CN110819737A - 一种检测猫肠道感染病原体的引物、试剂盒及应用 - Google Patents
一种检测猫肠道感染病原体的引物、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种检测猫肠道感染病原体的引物、试剂盒及应用，其包括猫瘟病毒(Feline Picornavirus，FPV)和猫冠状病毒(Feline Coronavirus，FCoV)共两个引物组，每组都由F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物、LB引物6条引物组成，序列因所针对的病原体而异。检测试剂盒包括FPV和FCoV共两种检测试剂，还有阴性对照和预处理液A和预处理液B：试剂盒的使用方法是蘸取患猫样本，处理后将其放入各检测试剂中在65℃中恒温下进行反应，完成后根据颜色变化判定阴阳性。本发明是基于LAMP技术，特异性扩增病原体基因片段，可在60分钟内完成采样和检测，用最易掌握的操作方式，实现高精度的检测结果。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，特别涉及一种检测猫肠道感染病原体的引物、试剂盒及应用。
背景技术
目前宠物病原体检测主要有胶体金试纸、PCR检验、第三方检测服务三种方式，胶体金试纸是最常用的技术。胶体金试纸技术发展较早，操作最简单，因此目前市场占有率最高，约占病原体检验市场的7成左右，代表公司为行业巨头爱德士、林特医药等。但是由于这一技术精确度低，阳性符合率仅为6成左右，精确度已逐渐不能满足市场需求，且可检验病原体种类并不完善，如最常见的猫肠道感染病原体不能检测等，故其市场份额在逐年紧缩。
PCR检验是近两年开始由人类医疗市场进入宠物医疗市场的，其最大的优势是精确度高，但是其器械成本也十分高，单台仪器设备的价格均在5万以上，操作也十分复杂，普通宠物医生很难进行操作。并且，安装其设备需要自建实验空间，并需保证实验环境的通风性良好，否则易产生假阳性，而大多宠物医院并不具备安装条件。因以上原因，现有PCR检验技术的院内检测的推广并不好，只有少数连锁宠物医院龙头企业的中心医院有配备。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术的不足，提供一种检测猫肠道感染病原体的引物、试剂盒及应用。本发明是基于LAMP技术，特异性扩增病原体基因片段，可在45-60min内完成采样-检测过程，用最易掌握的操作方式，实现高效、高精度的检测结果，从而达到精准检测的目的，并且本发明可以在感染病原体的潜伏期阶段及时检测，增加患病个体治愈率。与现有技术相比，本发明同时具备精确度高、操作便捷、成本低、无操作环境依赖等特点。
本发明的一种检测猫肠道感染病原体的引物，其在于包括FPV引物组和 FCoV引物组两个引物组，每组都由F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF 引物、LB引物6条引物组成，序列因所针对的病原体而异；其中FPV引物组包括外引物对FPV-F3和FPV-B3，内引物对FPV-FIP和FPV-BIP，以及环引物对 FPV-LF和FPV-LB；FCoV引物组包括外引物对FCoV-F3和FCoV-B3，内引物对FCoV-FIP和FCoV-BIP，以及环引物对FCoV-LF和FCoV-LB；详细序列如下所示：
FPV-F3：AATCAAGCAGCAGATGGT
FPV-B3：tggatctgttggtagcaata
FPV-FIP：tcaggtgtttctcctgttgtagtaGATCCAAGATATGCATTTGGTAGA
FPV-BIP：AGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAttatcatttgttacaggaaggtt
FPV-LF：gttttttgaccatgttg
FPV-LB：ATTGGATTCAAAATATTAACTTT
FCoV-F3：ACAGATCTCAATCTAGAGGAAG
FCoV-B3：tttacctgcagttttcttcc
FCoV-FIP：cctaatttttcaagcacggctacaaACAACATTCCAATAACCAAAGC
FCoV-BIP：TCACGTCCTAAATCAAAAGATCGTggtgtgtttgttggcatt
FCoV-LF：ttgtatcctcaacattat
FCoV-LB：ACTCAAAACCTAGGGACA
本发明还提供了一种检测猫肠道感染病原体的试剂盒，其包括上述所述的两个引物组。
