JP2021136899A - ウイルス増殖方法及びウイルス増殖促進剤の探索方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ワクチンの材料となるインフルエンザウイルスを、細胞培養を用いてより効率よく増殖させる方法、及びインフルエンザウイルス増殖促進剤を探索する方法を提供する。
【解決手段】細胞培養によってインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、前記細胞のアポトーシスを抑制する工程を含む、方法。
【選択図】なし
【解決手段】細胞培養によってインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、前記細胞のアポトーシスを抑制する工程を含む、方法。
【選択図】なし
Description
本発明は細胞培養によるインフルエンザウイルスの増殖方法及びインフルエンザウイルス増殖促進剤の探索方法に関する。
インフルエンザは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症であり、飛沫感染や接触感染等により感染し、高熱、頭痛、筋肉痛、関節痛等の強い全身症状を伴う呼吸器感染症である。インフルエンザワクチンの接種はインフルエンザの重症化の防御に最良の手段となっている。
インフルエンザワクチンは、ワクチン製造用のインフルエンザウイルスを発育鶏卵の尿膜腔内に接種して培養増殖させ、漿尿液から遠心にて濃縮精製し、ウイルス粒子を界面活性剤等で処理し、ホルマリンで不活化した全粒子ワクチン又はウイルス粒子をエーテルや界面活性剤で破砕後更に精製を行ったスプリットワクチン又はサブユニットワクチンである。しかしながらインフルエンザワクチンを、胚を有する鶏卵から製造する場合、時間、労働及び費用を要し、急な大量生産ができないという供給安定性の面で問題がある。
これに替わるウイルス生産方法として、インフルエンザウイルスを細胞培養において複製する手法が研究され、ＭＤＣＫ細胞がインフルエンザウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製のための適切な細胞であることが報告されている（非特許文献１）。また、特許文献１には、ＭＤＣＫ細胞の培養液中に分泌されるトリプシンインヒビターを除去又は低減した後に、細胞にインフルエンザウイルスを接種して、インフルエンザウイルス接種細胞を培養することによりウイルス生産量を増加できることが開示されている。
また、非特許文献２には、トリインフルエンザウイルス（Ａ／Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ／７９（Ｈ７Ｎ７））が、生体防御機能（アポトーシス）を利用して核外へ輸送され、効率的に増えることが開示され、インフルエンザウイルスの増殖には、培養細胞のアポトーシスが関与することが示唆されている。
Med Microbiol Immunol (1975)162,9-14
THE EMBO Journal(2003)22,2717-2728
本発明はワクチンの材料となるインフルエンザウイルスを、細胞培養を用いてより効率よく増殖させる方法、及びインフルエンザウイルス増殖促進剤を探索する方法を提供することに関する。
本発明者等は、鋭意研究を重ねた結果、インフルエンザウイルスを感染させた細胞において、アポトーシスに関連するＢｃｌ−２ファミリータンパク質の存在量がインフルエンザウイルスの増殖性に関与し、インフルエンザウイルスの増殖性が高い細胞においてはアポトーシス誘導因子が減少するのに対し、インフルエンザウイルスの増殖性が低い細胞においてはアポトーシス誘導因子のタンパク質量が維持されることを見出した。また、効率的にインフルエンザウイルスが増殖できる細胞株において、ウイルス感染に応じてアポトーシス抑制因子が活性化することも確認した。
すなわち、宿主細胞のアポトーシスを抑制することでインフルエンザウイルスの増殖性が向上し、ウイルス産生量を増加できること、またアポトーシスの制御能を指標としてインフルエンザウイルス増殖促進剤を探索できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、宿主細胞のアポトーシスを抑制することでインフルエンザウイルスの増殖性が向上し、ウイルス産生量を増加できること、またアポトーシスの制御能を指標としてインフルエンザウイルス増殖促進剤を探索できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）細胞培養によってインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、前記細胞のアポトーシスを抑制する工程を含む、方法。
２）１）の方法によってインフルエンザウイルスを増殖させ、細胞からウイルス粒子を回収する、インフルエンザウイルス粒子の調製方法。
３）以下の（１）〜（３）の工程を含む、インフルエンザウイルス増殖促進剤の評価又は選択方法。
（１）培養細胞に被験物質を接触させる工程、
（２）当該細胞におけるアポトーシス誘導因子若しくはアポトーシス抑制因子の発現レベル又は活性レベルを測定する工程、
（３）（２）で測定された結果に基づいて、アポトーシス誘導因子の発現レベル若しくは活性レベルを低下又は減少させるか、又はアポトーシス抑制因子の発現レベル若しくは活性レベルを増強又は増加させる被験物質をインフルエンザウイルス増殖促進剤として評価する工程。
１）細胞培養によってインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、前記細胞のアポトーシスを抑制する工程を含む、方法。
２）１）の方法によってインフルエンザウイルスを増殖させ、細胞からウイルス粒子を回収する、インフルエンザウイルス粒子の調製方法。
３）以下の（１）〜（３）の工程を含む、インフルエンザウイルス増殖促進剤の評価又は選択方法。
（１）培養細胞に被験物質を接触させる工程、
（２）当該細胞におけるアポトーシス誘導因子若しくはアポトーシス抑制因子の発現レベル又は活性レベルを測定する工程、
（３）（２）で測定された結果に基づいて、アポトーシス誘導因子の発現レベル若しくは活性レベルを低下又は減少させるか、又はアポトーシス抑制因子の発現レベル若しくは活性レベルを増強又は増加させる被験物質をインフルエンザウイルス増殖促進剤として評価する工程。
本発明のインフルエンザウイルスの増殖方法によれば、インフルエンザウイルスを効率よく増殖でき、ワクチン調製のためのインフルエンザウイルスを大量生産することができる。また、本発明のインフルエンザウイルス増殖促進剤の評価又は選択方法によれば、インフルエンザウイルスをよく増殖できるインフルエンザウイルス増殖促進剤を効率よく探索することができる。
本発明において、インフルエンザウイルスとしては、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型のいずれでも良いが、Ａ型及びＢ型を好適に例示することができる。
また、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（赤血球凝集素 ＨＡ：ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の型（ＨＡ型）とノイラミニダーゼの型（ＮＡ型）も特に制限されない。例えば、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ３Ｎ２株、Ｈ４Ｎ２株、Ｈ４Ｎ６株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ５Ｎ２株、Ｈ７Ｎ２株、Ｈ７Ｎ７株、Ｈ７Ｎ９株、Ｈ９Ｎ２株等の現在知られている亜型の他、将来単離・同定される亜型も包含される。
また、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（赤血球凝集素 ＨＡ：ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の型（ＨＡ型）とノイラミニダーゼの型（ＮＡ型）も特に制限されない。例えば、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ３Ｎ２株、Ｈ４Ｎ２株、Ｈ４Ｎ６株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ５Ｎ２株、Ｈ７Ｎ２株、Ｈ７Ｎ７株、Ｈ７Ｎ９株、Ｈ９Ｎ２株等の現在知られている亜型の他、将来単離・同定される亜型も包含される。
また対象となるウイルスは、ヒトに感染できるものであればよく、他にブタやトリ、ウマ、ウシへの感染能力を有するウイルスでもよい。
また、本発明のインフルエンザウイルスは、感染動物や患者等の感染個体から単離された株であってもよく、遺伝子工学的に培養細胞で樹立された組換えウイルスであってもよい。
本発明において、アポトーシスとは、ミトコンドリアの正常な機能が損なわれる過程を含む、積極的、機能的な細胞死であり、細胞で増殖制御機構として管理・調節された能動的な細胞死、すなわち「プログラム細胞死」を意味する。
