西哥、密克罗尼西亚、尼加拉瓜、巴基斯坦、巴拿马、巴拉圭、菲律宾、波多黎各、萨摩亚、西沙特阿拉伯、新加坡、斯里兰卡、苏里南、台湾、泰国、特立尼达和多巴哥、委内瑞拉、越南或中国。

实施例

通过参考以下实施例(其仅为说明本发明的某些方面和实施方式的目的而包括于本申请，并且不旨在以任何方式限制本发明)，将更容易地理解在此在整体上记述的发明。

实验步骤

细胞培养和病毒。HEK293T、Huh7、Huh7、Vero和A549细胞在添加了10％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES和1％青霉素-链霉素(Gibco)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)中培养。BHK-21细胞在添加了10％FBS、10mM HEPES和1％青霉素-链霉素的最低基础培养基α(MEM-α)中增殖。C6/36细胞在添加了10％FBS和1％青霉素-链霉素的Eagle最低基础培养基(EMEM)中培养，并且在28℃生长。K562细胞和原代CD14⁺单核细胞维持于添加了10％FBS、1％非必需氨基酸溶液(Gibco)和1％青霉素-链霉素的洛斯维·帕克纪念研究所(RPMI)1640培养基中。DV2NGC、DV1 276RK1、DV2 16681、DV3BC188/97和DV4 814699在C6/36细胞中增殖。SeV(Cantell)购自查尔斯河实验室。HSV-1为来自David Knipe(哈佛)的赠予。

质粒和转染。通过使用NotI和BamHI位点将NS2B/3(含NS2B和NS3)或DV2(NGC株)的NS3亚克隆至pQCXIP载体中，生成pQCXIP-NS2B/3-HA和pQCXIP-NS3-HA。通过将DV2(NGC株)的NS3或NS5亚克隆至BamHI和ClaI之间的pEBG载体中，生成GST-NS3和GST-NS5。相似地，将YFV(由普渡大学的Richard Kuhn提供)的NS3和HCV(由德州大学西南医学中心的ZhijianChen提供)的NS3亚克隆至pEBG载体。pEF-BOS-FLAG-NS3-Pro(aa 1-179)、pEF-BOS-FLAG-NS3-Hel(aa 169-618)pEF-BOS-FLAG-NS5-MTase(aa 1-319)和pEF-BOS-FLAG-NS5-Pol(aa297-901)通过使用NotI和SalI位点亚克隆至pEF-BOS-FLAG载体中生成。购买14-3-3ε(Uniprot：P62258-1)作为cDNA克隆，并且用N-末端FLAG和c-myc标签分别亚克隆至pEF-BOS和pCAGGS载体中。带有HA标签的14-3-3σ由Satoshi Inoue提供(东京大学)，并且经记述(Urano等，Nature 417,871-875(2002))。通过使用NotI和BamHI位点将STING(克隆ID5762441，Thermo Scientific)亚克隆至pQCXIP载体中，生成pQCXIP-STING-HA。编码HCVNS3/4A蛋白酶复合物(pcDNA3-FLAG-NS3/4A)及其S139A无催化活性的突变体的质粒为Zhijian Chen的赠予(Li等，PNAS 102，17717-17722(2005))。之前已记述了编码GST-RIG-I(2CARD)、RIG-I-FLAG和TRIM25-FLAG的质粒(Gack等，Nature 446,916-920(2007)；Wies等，Immunity 38,437-449(2013))。通过使用GST-NS3全长作为模板的PCR生成DV NS3截短突变体GST-NS3(1-92)、GST-NS3(93-168)、GST-NS3(43-92)、GST-NS3(82-168)、GST-NS3(63-168)和GST-NS3(43-168)。对全部构建体测序，以证实其与原始序列100％相符。使用磷酸钙法，或依照制造商的说明书，用TurboFectin 8.0(Origene)、Lipofectamine and Plus试剂或Lipofectamine 2000(皆出自Life Technologies)进行转染。

14-3-3ε敲低实验。靶向14-3-3ε(siGENOME SMARTpool M-017302-03-0005)的siRNA以及非靶向的对照siRNA购自Dharmacon。K562细胞接种至12孔板中，并且依照制造商的说明书使用Lipofectamine RNAiMAX(Life Technologies)，用300nM siRNA转染。内源14-3-3ε的敲低通过western blot分析确定。

抗体和试剂。对于western blot分析，使用以下抗体：抗-FLAG(M2，Sigma)、抗-HA(HA-7，Sigma)、抗-GST(Sigma)、抗-c-myc(9E10)、抗-β-肌动蛋白(Abcam)、抗-RIG-I(Alme-1，Adipogen)、抗-TRIM25(BD Biosciences)、抗-泛素(P4D1，Santa Cruz)、抗-PP1γ(Bethyl Laboratories)、抗-ISG15(F-9，Santa Cruz)、抗-ISG54(ProSci)、抗-STAT2(Santa Cruz)、抗-14-3-3ε(8C3，Santa Cruz)、抗-NS3(E1D8，由Eva Harris提供)、抗-NS3(GT2811，Genetex)、抗-MAVS(AT107，Enzo)、抗-GAPDH(CS204254，Millipore)、抗-IRF3(sc-9082，Santa Cruz)。对于14-3-3ε的免疫沉淀使用抗-14-3-3ε(11648-2-AP，Proteintech)。对于流式细胞术分析，抗-prM(2H2，Merck Millipore)使用商品试剂盒(ThermoScientific)缀合至DyLight 633，并且用以检测DV感染的细胞。使用抗-CD14-FITC(M5E2，BD Biosciences)以确定CD14⁺单核细胞的纯度。同种型对照抗体购自BD Biosciences。

