CN102367495B

CN102367495B - 一种用于检测牙鲆感染β诺达病毒的特异性引物及其检测方法

Info

Publication number: CN102367495B
Application number: CN2011104077367A
Authority: CN
Inventors: 孙金生; 张亦陈; 刘逸尘; 耿绪云; 顾中华; 杜宏薇
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2031-12-09
Also published as: CN102367495A

Abstract

本发明涉及用于检测牙鲆感染β诺达病毒的特异性引物及其检测方法。本发明针对靶基因序列的6个关联区域，设计4条特异性引物，确保检测的特异性和准确性；采用具有逆转录效力的方案，使整个检测可在一只PCR管中完成，只需一次加样，减少人为操作干扰，90分钟可完成检测，且不需昂贵设备；反应结束后加入SYBRGREENI染料即可通过肉眼快速辨识阳性结果，紫外辅助观察可进一步提高检测灵敏度，该方法的检出限与操作繁琐的RT-PCR相当；本发明检测样品可以是病灶组织的粗提液或是由其抽提的RNA，还可以是反转录获得的cDNA，因此非常适合用于现场定性和定量检测，在水产养殖病害防治中有着较高的推广应用价值。

Description

一种用于检测牙鲆感染β诺达病毒的特异性引物及其检测方法

本专利申请由天津师范大学生命科学学院/细胞遗传与分子调控天津市重点实验室完成，得到国家自然科学基金（30901094），天津市科技计划（09JCYBJC15000），天津市教委基金（20080618）以及国家科技支撑计划（2011BAD13B07,2011BAD13B04）的资助。

技术领域

本发明属于应用生物技术领域，涉及利用逆转录和链置换扩增联用的方法检测β诺达病毒对牙鲆的感染。更具体的说：是一种检测β诺达病毒基因的特异性引物及其检测方法。

背景技术

β诺达病毒属于诺达病毒科，其基因组由两条正链RNA构成，可感染40多种养殖鱼类，引发病毒性神经坏死病，又称作空泡性脑视网膜炎，是世界范围内流行的鱼类疾病，受感染的鱼苗死亡率接近100%。提早发现、快速诊断对于该病的防控至关重要。目前，对于诺达病毒基因复制和蛋白成熟过程，科学家们已经有了较多的了解，但快速诊断技术尚不完备，常用的诊断方法例如：行为体色观察、组织病理检查、RT-PCR法检测病毒衣壳蛋白基因、原位杂交法检测病毒核酸在组织中的分布、免疫学方法等。

链置换型聚合酶可以在合成新链的同时置换出原链，从而为下一轮扩增制备模板，因此扩增不需变性步骤，可以在等温条件下进行，基于该原理的环介导等温扩增技术（即LAMP技术）已显示出较好的应用前景，近年来广泛应用于微生物检测，它与常规的基因诊断技术相比有明显的优势，该技术尤其在现场操作、检测时间、对设备的要求、结果判断方面有更大的优势。

中国专利(申请号: 200610011855.X) 公开了一种环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测HCV和H5N1等RNA病毒基因的方法，它是对包括RNA病毒在各种生物制品、献血员、病人血液标本等的监测，每种病毒设计出六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配，省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成在等温环境中的循环置换扩增反应，最后用电泳或肉眼来检测结果。经检索本发明利用特殊设计的引物，并且采用逆转录和链置换扩增联用的方法检测β诺达病毒对牙鲆的感染，尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于利用逆转录和链置换扩增联用的方法检测β诺达病毒对牙鲆的感染，以此来提供一个在养殖现场能够快速准确检测β诺达病毒的手段，以便于高效检测样品是否受到β诺达病毒感染；与常规技术相比，本发明不需要分别在不同反应体系中进行核酸反转录和PCR扩增等过程，而是将反转录和扩增以及染色检验等各个过程置于同一个体系内完成，而且反应过程中不需额外补液以及更换反应管等操作，能较好地避免人为因素干扰，此外，本方法只需要简单的水浴锅即可完成实验，既大大缩短了反应的时间，又不需使用昂贵的PCR仪，省钱省力。

