CN110819736A - 一种检测犬三大常见病原体感染的引物、试剂盒及应用 - Google Patents
一种检测犬三大常见病原体感染的引物、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110819736A CN110819736A CN201910823372.7A CN201910823372A CN110819736A CN 110819736 A CN110819736 A CN 110819736A CN 201910823372 A CN201910823372 A CN 201910823372A CN 110819736 A CN110819736 A CN 110819736A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- concentration
- ccv
- cpv
- cdv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种检测犬三大常见病原体感染的引物、试剂盒及应用，其包括犬细小病毒(Canine Picornavirus，CPV)、犬冠状病毒(Canine Coronavirus，CCV)和犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)共三个引物组，每组都由F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物、LB引物6条引物组成，序列因所针对的病原体而异。检测试剂盒包括CPV、CCV和CDV共三种检测试剂，还有阴性对照和预处理液A和预处理液B；试剂盒的使用方法是蘸取患犬样本(检测CPV和CCV取粪便或肛拭子，检测CDV取眼或鼻的分泌物)，处理后将其放入各检测试剂中在65℃中恒温下进行反应，完成后根据颜色变化判定阴阳性。本发明是基于LAMP技术，特异性扩增病原体基因片段，可在60分钟内完成采样和检测，用最易掌握的操作方式，实现高精度的检测结果。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，特别涉及一种检测犬三大常见病原体感染的引物、试剂盒及应用。
背景技术
目前宠物病原体检测主要有胶体金试纸、PCR检验、第三方检测服务三种方式，胶体金试纸是最常用的技术。胶体金试纸技术发展较早，操作最简单，因此目前市场占有率最高，约占病原体检验市场的7成左右，代表公司为行业巨头爱德士、林特医药等。但是由于这一技术精确度低，阳性符合率仅为6成左右，精确度已逐渐不能满足市场需求，且可检验病原体种类并不完善，如最常见的犬三大常见病原体感染不能检测等，故其市场份额在逐年紧缩。
PCR检验是近两年开始由人类医疗市场进入宠物医疗市场的，其最大的优势是精确度高，但是其器械成本也十分高，单台仪器设备的价格均在5万以上，操作也十分复杂，普通宠物医生很难进行操作。并且，安装其设备需要自建实验空间，并需保证实验环境的通风性良好，否则易产生假阳性，而大多宠物医院并不具备安装条件。因以上原因，现有PCR检验技术的院内检测的推广并不好，只有少数连锁宠物医院龙头企业的中心医院有配备。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术的不足，提供一种检测犬三大常见病原体感染的引物、试剂盒及应用。本发明是基于LAMP技术，特异性扩增病原体基因片段，可在60min内完成采样-检测过程，用最易掌握的操作方式，实现高效、高精度的检测结果，从而达到精准检测的目的，并且本发明可以在感染病原体的潜伏期阶段及时检测，增加患病个体治愈率。与现有技术相比，本发明同时具备精确度高、操作便捷、成本低、无操作环境依赖等特点。
本发明的一种检测犬三大常见病原体感染的引物，其在于包括CPV引物组、CCV引物组和CDV引物组三个引物组，每组都由F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物、LB引物6条引物组成，序列因所针对的病原体而异；其中CPV引物组包括外引物对CPV-F3和CPV-B3，内引物对CPV-FIP和CPV-BIP，以及环引物对CPV-LF和CPV-LB；CCV引物组包括外引物对CCV-F3和CCV-B3，内引物对CCV-FIP和CCV-BIP，以及环引物对CCV-LF和CCV-LB；CDV引物组包括外引物对CDV-F3和CDV-B3，内引物对CDV-FIP和CDV-BIP，以及环引物对CDV-LF和CDV-LB；详细序列如下所示：
CPV-F3 AATCAAGCAGCAGATGGT
CPV-B3 TGGATCTGTTGGTAGCAATA
CPV-FIP TCAGGTGTTTCTCCTGTTGTAGTAGATCCAAGATATGCATTTGGTAGA
CPV-BIP AGATACAGGAAGATATCCAGAAGGATTATCATTTGTTACAGGAAGGTT
CPV-LF GTTTTTTGACCATGTTG
CPV-LB ATTGGATTCAAAATATTAACTTT
CCV-F3 TTGAAGGTGTGCCAACTG
CCV-B3 ATTTTACATAGTAAGCCCATCC
CCV-FIP TTGGTAAATTGTCGATGTCCACATTTCAGGGAATTTGTATGCTGA
CCV-BIP ATACGTAATGGTTGCATTACCTAGCCTTTCAATTTCTTGCCAACAAG
CCV-LF CCACCTGCAATTTTGAA
CCV-LB AGGACCATTGTCTACAC
CDV-F3 GGAATCCCCTGGACAGTTGA
CDV-B3 CCTTATTCTCCAACCAGCCTAA
CDV-FIP AGACCGCAAACAGAGTTGATGCTTGGAGGATCATAGACGACCCTGA