荧光素酶报告基因试验。将HEK293T细胞接种至12孔板中。次日，用200ng IFN-β荧光素酶构建体、300ng表达β-gal的pGK-β-gal，以及100ng-1μg编码效应蛋白的质粒转染细胞。为刺激IFN-β启动子活性，在转染48小时后共转染2ng的GST-RIG-I-2CARD，或者用SeV(50HAU/ml)感染细胞。收获细胞并测验荧光素酶活性(Promega)。荧光素酶值归一化至β-半乳糖苷酶活性，以控制转染效率。

下拉试验、免疫共沉淀和免疫印迹分析。HEK293T或Huh7细胞在NP-40缓冲液(50mMHEPES pH 7.4，150nM NaCl，1％[vol/vol]NP-40，蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Sigma])中裂解，并在13,000rpm下离心20分钟。如前所述进行GST或FLAG下拉、免疫共沉淀以及westernblot分析(Chan等，PloS one 7,e34508(2012)；Gack等，Nature 446,916-920(2007))。

大规模蛋白纯化和质谱。用pEF-BOS-FLAG-NS3-Pro、pEF-BOS-FLAG-NS3-Hel、pEF-BOS-FLAG-NS5-MTase或pEF-BOS-FLAG-NS5-Pol转染HEK239T细胞。两天后，用添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma)裂解细胞NP-40缓冲液。澄清的裂解液与约50％抗-FLAG-缀合的琼脂糖凝胶珠(Sigma)混合，并且在4℃孵育4小时。对所述珠彻底洗涤后，将结合的蛋白洗脱并且在NuPAGE 4-12％Bis-Tris梯度胶(Life Technologies)上分离。进行考马斯染色，并且将特别存在于FLAG-NS3-Pro样品中的约30kDa的条带切下，并在哈佛Taplin生物质谱机构通过离子阱质谱分析。

聚集显微。Huh7细胞在腔室玻片上或24孔板的盖玻片上生长，并且随后以指定的滴度用DV2或SeV感染，或模拟感染。在指定的时间点收获细胞，并用4％(w/v)多聚甲醛固定20分钟，在PBS中用0.2％(v/v)Triton-X-100透化，并在PBS中用10％(v/v)山羊血清或FBS封闭一小时。对于免疫染色，使用抗-14-3-3ε(Proteintech)、抗-NS3(GT2811或GTX124252，Genetex)、抗-NS4A(GTX 124249，Genetex)、抗-ISG54(12604-1-AP，Proteintech)、抗-RIG-I(Alme-1，Adipogen)和抗-FLAG(Sigma、Abcam和Bethyl)，随后用缀合至AlexaFluor 488、Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 647(Life Technologies或Abcam)的第二抗体孵育。细胞装入含DAPI的Vectashield(Vector实验室)以共染细胞核。全部激光扫描图像在IX8I共聚焦显微镜上获得。

直接蛋白相互作用试验。细菌纯化的重组人14-3-3ε蛋白(NP_006752.1)购自SinoBiological。在HEK293T细胞中表达的GST或GST-NS3(DV2，NGC株)在NP-40缓冲液中固定在谷胱甘肽缀合的琼脂糖凝胶珠上，并且用重组14-3-3ε蛋白(10μg/ml的终浓度)在4℃孵育2小时。用NP缓冲液彻底洗涤后，结合的蛋白在95℃用2×Laemmli缓冲液从所述珠上洗脱，并且加热5分钟，随后进行SDS-PAGE和western blot分析。相似地，TRIM25-FLAG和RIG-I-FLAG使用抗-FLAG缀合的琼脂糖凝胶珠纯化自转染的HEK293T细胞，并且测试与重组14-3-3ε的结合。

线粒体分馏试验。HEK293T或Huh7细胞用指定滴度下的DV或SeV感染，或模拟感染。20-24小时后，收获一部分细胞用于WCL，而另一部分细胞用于依照制造商的说明书使用商品线粒体/胞质分馏试剂盒(MIT1000，Merck Millipore)进行的分馏试验。简言之，在等渗线粒体缓冲液中使用Dounce均质器破坏细胞。裂解物经低速离心使细胞核和未破碎的细胞形成颗粒。上清随后在4℃下以10,000×g离心30分钟。对含有胞质和微粒体馏分(“胞质馏分”)的上清以及含有富集的线粒体馏分的颗粒进行二辛可宁酸(BCA)试验。将等量的蛋白上样，用于SDS-PAGE以及通过western blot分析。抗-GAPDH和抗-MAVS的western blot分析作为对照。

登革热病毒感染和流式细胞术分析。基于公开的方案进行感染(Diamond等，J.Virology74,7814-7823(2000))。简言之，每孔约1.5×10⁵个Huh7细胞接种至24孔板并让其附着4小时。病毒在250μl含2％FBS的DMEM中稀释，并在37℃孵育1.5小时。在感染后的指定时间点收获细胞和/或上清。对K562悬浮细胞进行相似的感染，只是在感染后直接将生长基质加入细胞。为检测DV感染的细胞，细胞在PBS中洗涤一次，在1％(w/v)多聚甲醛中固定、用0.1％皂苷(Sigma)透化，并且随后在透化缓冲液中，用抗-prM-DyLight 633在4℃下染色约40分钟。随后，用PBS洗涤细胞，并且在FACS Calibur(BD Biosciences)上的流式细胞术分析之前，在1％(w/v)多聚甲醛中重悬细胞。使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。

生物信息分析。通过http://www.viprbrc.org的网站，用NIAID病毒病原体数据库和分析资源(ViPR)在线分析来自全基因组DV序列的NS3蛋白序列。