アポトーシスシグナルが細胞内に存在するミトコンドリアに伝達されると、外膜・内膜間隙に存在する多種多様なタンパク質や核酸因子が放出され、細胞内の他器官に影響を及ぼす。その一例として細胞質に放出されたシトクロムｃは、その後様々な因子と作用し、アポトーシスに特異的な形態変化や生化学的変化を促す。斯様にアポトーシスにはミトコンドリアへのシグナル伝達と、ミトコンドリア外膜・内膜間隙に存在する多種多様なタンパク質や核酸因子の放出が重要であるが、これを左右している因子、即ち、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質が存在する。Ｂｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質はＢＨ（Ｂｃｌ−２ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインと呼ばれるアミノ酸配列を１つ以上有している。また、Ｃ末端側に疎水性の高いＴＭ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）領域を有しているため、ミトコンドリア膜上に移行し、アポトーシスを制御することが可能となる。
アポトーシスシグナルが細胞内に存在するミトコンドリアに伝達されると、外膜・内膜間隙に存在する多種多様なタンパク質や核酸因子が放出され、細胞内の他器官に影響を及ぼす。その一例として細胞質に放出されたシトクロムｃは、その後様々な因子と作用し、アポトーシスに特異的な形態変化や生化学的変化を促す。斯様にアポトーシスにはミトコンドリアへのシグナル伝達と、ミトコンドリア外膜・内膜間隙に存在する多種多様なタンパク質や核酸因子の放出が重要であるが、これを左右している因子、即ち、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質が存在する。Ｂｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質はＢＨ（Ｂｃｌ−２ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインと呼ばれるアミノ酸配列を１つ以上有している。また、Ｃ末端側に疎水性の高いＴＭ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）領域を有しているため、ミトコンドリア膜上に移行し、アポトーシスを制御することが可能となる。
Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質には、アポトーシスの促進に関わるアポトーシス誘導因子とアポトーシスの抑制に関わるアポトーシス抑制因子の相反する二種類が存在する。
アポトーシス誘導因子としてＢａｄ、Ｂｉｄ、Ｂａｘ及びＢｉｍ等が知られており、これらは細胞質に存在するが、細胞死のシグナルによりミトコンドリアへと移動し、そこでミトコンドリア膜の開口を促し、シトクロムｃをはじめとした多種多様なタンパク質や核酸因子の放出を促進する。細胞質内へ流出したシトクロムｃはＡｐａｆ−１と複合体を形成し、カスパーゼ９を活性化、さらにカスパーゼ３、６、７を活性化することでアポトーシスが起こると考えられている（Annu Rev Genet (2009)43:95-118）。一方、アポトーシスの抑制因子としてＢｃｌ−２やＢＣＬ−ＸＬ等が知られており、これらはミトコンドリアの外壁に存在してミトコンドリア膜の開口を抑制することでシトクロムｃの放出を阻害し、アポトーシスを抑制する。
なお、アポトーシス誘導因子としては、上記Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂａｘ及びＢｉｍの他に、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、ＢＣＬ−ＸＳ、Ｂｉｋ、Ｅｇｌ−１、Ｂｃｌ−Ｘβ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｏｋ−Ｌ及びＢｏｋ−Ｓが知られている。また、アポトーシス抑制因子としては、上記Ｂｃｌ−２、ＢＣＬ−ＸＬの他に、Ｍｃｌ−１、ＣＥＤ−９、Ａ１、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−６が知られている。
アポトーシス誘導因子としてＢａｄ、Ｂｉｄ、Ｂａｘ及びＢｉｍ等が知られており、これらは細胞質に存在するが、細胞死のシグナルによりミトコンドリアへと移動し、そこでミトコンドリア膜の開口を促し、シトクロムｃをはじめとした多種多様なタンパク質や核酸因子の放出を促進する。細胞質内へ流出したシトクロムｃはＡｐａｆ−１と複合体を形成し、カスパーゼ９を活性化、さらにカスパーゼ３、６、７を活性化することでアポトーシスが起こると考えられている（Annu Rev Genet (2009)43:95-118）。一方、アポトーシスの抑制因子としてＢｃｌ−２やＢＣＬ−ＸＬ等が知られており、これらはミトコンドリアの外壁に存在してミトコンドリア膜の開口を抑制することでシトクロムｃの放出を阻害し、アポトーシスを抑制する。
なお、アポトーシス誘導因子としては、上記Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂａｘ及びＢｉｍの他に、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、ＢＣＬ−ＸＳ、Ｂｉｋ、Ｅｇｌ−１、Ｂｃｌ−Ｘβ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｏｋ−Ｌ及びＢｏｋ−Ｓが知られている。また、アポトーシス抑制因子としては、上記Ｂｃｌ−２、ＢＣＬ−ＸＬの他に、Ｍｃｌ−１、ＣＥＤ−９、Ａ１、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−６が知られている。
本発明においては、後述する実施例に記載のとおり、インフルエンザウイルスの増殖性が高い細胞においてアポトーシス誘導因子であるＢｉｍの分解が認められ、同様にアポトーシス誘導因子であるＢＣＬ−ＸＳ量が減少すること、また、アポトーシス抑制因子であるＢＣＬ−ＸＬ及びＢｃｌ−２のタンパク質量が明らかに増加することが確認され、インフルエンザウイルスの感染に伴いアポトーシスが抑制されていることを明らかにした。
また、Ｂｉｍの分解はその上流でＥｒｋタンパク質の活性変化によって制御され、Ｅｒｋがリン酸化されて活性化するとＢｉｍは分解されるが（Mol Cancer Ther.2009;8:3173-80）、Ｅｒｋ活性化阻害剤の添加によりＢｉｍの分解が抑制されると、インフルエンザウイルスの増殖性は著しく抑制されることも確認された。さらに、分解されずに細胞質に存在するＢｉｍはミトコンドリアへ移行するとＢａｘタンパク質と結合することでアポトーシスの誘導に働くため、Ｂａｘのミトコンドリアにおける存在量を減らす目的でＢａｘのミトコンドリアへの移行を阻害可能なペプチドをインフルエンザウイルスの感染細胞へ作用させたところ、インフルエンザウイルスの増殖性が亢進することも明らかにした。
したがって、培養細胞のアポトーシスを抑制することによって、インフルエンザウイルスの増殖性を高めることができる。またアポトーシスの制御能を指標としてインフルエンザウイルス増殖促進剤の探索が可能である。
また、Ｂｉｍの分解はその上流でＥｒｋタンパク質の活性変化によって制御され、Ｅｒｋがリン酸化されて活性化するとＢｉｍは分解されるが（Mol Cancer Ther.2009;8:3173-80）、Ｅｒｋ活性化阻害剤の添加によりＢｉｍの分解が抑制されると、インフルエンザウイルスの増殖性は著しく抑制されることも確認された。さらに、分解されずに細胞質に存在するＢｉｍはミトコンドリアへ移行するとＢａｘタンパク質と結合することでアポトーシスの誘導に働くため、Ｂａｘのミトコンドリアにおける存在量を減らす目的でＢａｘのミトコンドリアへの移行を阻害可能なペプチドをインフルエンザウイルスの感染細胞へ作用させたところ、インフルエンザウイルスの増殖性が亢進することも明らかにした。
したがって、培養細胞のアポトーシスを抑制することによって、インフルエンザウイルスの増殖性を高めることができる。またアポトーシスの制御能を指標としてインフルエンザウイルス増殖促進剤の探索が可能である。
本発明のインフルエンザウイルスの増殖方法において、「アポトーシスを抑制する」とは、インフルエンザウイルスが感染した細胞内において、アポトーシスを負に誘導できるものであればその手段は限定されないが、好ましくは、上記のアポトーシス誘導因子の発現を抑制すること、分解を促進すること若しくはアポトーシス誘導因子の機能発現に必要な細胞内局在性やタンパク質複合体の形成を調節する等によりその活性を低下すること、或いはアポトーシス抑制因子の発現を促進すること、分解を抑制すること若しくはアポトーシス抑制因子の機能発現に必要な細胞内局在性やタンパク質複合体の形成を調節する等によりその活性を高めることが挙げられる。
例えば、アポトーシス誘導因子に対する阻害剤又はアポトーシス抑制因子の活性化剤はインフルエンザウイルス増殖促進剤となり得、これらをインフルエンザウイルスの培養系に適用することにより、インフルエンザウイルスの増殖促進を図ることができる。
例えば、アポトーシス誘導因子に対する阻害剤又はアポトーシス抑制因子の活性化剤はインフルエンザウイルス増殖促進剤となり得、これらをインフルエンザウイルスの培養系に適用することにより、インフルエンザウイルスの増殖促進を図ることができる。
