CN104328219B

CN104328219B - 鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用

Info

Publication number: CN104328219B
Application number: CN201410617814.XA
Authority: CN
Inventors: 周勇; 曾令兵; 孙爱义; 解旭东; 范玉顶; 徐进; 马杰
Original assignee: ZHENJIANG SHUIZHONGXIAN FISHERY DEVELOPMENT Co Ltd; Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: ZHENJIANG SHUIZHONGXIAN FISHERY DEVELOPMENT Co Ltd; Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2014-11-04
Filing date: 2014-11-04
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2034-11-04
Also published as: CN104328219A

Abstract

本发明公开了鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒包括无菌双蒸水、10×Taq反应缓冲液、dNTPs、正向引物5′‑TCTCGCTTCCTGTCGTCG‑3′、反向引物5′‑AGTTGGGCGTCAGCTTGG‑3′、荧光探针5′‑ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT‑3′，荧光探针5′端标记FAM，3′端标记ROX，5U/μL Taq DNA聚合酶，标准阳性模板pMCP。该试剂盒定量准确，检测速度快，仅1小时，加上DNA提取的制备，共仅需2‑3小时；方法易行，操作简便；可同时进行高通量的样品检测，准确率高达98％。

Description

鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用

技术领域

本发明属于鲟鱼病害检测技术领域，更具体涉及一种鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，更重要的是能快速地对鲟鱼虹彩病毒进行定量检测。同时还涉及一种鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒的用途。

技术背景

鲟鱼隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)辐鳍亚纲(Actinopterygii)软骨硬鳞总目(Chondrostei)鲟形目(Acipenseriformes)，是现存的古老生物种群，广泛分布于北半球。全世界现有鲟鱼2科6属26种，我国分布有8种，主要分布于长江流域、黑龙江流域和新疆3个区域。随着鲟鱼野生资源的不断减少，为了保护鲟鱼资源，我国水产养殖研究人员和养殖者积极开展鲟鱼的人工繁殖和养殖工作，目前国内已开展的养殖品种有中华鲟(Acipenser sinensis Gray)、施氏鲟(A.schrenckii Brandt)、达氏鲟(A.dabryanusDuneril)等，但是随着鲟鱼养殖业的发展，鲟鱼的疾病也日渐增多，主要是由细菌和寄生虫引起[田甜,杨元金,王京树,张旭.鲟鱼病害研究进展[J].湖北农业科学,2012,51(3):559-562.]。国外对鲟鱼病毒性疾病的研究相对起步较早，已报道有四种可感染鲟鱼并在鱼体内分离到的病毒，他们分别是高首鲟虹彩病毒(white sturgeon iridovirus,WSIV)，高首鲟疱疹病毒-I，II(white sturgeon herpesviruses-I,II,WSHV-I,II)和铲鲟虹彩病毒(Shovenose sturgeon iridovirus，SSIV)[王获,刘红柏,卢彤岩,华育平,孙大江.鲟鱼病毒性疾病研究进展[J].水产学杂志,2008,21(2):84-89.]，其中WSIV引起的鲟鱼病毒性疾病发病率和死亡率最高。随着鲟鱼的人工养殖迅速发展，引种杂交和高密度养殖可能导致国内鲟鱼病毒病的爆发，造成巨大经济损失，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法对其进行监控，保证鲟鱼养殖业的健康发展。近年来，实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)以其特异性高、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，在医学领域、微生物和动植物疾病检疫方面得到了广泛应用。笔者针对鲟鱼危害最严重的高首鲟虹彩病毒病建立了检测高首鲟虹彩病毒的实时荧光定量PCR检测方法，旨在对高首鲟虹彩病毒进行快速定性和定量检测。而传统的PCR法约需7个小时左右才能完成。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪器，更重要的是能快速地对高首鲟虹彩病毒进行定量检测。一次可检测32-384个样品，这样也减少了人力资源的浪费。

本发明的另一个目的是在于提供了一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒在高首鲟虹彩病毒病原检测中的应用，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，而且，荧光定量PCR检测试剂盒对样品的检测仅需2-3个小时就能完成，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括以下组分：

A).阳性模板pMCP

为含有高首鲟虹彩病毒MCP基因519个核苷酸片段(SEQ ID NO.4所示)的pMD19-T载体，即质粒pMCP。该载体可在大肠杆菌E.coli DH5 a中增殖。

B).荧光定量反应液：

10×Taq反应缓冲液、dNTPs、正向引物和反向引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水。

正向引物为5′-TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3′；

反向引物为5′-AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3′；

荧光探针：5′-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-ROX-3′。

优选的，荧光定量反应的体系为：

10×Taq反应缓冲液2μl、2.5mmol/L dNTPs 0.4μl、50μmol/L正向引物和反向引物各0.4μl、25μmol/L的荧光探针0.4μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.4μl、无菌双蒸水14μl，待测样品2μl。