定量实时PCR(qRT-PCR)。使用RNA提取试剂盒(OMEGA Bio-Tek)从细胞中提取全RNA。在用带有用于指定的靶标基因(IDT)的FAM报告基因染料的市售引物的一步qRT-PCR反应(具有ROX的SuperScript III Platinum一步qRT-PCR试剂盒，LifeTechnologies)中使用等量的RNA(通常为10-100ng)。各靶标基因的表达水平通过使用ΔΔCT法对GAPDH归一化计算，并且表达为与模拟感染的细胞相比的倍数。全部qRT-PCR反应在7300RT-PCR体系或7500FAST RT-PCR体系(均出自ABI)是运行。

NS3_KIKP突变登革热病毒的生成。基于DV2 16681的一个感染性的克隆，pD2/IC-30P，其由Claire Huang(CDC)提供，并且之前有记述(Butrapet等，J.Virology 74,3011-3019(2000)；Kinney等，Virology 230,300-308.(1997))，生成DV2_KIKP。使用PCR生成包含NS3基因中的R64K和E66K突变的突变pD2/IC-30P。通过XbaI消化，将野生型和突变感染克隆质粒线性化，并且使用T7启动子体内转录(RiboMAX大规模RNA生产体系，Promega)，加入m⁷G(5’)ppp(5’)A RNA帽状结构类似物(新英格兰生物实验室)。体内转录的RNA使用MicroBio-Spin柱(Bio Rad)纯化并且使用Lipofectamine 2000转染至Vero细胞中。收获病毒上清并用于在Vero细胞中增殖野生型和突变病毒。进一步使用Vero细胞以使用基于FACS的试验，用抗-prM抗体滴定重组病毒(Lambeth等，J.Clinical Microbiology 43,3267-3272(2005))。

原代人单核细胞中的DV感染研究。购买来自身份不明的健康供体的人外周血或外周血单核细胞(PBMC)(HemaCare)。对于人外周血，使用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)密度梯度离心分离PBMC。依照制造商的说明书(Miltenyi Biotec)，使用抗-CD14磁性微珠，自PBMC正向选择CD14⁺单核细胞。CD14⁺单核细胞在使用前在生长基质中静置过夜，或冷冻保藏以供以后的实验使用。如抗-CD14-FITC染色(BD Biosciences)和流式细胞术分析所确定，CD14⁺细胞的纯度通常为约90％。对于感染实验，在96孔板中，每孔约1.5×10⁵个CD14⁺单核细胞在250μl含有2％FBS的DMEM中用DV感染5小时，偶尔搅拌。

数据分析。使用未配对的双尾Student’s t检验。P<0.05定义为具有数据显著性。

实施例1.NS3蛋白与14-3-3ε相互作用

研究了对NS3和NS5的新的细胞相互作用伴侣的确认。为了识别相互作用的伴侣，使用亲和纯化和质谱(MS)分析了两种病毒蛋白的特定的带有FLAG标签的结构域：NS3蛋白酶(氨基酸(aa)1-179)和解旋酶(aa 169-619)结构域(FLAG-NS3-Pro和FLAG-NS3-Hel)，以及NS5甲基转移酶(aa 1-319)和聚合酶(aa 297-901)结构域(FLAG-NS5-MTase和FLAG-NS5-Pol)。MS分析显示，约30kDa的靶向线粒体的伴侣蛋白14-3-3ε特异性地与FLAG-NS3-Pro一起形成复合物，但并没有与FLAG-NS3-Hel、FLAG-NS5-MTase或FLAG-NS5-Pol在一起(图1，板块A，且数据未示出)。

使用免疫共沉淀(Co-IP)试验，首先确认了带有c-myc标签的14-3-3ε特异性地结合NS3-Pro，而非NS3-Hel(图1，板块B)。此外，与MS结果一致，异位表达的FLAG-14-3-3ε特异性地相互作用于NS3(与谷胱甘肽S-转移酶融合；GST-NS3)，而非GST-NS5或单独的GST(图1，板块C)。NS3和14-3-3ε之间的相互作用是特异性的，因为14-3-3σ，即与14-3-3ε具有约75％的同源性的14-3-3蛋白家族的另一成员，不结合GST-NS3(图1，板块D)。此外，外源表达的DV的NS3与内源的14-3-3ε强烈地相互作用(图1，板块E)；相比之下，两个同属于黄病毒科的相关的病毒，黄热病毒(YFV)和丙肝病毒(HCV)的NS3蛋白却不与14-3-3ε结合(图1，板块E)。接下来，通过免疫共沉淀确定内源14-3-3ε与在DV感染的人肝癌细胞(Huh7)中的NS3之间的相互作用，探讨了NS3在DV感染的过程中是否与14-3-3ε结合。NS3在DV感染的过程中有效地与内源14-3-3ε形成复合物(图1，板块F)。此外，对DV感染的Huh7细胞的激光扫描共聚焦显微镜检显示，14-3-3ε在整个细胞质中表达，而DV NS3则如之前所报道那样形成核周细胞质斑，指示位于ER衍生膜的DV复制复合物(Apte-Sengupta等，Current Opinion in Virology9C,134-142(2014))。NS3在这些核周体中大量地与14-3-3ε共定位，其也与DV复制复合物的关键成分NS4A共染(Miller等，J.of Biological Chemistry 282,8873-8882(2007))(图1，板块G)。最后我们通过进行体外结合试验，评估了NS3是否直接与14-3-3ε结合(图1，板块H)。这表明，固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上的GST-NS3，而非单独的GST，与细菌纯化的重组(r)14-3-3ε有效地相互作用，证明了NS3与14-3-3ε之间的直接相互作用。这些结果共同表明DVNS3与14-3-3ε直接互相结合，并且在DV感染的过程中形成复合物。

