JP2005523709A - インフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの検出のための細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はインフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの迅速な検出および生成に有用である細胞系を提供する。特に本発明は、インフルエンザA型、インフルエンザB型、またはパラインフルエンザウイルス3による感染に対する感受性の増大を示すか、または感染性ビリオンの生産性を増強することができるトランスジェニックミンク肺細胞に関する。本発明はインフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの臨床単離体の培養における使用、並びに診断適用のための抗原調製物としてワクチン処方のためのインフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの生成、並びに抗ウイルス薬のスクリーニングに適している。
本発明の理解を促すために、多くの用語を以下に定義する。
本発明はインフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの迅速な検出および生成に有用な細胞系を提供する。特に本発明は、インフルエンザA型、インフルエンザB型、またはパラインフルエンザウイルス3による感染に対する感受性の増大を示すか、または感染性ビリオンの生産性を増強することができるトランスジェニックミンク肺細胞に関する。本発明はインフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの臨床単離体の培養における使用、並びに診断適用のための抗原調製物としてワクチン処方のためのインフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの生成、並びに抗ウイルス薬のスクリーニングに適している。
本発明は、MvlLu-hF細胞系により例示される、ヒトフリンエンドプロテアーゼ(hF)を発現するトランスジェニックミンク肺上皮細胞(MvlLu)を提供する。フリンは、切断部位がコンセンサス配列R-X-K/R-R(配列番号3)の基質特異性を有するスブチリシン様エンドペプチダーゼである(van de Venら、Mol.Biol.Rep.14:265-275(1990))。ミンク宿主細胞におけるヒトフリンの発現により、さらに感染性のあるインフルエンザおよびパラインフルエンザビリオンが生成する能力をミンク細胞に付与されるのであろうと発明者は考える。
本発明はインフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの存在を検出するためのトランスジェニックミンク肺細胞の単一細胞型培養物を提供する。「単一細胞型培養物(single-cell type culture)」なる用語は、液体、ゲルまたは固体を問わず、単一の型の細胞を含有する組成物を意味する。本明細書にて提示するデータにより、例示的なMvlLu-hF細胞系が、親MvlLu細胞系よりも、インフルエンザA型、インフルエンザB型、およびパラインフルエンザウイルス3感染により感受性が増大したことが実証される。
(a)Herpes=ヘルペスウイルス
Entero=エンテロウイルス
Adeno=アデノウイルス
Myxo=ミクソウイルス
Paramy=パラミクソウイルス
(b)1次サル腎臓細胞はDiagnostic Hybridsから入手することができる(シェル様式用にはカタログ番号490102A、およびチューブ様式用にはカタログ番号49-0600A)。
単一細胞型単層または混合細胞型単層をインキュベーションした後、単層にインフルエンザまたはパラインフルエンザウイルスを含有することが疑われる標本、またはストックウイルス培養物(すなわち陽性対照)を接種する。陰性対照培養物または非感染対照培養物も用いることができる;これらの培養にはいかなるインフルエンザまたはパラインフルエンザウイルスも欠如している培養培地を与える。培養を接種するために、試験される標本のアリコートを標準的な培養容器中の適当な標準培養培地に置く。
不活性化されたインフルエンザワクチンを調製するために、硫酸セルファインを用いるアフィニティ・クロマトグラフィーによりMvlLu-hF細胞から生成されたウイルスを培養培地から単離する(Palacheら、J.Infect.Dis.176(補冊1):S20-S23(1997))。無傷の生ウイルスは当技術分野において公知の多くの方法のいずれか1つによる精製、例えば不活性化ウイルスワクチンを生成するためのホルマリンまたはプロピオンラクトン処理の後に不活性化される。具体的には、0.1% ホルムアルデヒド中4℃で10〜14日間ウイルス懸濁液をインキュベートすることによりインフルエンザウイルスを不活性化する。次に、ヒトでの臨床試験の前に、不活性化されたウイルス調製物を標準的なプロトコールを用いてマウスで試験する。