ここで、アポトーシス誘導因子阻害剤としては、Ｂａｘのミトコンドリア膜への移行を阻害するペプチド（例えばＰｅｐｔｉｄｅ Ｖ５、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐ５（ＴＯＣＲＩＳ社））、Ｂａｘのミトコンドリアでの機能を阻害するＢａｘ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ（ＴＯＣＲＩＳ社）、Ｂｉｄが関与するＢａｘのミトコンドリア膜上での活性化を阻害するｉＭＡＣ２（ＴＯＣＲＩＳ社）、Ｂｉｍの分解を促進することが期待されるＥｒｋ活性化剤（例えば１２−Ｏ−Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ−ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ；Ｓｉｇｍａ社）、Ｂｉｍがミトコンドリア膜上でＭｃｌ−１と結合することを阻害するＭＬ３１１（ＴＯＣＲＩＳ社製）等が挙げられる。
また、アポトーシス抑制因子活性化剤としては、Ｂｃｌ−２やＢＣＬ−ＸＬの転写活性を向上させる薬剤等が挙げられる。
また、アポトーシス抑制因子活性化剤としては、Ｂｃｌ−２やＢＣＬ−ＸＬの転写活性を向上させる薬剤等が挙げられる。
本発明のインフルエンザウイルスの増殖方法において、インフルエンザウイルスの増殖は、具体的には、細胞培地中の細胞にインフルエンザウイルスを感染させる工程、及び当該感染細胞をウイルスが複製可能な条件下で培養する工程により行われるが、本発明においては、アポトーシスを抑制する工程、具体的にはアポトーシス誘導因子の発現又は活性を抑制する工程又はアポトーシス抑制因子の発現又は活性を促進する工程が、例えばウイルス感染前、ウイルス感染後、又はウイルス感染と同時に行われる。好適には、アポトーシス誘導因子阻害剤やアポトーシス抑制因子活性化剤を、ウイルス感染前、ウイルス感染後、又はウイルス感染と同時に培地に添加することが挙げられる。
インフルエンザウイルスの増殖に用いられる細胞としては、インフルエンザウイルスに感受性であれば如何なる細胞も使用できる。このような細胞として、例えば、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓由来の株化細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞）、ＰＥＲ．Ｃ６（ヒト網膜細胞由来の株化細胞）、ＳＫ−ＮＥＰ−１細胞（ヒト腎臓由来の株化細胞）、Ａ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）、Ｄｕｃｋ ｅｍｂｒｙｏ細胞（アヒル胚細胞）が挙げられる。これらの細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、それぞれＣＣＬ−３４、ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−１０７、ＨＴＢ−４８、ＣＣＬ−１８５、ＣＣＬ−１４１等として登録されており、また、市販で購入することができる。また、インフルエンザウイルスに感受性を示すニワトリ由来の細胞として、ＣＥＦ細胞（Chicken embryonic fibroblast cell: ニワトリ胚由来線維芽細胞）が使用できる。なお、ＣＥＦ細胞には単離された細胞以外に発育鶏卵中に存在する細胞も含まれる。この他、インフルエンザウイルスの増殖には、インフルエンザウイルスを効率的に増殖させるために開発された細胞株を用いることもできる。斯かる細胞株としては、例えばＥＢ６６（登録商標）、ＤｕｃｋＣｅｌｔ−Ｔ１７（登録商標）、ＥＢｘ（登録商標）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
斯かる細胞を培養するための培地は、通常細胞培養に用いられる培地、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）、無血清培地（Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）等が挙げられるが何れを使用しても良い。
当該培地には、細胞の増殖効率を上げるために、非必須アミノ酸やL-グルタミンを添加することができる。また、インフルエンザウイルスの培養においては、ヘマグルチニンの開裂を促す目的でトリプシンやアセチル化トリプシン等のプロテアーゼを添加することができる。また、微生物のコンタミネーションを避けるために、ペニシリンやストレプトマイシン、ゲンタマイシン等の細胞培養に一般的に使用される抗生物質を添加してもよい。培地のｐＨは、適当な緩衝液（例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ）で動物細胞の増殖に適した６．５〜８、好ましくは、６．８〜７．３に調整される。
細胞培養の方法としては、培養器の底に細胞を付着させた静止培養、細胞を培地中に浮遊させて培養する浮遊培養が挙げられるが、工業生産レベルで行なうときは、浮遊培養が好ましい。浮遊培養の方法としては、マイクロキャリアなどの担体に細胞を付着させてこれを浮遊させて培養する方法又は担体を用いずに細胞を浮遊させて培養する方法等が挙げられるが、何れの方法を用いても良い。
細胞培養物（培養した細胞と培地の混液）は、そのままインフルエンザウイルスの接種に使用することできるが、インフルエンザウイルスの接種に際しては、新鮮な培地又は適当な緩衝液、例えば、ＰＢＳ、トリス緩衝液により細胞の洗浄が行なわれることが好ましい。
具体的には、スピナ−フラスコ等で培養増殖した細胞を低速遠心又は膜ろ過し、細胞と培養上清に分離し、遠心沈渣又は膜ろ過濃縮液の細胞に新鮮培地を加え、細胞を懸濁することにより培地交換が行われる。
具体的には、スピナ−フラスコ等で培養増殖した細胞を低速遠心又は膜ろ過し、細胞と培養上清に分離し、遠心沈渣又は膜ろ過濃縮液の細胞に新鮮培地を加え、細胞を懸濁することにより培地交換が行われる。
斯くして得られる細胞培養物に、インフルエンザウイルス液が添加され、一定条件下で培養が行なわれる。ウイルス培養開始時の初期細胞密度は０．００１〜１００×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬを用いることができるが、好ましくは０．０１〜１０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは０．１〜１０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。なお、細胞密度の測定は、血球計算盤等による一般的な方法に従って行えばよい。
培養条件は、細胞の種類、ウイルス接種量及び培養スケール・方法等の組み合わせにより適切に調節される。例えば、培養温度は、３３℃〜３９℃、好ましくは３４〜３８℃、培養期間は、１〜１０日間、好ましくは３〜７日間、炭酸ガス濃度は３〜８％、好ましくは４〜５％、酸素濃度は、１７〜２５％、好ましくは２０〜２２％が使用される。
本発明の方法によれば、インフルエンザウイルスを効率的に増殖させることができる。なお、培地中のウイルス含量は、モルモット等の赤血球を用いた赤血球凝集法（希釈倍数）やヘマグルチニンに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（μｇ／ｍＬ）、ウイルス感染価を測定するプラークアッセイやＴＣＩＤ５０、ウイルスＲＮＡ量を測定できるリアルタイムＰＣＲ等により測定することができる。
培養終了後、ウイルス感染細胞の培養上清（ウイルス浮遊液）からウイルス粒子が回収され、濃縮、精製及び不活化することにより、不活化全粒ワクチンや不活化スプリットワクチン用のウイルス粒子を調製することができる。生ワクチンや弱毒化生ワクチンとして用いる場合は、濃縮及び精製後にインフルエンザワクチン用のウイルス粒子として調製することができる。
ウイルス粒子の回収は、培養上清を清澄化すること、具体的には遠心分離又は濾過することにより行われ、次いで、濃縮のために、限外濾過が行われる。ウイルスの精製は、ショ糖密度勾配遠心分離等の超遠心分離や液体クロマトグラフィー等の手段を用いて行うことができる。精製ウイルス液は、不活化全粒ワクチンや不活化スプリットワクチンの場合、ホルマリン処理、紫外線照射、ベータプロピオラクトン、バイナリーエチレンイミン等により、不活化処理される。生ワクチンや弱毒化生ワクチンとして用いる場合は、上記精製ウイルス液をインフルエンザワクチン用のウイルス粒子として調製される。
斯かるインフルエンザウイルス粒子に、適宜医薬として許容され得る担体（緩衝剤、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウムゲル）等を添加し、各種剤型のワクチンを調製することができる。
本発明のインフルエンザウイルス増殖促進剤の評価又は選択方法は、以下の（１）〜（３）の工程により行われる。
（１）培養細胞に被験物質を接触させる工程、
（２）当該細胞におけるアポトーシス誘導因子若しくはアポトーシス抑制因子の発現レベル又は活性レベルを測定する工程、
（３）（２）で測定された結果に基づいて、アポトーシス誘導因子の発現レベル若しくは活性レベルを低下又は減少させるか、又はアポトーシス抑制因子の発現レベル若しくは活性レベルを増強又は増加させる被験物質をインフルエンザウイルス増殖促進剤として評価する工程。
（１）培養細胞に被験物質を接触させる工程、
（２）当該細胞におけるアポトーシス誘導因子若しくはアポトーシス抑制因子の発現レベル又は活性レベルを測定する工程、