CDV-BIP TACATTTGCATCCAGAGGAGCAAGTTTGAGCTTTCGACCCTTCG
CDV-LF ACTCTACTAACTTGATGCT
CDV-LB GGATTCTGAGGCAGATGA
本发明还提供了一种检测犬三大常见病原体感染的试剂盒，其包括上述所述的三个引物组。
本发明所述的一种检测犬三大常见病原体感染的试剂盒，其包括犬细小病毒、犬冠状病毒和犬瘟热病毒三种检测试剂，每种试剂分别由两部分组成，第一部分是通用型的RM部分，此部分三种试剂的成分相同，均由下列组分组成：Bst酶，浓度为37.5uM的羟基萘酚蓝，浓度为100mM的MgSO4，10xBst buffer，去离子水，浓度为10mM的dNTP，浓度为5M的甜菜碱；第二部分是特异型的PM部分，三种试剂的PM部分分别由前文所述的各自对应的引物组的水溶液组成。
优选所述的检测犬三大常见病原体感染的试剂盒，每支试剂中的RM部分的体积均为17微升，其由以下组分组成：
1微升Bst酶
1微升的浓度为37.5μM的羟基萘酚蓝
2微升浓度为100mM的MgSO4
2.5微升10xBst buffer
3微升去离子水
3.5微升的浓度为10mM的dNTP
4微升的浓度为5M的甜菜碱；
特异型的PM部分中各条引物的水溶液的浓度均为20μM，每支试剂的PM部分的体积均为7微升，具体如下：
犬细小病毒的检测试剂的PM部分：
浓度为20μM的CPV-F3引物0.5微升，浓度为20μM的CPV-B3引物0.5微升，浓度为20μM的CPV-FIP引物2微升，浓度为20μM的CPV-BIP引物2微升，浓度为20μM的CPV-LF引物1微升，浓度为20μM的CPV-LB引物1微升；
犬冠状病毒的检测试剂的PM部分：
浓度为20μM的CCV-F3引物0.5微升，浓度为20μM的CCV-B3引物0.5微升，浓度为20μM的CCV-FIP引物2微升，浓度为20μM的CCV-BIP引物2微升，浓度为20μM的CCV-LF引物1微升，浓度为20μM的CCV-LB引物1微升；
犬瘟热病毒的检测试剂的PM部分：
浓度为20μM的CDV-F3引物0.5微升,浓度为20μM的CDV-B3引物0.5微升，浓度为20μM的CDV-FIP引物2微升，浓度为20μM的CDV-BIP引物2微升，浓度为20μM的CDV-LF引物1微升，浓度为20μM的CDV-LB引物1微升。
本发明所述的检测犬三大常见病原体感染的试剂盒，其还包括阴性对照和预处理液A和预处理液B；所述阴性对照每支的体积为25微升，由下列组分组成：3.5微升的浓度为10mM的dNTP，4微升的浓度为5M的甜菜碱，1微升的浓度为37.5μM的羟基萘酚蓝,2微升的浓度为100mM的MgSO4,2.5微升10xBstbuffer，12微升去离子水；
所述预处理液A为：有效成分为1％Triton X-100裂解液；
所述预处理液B为稀释液，成分为纯去离子水。
优选所述的检测犬三大常见病原体感染的试剂盒由下列组分组成：
犬细小病毒检测试剂,
犬冠状病毒检测试剂，
犬瘟热病毒检测试剂，
阴性对照，
预处理液A，
预处理液B。
本发明还提供了所述的试剂盒在检测犬三大常见病原体感染中的应用，其使用方法包含以下步骤：
(1)取一支无菌棉签蘸取患犬样本，检测CPV和CCV取粪便或肛拭子，检测CDV取眼或鼻的分泌物；
(2)将患犬样本浸入预处理液A中，进行裂解，轻轻晃动混匀30秒；
(3)吸出5微升裂解混匀后的液体转移到预处理液B中，进行稀释；
(4)分别吸取1微升稀释后的样本，加入3种检测试剂中，轻轻晃动混匀后，放到恒温设备中，在温度65度下进行反应。
(5)反应结束后，观察试剂颜色变化，与阴性对照对比，判定阴阳性。
本发明的对犬三大常见病原体感染的检测用于非诊断目的。
有益效果
本发明是基于LAMP技术，特异性扩增病原体基因片段，对猫上呼吸道感染的几种常见病原体在60min内完成采样-检测过程，用最易掌握的操作方式，实现高效、高精度的检测结果，从而达到精准检测的目的，并且可以在感染病原体的潜伏期阶段及时检测，增加患病个体治愈率。与现有技术相比，本发明同时具备了精确度高、操作便捷、成本低、产品品类齐全、高特异性、高灵敏度且操作简捷、重复性好、结果易判断等特点。并且,由于本发明提供的引物组具有极高的特异性,因此,在LAMP扩增中,无需提取样品的DNA而直接进行扩增,进一步缩短了检测时间,而且简化了操作。可以取代落后的胶体金试纸，成为行业的新标准。
附图说明
图1是为本发明检测方法的建立
其中试剂的排列顺序从左至右依次为：CPV阴性，CPV阳性，CCV阴性，CCV阳性，CDV阴性，CDV阳性。
图2为待测样品8的本发明方法的检测结果
其中试剂的排列顺序为：左1为阴性对照，左2-4依次分别为检测CPV，CCV，CDV的试剂。
图3为采用本发明试剂盒检测不同稀释倍率样品的CPV检测结果图
从左至右依次排列为测试原液、稀释10倍样品、稀释100倍样品、稀释1000倍样品、阴性对照。
图4为采用本发明试剂盒检测不同稀释倍率样品的CCV检测结果图
样品排列顺序同图3。
图5为采用本发明试剂盒检测不同稀释倍率样品的CDV检测结果图
样品排列顺序同图3。
图6为采用PCR方法检测不同稀释倍率样品的CPV检测电泳结果图
左边第一列为100bp DNA标志物(全式金)，其它五个泳道从左到右依次为：1—测试原液，2—稀释10倍样品，3—稀释100倍样品，4—稀释1000倍样品，5—阴性对照。
图7为采用PCR方法检测不同稀释倍率样品的CCV检测电泳结果图
样品的泳道排列顺序同图6。
图8为采用PCR方法检测不同稀释倍率样品的CDV检测电泳结果图
样品的泳道排列顺序同图6。
具体实施方式
下面结合说明书附图介绍本发明的较佳实施例，举例证明本发明可以实施，通过向本领域中的技术人员完整介绍本发明，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，其保护范围并非仅限于文中提到的实施例，本文的附图和说明本质上是举例说明而不是限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的原材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或已公开。