本发明所述的一种检测猫肠道感染病原体的试剂盒，其包括猫瘟病毒和猫冠状病毒两种检测试剂，每种试剂分别由两部分组成，第一部分是通用型的RM 部分，此部分三种试剂的成分相同，均由下列组分组成：Bst酶，浓度为37.5uM 的羟基萘酚蓝，浓度为100mM的MgSO4，10xBst buffer，去离子水，浓度为10mM 的dNTP，浓度为5M的甜菜碱；第二部分是特异型的PM部分，三种试剂的PM部分分别由前文所述的各自对应的引物组的水溶液组成。
优选所述的检测猫肠道感染病原体的试剂盒，每支试剂中的RM部分的体积均为17微升，其由以下组分组成：
1微升Bst酶
1微升的浓度为37.5μM的羟基萘酚蓝
2微升浓度为100mM的MgSO4
2.5微升10xBst buffer
3微升去离子水
3.5微升的浓度为10mM的dNTP
4微升的浓度为5M的甜菜碱；
特异型的PM部分中各条引物的水溶液的浓度均为20μM，每支试剂的PM部分的体积均为7微升，具体如下：
猫瘟病毒的检测试剂的PM部分：
浓度为20μM的FPV-F3引物0.5微升，浓度为20μM的FPV-B3引物0.5微升，浓度为20μM的FPV-FIP引物2微升，浓度为20μM的FPV-BIP引物2微升，浓度为20μM的FPV-LF引物1微升，浓度为20μM的FPV-LB引物1微升；
猫冠状病毒的检测试剂的PM部分：
浓度为20μM的FCoV-F3引物0.5微升，浓度为20μM的FCoV-B3引物0.5微升，
浓度为20μM的FCoV-FIP引物2微升，浓度为20μM的FCoV-BIP引物2微升，浓度为20μM的FCoV-LF引物1微升，浓度为20μM的FCoV-LB引物1微升。
本发明所述的检测猫肠道感染病原体的试剂盒，其还包括阴性对照和预处理液A和预处理液B；所述阴性对照每支的体积为25微升，由下列组分组成： 3.5微升的浓度为10mM的dNTP，4微升的浓度为5M的甜菜碱，1微升的浓度为 37.5μM的羟基萘酚蓝,2微升的浓度为100mM的MgSO4,2.5微升10xBst buffer， 12微升去离子水；
所述预处理液A为：有效成分为1％Triton X-100裂解液；
所述预处理液B为稀释液，成分为纯去离子水。
优选所述的检测猫肠道感染病原体的试剂盒由下列组分组成：
猫瘟病毒检测试剂,
猫冠状病毒检测试剂，
阴性对照，
预处理液A，
预处理液B。
本发明还提供了所述的试剂盒在检测猫肠道感染病原体中的应用，其使用方法包含以下步骤：
(1)取一支无菌棉签蘸取患猫样本，方法是取粪便或肛拭子；
(2)将患猫样本浸入预处理液A中，进行裂解，轻轻晃动混匀30秒；
(3)吸出5微升裂解混匀后的液体转移到预处理液B中，进行稀释；
(4)分别吸取1微升稀释后的样本，加入3种检测试剂中，轻轻晃动混匀后，放到恒温设备中，在温度65度下进行反应；
(5)反应结束后，观察试剂颜色变化，与阴性对照对比，判定阴阳性。
本发明的对猫肠道感染病原体的检测用于非诊断目的。
有益效果
本发明是基于LAMP技术，特异性扩增病原体基因片段，对猫肠道感染的两种常见病原体在60min内完成采样-检测过程，用最易掌握的操作方式，实现高效、高精度的检测结果，从而达到精准检测的目的，并且可以在感染病原体的潜伏期阶段及时检测，增加患病个体治愈率。与现有技术相比，本发明同时具备了精确度高、操作便捷、成本低、产品品类齐全、高特异性、高灵敏度且操作简捷、重复性好、结果易判断等特点。并且,由于本发明提供的引物组具有极高的特异性,因此,在LAMP扩增中,无需提取样品的DNA而直接进行扩增,进一步缩短了检测时间,而且简化了操作。可以取代落后的胶体金试纸，成为行业的新标准。
附图说明
图1为本发明检测方法的建立
其中试剂的排列顺序从左至右依次为：FPV阴性，FPV阳性，FCoV阴性， FCoV阳性。
图2为待测样品8的本发明方法的检测结果
其中试剂的排列顺序为：左1为阴性对照，左2-3依次分别为检测FPV， FCoV的试剂。
图3为采用本发明试剂盒检测不同稀释倍率样品的FPV检测结果图
从左至右依次排列为测试原液、稀释10倍样品、稀释100倍样品、稀释 1000倍样品、阴性对照。
图4为采用本发明试剂盒检测不同稀释倍率样品的FCoV检测结果图
样品排列顺序同图3。
图5为采用PCR方法检测不同稀释倍率样品的FPV检测电泳结果图
左边第一列为100bp DNA标志物(全式金)，其它五个泳道从左到右依次为：1—测试原液，2—稀释10倍样品，3—稀释100倍样品，4—稀释1000倍样品，5—阴性对照。
图6为采用PCR方法检测不同稀释倍率样品的FCoV检测电泳结果图