（３）（２）で測定された結果に基づいて、アポトーシス誘導因子の発現レベル若しくは活性レベルを低下又は減少させるか、又はアポトーシス抑制因子の発現レベル若しくは活性レベルを増強又は増加させる被験物質をインフルエンザウイルス増殖促進剤として評価する工程。
本発明の方法に用いられる細胞としては、アポトーシス誘導因子又はアポトーシス抑制因子が発現可能な細胞、すなわちアポトーシスを制御可能なＢｃｌ−２ファミリータンパク質を生来的に発現する細胞又は外来的に当該Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞が使用される。
Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質を生来的に発現する細胞としては、具体的にはイヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞株（ＭＤＣＫ細胞）、アフリカミドリザル腎由来細胞株（ＣＯＳ７細胞）、スルファチドと呼ばれるインフルエンザウイルスの増殖性に影響を及ぼすことが報告されている糖脂質の生合成に必要な酵素（ＣＧＴ，ｃｅｒａｍｉｄｅ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ； 及びＣＳＴ，ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をＣＯＳ７細胞に遺伝子導入しスルファチドを強制発現させ樹立した細胞株であるＳｕｌＣＯＳ１細胞（J Virol. 2008; 82: 5940-5950）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞株（Ｖｅｒｏ細胞）、ヒト肺胞基底上皮細胞株（Ａ５４９細胞）、ニワトリ胚由来線維芽細胞（ＣＥＦ）などが挙げられる。本発明の方法に用いられる細胞は、望ましくはインフルエンザウイルスの感染が成立する細胞株及び初代培養細胞であるが、これらに限定されるものではない。
Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞は、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞、好ましくはＢｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする遺伝子が恒常的に発現可能なように宿主細胞に導入されている細胞であり、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸が、染色体外要素として当該核酸が複製可能となるように導入されている細胞、又は当該核酸が染色体組み込みにより複製可能となるように導入されている細胞が挙げられる。ここで、核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡの何れでも良い。当該Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸が発現可能なように導入されている細胞は、前記Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸と、用いられる宿主細胞におけるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現に適したベクターとを連結させることにより得られたＢｃｌ−２ファミリータンパク質発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得ることができる。宿主細胞へのＢｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸の導入は、当該分野で周知の形質転換、トランスフェクション等の方法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、ウイルスを利用した方法等に準じて行なうことができる。
Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質を生来的に発現する細胞としては、具体的にはイヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞株（ＭＤＣＫ細胞）、アフリカミドリザル腎由来細胞株（ＣＯＳ７細胞）、スルファチドと呼ばれるインフルエンザウイルスの増殖性に影響を及ぼすことが報告されている糖脂質の生合成に必要な酵素（ＣＧＴ，ｃｅｒａｍｉｄｅ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ； 及びＣＳＴ，ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をＣＯＳ７細胞に遺伝子導入しスルファチドを強制発現させ樹立した細胞株であるＳｕｌＣＯＳ１細胞（J Virol. 2008; 82: 5940-5950）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞株（Ｖｅｒｏ細胞）、ヒト肺胞基底上皮細胞株（Ａ５４９細胞）、ニワトリ胚由来線維芽細胞（ＣＥＦ）などが挙げられる。本発明の方法に用いられる細胞は、望ましくはインフルエンザウイルスの感染が成立する細胞株及び初代培養細胞であるが、これらに限定されるものではない。
Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞は、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞、好ましくはＢｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする遺伝子が恒常的に発現可能なように宿主細胞に導入されている細胞であり、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸が、染色体外要素として当該核酸が複製可能となるように導入されている細胞、又は当該核酸が染色体組み込みにより複製可能となるように導入されている細胞が挙げられる。ここで、核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡの何れでも良い。当該Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸が発現可能なように導入されている細胞は、前記Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸と、用いられる宿主細胞におけるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現に適したベクターとを連結させることにより得られたＢｃｌ−２ファミリータンパク質発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得ることができる。宿主細胞へのＢｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸の導入は、当該分野で周知の形質転換、トランスフェクション等の方法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、ウイルスを利用した方法等に準じて行なうことができる。
前記Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸は、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸に対応する既知の塩基配列の情報に基づき、前記塩基配列から作製した適切なプライマー対を用いたＰＣＲ法及び／又は前記塩基配列から作製した適切なプローブとｃＤＮＡライブラリーとを用いたハイブリダイゼーション法等により得ることができる。また、前記Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質発現ベクターは、前記Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸と、用いられる宿主細胞におけるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の発現に適したベクターとを連結させることにより得られる。また、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸には、分子生物学的実験のために用いられるＴａｇ配列、修飾、特定のアミノ酸配列、別のタンパク質などをコードする核酸を連結させても良い。前記ベクターは、調製が容易であり、用いられる宿主細胞に効率よく導入でき、当該宿主細胞においてＢｃｌ−２ファミリータンパク質を発現させることができるベクターであればよく、好ましくは、大腸菌のプラスミド、酵母のプラスミド、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等の動物ウイルスベクターが望ましい。