1材料和方法
1.1病原体
本发明的病原体样本如无特殊说明,其它皆来自于宠物医院活体样本。
1.2主要试剂
去离子水购自天根生化科技有限公司；
Bst酶，10xBst buffer，MgSO4，dNTP购自NEB公司；
甜菜碱购自北京天恩泽基因科技有限公司；
羟基萘酚蓝购自成都贝斯特试剂有限公司；
引物均购自苏州泓迅科技有限公司；
离心管购自广州洁特生物过滤股份有限公司。
1.3引物设计
首先，在Genbank数据库中搜索犬细小病毒(CPV)的VP2基因序列，犬冠状病毒(CCV)的M蛋白序列和犬瘟热病毒(CDV)的N蛋白序列，并通过ClustalX软件进行序列比对；然后，通过LAMP引物设计软件(Primer Explorer software，version5.0)，针对上述特异性保守序列分别进行LAMP引物设计，根据专业经验进行了人工选择和校正，再根据多轮实验测试，在合成的引物组合中筛选出本发明的引物组。
实施例1、检测犬三大常见病原体感染的引物的制备
本实施例的一种检测犬三大常见病原体感染的引物，其包括CPV引物组、CCV引物组和CDV引物组三个引物组，每组都由F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物、LB引物6条引物组成，序列因所针对的病原体而异；其中CPV引物组包括外引物对CPV-F3和CPV-B3,内引物对CPV-FIP和CPV-BIP，以及环引物对CPV-LF和CPV-LB；CCV引物组包括外引物对CCV-F3和CCV-B3,内引物对CCV-FIP和CCV-BIP，以及环引物对CCV-LF和CCV-LB；CDV引物组包括外引物对CDV-F3和CDV-B3,内引物对CDV-FIP和CDV-BIP，以及环引物对CDV-LF和CDV-LB；详细序列如下所示：
CPV-F3 AATCAAGCAGCAGATGGT
CPV-B3 TGGATCTGTTGGTAGCAATA
CPV-FIP TCAGGTGTTTCTCCTGTTGTAGTAGATCCAAGATATGCATTTGGTAGA
CPV-BIP AGATACAGGAAGATATCCAGAAGGATTATCATTTGTTACAGGAAGGTT
CPV-LF GTTTTTTGACCATGTTG
CPV-LB ATTGGATTCAAAATATTAACTTT
CCV-F3 TTGAAGGTGTGCCAACTG
CCV-B3 ATTTTACATAGTAAGCCCATCC
CCV-FIP TTGGTAAATTGTCGATGTCCACATTTCAGGGAATTTGTATGCTGA
CCV-BIP ATACGTAATGGTTGCATTACCTAGCCTTTCAATTTCTTGCCAACAAG
CCV-LF CCACCTGCAATTTTGAA
CCV-LB AGGACCATTGTCTACAC
CDV-F3 GGAATCCCCTGGACAGTTGA
CDV-B3 CCTTATTCTCCAACCAGCCTAA
CDV-FIP AGACCGCAAACAGAGTTGATGCTTGGAGGATCATAGACGACCCTGA
CDV-BIP TACATTTGCATCCAGAGGAGCAAGTTTGAGCTTTCGACCCTTCG
CDV-LF ACTCTACTAACTTGATGCT
CDV-LB GGATTCTGAGGCAGATGA
实施例2、利用检测犬三大常见病原体感染的试剂盒检测待测样品
一、检测试剂盒的制备
本实施例所述的犬三大常见病原体感染检测试剂盒，其包括猫疱疹病I型、犬冠状病毒和犬瘟热病毒三种检测试剂，每种试剂分别由两部分组成，第一部分是通用的RM部分，此部分三种试剂的成分相同，均由以下原料组成：
1微升Bst酶
1微升羟基萘酚蓝(37.5μM)
2微升MgSO4(100mM)
2.5微升10xBst buffer
3微升去离子水
3.5微升dNTP(10mM)
4微升甜菜碱(5M)；共计17微升。
第二部分是特异型的PM部分，为各条引物的水溶液，水溶液的浓度均为20μM,每支试剂中PM部分的体积均为7微升，具体含量如下：
犬细小病毒的检测试剂的PM部分：
0.5微升CPV-F3引物(20μM)，0.5微升CPV-B3引物(20μM)，
2微升CPV-FIP引物(20μM)，2微升CPV-BIP引物(20μM)，
1微升CPV-LF引物(20μM)，1微升CPV-LB引物(20μM)；
犬冠状病毒的检测试剂的PM部分：
0.5微升CCV-F3引物(20μM)，0.5微升CCV-B3引物(20μM)，
2微升CCV-FIP引物(20μM)，2微升CCV-BIP引物(20μM)，
1微升CCV-LF引物(20μM)，1微升CCV-LB引物(20μM)；
犬瘟热病毒的检测试剂的PM部分：
0.5微升CDV-F3引物(20μM)，0.5微升CDV-B3引物(20μM)，
2微升CDV-FIP引物(20μM)，2微升CDV-BIP引物(20μM)，
1微升CDV-LF引物(20μM)，1微升CDV-LB引物(20μM)。
本实施例所述的试剂盒还包括阴性对照和预处理液A和预处理液B。所述阴性对照每支的体积为25微升，由下列组分组成：3.5微升dNTP(10mM)，4微升甜菜碱(5M)，1微升羟基萘酚蓝(37.5μM),2微升MgSO4(100mM),2.5微升10xBst buffer，12微升去离子水；
本实施例所述预处理液A为：有效成分为1％Triton X-100裂解液，用于裂解组织细胞，释放病原体；
所述预处理液B为稀释液，成分为纯去离子水。
本实施例所述试剂盒包括下列组分：
犬细小病毒检测试剂，
犬冠状病毒检测试剂，
犬瘟热病毒检测试剂，