实施例2.14-3-3ε对于控制DV复制至关重要

确定了异位表达的14-3-3ε在Huh7细胞中对DV复制的效果。14-3-3ε表达压制了DV2复制，并且14-3-3ε过表达抑制了代表全部4个血清型(DV1-4)的4种其它DV株的复制，但对不相关的DNA病毒单纯疱疹病毒-1(HSV-1)无影响。为确定14-3-3ε在限制DV复制中的相关性，使用短干扰RNA(siRNA)使K562细胞中的14-3-3ε表达沉默。与非靶向的对照siRNA相比，K562细胞中14-3-3ε的敲低显著增强DV复制，这佐证了14-3-3ε在控制DV复制中起作用。

实施例3.NS2B/3不依赖于蛋白水解活性地抑制RIG-I活化

评估了与NS2B形成复合物的NS3是否可以切割14-3-3ε。免疫印迹(IB)分析显示，在具有蛋白水解活性的NS2B/3的构建体过表达时，未产生任何共表达的FLAG-14-3-3ε的切割产物(图8，板块A)。与此相佐证的是，内源性14-3-3ε蛋白的水平在DV感染的过程中不变(图1，板块F，以及图4，板块D)，这强烈地表明DV NS2B/3不切割14-3-3ε。此外，NS2B/3不切割TRIM25或RIG-I，即14-3-3ε易位子复合物的另两个必要成分(图8，板块B)。相比之下，作为阳性对照，NS2B/3很容易地切割共表达STING。

接下来评估了NS3是以依赖于切割还是不依赖于切割的方式抑制RIG-I信号转导。为回答这一问题，生成了无催化活性的NS2B/3突变体(NS2B/3_S135A)(Khumthong等，J.Biochem.and Mol.Bio.35,206-212(2002))，与WT NS2B/3不同的是，其无法切割自身或STING(图S2B)。NS2B/3和NS2B/3_S135A的异位表达均高效地压制了由RIG-I 2CARD(RIG-I的具有组成性活性的信号组件)的异位表达介导的IFN-β诱导(图3，板块A和B)。相比之下，仅HCV的WT NS3/4A压制了RIG-I 2CARD介导的IFN-β诱导，而无活性突变体NS3/4A_S139A却做不到(图3，板块A)。单独的NS3，因没有其共因子NS2B而不具有蛋白水解活性(Falgout等，J.Virology 65,2467-2475(1991))(图8，板块B)，与NS2B/3WT和NS2B/3_S135A同样高效地阻断了RIG-I 2CARD和SeV诱导的IFN-β启动子活化(图2B和2C)。与这一发现一致的是，NS3过表达也抑制由SeV感染引发的内源IRF3二聚化和ISG诱导(图2D和2E)。这些结果表明DV NS3以不依赖于切割的方式抑制RIG-I和14-3-3ε介导的信号转导。

实施例4.NS3阻止RIG-I-TRIM25复合体与14-3-3ε结合，从而抑制活化的RIG-I转 移至线粒体/MAM

考察了NS3是否(i)阻断对RIG-I的K63连接的泛素化，(ii)干扰14-3-3ε、RIG-I和TRIM25形成复合体或(iii)抑制RIG-I转移至线粒体/MAM，这些皆为RIG-I活化的关键步骤。在GST和GST-NS3共表达的两种细胞中，在SeV感染后均检测到了有效的FLAG-RIG-I的泛素化(图4，板块A)。在DV和SeV感染的两种过程中均检测到了强有力的内源RIG-I的泛素化，其表明DV不抑制RIG-I的泛素化(图4，板块B)。

确定了存在或不存在外源NS3时内源RIG-I在SeV感染后与14-3-3ε或TRIM25的结合。尽管SeV感染引发14-3-3ε和TRIM25两者与RIG-I结合，然而GST-NS3的表达，而非单独的GST，降低14-3-3ε与RIG-I的结合，但不影响病毒诱导的TRIM25和RIG-I之间的相互作用(图4，板块C)。与此相佐证的是，DV感染与SeV感染同样有效地诱导内源RIG-I和TRIM25形成复合体(图4，板块D)。然而，在DV感染的过程中，14-3-3ε和RIG-I之间的相互作用极小，并且与在模拟感染的细胞中观察到的相互作用相当。相比之下，SeV感染诱导稳健的14-3-3ε-RIG-I结合(图4，板块D)。这些结果表明NS3不影响TRIM25结合和RIG-I的K63连接的泛素化，而是特异性地阻断RIG-I与14-3-3ε的相互作用。与此相佐证的是，虽然RIG-I和TRIM25两者均在感染的细胞中与14-3-3ε形成三元复合物(Liu等，Cell Host&Microbe 11,528-537(2012))，但是仅RIG-I-FLAG，而非TRIM25-FLAG，在体外结合试验中与细菌纯化的r14-3-3ε相互作用(图9，板块A)。

进行了DV或SeV感染的Huh7细胞的分馏研究。在模拟感染的细胞中，RIG-I几乎仅存在于胞质馏分中，而在SeV感染的细胞中，RIG-I以及MAVS在线粒体馏分中含量丰富，表明其由胞质转移至线粒体/MAM。与此形成鲜明对比的是，在DV感染的过程中，RIG-I未转移至含MAVS的线粒体馏分(图4，板块E)。由于GST-NS3，而非单独的GST的异位表达明显减少了感染的细胞的线粒体馏分中的RIG-I含量，RIG-I转移中的缺陷可归因于NS3(图9，板块B)。这些结果共同表明与NS3的结合阻断了14-3-3ε与活化的RIG-I-TRIM25复合物相互作用，从而阻止RIG-I转移至线粒体/MAM以启动抗病毒信号。