また、前記宿主細胞としては、前記Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、Ｓｆ−９ ｉｎｓｅｃｔ細胞、その他、株化された細胞や動物より単離された初代培養細胞等が挙げられる。また、本発明の方法に用いられる細胞として記載したＭＤＣＫ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＳｕｌＣＯＳ１細胞、Ａ５４９細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＥＦ細胞を前記宿主細胞として用いても良い。
本発明の方法に使用される前記Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質発現可能細胞は、例えば、当該細胞におけるＢｃｌ−２ファミリータンパク質の機能の発現、タンパク質レベルでの発現、遺伝子レベルでの発現、蛍光・発光物質の導入、薬剤耐性遺伝子の導入等を指標として選択することができる。前記Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞の選択には、適切な選択培地等を用いることができる。
Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質発現可能細胞の培養に用いられる培地としては、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）、無血清培地（Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられ、当該培地には、細胞の増殖効率を上げるために、非必須アミノ酸やL-グルタミンを添加することができる。また、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質発現可能細胞の薬剤耐性遺伝子の導入等を指標として選択を行うためにＧ４１８硫酸塩やネオマイシンなど、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質と同時に導入した遺伝子の選別に必要な薬剤を添加しても良い。また、微生物のコンタミネーションを避けるために、ペニシリンやストレプトマイシン、ゲンタマイシン等の細胞培養に一般的に使用される抗生物質を添加してもよい。培地のｐＨは、適当な緩衝液（例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ）で動物細胞の増殖に適した６．５〜８、好ましくは、６．８〜７．３に調整される。
工程（１）において、被験物質と細胞との接触は、当該分野で公知の手段であればよく、例えば、当該被験物質の細胞培養培地への添加、または細胞への直接的な添加（例えば、滴下、塗布、散布、噴霧、パッチ等）が挙げられる。被験物質の濃度及び接触量は、被験物質の形態、化学的性質、細胞毒性等に基づいて適宜設定すればよい。例えば、適当な濃度に希釈した被験物質の所定量を、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４〜４８時間、該細胞に曝露することが挙げられる。
尚、本発明において、被験物質としては、特に限定されず、天然に存在する物質（例えば動植物、海洋生物、微生物及びそれらの抽出物又はそれらに由来する天然成分等）、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
工程（２）において、アポトーシス誘導因子若しくはアポトーシス抑制因子の発現又は活性は、例えば、被験物質を接触させる細胞群と接触させない群（対照細胞）を用意し、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の発現状態又は活性を遺伝子又はタンパク質レベル（例えばタンパク質発現量、タンパク質の生物活性、ｍＲＮＡ発現量、プロモーターの活性、タンパク質の細胞内局在性、タンパク質相互作用等）で測定し、必要に応じて当該測定値を定量化した後、両者間で比較することにより行うことができる。なお、対照細胞としては、被験物質を接触させない代わりに、対照物質を接触させたものを用いてもよい。測定は、当該分野で公知の方法に従って行えばよく、遺伝子発現解析方法としては、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるレポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ等を用いることができ、タンパク質発現の解析方法としては、ウェスタンブロッティング法、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ、バインディングアッセイ、ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、ＦＡＣＳ等を用いることができる。
好適には、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域−レポーター遺伝子構築物を含む細胞における転写活性をレポーターアッセイにより測定すること、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質を内在的に発現する細胞におけるｍＲＮＡの発現量を測定すること等が挙げられる。
上記のように測定したアポトーシス誘導因子若しくはアポトーシス抑制因子の発現レベルや活性レベル（例えば、生物活性、細胞内局在性、タンパク質間相互作用等）に基づき、インフルエンザウイルス増殖促進剤を評価又は選択することができる。すなわち、被験物質を添加した細胞におけるアポトーシス誘導因子の発現レベル若しくは活性レベルが対照群（例えば被験物質を添加しない対照細胞）でのレベルと比較して低下又は減少している、或いはアポトーシス抑制因子の発現レベル若しくは活性レベルが対照群（例えば被験物質を添加しない対照細胞）でのレベルと比較して増強又は増加していれば、インフルエンザウイルス増殖促進剤として評価又は選択できる。なお、斯くしてインフルエンザウイルス増殖促進剤として評価又は選択された被験物質は、必要に応じてＩｎ ｖｉｔｒｏやＩｎ ｖｉｖｏ試験においてインフルエンザウイルスの増殖促進能を調べることにより、インフルエンザウイルス増殖促進剤として機能することを確認することができる（工程（３））。
斯くして本発明の方法により探索されたインフルエンザウイルス増殖促進剤は、ワクチン製造において、インフルエンザウイルスの増殖を促進するための素材又は製剤として使用可能である。すなわち、斯かるインフルエンザウイルス増殖促進剤は、インフルエンザウイルスを宿主中で増殖する場合において、その培養系に添加（ウイルス感染前、ウイルス感染後、又はウイルス感染と同時）して使用することにより、ウイルスの増殖を促進できる。
実施例１ インフルエンザウイルスの増殖性とアポトーシス誘導因子分解性の評価
（１）過去にウイルス増殖性の違いが報告されているＣＯＳ７細胞とＳｕｌＣＯＳ１細胞（J Virol. 2008; 82: 5940-5950）を用いてインフルエンザウイルスの増殖性の違いを評価した。各細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）にて３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。上記細胞を２４ウェルプレートに播種し、コンフルエントの状態で試験に用いた。上述の２４ウェルプレートに播種した各細胞をＰＢＳで洗浄後、Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏ社製）を４００μＬ／ウェルで添加し、１時間馴化させた。
（１）過去にウイルス増殖性の違いが報告されているＣＯＳ７細胞とＳｕｌＣＯＳ１細胞（J Virol. 2008; 82: 5940-5950）を用いてインフルエンザウイルスの増殖性の違いを評価した。各細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）にて３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。上記細胞を２４ウェルプレートに播種し、コンフルエントの状態で試験に用いた。上述の２４ウェルプレートに播種した各細胞をＰＢＳで洗浄後、Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏ社製）を４００μＬ／ウェルで添加し、１時間馴化させた。
（２）上記細胞にＡ型インフルエンザウイルスであるＨ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザウイルス株（Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３０／２００９）及びＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１）を感染価ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．００５となるように感染させ、１時間インキュベートした。その後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、２．０μｇ／ｍＬ−アセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）含有ＳＦＭ培養培地を５００μＬ／ウェル量加え、２３時間培養した。感染２４時間後に培養上清を回収し、後述のフォーカスアッセイにより、インフルエンザウイルス量を定量した（図１Ａ）。なお、以降の実施例においてインフルエンザウイルスの増殖性を評価する試験では、２．０μｇ／ｍＬ−アセチル化トリプシン含有ＳＦＭ培養培地をインフルエンザウイルスの培養に用いた。