阴性对照，
预处理液A，
预处理液B，
本实施例所述的试剂盒的制备方法，其包含以下内容：
(一)三种检测试剂的制备：
(1)先制备通用的RM部分，此部分三种试剂的制备方法和原料均相同，制备步骤如下：
取0.5ml离心管，用微量移液器依次加入以下试剂：
2.5微升10xBst buffer
3微升去离子水
4微升甜菜碱
3.5微升dNTP(10mM)
2微升MgSO4(100mM)
1微升羟基萘酚蓝(37.5μM)
1微升Bst酶
共17微升，轻轻混匀即得RM部分。
(2)再制备三种检测试剂的PM部分：
犬细小病毒的检测试剂的PM部分：
0.5微升CPV-F3引物(20μM)，0.5微升CPV-B3引物(20μM)，
2微升CPV-FIP引物(20μM)，2微升CPV-BIP引物(20μM)，
1微升CPV-LF引物(20μM)，1微升CPV-LB引物(20μM)；
犬冠状病毒的检测试剂的PM部分：
0.5微升CCV-F3引物(20μM)，0.5微升CCV-B3引物(20μM)，
2微升CCV-FIP引物(20μM)，2微升CCV-BIP引物(20μM)，
1微升CCV-LF引物(20μM)，1微升CCV-LB引物(20μM)；
犬瘟热病毒的检测试剂的PM部分：
0.5微升CDV-F3引物(20μM)，0.5微升CDV-B3引物(20μM)，
2微升CDV-FIP引物(20μM)，2微升CDV-BIP引物(20μM)，
1微升CDV-LF引物(20μM)，1微升CDV-LB引物(20μM)。
(3)将三种试剂的PM部分分别加入到步骤(1)制得的RM部分，然后混匀即可。即将犬细小病毒的检测试剂的PM部分加入到17微升的通用RM部分得到犬细小病毒的检测试剂；将犬冠状病毒的检测试剂的PM部分加入17微升的通用RM部分得到犬冠状病毒的检测试剂；将犬瘟热病毒的检测试剂的PM部分加入17微升的通用RM部分得到犬冠状病毒的检测试剂。
(二)阴性对照液的制备：
将3.5微升dNTP(10mM)，4微升甜菜碱(5M)，1微升羟基萘酚蓝(37.5μM),2微升MgSO4(100mM),2.5微升10xBst buffer，12微升去离子水依次加入后混匀即得。
将本实施例的试剂盒用于检测猫上呼吸道感染的病原体，检测方法包含以下步骤：
(1)取一支无菌棉签，蘸取患犬样本，检测CPV和CCV取粪便或肛拭子，检测CDV取眼或鼻的分泌物；
(2)将患犬样本浸入预处理液A中，进行裂解，轻轻晃动混匀30秒；
(3)吸出5微升裂解混匀后的液体转移到预处理液B中，进行稀释；
(4)分别吸取1微升稀释后的样本，加入3种检测试剂中，盖紧装试剂的离心管的管盖，轻轻晃动混匀后，将其放到恒温设备中，在温度65度下进行反应，反应时间60分钟。
(5)反应结束后，分别观察三种检测试剂颜色变化，与阴性对照对比，判定阴阳性。若呈现蓝绿色则为阳性，若与阴性对照类似，呈现蓝紫色为阴性。
针对三种不同病原体，本实施例的检测方法最终的显示结果见图1。
实施例3、准确性实验
患犬可以同时携带犬细小病毒、犬冠状病毒和犬瘟热病毒三种，也可以是携带其中的任意两种或一种。取一健康犬作为待测样品1和5，然后根据患犬带有的已确定的病原体的不同情况设置待测样品2-8，详见表1：
表1
注：“-”代表“无”，“+”代表“有”。
将每组待测样品分别采用实施例2的检测方法进行检测，检测完成后观察检测结果,如图2为待测样品5的检测结果显示,图2中试剂的排列顺序为：左1为阴性对照，左2-3依次分别为检测CPV，CCV的试剂。由图2可以看出,左1的阴性对照显示蓝紫色,左2-左3的检测CPV和CCV的试剂均为蓝绿色，所以待测样品4的本实施例CPV和CCV的检测结果均为阳性。将结果与表1提供信息相比较,检测结果是正确的。
将各待测样品的检测结果进行汇总，结果见下表2：
表2
将表2的检测结果与表1的相对应内容比较可以得知，用本发明的试剂盒检测各待测样品的检测结果都是正确的。说明本发明提供的引物和试剂盒能够准确的分辨其相对应的病毒,检测结果准确性好。将每组代测样品分别进行10次重复检测，每组的各次检测结果均相同，准确性和重复性都很好。
检测应用：
在合作的宠物医院完成60例患犬样本的测试，其中20例CPV+，CCV-；16例CPV-，CCV+；8例CPV+，CCV+；16例CDV+，经验证，检测结果均正确。
实施例4、特异性测试
参照本发明实施例2的检测方法，将待测样本分别换为猫上呼吸道感染样本(猫疱疹病毒I型、猫杯状病毒和猫衣原体阳性，为医院活体样本)进行检测，每组设3次重复，检测结果显示：均显示蓝紫色，未见任何阳性反应。说明本发明检测引物和检测方法具有良好的特异性。
实施例5、灵敏度测试
采集一个CPV和CCV阳性患犬样本和一个CDV阳性患犬样本，分别使用本发明的方法与PCR加电泳跑胶检测对比。实验过程如下：
一.制备测试原液
(1)取患犬样本200微升，使用北京全式金公司EasyPure Viral DNA/RNAKit试剂盒,按照其说明书操作，提取获得样本的核酸提取物(包括DNA和RNA)。
(http://www.transgen.com.cn/attached/down/ER201-01_2017050515.pdf)；
(2)取10微升样本核酸提取物，进行逆转录后得到样本核酸逆转录产物，即为测试原液。逆转录采用Thermo Fisher Scientific公司的逆转录试剂盒,操作步骤按其操作说明书进行。参考网址为：
(https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/pcr/reverse-transcription/rt-pcr.html)。
将测试原液分别梯度稀释10，100，1000倍后进行相关测试。