样品的泳道排列顺序同图5。
具体实施方式
下面结合说明书附图介绍本发明的较佳实施例，举例证明本发明可以实施，通过向本领域中的技术人员完整介绍本发明，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，其保护范围并非仅限于文中提到的实施例，本文的附图和说明本质上是举例说明而不是限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的原材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或已公开。
1材料和方法
1.1病原体
本发明的病原体样本如无特殊说明,其它皆来自于宠物医院活体样本。
1.2主要试剂
去离子水购自天根生化科技有限公司；
Bst酶，10xBst buffer，MgSO4，dNTP购自NEB公司；
甜菜碱购自北京天恩泽基因科技有限公司；
羟基萘酚蓝购自成都贝斯特试剂有限公司；
引物均购自苏州泓迅科技有限公司；
离心管购自广州洁特生物过滤股份有限公司。
1.3引物设计
首先，在Genbank数据库中搜索猫瘟病毒(FPV)的VP2基因序列，猫冠状病毒(FCoV)的7b基因序列，并通过ClustalX软件进行序列比对；然后，通过 LAMP引物设计软件(PrimerExplorer software，version5.0)，针对上述特异性保守序列分别进行LAMP引物设计，根据专业经验进行了人工选择和校正，再根据多轮实验测试，在合成的引物组合中筛选出本发明的引物组。
实施例1、检测猫肠道感染病原体的引物的制备
本实施例的一种检测猫肠道感染病原体的引物，其包括FPV引物组和FCoV 引物组两个引物组，每组都由F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物、 LB引物6条引物组成，序列因所针对的病原体而异；其中FPV引物组包括外引物对FPV-F3和FPV-B3,内引物对FPV-FIP和FPV-BIP，以及环引物对FPV-LF和 FPV-LB；FCoV引物组包括外引物对FCoV-F3和FCoV-B3,内引物对FCoV-FIP和 FCoV-BIP，以及环引物对FCoV-LF和FCoV-LB；详细序列如下所示：
FPV-F3：AATCAAGCAGCAGATGGT
FPV-B3：tggatctgttggtagcaata
FPV-FIP：tcaggtgtttctcctgttgtagtaGATCCAAGATATGCATTTGGTAGA
FPV-BIP：AGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAttatcatttgttacaggaaggtt
FPV-LF：gttttttgaccatgttg
FPV-LB：ATTGGATTCAAAATATTAACTTT
FCoV-F3：ACAGATCTCAATCTAGAGGAAG
FCoV-B3：tttacctgcagttttcttcc
FCoV-FIP：cctaatttttcaagcacggctacaaACAACATTCCAATAACCAAAGC
FCoV-BIP：TCACGTCCTAAATCAAAAGATCGTggtgtgtttgttggcatt
FCoV-LF：ttgtatcctcaacattat
FCoV-LB：ACTCAAAACCTAGGGACA
实施例2、利用检测猫肠道感染病原体的试剂盒检测待测样品
一、检测试剂盒的制备
本实施例所述的猫肠道感染病原体检测试剂盒，其包括猫瘟病毒和猫冠状病毒两种检测试剂，每种试剂分别由两部分组成，第一部分是通用的RM部分，此部分两种试剂的成分相同，均由以下原料组成：
1微升Bst酶
1微升羟基萘酚蓝(37.5μM)
2微升MgSO4(100mM)
2.5微升10xBst buffer
3微升去离子水
3.5微升dNTP(10mM)
4微升甜菜碱(5M)；共计17微升。
第二部分是特异型的PM部分，为各条引物的水溶液，水溶液的浓度均为 20μM,每支试剂中PM部分的体积均为7微升，具体含量如下：
猫瘟病毒的检测试剂的PM部分：
0.5微升FPV-F3引物(20μM)，0.5微升FPV-B3引物(20μM)，
2微升FPV-FIP引物(20μM)，2微升FPV-BIP引物(20μM)，
1微升FPV-LF引物(20μM)，1微升FPV-LB引物(20μM)；
猫冠状病毒的检测试剂的PM部分：
0.5微升FCoV-F3引物(20μM)，0.5微升FCoV-B3引物(20μM)，
2微升FCoV-FIP引物(20μM)，2微升FCoV-BIP引物(20μM)，