本发明主要用于水产生物病害诊断、防治，不但具有高效、快速、准确及操作简便等特点，而且对检测样品的形式具有广泛的适应性，检测样本可以是病灶组织的粗提液，或是由其抽提的RNA，还可以是由抽提的RNA反转录获得的cDNA。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种用于检测β诺达病毒基因的特异性引物，其特征在于包括：2条外侧引物：N2L2fw，CGTCCGCTGTCCATTGAC；N2L2rw，GGGGCTGCTCATCAGAGT；

2条内侧引物：N2L2fn，GCAGGTGTGCCAGCATTTCCTTTTTACAGCCTTGGAACTGGAGA；N2L2rn，CTGGTTTCGCTGGGGCATCTTTTTGTAGGCAACGCCATCTGTG。

本发明所述的特异性引物快速检测β诺达病毒基因的方法，其特征在于按如下步骤：

（1）使用上述的2条外侧引物和2条内侧引物序列，采用逆转录和链置换扩增联用的方案，在反应体系中加入供试模板进行90分钟扩增反应；扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：预混引物5μL，dNTP 4μL，1×Thermopol Roaction Buffer 2.5μL，Bst DNA聚合酶 1μL，M-Mlv反转录酶 1μL，模板5μL，DEPC水 6.5 μL；混匀后按照42℃，10min；65℃，45min；80℃，10min程序进行孵育，4℃保存；其中的预混引物体积比为：N2L2fn：N2L2fw：N2L2rn：N2L2rw=4:1:4:1（浓度为10μM）；

（2）利用荧光染料SYBR GREEN I呈现反应结果，在可见光下肉眼即可辨识，或利用紫外观察箱辅助观察；其中所述的感染β诺达病毒的模板为：感染β诺达病毒的牙鲆幼鱼的脑组织粗提液、从病鱼脑组织抽提的RNA及由抽提的总RNA反转录获得的cDNA三种样本。

本发明所述的检测方法中引物的贮存浓度为100μM，工作浓度为10μM。

本发明公开的检测β诺达病毒基因的特异性引物及其检测方法的重点在于：

1.本发明建立了一种便捷高效的检测方法，可用于对β诺达病毒的高效检测。首先，该方法针对靶基因的6个相关区域，设计4条特异性引物，在保证扩增准确性的前提下，大大提高了检测灵敏度；其次，该方法利用链置换型聚合酶进行扩增反应，因此无需常规PCR的变性等步骤，也不需PCR仪等精密仪器及昂贵设备；第三，本发明对检测样品的形式具有广泛的适应性，模板可以是病灶组织的粗提液，或是由其抽提的RNA，还可以是由抽提的RNA反转录获得的cDNA等三种形式；第四，本发明利用核酸染料呈现反应结果，在可见光下肉眼即可辨识，如果利用紫外观察箱辅助，可进一步提高检测灵敏度。

2.根据β诺达病毒基因组序列设计4条引物，包括2条外侧引物(N2L2fw和N2L2rw)以及2条内引物(N2L2fn和N2L2rn)，序列见表1；

表1：β诺达病毒检测引物序列

引物名称	序列Sequence( 5’--- 3’)
		N2L2fw	CGTCCGCTGTCCATTGAC（NO1）
N2L2rw	GGGGCTGCTCATCAGAGT（NO2）
		N2L2fn	GCAGGTGTGCCAGCATTTCCTTTTTACAGCCTTGGAACTGGAGA（NO3）
N2L2rn	CTGGTTTCGCTGGGGCATCTTTTTGTAG GCAACGCCATCTGTG（NO4）

为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明：

1、原理

链置换型DNA聚合酶可以在合成新链的同时置换出原链，从而为下一轮扩增制备模板，因此扩增不需变性等步骤，可以在等温条件下进行，基于该原理的环介导等温扩增（即LAMP）是一种新型的核酸扩增技术，在恒温65℃左右（酶的最适温度）反应大约l个小时，产物是大小不一的片段，该技术对模板扩增效果比较明显，与常规PCR技术相比有更高的灵敏性和特异性，实验所用的反应仪器也比较简单，只需要一个恒温水浴锅即可，操作简单快捷、省时省力，在实际应用上有更高的可操作性。逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）则是将逆转录和等温扩增两步操作偶联，从而可实现对RNA样品的检测。