二.将上述步骤一制备好的测试原液和梯度稀释后的各液体分别采用本发明的试剂盒进行检测，每个样品测试时的步骤均是：将各待测样品直接分别加入到试剂盒中的3种检测试剂中，各待测样品加入到每种试剂的量均为1微升，盖紧装试剂的离心管的管盖，轻轻晃动混匀后，将其放到恒温设备中，在温度65度下进行反应，反应时间50分钟。反应结束后，分别观察三种检测试剂颜色变化，与阴性对照对比，判定阴阳性。各样品的检测结果汇总见下表3：
表3
| 样品原液 | 稀释10倍 | 稀释100倍 | 稀释1000倍 | 阴性对照 | |
| CPV检测试剂 | 蓝绿色 | 蓝绿色 | 蓝绿色 | 蓝紫色 | 蓝紫色 |
| CCV检测试剂 | 蓝绿色 | 蓝绿色 | 蓝绿色 | 蓝紫色 | 蓝紫色 |
| CDV检测试剂 | 蓝绿色 | 蓝绿色 | 蓝绿色 | 蓝紫色 | 蓝紫色 |
由表3可以看出，本发明的检测方法中，三种试剂的最低检测浓度都是稀释100倍。
图3为采用本发明方法检测不同稀释倍率样品的CPV检测结果图。从左至右依次排列为测试原液、稀释10倍样品、稀释100倍样品、稀释1000倍样品、阴性对照。CCV和CDV检测结果见图4和图5。
三.将测试原液和梯度稀释后的各液体分别进行PCR检测，使用天根生化公司的taq-PCR试剂盒，按其操作说明书进行操作，具体见下网址：
(http://www.tiangen.com/asset/imsupload/up0718751001543655183.pdf)每次测试时待测样品的加入量均是1微升,此方法检测这三种病原体时，每种病原体检测分别各采用两条引物，引物均为标准常用的上下游引物,各条引物的浓度均为10μM,用量均为1微升。
(1)其中检测CPV时，使用的引物为：
| CPV-F | AATCAAGCAGCAGATGGT |
| CPV-B | TGGATCTGTTGGTAGCAATA |
PCR反应得到的PCR产物长度为200bp左右，反应完成后，将PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳(添加gel red,详见
http://www.bosunlife.com/product/sp_prod/GelRed_GelGreen.asp)，100v电泳20分钟，在紫外光下拍照。
将测试原液和不同稀释倍率后的液体分别进行检测，结果见图6。
(2)另外分别进行各待测样品的CCV和CDV病原体的检测，这两种病原体的PCR检测方法和步骤与CPV除了所用引物不同，其它均相同。其中检测CCV时，使用的引物为：
| CCV-F | TTGAAGGTGTGCCAACTG |
| CCV-B | ATTTTACATAGTAAGCCCATCC |
(3)检测CDV时，使用的引物为：
| CDV-F | GGAATCCCCTGGACAGTTGA |
| CDV-B | CCTTATTCTCCAACCAGCCTAA |
检测完成后，CCV检测的电泳结果见图7，CDV检测的电泳结果见图8。
由图6至图8可以看出，此PCR方法三种试剂的最低检测浓度均是稀释10倍，而由上文得知，本发明方法三种试剂的最低检测浓度均为稀释100倍，由此可见：本发明检测方法的最低检测浓度是PCR的1/10。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳芭卡生物科技有限公司
<120> 一种检测犬三大常见病原体感染的引物、试剂盒及应用
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aatcaagcag cagatggt 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tggatctgtt ggtagcaata 20
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcaggtgttt ctcctgttgt agtagatcca agatatgcat ttggtaga 48
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
agatacagga agatatccag aaggattatc atttgttaca ggaaggtt 48
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gttttttgac catgttg 17
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
attggattca aaatattaac ttt 23
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ttgaaggtgt gccaactg 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
attttacata gtaagcccat cc 22
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ttggtaaatt gtcgatgtcc acatttcagg gaatttgtat gctga 45
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
atacgtaatg gttgcattac ctagcctttc aatttcttgc caacaag 47
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ccacctgcaa ttttgaa 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
aggaccattg tctacac 17
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ggaatcccct ggacagttga 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