1微升FCoV-LF引物(20μM)，1微升FCoV-LB引物(20μM)。
本实施例所述的试剂盒还包括阴性对照和预处理液A和预处理液B。所述阴性对照每支的体积为25微升，由下列组分组成：3.5微升dNTP(10mM)，4微升甜菜碱(5M)，1微升羟基萘酚蓝(37.5μM),2微升MgSO4(100mM),2.5微升 10xBst buffer，12微升去离子水；
本实施例所述预处理液A为：有效成分为1％Triton X-100裂解液，用于裂解组织细胞，释放病原体；
所述预处理液B为稀释液，成分为纯去离子水。
本实施例所述试剂盒包括下列组分：
猫瘟病毒检测试剂，
猫冠状病毒检测试剂，
阴性对照，
预处理液A，
预处理液B，
本实施例所述的试剂盒的制备方法，其包含以下内容：
(一)两种检测试剂的制备：
(1)先制备通用的RM部分，此部分两种试剂的制备方法和原料均相同，制备步骤如下：
取0.5ml离心管，用微量移液器依次加入以下试剂：
2.5微升10xBst buffer
3微升去离子水
4微升甜菜碱
3.5微升dNTP(10mM)
2微升MgSO4(100mM)
1微升羟基萘酚蓝(37.5μM)
1微升Bst酶
共17微升，轻轻混匀即得RM部分。
(2)再制备两种检测试剂的PM部分：
猫瘟病毒的检测试剂的PM部分：
0.5微升FPV-F3引物(20μM)，0.5微升FPV-B3引物(20μM)，
2微升FPV-FIP引物(20μM)，2微升FPV-BIP引物(20μM)，
1微升FPV-LF引物(20μM)，1微升FPV-LB引物(20μM)；
猫冠状病毒的检测试剂的PM部分：
0.5微升FCoV-F3引物(20μM)，0.5微升FCoV-B3引物(20μM)，
2微升FCoV-FIP引物(20μM)，2微升FCoV-BIP引物(20μM)，
1微升FCoV-LF引物(20μM)，1微升FCoV-LB引物(20μM)。
(3)将两种试剂的PM部分分别加入到步骤(1)制得的RM部分，然后混匀即可。即将猫瘟病毒的检测试剂的PM部分加入到17微升的通用RM部分得到猫瘟病毒的检测试剂；将猫冠状病毒的检测试剂的PM部分加入17微升的通用 RM部分得到猫冠状病毒的检测试剂。
(二)阴性对照液的制备：
将3.5微升dNTP(10mM)，4微升甜菜碱(5M)，1微升羟基萘酚蓝(37.5μM), 2微升MgSO4(100mM),2.5微升10xBst buffer，12微升去离子水依次加入后混匀即得。
将本实施例的试剂盒用于检测猫肠道感染的病原体，检测方法包含以下步骤：
(1)取一支无菌棉签，蘸取患猫样本，方法是先取患猫的粪便或肛拭子；
(2)将患猫样本浸入预处理液A中，进行裂解，轻轻晃动混匀30秒；
(3)吸出5微升裂解混匀后的液体转移到预处理液B中，进行稀释；
(4)分别吸取1微升稀释后的样本，加入2种检测试剂中，盖紧装试剂的离心管的管盖，轻轻晃动混匀后，将其放到恒温设备中，在温度65度下进行反应，反应时间45-60分钟。
(5)反应结束后，分别观察两种检测试剂颜色变化，与阴性对照对比，判定阴阳性。若呈现蓝绿色则为阳性，若与阴性对照类似，呈现蓝紫色为阴性。
针对两种不同病原体，本实施例的检测方法最终的显示结果见图1。
实施例3、准确性实验
肠道感染的患猫可以同时携带猫瘟病毒和猫冠状病毒，也可以是携带其中的任意一种。取一健康猫做为待测样品1，然后根据患猫带有的已确定的病原体的不同情况设置待测样品2-4，详见表1：
表1
注：“-”代表“无”，“+”代表“有”。
将每组待测样品分别采用实施例2的检测方法进行检测，检测完成后观察检测结果,如图2为待测样品4的检测结果显示,图2中试剂的排列顺序为：左 1为阴性对照，左2-3依次分别为检测FPV，FCoV的试剂。由图2可以看出,左 1的阴性对照显示蓝紫色,左2-3的检测FPV，FCoV的试剂均为蓝绿色,所以待测样品4的本实施例FPV和FCoV的检测结果均为阳性,将结果与表1提供信息相比较,检测结果是正确的。
将各待测样品的检测结果进行汇总，结果见下表2：
表2
| 阴性对照 | FPV检测试剂 | FCoV检测试剂 | |
| 待测样品1 | 蓝紫色 | 蓝紫色 | 蓝紫色 |
| 待测样品2 | 蓝紫色 | 蓝绿色 | 蓝紫色 |
| 待测样品3 | 蓝紫色 | 蓝紫色 | 蓝绿色 |
| 待测样品4 | 蓝紫色 | 蓝绿色 | 蓝绿色 |
将表2的检测结果与表1的相对应内容比较可以得知，用本发明的试剂盒检测各待测样品的检测结果都是正确的。说明本发明提供的引物和试剂盒能够准确的分辨其相对应的病毒,检测结果准确性好。将每组代测样品分别进行10次重复检测，每组的各次检测结果均相同，准确性和重复性都很好。