2、引物设计

根据β诺达病毒RNA2基因序列，运用在线软件(https://prmierexplorer.jp/lamp30.0/index.htmL)设计1套引物: 2条外侧引物(N2L2fw和N2L2rw)以及2条内侧引物(N2L2fn和N2L2rn)，由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表1。

3、材料与方法：

（1）试剂：Bst DNA聚合酶、1×Thermopol Roaction BufferdNTP、PCR专用水Mlv反转录酶、SYBR GREEN I染料

（2）扩增反应体系及扩增程序：预混引物（N2L2fn：N2L2fw：N2L2rn：N2L2rw=4:1:4:1）5μL，dNTP 4μL，1×Thermopol Roaction Buffer 2.5μL，Bst DNA聚合酶 1μL，M-Mlv反转录酶 1μL，模板5μL（制备方法见实施例1），DEPC水 6.5 μL；混匀后42℃，10min；65℃，45min；80℃，10min。

（3）采用荧光染料SYBR GREEN I呈现反应结果，直接通过肉眼或借助紫外观察箱观察，绿色荧光为阳性，橙色荧光为阴性（见图1）。

本发明采用特异性引物检测β诺达病毒的快速鉴定方法与常规技术相比，具有以下优点：

（1）本发明是针对靶基因的6个不同的区域，设计4条特异性引物，进行类似巢式的扩增反应，既有较高的灵敏度又能提高结果的准确性。反应结束后只需加入SYBR GREEN I染料即可通过肉眼快速辨识阳性结果；该方法的检出限与操作繁琐的RT-PCR相当，利用紫外观察箱辅助检测时，可进一步提高灵敏度（见图2、图3）。

（2）本发明利用了M-Mlv反转录酶反应条件宽泛的特点，将反转录和扩增以及染色检测多步操作整合在同一体系中，只需一次加样，反应期间不需更换反应管和补液，从而进一步减少人为操作干扰，并缩短检测时间，全部检测仅需约90分钟，

（3）由于使用了链置换型DNA聚合酶，因此扩增反应无需变性环节，可在恒温条件下进行，无需昂贵设备，而且具有操作简便，灵敏度好，

（4）本发明建立的方法对样品适应范围广，不但可检测纯化的核酸，还能直接检测病灶组织的粗提液，非常适用于现场定性和定量分析，在水产养殖病害防治方面有着重大的推广应用价值。

附图说明：

图1为紫外光条件下观察结果，绿色荧光为阳性，无绿色荧光为阴性；

图2为可见光条件下观察结果，绿色荧光为阳性，无绿色荧光为阴性；

图3为紫外条件下观察的阳性结果；

图4为感染β诺达病毒的牙鲆幼鱼脑RNA样品的检测结果，其中左为阳性，右为阴性；

图5为感染β诺达病毒的牙鲆幼鱼脑组织粗提液的检测结果；其中左为阳性，右为阴性。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。

特别加以说明的是，本发明使用的试剂材料：本发明引物合成由生工生物工程（上海）有限公司合成，见序列表或表1；Bst DNA聚合酶与1×Thermopol Reaction Buffer 购自NEB公司；dNTP与PCR专用水购自TAKARA(大连)公司；M-Mlv反转录酶购自Promega（北京）生物技术有限公司；SYBR GREEN I染料购自上海索莱宝生物科技有限公司；牙鲆幼鱼由天津海发珍品养殖中心提供。

实施例1：

感染β诺达病毒的牙鲆幼鱼脑RNA样品的检测

（1）引物合成：由生工生物工程（上海）有限公司合成。

（2）感染β诺达病毒幼鱼脑RNA样品制备：

①将10条牙鲆幼鱼置于预冷的解剖盘上，用经180℃烘烤8个小时的剪刀和镊子解剖，迅速将约0.1g脑组织转移至无RNase的1.5mL离心管中并加入1mL Trizol，在冰浴中充分匀浆，室温静置5min。4℃离心（12000rpm， 10min）；