实施例5.NS3使用仿磷酸化的RxEP基序与14-3-3ε结合

为了识别NS3的蛋白酶结构域(NS3-Pro)中的14-3-3ε结合位点，构建了GST融合的NS3-Pro截短片段，并且通过免疫共沉淀检验其结合内源14-3-3ε的能力。全长GST-NS3作为阳性对照(图5，板块A和图10)。全长GST-NS3、GST-NS3_1-92和GST-NS3_43-92有效地与内源14-3-3ε相互作用，而其它NS3片段在相同的条件下不结合14-3-3ε。

许多与14-3-3家庭成员结合的细胞蛋白的标志为存在典型的高亲和性结合基序，如Rxx(pS/pT)xP，其中x表示任何残基，并且pS/pT指示磷酸化的丝氨酸/苏氨酸残基(Mhawech，Cell Research 15,228-236(2005))。Rxx(pS/pT)xP中的S/T的磷酸化已被显示为14-3-3结合所必需的，因为这一残基的去磷酸化会消除14-3-3的相互作用(Yaffe等，Cell 91,961-971(1997))。对足以进行14-3-3结合的NS3_43-92(图5，板块A)更仔细的考察揭示了“压缩”⁶⁴RIEP⁶⁷基序，其具有与细胞Rxx(pS/pT)xP基序的高度相似性但是将pS/pT替换为带电的Glu⁶⁶(E⁶⁶)残基(图5，板块B)。基于DV NS3蛋白的晶体结构(Luo等，J.Virology82,173-183(2008))，其显示出NS3的长条的形状，其中在Pro和Hel结构域之间的接头区采用延伸的构象，该⁶⁴RIEP⁶⁷基序可能暴露在外以结合14-3-3ε并且无空间位阻(图5，板块C)。此外，⁶⁴RIEP⁶⁷基序在DV2株NGC和16681之间是保守的，而DV1、3和4包含相似基序，⁶⁴RLEP⁶⁷(图5，板块B)，表明⁶⁴RxEP⁶⁷基序在多种DV株之间是保守的。确实，通过生物信息学分析，比对了来源于经完全测序的DV1-4株的超过3000个NS3序列，结果显示⁶⁴RxEP⁶⁷基序在所有被分析的NS3序列中除了两个以外都是保守的，而相邻的残基显示显著更多的多态性(图5，板块D)。

为评估DV NS3是否将⁶⁴RxEP⁶⁷中的仿磷酸化的E⁶⁶残基用于14-3-3ε结合，将来自DV1、3和4(RLEP)或WNV(RLDP)的对应的基序，其均包含第66位上仿磷酸化的残基(E⁶⁶或D⁶⁶)，移植进入来源于DV2(含有RIEP的NGC株)的全长NS3。另外，将来自YFV(KLIP)的对应的基序，其包含第66位上不带电荷的疏水残基(I⁶⁶)，移植进入DV2NS3。包含E⁶⁶或D⁶⁶的含有RLEP和RLDP的嵌合NS3蛋白(NS3_RLEP和NS3_RLDP)均能够结合14-3-3ε。相比之下，NS3_KLIP显示强烈减少的结合(图5，板块E)，这与我们的YFV NS3不结合14-3-3ε的结果一致(图1，板块E)。这表明D⁶⁶，其也是仿磷酸化的残基，可以取代E⁶⁶，并且I⁶⁵和L⁶⁵在功能上等同。

为进一步探究NS3中仿磷酸化的E⁶⁶残基对于14-3-3ε结合的重要性，将E⁶⁶替换为Lys(K⁶⁶)，一种带正电的氨基酸(NS3_RIKP)。NS3_RIKP显示出与14-3-3ε结合的极大减少，表明仿磷酸化的E⁶⁶(或D⁶⁶)对于14-3-3ε相互作用至关重要。此外，其它的R⁶⁴至K⁶⁴(NS3_KIKP)的突变导致14-3-3ε结合几乎完全缺失，证明E⁶⁶和R⁶⁴对于NS3与14-3-3ε相互作用的重要性(图5，板块F)。这些结果共同表明，DV NS3不是利用典型的含有pS/pT的14-3-3结合基序，而是使用含有仿磷酸化的(E⁶⁶)残基的压缩RxEP基序结合14-3-3ε。

实施例6.有14-3-3ε-结合缺陷的NS3_KIKP突变蛋白对RIG-I转移和IFN-β诱导的压 制受损

对表现为14-3-3ε结合几乎完全缺失的NS3_KIKP突变蛋白进行了功能性表征。比较了WTNS3和NS3_KIKP突变体对于SeV感染引发的内源RIG-I和14-3-3ε的复合体形成的抑制作用。尽管WT NS3有效抑制SeV诱导的RIG-I-14-3-3ε结合，但NS3_KIKP不影响其相互作用(图11，板块A)。与此相符的是，尽管WT NS3有效阻断内源RIG-I转移至含MAVS的线粒体馏分，但NS3_KIKP的表达不抑制RIG-I转移(图5，板块G)。此外，WT NS3的表达，而非NS3_KIKP，显著压制SeV介导的IFN-β转录活化和ISG蛋白表达(图11，板块B和C)。这些数据表示有14-3-3ε结合缺陷的突变NS3蛋白无法抑制RIG-I-14-3-3ε结合以及RIG-I转移至线粒体/MAM，因而其压制IFN和ISG诱导的能力受损。这共同表明NS3阻断RIG-I-14-3-3ε相互作用和RIG-I转移的能力取决于其结合14-3-3ε的能力。