检测应用：
在合作的宠物医院完成25例猫肠道感染病原体患猫的测试，其中20例FPV+，FCoV-；2例FPV-，FCoV-；3例FPV-，FCoV+，经验证，检测结果均正确。
实施例4、特异性测试
参照本发明实施例2的检测方法，将待测样本分别换为猫上呼吸道感染样本(为医院活体样本)进行检测，每组设3次重复，检测结果显示：均显示蓝紫色，未见任何阳性反应。说明本发明检测引物和检测方法具有良好的特异性。
实施例5、灵敏度测试
采集一个患猫样本，为FPV和FCoV阳性，分别使用本发明的方法与PCR加电泳跑胶检测对比。实验过程如下：
一.制备测试原液
(1)取该患猫样本200微升，使用北京全式金公司EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒,按照其说明书操作，提取获得样本的核酸提取物(包括DNA和 RNA)。
(http://www.transgen.com.cn/attached/down/ER201-01_2017050515.pdf)；
(2)取10微升样本核酸提取物，进行逆转录后得到样本核酸逆转录产物，即为测试原液。逆转录采用Thermo Fisher Scientific公司的逆转录试剂盒, 操作步骤按其操作说明书进行。参考网址为：
(https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/pcr/reverse-transcription/rt-pcr.html)。
将测试原液分别梯度稀释10，100，1000倍后进行相关测试。
二.将上述步骤一制备好的测试原液和梯度稀释后的各液体分别采用本发明的试剂盒进行检测，每个样品测试时的步骤均是：将各待测样品直接分别加入到试剂盒中的2种检测试剂中，各待测样品加入到每种试剂的量均为1微升，盖紧装试剂的离心管的管盖，轻轻晃动混匀后，将其放到恒温设备中，在温度65 度下进行反应，反应时间60分钟。反应结束后，分别观察2种检测试剂颜色变化，与阴性对照对比，判定阴阳性。各样品的检测结果汇总见下表3：
表3
| 样品原液 | 稀释10倍 | 稀释100倍 | 稀释1000倍 | 阴性对照 | |
| FPV检测试剂 | 蓝绿色 | 蓝绿色 | 蓝绿色 | 蓝紫色 | 蓝紫色 |
| FCoV检测试剂 | 蓝绿色 | 蓝绿色 | 蓝绿色 | 蓝紫色 | 蓝紫色 |
由表3可以看出，本发明的检测方法中，2种试剂的最低检测浓度都是稀释100倍。
图3为采用本发明方法检测不同稀释倍率样品的FPV检测结果图。从左至右依次排列为测试原液、稀释10倍样品、稀释100倍样品、稀释1000倍样品、阴性对照。FCoV检测结果见图4。
三.将测试原液和梯度稀释后的各液体分别进行PCR检测，使用天根生化公司的taq-PCR试剂盒，按其操作说明书进行操作，具体见下网址：
(http://www.tiangen.com/asset/imsupload/up0718751001543655183.pdf； )
每次测试时待测样品的加入量均是1微升,此方法检测这三种病原体时，每种病原体检测分别各采用两条引物，引物均为标准常用的上下游引物,各条引物的浓度均为10μM,用量均为1微升。
(1)其中检测FPV时，使用的引物为：
| FPV-F | AATCAAGCAGCAGATGGT |
| FPV-B | tggatctgttggtagcaata |
PCR反应得到的PCR产物长度为200bp左右，反应完成后，将PCR产物用 2％的琼脂糖凝胶电泳(添加gel red,详见
http://www.bosunlife.com/product/sp_prod/GelRed_GelGreen.asp)，100v 电泳20分钟，在紫外光下拍照。
将测试原液和不同稀释倍率后的液体分别进行检测，结果见图5。
(2)另外进行各待测样品的FCoV病原体的检测，这种病原体的PCR检测方法和步骤与FPV除了所用引物不同，其它均相同。其中检测FCoV时，使用的引物为：
| FCoV-F | ACAGATCTCAATCTAGAGGAAG |
| FCoV-B | tttacctgcagttttcttcc |
检测完成后，FCoV检测的电泳结果见图6。
由图5至图6可以看出，此PCR方法2种试剂的最低检测浓度均是稀释10 倍，而由上文得知，本发明方法2种试剂的最低检测浓度均为稀释100倍，由此可见：本发明检测方法的最低检测浓度是PCR的1/10。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳芭卡生物科技有限公司