优选的，阳性模板pMCP转化大肠杆菌E.coli DH5 a增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀(所测样品在吸收波长为260nm紫外线照射下的光密度)的定量并稀释至1×10⁷copies/μL，-20℃保存。

在本发明提供高首鲟虹彩病毒快速定量检测高首鲟虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3′端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5′-3′外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET(荧光共振能量转移)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对高首鲟虹彩病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环圈数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒在制备高首鲟虹彩病毒检测试剂盒中的应用，其步骤如下：

A)用标准阳性模板制备阳性标准品，并用紫外分光光度计定量；

B)用DNA裂解液从待测标本中提取DNA；

C)分别取B)步中的DNA和同样量的系列稀释的A)步中的阳性标准品加入到含Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；

D)通过比较待测样品和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。

在本发明中提供的高首鲟虹彩病毒快速定量检测高首鲟虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒可对高首鲟虹彩病毒进行定量检测，并可替代一直沿用的传统的PCR检测方法。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、定量准确；准确性好，标准偏差为0.1，变异系数为0.52％；最低可检测到10个病毒核酸分子拷贝数，特异性好。

2、检测速度快，仅1小时，加上DNA提取的制备，共仅需2-3小时；

3、方法易行，操作简便；

4、可同时进行高通量的样品检测，准确率高达98％。

5.在本发明提供检测高首鲟虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒中，针对高首鲟虹彩病毒检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术(荧光定量PCR技术)和定量检测系统相结合，将其用于高首鲟虹彩病毒定量检测。通过优化方案，反复实验，建立了检测高首鲟虹彩病毒荧光定量PCR方法，并研制出检测高首鲟虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝数，完全可以满足快速鉴别诊断高首鲟虹彩病毒的要求。

附图说明

图1为高首鲟虹彩病毒实时荧光定量PCR检测标准曲线图。

结果：拷贝数(x)与Ct的关系为：Ct＝-3.259lgX+38.137；相关系数(R²)达到0.9933，斜率为-3.259；

图2为施氏鲟脾脏组织细胞出现病变的核酸提取物的扩增曲线图。

结果：为阳性；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

高首鲟虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒组成：

A).阳性模板pMCP

为含有高首鲟虹彩病毒MCP基因519个核苷酸片段(SEQ ID NO.4所示)的pMD19-T载体。

B).荧光定量反应液：

10×Taq反应缓冲液、2.5mmol/L dNTPs、50μmol/L正向引物和反向引物、25μmol/L荧光探针、5U/μL Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水。

正向引物为5′-TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3′；

反向引物为5′-AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3′；

荧光探针：5′-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-ROX-3′。

自备试剂：20％PEG、蛋白酶K(5～10mg/ml)、酚：氯仿(体积比1：1)、3mol/L醋酸钠、70％乙醇、无水乙醇。

用于以下实施例。

实施例2：

高首鲟虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒标准曲线的建立。

A).模板制备:

将含有高首鲟虹彩病毒MCP基因519个核苷酸片段(SEQ ID NO.4所示)连接入pMD19-T载体，阳性质粒pMCP转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测定阳性重组质粒浓度为450μg/mL，A260/A280值为1.88。

并根据以下方法计算重组质粒的DNA拷贝数。

分子拷贝数(copies/μL)＝DNA质量浓度/DNA分子量，其中：DNA质量浓度＝260nm吸光度×稀释倍数×6.02×10²³；DNA分子量＝DNA碱基数×324.5。

B).标准曲线制备

将阳性质粒pMCP进行10倍梯度稀释，以1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10copies/μL作为标准品模板，建立标准曲线。

分别取不同稀释梯度的重组质粒2μL，依次加入10×Taq反应缓冲液2μL、2.5mmol/LdNTPs 0.4μL、50μmol/L正向引物和反向引物各0.4μL、25μmol/L荧光探针引物0.4μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，无菌双蒸水14μl，反应总体系为20μl。将上述反应体系混匀后进行PCR扩增，反应参数：95℃10min；95℃10s，64℃45s，共40个循环每个稀释度设3个重复。

据质粒拷贝数与Ct值的相关性，分析得到标准曲线(图1)。横坐标代表质粒模板拷贝数(x)，纵坐标为Ct值，拷贝数(x)与Ct的关系为：Ct＝-3.259lgX+38.137；相关系数R²＝0.9933。

通过对重组质粒各稀释度核样品进行荧光定量PCR检测。结果显示，本方法对重组质粒进行扩增最低可检测到10个病毒核酸分子拷贝数。对同一阳性样品在同一次试验间获得的Ct值进行分析，以检验检验建立的实时荧光定量PCR法稳定性和重复性，结果表明，同一次试验内72个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本重合，Ct值读数范围为18.82～19.22，标准偏差为0.1，变异系数为0.52％；统计结果表明，本发明所建立的高首鲟虹彩病毒实时荧光定量PCR检测方法重复性好，可进行稳定、可靠的检测。