实施例7.编码NS3_KIKP突变蛋白的重组DV在复制上弱化并且引起IFN、ISG和促炎细 胞因子水平提高

构建了编码14-3-3ε结合和RIG-I拮抗上受损的NS3_KIKP突变蛋白的重组DV。作为NS2B/3蛋白酶复合体的一部分，NS3处理病毒多聚蛋白并且因此对于DV复制是必要的，因此确定了NS2B/3_KIKP突变蛋白是否保持了蛋白水解活性。IB分析显示，与WT NS2B/3相似，NS2B/3_KIKP能够诱导自身切割(图12，板块A)，其证实完整的蛋白水解活性并且进一步表明编码NS2B/3_KIKP的重组DV将是可行的。使用反向遗传学，引入最初来源于DV2 16681的感染性克隆中的R⁶⁴→K⁶⁴和E⁶⁶→K⁶⁶突变(Butrapet等，J.Virology 74,3011-3019(2000)；Kinney等，Virology 230,300-308(1997))，从而通过工程化得到编码NS3_KIKP的重组突变DV(下称DV2_KIKP)。

在I型IFN反应有缺陷的Vero细胞中评估病毒的复制(Desmyter等，J.V irology2,955-961(1968))，结果显示，与亲本病毒(DV2_WT)相比，DV2_KIKP显示出降低的复制能力，使得在感染后48小时和72小时的病毒载量比DV2_WT低大约1个对数(图12，板块B和C)。在蚊(C6/36)和仓鼠(BHK21)细胞中还观察到了DV2_KIKP与WT病毒相比降低的复制效率(数据未示出)，表明DV2_KIKP的轻微弱化的复制能力不依赖于宿主I型IFN体系。

接下来，在具有完整的I型IFN反应的Huh7细胞中检验DV2_WT和DV2_KIKP的复制。DV2_WT与DV2_KIKP在感染后24小时的复制速率相似(图12，板块D)；然而，在感染后72小时，DV2_KIKP的复制被强烈压制，而DV2_WT有效地复制(图5，板块A)。为确定强烈减少的DV2_KIKP的复制是否是其无法拮抗RIG-I造成的，在天然包含RIG-I突变蛋白(RIG-I T55I)的Huh7亚细胞系Huh7.5细胞中确定了DV2_KIKP的复制，所述RIG-I突变蛋白具有TRIM25结合缺陷并且因而在泛素介导的RIG-I活化上也有缺陷(Gack等，PNAS105,16743-16748(2008)；Sumpter等，J.Virology79,2689-2699(2005))DV2_KIKP几乎与DV2_WT同样有效地在Huh7.5细胞中复制(图6，板块A)，表明DV2_KIKP无法在Huh7细胞中复制主要是RIG-I活化造成的。另外，与Huh7细胞相比，DV2_WT在Huh7.5细胞中的复制仅显示轻微增长(图6，板块A)，表明DV2_WT有效地拮抗RIG-I信号。

为评估与DV2_WT相比，DV2_KIKP在Huh7细胞中降低的复制能力是否是由于其无法阻断IFN诱导而造成的，确定了在DV2_KIKP或DV2_WT感染后IFN-β、ISG和促炎细胞因子的基因上调。为了解释复制效率上的差别，将Huh7细胞用DV2_WT或DV2_KIKP感染，使用的MOI(分别为0.3和1)导致相当的感染性(如流式细胞术所测定，感染后两天约75％的细胞被感染[数据未示出])。DV2_KIKP引起相比DV2_WT明显更高的IFNB1、ISG(ISG15、IFIH1和MX1)和促炎细胞因子(TNF、IL6和CCL5)的水平(图6，板块B)。与此相符的是，如共聚焦免疫荧光镜检所确定，A549细胞的DV2_KIKP感染强有力地诱导邻近的未感染的细胞中的ISG蛋白表达(ISG54和RIG-I)。相比之下，响应DV2_WT感染后，ISG蛋白诱导较低(图12，板块E)。关键的是，我们发现与DV2_WT相比，DV2_KIKP产生的更高的IFNB1诱导是由RIG-I活化介导的，因为RIG-I信号转导有缺陷的Huh7.5细胞在DV2_KIKP感染后显示出低IFNB1诱导(图6，板块C)。为了排除DV2_KIKP的受损的抑制ISG诱导的能力是由于其降解STAT2能力中潜在的缺陷所造成这种可能性，检验了在感染的Huh7细胞中内源STAT2的降解。DV2_WT和DV2_KIKP均能够有效地降解STAT2。此外，由于WTNS2B/3和NS2B/3_KIKP均有效地切割STING，STING拮抗的缺失可能无法解释DV2_KIKP引起的更高的IFN反应(图12，板块A)。在作用机制上，DV2_KIKP感染的细胞显示RIG-I有效转移至线粒体分馏。相比之下，DV2_WT感染轻微地引起RIG-I转移(图6，板块D)。这些结果共同表明14-3-3ε结合缺陷的DV2_KIKP病毒无法拮抗RIG-I，并且因而引起IFN、ISG和促炎细胞因子的增强的诱导。该增强的免疫应答转而促进对DV2_KIKP复制的限制。