以下の実施例は本発明における特定の好ましい態様および局面を説明するために役立つものであり、その範囲を限定することを意図するものではない。
ヒトフリン(hF)を発現するトランスジェニックミンク肺(MvlLu)細胞の作製
ミンク肺細胞(ATCC#CCL-64)の単層をトリプシンで処理した後2次培養し、E-MEM培養培地(Diagnostic Hybrids)の存在下、12ウェルプレートのウェルに播種し、そして36℃で48時間インキュベートした。新たに形成された細胞単層を続いてトランスフェクションに使用した。
MvlLu-hF細胞を用いる臨床試料由来インフルエンザA型ウイルスの検出
MvlLu-hF細胞によるインフルエンザA型ウイルスの検出のための感受性を親MvlLu細胞と比較するために、感染細胞の血球吸着(HAD)および免疫蛍光染色を以下のように決定した。つまり、各細胞型を2×105セル/mlの密度でウェルあたり0.2mlを用いて48ウェルプレートに播種した。細胞が単層を形成した後(通常約2〜3日)、凍結ストックからの以前に試験された17個のインフルエンザA型ウイルス陽性臨床試料を各細胞の2つのウェルに1ウェルあたり5μlの接種量で接種した。5% CO2雰囲気下、36℃で一晩インキュベートした後、培地を除去し、そしてモルモット赤血球(RBC)0.2mlを加えた。ヘパリン(Charles River)中に収集したモルモットRBCをリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で3回洗浄し、そして次に使用前に0.2% RBCの濃度で再懸濁した。プレートを4℃で30分間インキュベートした後、振盪および吸引により遊離しているRBCを除去した。図2に示すように、インフルエンザA型ウイルスに感染した細胞に吸着したRBCが塊状で現れた。
MvlLu-hF細胞を用いるインフルエンザA型ウイルスの生成
ミンク肺上皮細胞はヒトインフルエンザウイルスの単離および培養のためのマディオンダービーイヌ腎臓(Madin-Darby canine kidney)(MDCK)上皮細胞の代替である(Schultz-Cherryら、J.Clin.Microbiol.36:3718-3720(1998);並びにHuangおよびTurchek、J.Clin.Microbiol.38:422-423(2000)参照)。本発明の開発中に得られた、そして前記の実施例2で示した結果により、ヒトフリンを発現するミンク肺細胞(MvlLu-hF)はワクチン調製のための高力価のインフルエンザA型ウイルスストックの生成に適している。
MvlLu-hF細胞を用いる臨床試料からのインフルエンザB型ウイルスの検出
トランスジェニックMvlLu-hF細胞によるインフルエンザB型ウイルスの検出のための感受性を親MvlLu細胞と比較するために、以前に陽性であると試験された4個の凍結臨床標本を用いて、24ウェルプレートで培養された双方の細胞に接種した。36℃で一晩インキュベートした後、細胞を抗インフルエンザB型ウイルス抗体(Diagnostic Hybrids)で染色し、そして陽性の蛍光染色細胞を計数した。
MvlLu-hF細胞を用いる臨床試料からのパラインフルエンザウイルス3の検出
トランスジェニックMvlLu-hF細胞によるパラインフルエンザウイルスの検出のための感受性を親MvlLu細胞と比較するために、以前に陽性であると試験された5個の凍結臨床標本を用いて、24ウェルプレートで培養された双方の細胞に接種した。36℃で40時間インキュベートした後、細胞を抗パラインフルエンザウイルス3抗体(Diagnostic Hybrids)で染色し、そして陽性の蛍光染色細胞を計数した。
Claims (18)
- MvlLu-hFと称されるトランスジェニック細胞系。
- (a)MvlLu細胞系と比較して、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択される少なくとも1つのウイルスに対する感受性の増大、並びに(b)MvlLu細胞系と比較して、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択される少なくとも1つのウイルスでの接種時におけるおける感染性ビリオンの生産性の増強、からなる群より選択される特性を有する、MvlLu-hFと称されるトランスジェニック細胞系から確立された細胞系。
- 細胞系がインフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択される少なくとも1つのウイルスに対するMvlLu-hFと称される細胞系の感受性を有している請求項2記載の細胞系。