（３）フォーカスアッセイ
１２ウェルプレートにＭＤＣＫ細胞をコンフルエントとなるように５％ＦＢＳを添加したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ培地）で培養し、ＰＢＳで洗浄後、ＳＦＭに１時間馴化させた。ＣＯＳ７細胞及びＳｕｌＣＯＳ１細胞にインフルエンザウイルスを感染させ、感染後２４時間で回収した培養上清を１００−１０００００倍に希釈し、上記１２ウェルプレートにて培養したＭＤＣＫ細胞に５００μＬ／ウェル量加え１時間インキュベートすることで、インフルエンザウイルスを感染させた。本試験は三重測定にて行った。感染後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、１．２ｗ／ｖ％−セオラス（旭化成ケミカルズ，ＲＣ５９１）及び２．０μｇ／ｍＬ−アセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）含有ＳＦＭを２．０ｍＬ／ウェルとなるように加え、３０時間培養した。培養後、ウェルを４℃に冷やしたＰＢＳで３回洗浄後、−２０℃に冷やした１００％メタノール（Ｗａｋｏ社製）を加え、細胞を固定化した。固定化細胞は一次抗体：Ａｎｔｉ−ＮＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ（マウスハイブリドーマ（４Ｅ６）細胞培養上清（J Virol. 2008; 82: 5940-50にて使用実績あり））及び二次抗体：ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ社製）にて反応させ、ＤＥＰＤＡ反応液（１．２ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩（富士フイルム和光純薬株式会社製）、０．００３％ 過酸化水素、２ｍＭ ４−クロロ−１−ナフトール（富士フイルム和光純薬株式会社製）を含む１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０））を用いＨＲＰと反応させ、染色されたフォーカス数をカウントした。フォーカスアッセイは独立した三重測定で行った。グラフの値は三重測定の結果を平均値±標準誤差で示した。
１２ウェルプレートにＭＤＣＫ細胞をコンフルエントとなるように５％ＦＢＳを添加したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ培地）で培養し、ＰＢＳで洗浄後、ＳＦＭに１時間馴化させた。ＣＯＳ７細胞及びＳｕｌＣＯＳ１細胞にインフルエンザウイルスを感染させ、感染後２４時間で回収した培養上清を１００−１０００００倍に希釈し、上記１２ウェルプレートにて培養したＭＤＣＫ細胞に５００μＬ／ウェル量加え１時間インキュベートすることで、インフルエンザウイルスを感染させた。本試験は三重測定にて行った。感染後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、１．２ｗ／ｖ％−セオラス（旭化成ケミカルズ，ＲＣ５９１）及び２．０μｇ／ｍＬ−アセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）含有ＳＦＭを２．０ｍＬ／ウェルとなるように加え、３０時間培養した。培養後、ウェルを４℃に冷やしたＰＢＳで３回洗浄後、−２０℃に冷やした１００％メタノール（Ｗａｋｏ社製）を加え、細胞を固定化した。固定化細胞は一次抗体：Ａｎｔｉ−ＮＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ（マウスハイブリドーマ（４Ｅ６）細胞培養上清（J Virol. 2008; 82: 5940-50にて使用実績あり））及び二次抗体：ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ社製）にて反応させ、ＤＥＰＤＡ反応液（１．２ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩（富士フイルム和光純薬株式会社製）、０．００３％ 過酸化水素、２ｍＭ ４−クロロ−１−ナフトール（富士フイルム和光純薬株式会社製）を含む１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０））を用いＨＲＰと反応させ、染色されたフォーカス数をカウントした。フォーカスアッセイは独立した三重測定で行った。グラフの値は三重測定の結果を平均値±標準誤差で示した。
（４）ウエスタンブロットによるＢｉｍの検出
ウエスタンブロットによる解析は既報の方法（Biosci Biotechnol Biochem. 2018;82:1568-75）を一部改変し実施した。ＣＯＳ７細胞とＳｕｌＣＯＳ１細胞を１２ウェルプレートでコンフルエントとなるように培養し、ＳＦＭ培地で馴化後、インフルエンザウイルス(Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ)をＭＯＩ＝３．０で感染させた。感染前の細胞（０時間）と、感染後３時間、５時間、７時間、９時間、１２時間後にｃＯｍｐｌｅｔｅ（登録商標） Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）とＰｈｏｓＳＴＯＰ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を製造業者のプロトコルに従い添加したＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ社製）を２００μＬ／ウェル加えた。その後、スクレーパーを用い細胞溶解液を回収し、３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。細胞溶解液は最終タンパク質濃度が１．０ｍｇ／ｍＬ、還元剤としてＤＬ−ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ社製）の最終濃度が５０ｍＭとなるようにＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を添加し、１００℃で５分間処理した。各サンプル５μｇのタンパク質量となるように４―１５％ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）にアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、泳動により分離されたタンパク質をｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（メンブレン）に１００Ｖで１時間転写し、ＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で３時間振盪反応させた。その後メンブレンは１：１０００倍にＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で希釈した一次抗体と４℃で１６時間反応させた。次いで、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ-ｌｉｎｋｅｄ抗体（＃７０７４）またはａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ-ｌｉｎｋｅｄ抗体（＃７０７６）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を１：２０００倍にＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（ＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で希釈した抗体溶液と１時間反応させた。シグナルの検出にはＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｅｒ（Ｅｚ−ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ，ＡＴＴＯ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により可視化した。Ｂｉｍに対する一次抗体（＃２８１９）はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入した。