尽管在DV体内感染的过程中通常涉及肝脏，然而单核吞噬细胞被认为是用于DV复制的主要的体内细胞靶标(Jessie等，The J.Infectious Diseases 189,1411-1418(2004))。因此，具有DV2_WT或DV2_KIKP(MOI均为1)的原代人CD14⁺单核细胞被感染，并随后通过qRT-PCR测量感染后24小时后的IFNB1诱导。DV2_WT和DV2_KIKP测得的IFNB1诱导均低于检测限(数据未示出)，与之前的研究相符，其可能是由于原代单核细胞在体外的感染率较低引起的(Kou等，Virology 410,240-247(2011))。然而，测量促炎细胞因子TNF、CCL5、IL8和IL6的基因表达(其全部在病毒感染后在单核细胞中被强烈诱导)时，检测到了这些细胞因子被DV2_KIKP而非DV2_WT强有力地诱导(图7，板块A)。与此一致，与DV2_WT感染的细胞相比，DV_KIKP感染的CD14⁺单核细胞显示增强的IL-6蛋白分泌(图7，板块B)。这些结果共同表示编码14-3-3ε结合缺陷的NS3蛋白的突变DV在其拮抗RIG-I的能力上受损，并且因而在人肝细胞和原代人单核细胞中引起增强的先天性免疫反应。

实施例8.登革热DV2_KIKP突变病毒引起增强的T细胞应答

为了检验生成的突变登革热病毒(DV2_KIKP)与WT登革热病毒(DV2_WT)相比是否区别性地影响获得性免疫应答，将原代单核细胞来源的树突细胞(moDC)用DV2_WT或DV2_KIKP感染，并且随后与同系初始pan T细胞共培养。感染后72小时，与DV2_KIKP感染的moDC共培养的T细胞显示与DV2_WT相比增加的STAT1磷酸化(pSTAT1)，表明增强的干扰素α/β受体(IFNAR)信号(图13，板块A)。此外，与DV2_KIKP感染的moDC共培养的T细胞在感染后96小时分泌的IFN水平与DV2WT感染的moDC共培养的T细胞相比显著更高，证明DV2_KIKP对T细胞的更强的活化(图13，板块B)。这些结合共同表明DV2_KIKP不仅引起增强的先天性免疫应答，还在原代细胞中引起更强的获得性免疫应答。

实施例9.西尼罗河病毒(WNV)NS3蛋白拮抗RIG-I活化

如本申请所讨论，登革热病毒NS3包含RxEP基序以取代14-3-3ε结合。多个黄病毒NS3蛋白的序列比对显示西尼罗河病毒包含RLDP基序(图14)。由于D和E一样也是仿磷酸化的残基，确定了WNV NS3是否结合14-3-3ε以拮抗RIG-I活化和I类干扰素(IFN)诱导。WNV的NY99和Kunjin株的NS3均能够结合内源14-3-3ε(图15)。与此一致，两种WNV NS3蛋白的异位表达均压制RIG-I(2CARD)介导的IFN诱导(图16)，表明WNV NS3也阻断RIG-I信号。最后，与关于登革热病毒NS3公开的结果相似，WNV NS3(NY99株)中的RLDP基序突变为KIKP使14-3-3ε的结合强烈减少(图17)。这共同表明WNV使用仿磷酸化的基序以靶向14-3-3和RIG-I。

尽管本公开经参考其具体的实施方式记述，但本领域的技术人员应当理解，可以进行多种变化且可以取代等同物，而不偏离本公开的真实精神和范围。另外，可以进行多种变更以使得本公开的目的、精神和范围适应于特定的情况、材料、组合物、过程、工序或步骤。这样的变更都旨在落入本公开的范围之内。

本申请提及的所有公开、专利、专利申请和序列登录号都通过引用整体并入本申请，如同具体、单独地指出各公开、专利或专利申请通过引用并入。出现冲突的情况下，以本申请，包括本申请的任何定义为准。

Claims (49)

1.一种突变黄病毒，其包含突变的NS3蛋白，其中所述突变的NS3蛋白有14-3-3ε结合缺陷。

2.根据权利要求1所述的突变病毒，其中所述黄病毒为登革热病毒、西尼罗河病毒或寨卡病毒。

3.根据权利要求1或2所述的突变病毒，其中所述突变的NS3蛋白在相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间包含突变。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的突变病毒，其中所述突变为氨基酸取代、插入、删除，或其组合。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的突变病毒，其中所述突变包含在相对于SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间将至少一个氨基酸取代为不同的氨基酸。

6.根据权利要求1-4中任意一项所述的突变病毒，其中所述突变包含在相对于SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间将至少一个氨基酸取代为赖氨酸。

7.根据权利要求1-4中任意一项所述的突变病毒，其中所述突变包含将相对于SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列第66位的氨基酸取代为赖氨酸。

8.根据权利要求1-4中任意一项所述的突变病毒，其中所述突变包含将相对于SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列第64位的氨基酸取代为赖氨酸。

9.根据权利要求1-4中任意一项所述的突变病毒，其中所述突变包含将相对于SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列第64至66位的氨基酸取代为氨基酸序列赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸。

10.根据权利要求2-9中任意一项所述的突变病毒，其中黄病毒为登革热病毒血清1型、登革热病毒血清2型、登革热病毒血清3型或登革热病毒血清4型。

11.根据权利要求10所述的突变病毒，其中所述减毒的登革热病毒为登革热病毒血清2型。

12.一种药物组合物，其包含根据前述任意一项权利要求所述的突变病毒，以及药学上可接受的运载体。

13.一种黄病毒疫苗，其包含根据权利要求1-11中任意一项所述的突变病毒。

14.根据权利要求13所述的疫苗，其中所述突变病毒选自突变登革热病毒、突变西尼罗河病毒和突变寨卡病毒。

15.根据权利要求13或14所述的疫苗，其进一步包含佐剂。

16.根据权利要求13-15中任意一项所述的疫苗，其中所述黄病毒为活病毒。

17.一种突变NS3蛋白，其在相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间包含突变。

18.根据权利要求17所述的突变NS3蛋白，其中所述突变包含氨基酸取代、插入、删除，或其组合。

19.根据权利要求17或18所述的突变NS3蛋白，其中所述突变包含在相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间将至少一个氨基酸取代为不同的氨基酸。