ccttattctc caaccagcct aa 22
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
agaccgcaaa cagagttgat gcttggagga tcatagacga ccctga 46
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
tacatttgca tccagaggag caagtttgag ctttcgaccc ttcg 44
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
actctactaa cttgatgct 19
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
ggattctgag gcagatga 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
aatcaagcag cagatggt 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
tggatctgtt ggtagcaata 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
ttgaaggtgt gccaactg 18
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
attttacata gtaagcccat cc 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
ggaatcccct ggacagttga 20
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
ccttattctc caaccagcct aa 22
Claims (7)
1.一种检测犬三大常见病原体感染的引物，其特征在于其包括CPV引物组、CCV引物组和CDV引物组三个引物组，每组均由F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LF引物、LB引物6条引物组成，序列因所针对的病原体而异；其中CPV引物组包括外引物对CPV-F3和CPV-B3，内引物对CPV-FIP和CPV-BIP，以及环引物对CPV-LF和CPV-LB；CCV引物组包括外引物对CCV-F3和CCV-B3，内引物对CCV-FIP和CCV-BIP，以及环引物对CCV-LF和CCV-LB；CDV引物组包括外引物对CDV-F3和CDV-B3，内引物对CDV-FIP和CDV-BIP，以及环引物对CDV-LF和CDV-LB；详细序列如下所示：
CPV-F3 AATCAAGCAGCAGATGGT
CPV-B3 TGGATCTGTTGGTAGCAATA
CPV-FIP TCAGGTGTTTCTCCTGTTGTAGTAGATCCAAGATATGCATTTGGTAGA
CPV-BIP AGATACAGGAAGATATCCAGAAGGATTATCATTTGTTACAGGAAGGTT
CPV-LF GTTTTTTGACCATGTTG
CPV-LB ATTGGATTCAAAATATTAACTTT
CCV-F3 TTGAAGGTGTGCCAACTG
CCV-B3 ATTTTACATAGTAAGCCCATCC
CCV-FIP TTGGTAAATTGTCGATGTCCACATTTCAGGGAATTTGTATGCTGA
CCV-BIP ATACGTAATGGTTGCATTACCTAGCCTTTCAATTTCTTGCCAACAAG
CCV-LF CCACCTGCAATTTTGAA
CCV-LB AGGACCATTGTCTACAC
CDV-F3 GGAATCCCCTGGACAGTTGA
CDV-B3 CCTTATTCTCCAACCAGCCTAA
CDV-FIP AGACCGCAAACAGAGTTGATGCTTGGAGGATCATAGACGACCCTGA
CDV-BIP TACATTTGCATCCAGAGGAGCAAGTTTGAGCTTTCGACCCTTCG
CDV-LF ACTCTACTAACTTGATGCT
CDV-LB GGATTCTGAGGCAGATGA
2.一种检测犬三大常见病原体感染的试剂盒，其特征在于其包括权利要求1所述的三个引物组。
3.如权利要求2所述的一种检测犬三大常见病原体感染的试剂盒，其特征在于其包括犬细小病毒CPV、犬冠状病毒CCV和犬瘟热病毒CDV三种检测试剂，每种试剂分别由两部分组成，第一部分是通用型的RM部分，此部分三种试剂的成分相同，均由下列组分组成：Bst酶，浓度为37.5uM的羟基萘酚蓝，浓度为100mM的MgSO4，10xBst buffer，去离子水，浓度为10mM的dNTP，浓度为5M的甜菜碱；第二部分是特异型的PM部分，三种试剂的PM部分分别由权利要求1所述的各自对应的引物组的水溶液组成。
4.如权利要求3所述的检测犬三大常见病原体感染的试剂盒，其特征在于每支试剂中的RM部分的体积均为17微升，由以下组分组成：
1微升Bst酶
1微升的浓度为37.5μM的羟基萘酚蓝
2微升浓度为100mM的MgSO4
2.5微升10xBst buffer
3微升去离子水
3.5微升的浓度为10mM的dNTP
4微升的浓度为5M的甜菜碱；
特异型的PM部分中各条引物的水溶液的浓度均为20μM，每支试剂的PM部分的体积均为7微升，具体如下：
犬细小病毒的检测试剂的PM部分：
浓度为20μM的CPV-F3引物0.5微升，浓度为20μM的CPV-B3引物0.5微升，
浓度为20μM的CPV-FIP引物2微升，浓度为20μM的CPV-BIP引物2微升，