<120> 一种检测猫肠道感染病原体的引物、试剂盒及应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aatcaagcag cagatggt 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tggatctgtt ggtagcaata 20
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcaggtgttt ctcctgttgt agtagatcca agatatgcat ttggtaga 48
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
agatacagga agatatccag aaggattatc atttgttaca ggaaggtt 48
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gttttttgac catgttg 17
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
attggattca aaatattaac ttt 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
acagatctca atctagagga ag 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
tttacctgca gttttcttcc 20
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
cctaattttt caagcacggc tacaaacaac attccaataa ccaaagc 47
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tcacgtccta aatcaaaaga tcgtggtgtg tttgttggca tt 42
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ttgtatcctc aacattat 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
actcaaaacc tagggaca 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
aatcaagcag cagatggt 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
tggatctgtt ggtagcaata 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
acagatctca atctagagga ag 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
tttacctgca gttttcttcc 20
Claims (7)
1.一种检测猫肠道感染病原体的引物，其特征在于其包括FPV引物组和FCoV引物组共两个引物组，每组均由F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物、LB引物6条引物组成，序列因所针对的病原体而异；其中FPV引物组包括外引物对FPV-F3和FPV-B3，内引物对FPV-FIP和FPV-BIP，以及环引物对FPV-LF和FPV-LB；FCoV引物组包括外引物对FCoV-F3和FCoV-B3，内引物对FCoV-FIP和FCoV-BIP，以及环引物对FCoV-LF和FCoV-LB；详细序列如下所示：
FPV-F3：AATCAAGCAGCAGATGGT
FPV-B3：tggatctgttggtagcaata
FPV-FIP：tcaggtgtttctcctgttgtagtaGATCCAAGATATGCATTTGGTAGA
FPV-BIP：AGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAttatcatttgttacaggaaggtt
FPV-LF：gttttttgaccatgttg
FPV-LB：ATTGGATTCAAAATATTAACTTT
FCoV-F3：ACAGATCTCAATCTAGAGGAAG