ウエスタンブロットによる解析は既報の方法（Biosci Biotechnol Biochem. 2018;82:1568-75）を一部改変し実施した。ＣＯＳ７細胞とＳｕｌＣＯＳ１細胞を１２ウェルプレートでコンフルエントとなるように培養し、ＳＦＭ培地で馴化後、インフルエンザウイルス(Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ)をＭＯＩ＝３．０で感染させた。感染前の細胞（０時間）と、感染後３時間、５時間、７時間、９時間、１２時間後にｃＯｍｐｌｅｔｅ（登録商標） Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）とＰｈｏｓＳＴＯＰ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を製造業者のプロトコルに従い添加したＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ社製）を２００μＬ／ウェル加えた。その後、スクレーパーを用い細胞溶解液を回収し、３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。細胞溶解液は最終タンパク質濃度が１．０ｍｇ／ｍＬ、還元剤としてＤＬ−ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ社製）の最終濃度が５０ｍＭとなるようにＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を添加し、１００℃で５分間処理した。各サンプル５μｇのタンパク質量となるように４―１５％ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）にアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、泳動により分離されたタンパク質をｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（メンブレン）に１００Ｖで１時間転写し、ＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（ＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で３時間振盪反応させた。その後メンブレンは１：１０００倍にＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で希釈した一次抗体と４℃で１６時間反応させた。次いで、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ-ｌｉｎｋｅｄ抗体（＃７０７４）またはａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ-ｌｉｎｋｅｄ抗体（＃７０７６）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を１：２０００倍にＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（ＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で希釈した抗体溶液と１時間反応させた。シグナルの検出にはＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｅｒ（Ｅｚ−ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ，ＡＴＴＯ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により可視化した。Ｂｉｍに対する一次抗体（＃２８１９）はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入した。
（５）可視化したＢｉｍのタンパク質量を数値化したところ、ＣＯＳ７細胞では感染時間依存的な変動は認められなかったが、ＳｕｌＣＯＳ１細胞においてはＢｉｍが感染から９時間以降、分解されていることが明らかとなった（図１Ｂ）。グラフの値はＮ＝４の結果を平均値±標準誤差で示した。統計解析は一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ法による検定を行った。††， ｐ＜０．０１（感染３時間に対し）。
（６）本検討の結果、ＳｕｌＣＯＳ１細胞におけるインフルエンザウイルの増殖性が高いことと、Ｂｉｍが分解されることが関連することが示された。また、Ｂｉｍはアポトーシス誘導因子であり、インフルエンザウイルスの感染に伴いＢｉｍが分解され、アポトーシスが抑制されていることを明らかにした。
実施例２ アポトーシス誘導因子の分解抑制によるインフルエンザウイルス増殖抑制効果
（１）癌研究の領域において、Ｂｉｍの分解制御はその上流でＥｒｋタンパク質の活性変化によって制御されていることが報告されている（Mol Cancer Ther. 2009;8:3173-80）。上記文献によれば、Ｅｒｋがリン酸化することで活性化するとＢｉｍは分解される。そこで、Ｅｒｋの活性化阻害剤であるＵ０１２６（Ｓｉｇｍａ社製）をインフルエンザウイルス感染後のＭＤＣＫ細胞に添加し、Ｂｉｍの分解抑制効果を評価した。１２ウェルにコンフルエントの状態に培養したＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）をＭＯＩ＝３．０で感染させ、感染１時間後から９時間後までＵ０１２６を１０または５０μＭ濃度で添加し、その後、実施例１（４）で示したウエスタンブロット法と同様の手法でＥｒｋの活性化とＢｉｍの分解を解析した。Ｅｒｋ（＃９１０２）及びｐｈоｓｐｈоＥｒｋ（＃９１０１）に対する一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入した。
（１）癌研究の領域において、Ｂｉｍの分解制御はその上流でＥｒｋタンパク質の活性変化によって制御されていることが報告されている（Mol Cancer Ther. 2009;8:3173-80）。上記文献によれば、Ｅｒｋがリン酸化することで活性化するとＢｉｍは分解される。そこで、Ｅｒｋの活性化阻害剤であるＵ０１２６（Ｓｉｇｍａ社製）をインフルエンザウイルス感染後のＭＤＣＫ細胞に添加し、Ｂｉｍの分解抑制効果を評価した。１２ウェルにコンフルエントの状態に培養したＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）をＭＯＩ＝３．０で感染させ、感染１時間後から９時間後までＵ０１２６を１０または５０μＭ濃度で添加し、その後、実施例１（４）で示したウエスタンブロット法と同様の手法でＥｒｋの活性化とＢｉｍの分解を解析した。Ｅｒｋ（＃９１０２）及びｐｈоｓｐｈоＥｒｋ（＃９１０１）に対する一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入した。
（２）可視化したＥｒｋおよびｐｈоｓｐｈоＥｒｋ、Ｂｉｍのタンパク質量を数値化したところ、ウイルス感染に伴いＥｒｋは活性化するのに対し、Ｕ０１２６を添加することでその活性化は抑制された（図２Ａ左）。加えて、ウイルス感染に伴いＢｉｍは減少したが、Ｕ０１２６を添加することでその分解は抑制された（図２Ａ右）。グラフの値はＮ＝４の結果を平均値±標準誤差で示した。統計解析は一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ法による検定を行った。***， ｐ＜０．００１（感染（−）に対し）、†††， ｐ＜０．００１（対照に対し）。図２Ａ右に記載の有意水準は感染（−）に対する値を示している。
（３）次に、Ｕ０１２６を添加した条件におけるインフルエンザウイルスの増殖性を評価した。２４ウェルプレートにコンフルエントとなるように培養したＭＤＣＫ細胞をＳＦＭに１時間馴化後、インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）をＭＯＩ＝０．０１で感染させた。感染１時間後にＳＦＭで細胞を洗浄し、その後、２．０μｇ／ｍＬ−アセチル化トリプシン含有ＳＦＭ培養培地またはＵ０１２６を１０または５０ μＭ濃度で添加し２３時間培養した。感染２４時間後に後述のＨＡアッセイにより培養上清中に存在するウイルス量を測定した。
（４）ＨＡアッセイ
Ｕ底９６ウェルプレートを用い、インフルエンザウイルス培養上清５０μＬを２−１０２４倍まで２倍ずつ、希釈系列を作製した。そこへ、０．７％モルモット赤血球含有ＰＢＳ ５０μＬを加え、４℃で２時間静置した。その後、赤血球の凝集を確認し、凝集が認められない希釈濃度をＨＡ価とした。
Ｕ底９６ウェルプレートを用い、インフルエンザウイルス培養上清５０μＬを２−１０２４倍まで２倍ずつ、希釈系列を作製した。そこへ、０．７％モルモット赤血球含有ＰＢＳ ５０μＬを加え、４℃で２時間静置した。その後、赤血球の凝集を確認し、凝集が認められない希釈濃度をＨＡ価とした。
（５）本検討の結果、Ｕ０１２６を添加することでインフルエンザウイルスの増殖性は著しく低下することが示された。よって、Ｂｉｍの分解を抑制することでインフルエンザウイルスの増殖性は抑制されることが示唆された。
（６）実施例１の結果と本検討結果は、Ｂｉｍの存在の有無や変化を調べることが培養細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖性を評価する指標に成り得ることを示している。
実施例３ インフルエンザウイルス感染によるアポトーシス抑制系活性化効果の評価
（１）実施例１の方法と同様の手法を用い、ＭＤＣＫ細胞とＳｕｌＣＯＳ１細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖性を比較解析したところ、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍおよびＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスの増殖性は両細胞間に差は認められなかった（図３Ａ）。グラフの値は三重測定の結果を平均値±標準誤差で示した。本結果から、ＭＤＣＫ細胞はＳｕｌＣＯＳ１細胞と同等のウイルス増殖能を有していると言える。