- (a)MvlLuと比較して、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択される少なくとも1つのウイルスに対する感受性の増大、並びに(b)MvlLuと比較して、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択される少なくとも1つのウイルスでの接種時における感染性ビリオンの生産性の増強、からなる群より選択される特性を有する、ヒトフリンを発現するトランスジェニックミンク肺上皮細胞系。
- ヒトフリンは配列番号1の配列によりコードされる請求項4記載の細胞系。
- インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択される少なくとも1つのウイルスに対するMvlLu-hFと称される細胞系の感受性を有する、請求項4記載のトランスジェニックミンク肺上皮細胞系。
- ヒトフリンを発現するトランスジェニックミンク肺上皮細胞を含む組成物であって、該細胞が(a)MvlLu細胞系と比較して、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択される少なくとも1つのウイルスに対する感受性の増大、並びに(b)MvlLu細胞系と比較して、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択される少なくとも1つのウイルスでの接種時における感染性ビリオンの生産性が増強、からなる群より選択される特性を有する、組成物。
- トランスジェニックミンク肺上皮細胞とは異なる第2細胞型をさらに含む組成物であって、該トランスジェニックミンク肺上皮細胞および該第2細胞型は混合細胞型培養物中にある、請求項7の組成物。
- MvlLu-hFと称されるトランスジェニック細胞系を含む組成物。
- MvlLu-hF細胞とは異なる第2細胞型をさらに含む組成物であって、該MvlLu-hF細胞および該第2細胞型は混合細胞型培養物中にある、請求項9の組成物。
- MvlLu-hFと称されるトランスジェニック細胞系から確立された細胞を含む組成物であって、該確立された細胞が(a)MvlLu細胞系と比較して、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択される少なくとも1つのウイルスに対する感受性の増大、並びに(b)MvlLu細胞系と比較して、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択される少なくとも1つのウイルスでの接種時における感染性ビリオンの生産性が増強、からなる群より選択される特性を有する、組成物。
- 確立された細胞とは異なる第2細胞型をさらに含む組成物であって、該確立された細胞および該第2細胞型は混合細胞型培養物中にある、請求項11の組成物。
- 以下を含む、試料中のインフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択されるウイルスの検出方法:
a)i)該ウイルスの含有が疑われる試料;および
ii)MvlLu-hFと称される細胞を含む組成物;
を提供する段階;
b)該細胞に該試料を接種して、接種細胞を生成する段階;並びに
c)該ウイルスの存在に関して該接種細胞を観察する段階。 - MvlLu-hF細胞とは異なる第2細胞型をさらに含む方法であって、該MvlLu-hF細胞および該第2細胞型は混合細胞型培養物中にある、請求項13の方法。
- インフルエンザA型ウイルス反応性モノクローナル抗体、インフルエンザB型ウイルス反応性モノクローナル抗体、およびパラインフルエンザウイルス3反応性モノクローナル抗体からなる群より選択されるモノクローナル抗体を提供する段階をさらに含み、工程c)は該ウイルスを観察するために該モノクローナル抗体を使用することを含む、請求項13の方法。
- 以下を含む、試料中のインフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択されるウイルスを検出するためのキット:
a)MvlLu-hFと称される細胞を含む組成物;および
b)インフルエンザA型ウイルス反応性モノクローナル抗体、インフルエンザB型ウイルス反応性モノクローナル抗体、およびパラインフルエンザウイルス3反応性モノクローナル抗体からなる群より選択されるモノクローナル抗体。 - MvlLu-hF細胞とは異なる第2細胞型をさらに含み、該MvlLu-hF細胞および該第2細胞型は混合細胞型培養物中にある、請求項16のキット。
- 以下を含む、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、およびパラインフルエンザウイルス3からなる群より選択されるウイルスを生成する方法:
a)i)ウイルスを含有する試料;および
ii)MvlLu-hFと称される細胞を含む組成物;
を提供する段階;並びに
b)該細胞に該試料を接種して、接種細胞を生成し、ここで該接種細胞は該ウイルスを生成する段階。
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