FCoV-B3：tttacctgcagttttcttcc
FCoV-FIP：cctaatttttcaagcacggctacaaACAACATTCCAATAACCAAAGC
FCoV-BIP：TCACGTCCTAAATCAAAAGATCGTggtgtgtttgttggcatt
FCoV-LF：ttgtatcctcaacattat
FCoV-LB：ACTCAAAACCTAGGGACA
2.一种检测猫肠道感染病原体的试剂盒，其特征在于其包括权利要求1所述的三个引物组。
3.如权利要求2所述的一种检测猫肠道感染病原体的试剂盒，其特征在于其包括猫瘟病毒和猫冠状病毒两种检测试剂，每种试剂分别由两部分组成，第一部分是通用型的RM部分，此部分三种试剂的成分相同，均由下列组分组成：Bst酶，浓度为37.5uM的羟基萘酚蓝，浓度为100mM的MgSO4，10xBst buffer，去离子水，浓度为10mM的dNTP，浓度为5M的甜菜碱；第二部分是特异型的PM部分，三种试剂的PM部分分别由权利要求1所述的各自对应的引物组的水溶液组成。
4.如权利要求3所述的检测猫肠道感染病原体的试剂盒，其特征在于每支试剂中的RM部分的体积均为17微升，由以下组分组成：
1微升Bst酶
1微升的浓度为37.5μM的羟基萘酚蓝
2微升浓度为100mM的MgSO4
2.5微升10xBst buffer
3微升去离子水
3.5微升的浓度为10mM的dNTP
4微升的浓度为5M的甜菜碱；
特异型的PM部分中各条引物的水溶液的浓度均为20μM，每支试剂的PM部分的体积均为7微升，具体如下：
猫瘟病毒的检测试剂的PM部分：
浓度为20μM的FPV-F3引物0.5微升，浓度为20μM的FPV-B3引物0.5微升，
浓度为20μM的FPV-FIP引物2微升，浓度为20μM的FPV-BIP引物2微升，浓度为20μM的FPV-LF引物1微升，浓度为20μM的FPV-LB引物1微升；
猫冠状病毒的检测试剂的PM部分：
浓度为20μM的FCoV-F3引物0.5微升，浓度为20μM的FCoV-B3引物0.5微升，
浓度为20μM的FCoV-FIP引物2微升，浓度为20μM的FCoV-BIP引物2微升，
浓度为20μM的FCoV-LF引物1微升，浓度为20μM的FCoV-LB引物1微升。
5.如权利要求4所述的一种检测猫肠道感染病原体的试剂盒，其特征是所述试剂盒还包括阴性对照和预处理液A和预处理液B；所述阴性对照每支的体积为25微升，由下列组分组成：3.5微升的浓度为10mM的dNTP，4微升的浓度为5M的甜菜碱，1微升的浓度为37.5μM的羟基萘酚蓝,2微升的浓度为100mM的MgSO4,2.5微升10xBst buffer，12微升去离子水；
所述预处理液A为：有效成分为1％Triton X-100裂解液，体积每支200微升；
所述预处理液B为稀释液，成分为纯去离子水，体积为每支200微升。
6.如权利要求5所述的一种检测猫肠道感染病原体的试剂盒，其特征是所述试剂盒由下列组分组成：
猫瘟病毒检测试剂,
猫冠状病毒检测试剂，
阴性对照，
预处理液A，
预处理液B。
7.如权利要求2-6任意之一所述的试剂盒在检测猫肠道感染病原体中的应用，其特征是使用方法包含以下步骤：
(1)取一支无菌棉签蘸取患猫样本，方法是取粪便或肛拭子；
(2)将患猫样本浸入预处理液A中，进行裂解，轻轻晃动混匀30秒；
(3)吸出5微升裂解混匀后的液体转移到预处理液B中，进行稀释；
(4)分别吸取1微升稀释后的样本，加入3种检测试剂中，轻轻晃动混匀后，放到恒温设备中，在温度65度下进行反应；
(5)反应结束后，观察试剂颜色变化，与阴性对照对比，判定阴阳性。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112899406A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-06-04 | 上海基灵生物科技有限公司 | 一种检测猫消化道传染病原体的核酸组合物、试剂盒及检测方法 |
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-
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- 2019-09-02 CN CN201910823731.9A patent/CN110819737A/zh active Pending
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