（１）実施例１の方法と同様の手法を用い、ＭＤＣＫ細胞とＳｕｌＣＯＳ１細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖性を比較解析したところ、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍおよびＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスの増殖性は両細胞間に差は認められなかった（図３Ａ）。グラフの値は三重測定の結果を平均値±標準誤差で示した。本結果から、ＭＤＣＫ細胞はＳｕｌＣＯＳ１細胞と同等のウイルス増殖能を有していると言える。
（２）上述のウイルス増殖能が同等の２種の細胞を用い、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質に属するアポトーシス関連因子のタンパク質量を解析した。ＢＣＬ−ＸＬおよびＢＣＬ−ＸＳ（＃６３３９０１）、Ｂｃｌ−２（＃６５８７０１）、に対する一次抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社より入手した。βＡｃｔｉｎ（＃４９６７）に対する一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより入手した。１２ウェルプレートでコンフルエントの状態に培養したＭＤＣＫ細胞とＳｕｌＣＯＳ１細胞にインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）をＭＯＩ＝３．０で感染させ、感染９時間後の細胞を回収し、その後、実施例１（４）で示したウエスタンブロット法と同様の手法で各タンパク質を可視化した。
（３）本検討の結果、インフルエンザウイルス感染に伴いアポトーシス抑制に関与するＢＣＬ−ＸＬおよびＢｃｌ−２のタンパク質量が明らかに増加し、アポトーシス誘導に関与するＢＣＬ−ＸＳ量は減少した。このことは、ウイルス増殖能が高いＭＤＣＫ細胞とＳｕｌＣＯＳ１細胞で、インフルエンザウイルスの感染に伴いアポトーシスが抑制されていることを示している。
（４）以上より、細胞培養によってインフルエンザウイルスを効率的に増殖させる目的でアポトーシス誘導因子の活性を抑制する、またはアポトーシス抑制因子の活性化を誘導することが有用であることが明らかとなった。また、このことは、アポトーシス制御能を指標としてインフルエンザウイルス増殖促進剤の探索が可能であることを意味する。
実施例４ Ｂａｘ阻害剤（２種類）のインフルエンザウイルス増殖促進効果の検討
（１）実施例１の方法と同様の手法を用い、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖性についてＢａｘ阻害剤を添加した条件にて評価した。Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１（実験株）インフルエンザウイルス株を感染価Ｍｏｉ＝０．００１となるように感染させ、１時間インキュベートした後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、Ｂａｘ阻害剤（Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ （Ｖ５）（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）及び（Ｐ５）（Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（配列番号２）；ＴＯＣＲＩＳ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））を１．０ μＭ濃度で添加し、２３時間培養した。感染後２４時間に培養上清を回収し、ＨＡアッセイにより、インフルエンザウイルスのＨＡ価を測定した（図４）。
（１）実施例１の方法と同様の手法を用い、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖性についてＢａｘ阻害剤を添加した条件にて評価した。Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１（実験株）インフルエンザウイルス株を感染価Ｍｏｉ＝０．００１となるように感染させ、１時間インキュベートした後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、Ｂａｘ阻害剤（Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ （Ｖ５）（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）及び（Ｐ５）（Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（配列番号２）；ＴＯＣＲＩＳ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））を１．０ μＭ濃度で添加し、２３時間培養した。感染後２４時間に培養上清を回収し、ＨＡアッセイにより、インフルエンザウイルスのＨＡ価を測定した（図４）。
（２）本検討の結果、アポトーシスの抑制に働くＢａｘ阻害剤の添加はＨ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１（実験株）インフルエンザウイルス株のＨＡ価を増加させることが明らかとなった。
（３）以上より、細胞培養によってインフルエンザウイルスを効率的に増殖させる目的でアポトーシス誘導因子の活性を抑制することが有用であることが明らかとなった。また、このことは、アポトーシス制御能を指標としてインフルエンザウイルス増殖促進剤の探索が可能であることを意味する。
Claims (7)
- 細胞培養によってインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、前記細胞のアポトーシスを抑制する工程を含む、方法。
- アポトーシスの抑制が、前記細胞のアポトーシス誘導因子の発現又は活性を抑制するか、又はアポトーシス抑制因子の発現又は活性を促進することにより行われる、請求項１記載の方法。
- アポトーシス抑制因子がＢｃｌ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、ＣＥＤ−９、Ａ１、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−６から選ばれる１種以上のＢｃｌ−２ファミリータンパク質であり、アポトーシス誘導因子がＢａｘ、Ｂｉｍ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、ＢＣＬ−ＸＳ、Ｂｉｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｅｇｌ−１、Ｂｃｌ−Ｘβ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｏｋ−Ｌ及びＢｏｋ−Ｓから選ばれる１種以上のＢｃｌ−２ファミリータンパク質である、請求項２記載の方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の方法によってインフルエンザウイルスを増殖させ、細胞からウイルス粒子を回収する、インフルエンザウイルス粒子の調製方法。
- 前記ウイルス粒子が、インフルエンザワクチン調製に用いられるものである、請求項４記載の方法。
- 以下の（１）〜（３）の工程を含む、インフルエンザウイルス増殖促進剤の評価又は選択方法。
（１）培養細胞に被験物質を接触させる工程、
（２）当該細胞におけるアポトーシス誘導因子若しくはアポトーシス抑制因子の発現レベル又は活性レベルを測定する工程、
（３）（２）で測定された結果に基づいて、アポトーシス誘導因子の発現レベル若しくは活性レベルを低下又は減少させるか、又はアポトーシス抑制因子の発現レベル若しくは活性レベルを増強又は増加させる被験物質をインフルエンザウイルス増殖促進剤として評価する工程。 - アポトーシス抑制因子がＢｃｌ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、ＣＥＤ−９、Ａ１、Ｂｆｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ及びＢｃｌ−６から選ばれる１種以上のＢｃｌ−２ファミリータンパク質であり、アポトーシス誘導因子がＢａｘ、Ｂｉｍ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、ＢＣＬ−ＸＳ、Ｂｉｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｅｇｌ−１、Ｂｃｌ−Ｘβ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｏｋ−Ｌ及びＢｏｋ−Ｓから選ばれる１種以上のＢｃｌ−２ファミリータンパク質である、請求項６記載の方法。
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