实施例3：

特异性检测：

以高首鲟虹彩病毒、高首鲟疱疹病毒-I，II、铲鲟虹彩病毒和施氏鲟脾脏组织细胞的基因组总DNA为模板，进行实时荧光定量PCR特异性检测。

结果表明，高首鲟虹彩病毒总DNA模板有典型扩增曲线，荧光信号值高，检测结果为阳性。该样品的对照组高首鲟疱疹病毒-I，II、铲鲟虹彩病毒和施氏鲟脾脏组织细胞的基因组总DNA无特异性扩增信号。

实施例4：

样品：接种高首鲟虹彩病毒(WHITE STURGEON IRIDOVIRUS,WSIV)，出现病变的施氏鲟脾脏组织细胞。

1.高首鲟虹彩病毒荧光定量PCR试剂盒组成与配制，

试剂组成：

a).DNA提取试剂：20％PEG、蛋白酶K(5-10mg/ml)、酚：氯仿(体积比1：1)、3mol/L醋酸钠、70％乙醇、无水乙醇。

b).标准阳性模板pMCP，为含有高首鲟虹彩病毒MCP基因519个核苷酸片段(SEQID NO.4所示)的pMD19-T载体。

c).荧光定量反应液体系：PCR 10×buffer 2μl，正向引物和反向引物各0.4μl(50μmol/L)，荧光探针0.4μl(25μmol/L)，dNTPs 0.4μl(10mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.4μl(5U/μl)，无菌双蒸水14μl。

正向引物为5′-TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3′；

反向引物为5′-AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3′；

荧光探针：5′-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-ROX-3′。

2.用高首鲟虹彩病毒快速定量检测的荧光定量PCR试剂盒检测高首鲟虹彩病毒样品

A)取高首鲟虹彩病毒接种施氏鲟脾脏组织细胞出现病变以后于-80℃至室温条件反复冻融三次，4000r离心30min，取上清转移至35mL超速离心管中，20000r离心2h，用750μl水悬浮病毒沉淀，加入等体积预冷的20％PEG 8000，反复颠倒数次，室温放置30min；室温12000r/min离心5min，弃去上清；加入100μl灭菌水，重悬病毒粒子，加入10μl蛋白酶K(5-10mg/ml)，50℃温浴1h；加入等体积的酚：氯仿(1：1)抽提，室温12000r/min离心5min，取上清至另一离心管；加入加1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃放置20min；4℃12000r/min离心15min，弃上清；加入500μl 70％乙醇，12000r/min离心5min，弃掉上清，并挥发去乙醇，沉淀用20ul灭菌双蒸水溶解备用。.

B)将阳性标准模板(试剂b)系列稀释为1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10copies/μL，建立标准曲线。

C)分别取荧光定量PCR反应液(试剂c)各18μl，取第A)步所得DNA和第B)步稀释的阳性标准模板各2μl，反应总体系为20μl，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变10min；94℃10s，64℃45s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530nm。循环结束后，运用仪器自带软件，对样本进行分析，结果如下：

该样品为阳性(图2实验组)。Ct值为：22.46，根据标准曲线计算出样品中病毒核酸量约为10^4.81copies/μL DNA。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所;镇江水中仙渔业发展有限公司

<120> 鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用

<130> 鲟鱼虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctcgcttcc tgtcgtcg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agttgggcgt cagcttgg 18

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actgtgccaa tgctctcaaa cgaat 25

<210> 4

<211> 519

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accgaagtgt tggactctcg cttcctgtcg tcggtatgta cggtattagc ttttttatga 60

acattcgttt gagagcattg gcacagtgta taaaccgaac agcaaacgtt tctgtttctg 120

acctgagact ctccgtcgag agcgcaaacc ttatctacga tgctatcttc ctcgatatgt 180

ctgaaagaaa gacgtttact tcttacaagc aagaatattt ggttgaattg cttcagtgtt 240

ctgctaacaa ccctgttaca tccgtggcca ccaagctgac gcccaacttt tcacatccgg 300

ttaaatttat gatctggcac attaaaatgg gcaagtataa tactggaaag aaatttttgg 360

gatacgattc taataactgg gaagacatga tcaaaaaagc aactgcgcgt ttttgcctgt 420

ctctggctaa aactatcaat cgcgaaggtg ttcttatgtt ggatcttcca accaacagcg 480

ggtttataca gatcgaccct gctattgtcg catctagac 519

Claims

1.一种高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

正向引物为5′-TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3′、

反向引物为5′-AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3、

和荧光探针：5′-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-ROX-3′。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

A).阳性模板pMCP

为含有SEQ ID NO.4所示核苷酸的pMD19-T载体、

和B).荧光定量反应液：

10×Taq反应缓冲液、dNTPs、正向引物和反向引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、正向引物为5′-TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3′、反向引物为5′-AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3′、和荧光探针：5′-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-ROX-3′。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒用于高首鲟虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR的体系如下：

4.权利要求1～3所述的任何一个试剂盒在制备高首鲟虹彩病毒检测试剂盒中的应用。