②取上述①中上清到1.5mL干净的离心管中，加入0.5mL氯仿振荡15s，静置2min；

③将上述②4℃，12000rpm离心 15min后取无色上清；

④向上述③中加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀管中液体，室温静置15min，以沉淀RNA。

⑤将上述④离心 10min（4℃，12000rpm），弃上清；

⑥向上述⑤中加入1mL 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀，然后离心 6min（4℃，7500rpm），弃上清；

Figure 2011104077367100002DEST_PATH_IMAGE001

将上述⑥晾干，加入适量的DEPC水溶解（65℃促溶10-15min）。

（3）检测反应：

反应体系如下（25μL）：预混引物（N2L2fn：N2L2fw：N2L2rn：N2L2rw=4:1:4:1）5μL，dNTP 4μL，1×Thermopol Reaction Buffer 2.5μL，Bst DNA聚合酶 1μL，M-Mlv反转录酶 1μL，模板 5μL，DEPC水 6.5μL；

将上述体系混匀后42℃，10min；65℃，45min；80℃，10min，结束后加SYBR GREEN I染液2μL，观察结果。

（4）结果观察及判定；

将反应管置于黑色背景上，在可见光下或紫外观察箱中检视各反应管的颜色，呈现绿色荧光的为阳性结果（见图4），即检测样品中含有β诺达病毒的酸序列。

实施例2：

感染β诺达病毒的牙鲆幼鱼脑组织粗提液的检测

基本操作与实施例1的相同，只是检测样本为牙鲆幼鱼脑组织粗提液，具体为将牙鲆幼鱼置于预冷的解剖盘上，用经180℃烘烤8个小时的剪刀和镊子解剖，称取其脑部组织约1g，加1mL DEPC水匀浆。将匀浆液离心（4000rpm，1min），吸取上清至新的1.5mL离心管中，然后取此上清5μL 作为模板。反应后加2μL SYBR GREEN I染料，观察结果。结果判定绿色荧光为阳性（见图5），即检测样品中含有β诺达病毒核酸序列。

实施例3 应用实施例

常规方法的检测:

①从感染β诺达病毒的动物脑组织中提取RNA；

②以①所得RNA为模板进行反转录制备cDNA；

③设计特异性引物，以②制备的cDNA为模板进行PCR反应；

④核酸电泳观察条带大小，并进行胶回收；

⑤ 将回收片段连接到测序载体上（一般为PMD18-T载体）；

⑥转化；

⑦挑单克隆送测序；

⑧将测序结果与已发布的β诺达病毒基因组进行同源比对判定。

本发明实际检测的例子(养殖鱼类):

①解剖并称取1g患病动物脑组织，加1mL DEPC水匀浆；

②将①匀浆液离心（4000rpm，1min），吸取上清至新的1.5mL干净离心管中；

③然后以上述②中所述的上清为模板进行逆转录和等温扩增联合反应（见实施例1）；

④反应后加2μL SYBR GREEN I染料，观察结果；

⑤绿色荧光为阳性。

对比实验优点：进一步减少人为操作干扰,并缩短检测时间，无需昂贵设备辅助，操作简便，灵敏度好。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 一种用于检测牙鲆感染β诺达病毒的特异性引物及其检测方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 基因序列

<400> 1

cgtccgctgt ccattgac 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 基因序列

<400> 2

ggggctgctc atcagagt 18

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 基因序列

<400> 3

gcaggtgtgc cagcatttcc tttttacagc cttggaactg gaga 44

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 基因序列

<400> 4

ctggtttcgc tggggcatct ttttgtaggc aacgccatct gtg 43

Claims

1.一种用于检测牙鲆感染β诺达病毒的特异性引物，其特征在于：

包括2条N2L2fw和N2L2rw外侧引物序列：CGTCCGCTGTCCATTGAC和GGGGCTGCTCATCAGAGT；2条N2L2fn和N2L2rn内侧引物序列：GCAGGTGTGCCAGCATTTCCTTTTTACAGCCTTGGAACTGGAGA和CTGGTTTCGCTGGGGCATCTTTTTGTAGGCAACGCCATCTGTG。