浓度为20μM的CPV-LF引物1微升，浓度为20μM的CPV-LB引物1微升；
犬冠状病毒的检测试剂的PM部分：
浓度为20μM的CCV-F3引物0.5微升，浓度为20μM的CCV-B3引物0.5微升，
浓度为20μM的CCV-FIP引物2微升，浓度为20μM的CCV-BIP引物2微升，
浓度为20μM的CCV-LF引物1微升，浓度为20μM的CCV-LB引物1微升；
犬瘟热病毒的检测试剂的PM部分：
浓度为20μM的CDV-F3引物0.5微升，浓度为20μM的CDV-B3引物0.5微升，
浓度为20μM的CDV-FIP引物2微升，浓度为20μM的CDV-BIP引物2微升，
浓度为20μM的CDV-LF引物1微升，浓度为20μM的CDV-LB引物1微升。
5.如权利要求4所述的一种检测犬三大常见病原体感染的试剂盒，其特征是所述试剂盒还包括阴性对照和预处理液A和预处理液B；所述阴性对照每支的体积为25微升，由下列组分组成：3.5微升的浓度为10mM的dNTP，4微升的浓度为5M的甜菜碱，1微升的浓度为37.5μM的羟基萘酚蓝,2微升的浓度为100mM的MgSO4,2.5微升10xBst buffer，12微升去离子水；
所述预处理液A为：有效成分为1％Triton X-100裂解液；
所述预处理液B为稀释液，成分为纯去离子水。
6.如权利要求5所述的一种检测犬三大常见病原体感染的试剂盒，其特征是所述试剂盒由下列组分组成：
犬细小病毒检测试剂,
犬冠状病毒检测试剂，
犬瘟热病毒检测试剂，
阴性对照，
预处理液A，
预处理液B。
7.如权利要求2-6任意之一所述的试剂盒在检测犬三大常见病原体感染中的应用，其特征是使用方法包含以下步骤：
(1)取一支无菌棉签蘸取患犬样本，检测CPV和CCV取肛拭子，检测CDV取眼或鼻的分泌物；
(2)将患犬样本浸入预处理液A中，进行裂解，轻轻晃动混匀30秒；
(3)吸出5微升裂解混匀后的液体转移到预处理液B中，进行稀释；
(4)分别吸取1微升稀释后的样本，加入3种检测试剂中，轻轻晃动混匀后，放到恒温设备中，在温度65度下进行反应；
(5)反应结束后，观察试剂颜色变化，与阴性对照对比，判定阴阳性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910823372.7A CN110819736A (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 一种检测犬三大常见病原体感染的引物、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910823372.7A CN110819736A (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 一种检测犬三大常见病原体感染的引物、试剂盒及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110819736A true CN110819736A (zh) | 2020-02-21 |
Family
ID=69547901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910823372.7A Pending CN110819736A (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 一种检测犬三大常见病原体感染的引物、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110819736A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111763766A (zh) * | 2020-04-14 | 2020-10-13 | 南京农业大学 | 一步法检测犬腹泻病毒的引物对、TaqMan探针及方法与应用 |
| CN113151609A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-07-23 | 上海基灵生物科技有限公司 | 一种检测犬冠状病毒和犬细小病毒的核酸组合物、试剂盒及应用 |
| CN116287459A (zh) * | 2023-03-02 | 2023-06-23 | 北京芯之悦生物技术中心(有限合伙) | 一种用于鉴别诊断犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒的引物组合物及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101250577A (zh) * | 2008-03-05 | 2008-08-27 | 苏州大学 | 环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒及方法 |
| CN101307356A (zh) * | 2008-04-29 | 2008-11-19 | 广州华峰生物科技有限公司 | 基于环介导等温扩增技术的金黄色葡萄球菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法 |
| CN101899532A (zh) * | 2009-12-17 | 2010-12-01 | 上海交通大学 | 犬细小病毒的lamp检测试剂盒及其检测方法 |
| CN106367535A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-02-01 | 许昌学院 | 检测ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物及其方法 |