20.根据权利要求17-19中任意一项所述的突变NS3蛋白，其中所述突变包含在相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的氨基酸63和氨基酸67之间将至少一个氨基酸取代为赖氨酸。

21.根据权利要求17-20中任意一项所述的突变NS3蛋白，其中所述突变包含将相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列第66位的氨基酸取代为赖氨酸。

22.根据权利要求17-20中任意一项所述的突变NS3蛋白，其中所述突变包含将相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列第64位的氨基酸取代为赖氨酸。

23.根据权利要求17-20中任意一项所述的突变NS3蛋白，其中所述突变对应于将相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列第64至66位的氨基酸取代为氨基酸序列赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸。

24.一种病毒，其包含根据权利要求17-23中任意一项所述的突变NS3蛋白。

25.一种核酸，其编码根据权利要求17-23中任意一项所述的突变NS3蛋白。

26.一种病毒，其包含根据权利要求25所述的核酸。

27.一种表达载体，其包含根据权利要求25所述的核酸。

28.一种细胞，其包含根据权利要求25所述的核酸或根据权利要求27所述的表达载体。

29.一种用于产生突变NS3蛋白的方法，所述方法包含在适于蛋白表达的条件下培养根据权利要求28所述的细胞，从而产生所述突变NS3蛋白。

30.根据权利要求29所述的方法，其进一步包含分离所述突变NS3蛋白。

31.一种用于引起个体中针对黄病毒的免疫应答的方法，其包含向所述个体施用包含组合物，其包含根据权利要求1-11中任意一项所述的突变病毒。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述个体为人。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述个体曾暴露于黄病毒。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述个体在最近6个月内、在最近一个月内、在最近两周内、在最近一周内、在最近72个小时内、在最近48个小时内、在最近24个小时内、在最近12个小时内、在最近6个小时内、在最近4个小时内、在最近2个小时内或在最近一个小时内暴露于登革热病毒。

35.根据权利要求31-34中任意一项所述的方法，其中所述个体曾暴露于包含所述登革热病毒的蚊子。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述个体在最近6个月内、在最近一个月内、在最近两周内、在最近一周内、在最近72个小时内、在最近48个小时内、在最近24个小时内、在最近12个小时内、在最近6个小时内、在最近4个小时内、在最近2个小时内或在最近一个小时内暴露于所述蚊子。

37.根据权利要求31-36中任意一项所述的方法，其中所述个体处于发展黄病毒感染的风险。

38.根据权利要求31-37中任意一项所述的方法，其中所述个体具有黄病毒感染。

39.根据权利要求31-39中任意一项所述的方法，其中所述个体将前往流行黄病毒的地区。

40.根据权利要求40所述的方法，其中所述地区在美国、阿根廷、澳大利亚、孟加拉、巴巴多斯、玻利维亚、伯利兹、巴西、柬埔寨、哥伦比亚、哥斯达黎加、古巴、多米尼加共和国、法属玻利尼西亚、瓜德罗普、萨尔瓦多、格拉纳达、危地马拉、圭亚那、海地、洪都拉斯、印度、印度尼西亚、牙买加、老挝、马来西亚、美拉尼西亚、墨西哥、密克罗尼西亚、尼加拉瓜、巴基斯坦、巴拿马、巴拉圭、菲律宾、波多黎各、萨摩亚、西沙特阿拉伯、新加坡、斯里兰卡、苏里南、台湾、泰国、特立尼达和多巴哥、委内瑞拉、越南和/或中国。

41.一种用于保护个体免于感染黄病毒的方法，其包括向所述个体施用根据权利要求1-11中任意一项所述的突变病毒。

42.根据权利要求42所述的方法，其中所述个体为人。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述个体暴露于黄病毒。

44.根据权利要求41-43中任意一项所述的方法，其中所述个体暴露于包含黄病毒的蚊子。

45.根据权利要求41-44中任意一项所述的方法，其中所述个体不具有黄病毒感染，但处于发展黄病毒感染的风险。

46.根据权利要求41-45中任意一项所述的方法，其中所述个体将前往流行黄病毒的地区。

47.根据权利要求46的方法，其中所述地区在美国、阿根廷、澳大利亚、孟加拉、巴巴多斯、玻利维亚、伯利兹、巴西、柬埔寨、哥伦比亚、哥斯达黎加、古巴、多米尼加共和国、法属玻利尼西亚、瓜德罗普、萨尔瓦多、格拉纳达、危地马拉、圭亚那、海地、洪都拉斯、印度、印度尼西亚、牙买加、老挝、马来西亚、美拉尼西亚、墨西哥、密克罗尼西亚、尼加拉瓜、巴基斯坦、巴拿马、巴拉圭、菲律宾、波多黎各、萨摩亚、西沙特阿拉伯、新加坡、斯里兰卡、苏里南、台湾、泰国、特立尼达和多巴哥、委内瑞拉、越南或中国。

48.根据权利要求41-47中任意一项所述的方法，其中所述黄病毒为登革热病毒、西尼罗河病毒或寨卡病毒。

49.一种治疗病毒感染的方法，所述方法包含向个体施用根据权利要求1-11中任意一项所述的突变病毒、根据权利要求17-23中任意一项所述的突变NS3蛋白、根据权利要求12所述的药物组合物，根据权利要求13-16中任意一项所述的疫苗、权利要求24或26所述的病毒，或其组合。