| CN108374056A (zh) * | 2017-09-01 | 2018-08-07 | 北京市农林科学院 | 用于检测检测犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状毒病毒的引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN108588277A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-09-28 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 一种犬瘟热病毒可视化核酸检测方法 |
-
2019
- 2019-09-02 CN CN201910823372.7A patent/CN110819736A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101250577A (zh) * | 2008-03-05 | 2008-08-27 | 苏州大学 | 环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒及方法 |
| CN101307356A (zh) * | 2008-04-29 | 2008-11-19 | 广州华峰生物科技有限公司 | 基于环介导等温扩增技术的金黄色葡萄球菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法 |
| CN101899532A (zh) * | 2009-12-17 | 2010-12-01 | 上海交通大学 | 犬细小病毒的lamp检测试剂盒及其检测方法 |
| CN106367535A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-02-01 | 许昌学院 | 检测ⅱ型猪圆环病毒的环介导等温扩增引物及其方法 |
| CN108374056A (zh) * | 2017-09-01 | 2018-08-07 | 北京市农林科学院 | 用于检测检测犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状毒病毒的引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN108588277A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-09-28 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 一种犬瘟热病毒可视化核酸检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| PATRICK C. Y. WOO ET AL.: "Complete Genome Sequence of a Novel Picornavirus, Canine Picornavirus, Discovered in Dogs" * |
| 何丽丽;关玮琨;江馗语;朱颖;刘文鑫;冯瑜菲;胡文霞;师东方;: "犬瘟热病毒N基因环介导等温扩增检测方法的建立" * |
| 关玮琨;何丽丽;冯瑜菲;朱颖;刘文鑫;江馗语;胡文霞;师东方;: "犬细小病毒环介导等温扩增检测方法的建立" * |
| 苏霞;周宏专;常彦嫣;杨兵;: "犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒三重PCR检测方法的建立" * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111763766A (zh) * | 2020-04-14 | 2020-10-13 | 南京农业大学 | 一步法检测犬腹泻病毒的引物对、TaqMan探针及方法与应用 |
| CN111763766B (zh) * | 2020-04-14 | 2022-12-27 | 南京农业大学 | 一步法检测犬腹泻病毒的引物对、TaqMan探针及方法与应用 |
| CN113151609A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-07-23 | 上海基灵生物科技有限公司 | 一种检测犬冠状病毒和犬细小病毒的核酸组合物、试剂盒及应用 |
| CN116287459A (zh) * | 2023-03-02 | 2023-06-23 | 北京芯之悦生物技术中心(有限合伙) | 一种用于鉴别诊断犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒的引物组合物及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2016188144A1 (zh) | 一种具有增强鉴别能力的str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
| CN110819736A (zh) | 一种检测犬三大常见病原体感染的引物、试剂盒及应用 | |
| CN109811088B (zh) | 一种检测猫上呼吸道感染病原体的引物、试剂盒及应用 | |
| Fischer et al. | Detection and differentiation of field and vaccine strains of canine distemper virus using reverse transcription followed by nested real time PCR (RT-nqPCR) and RFLP analysis | |
| CN107058628B (zh) | 一种用于检测手足口病相关病原体的lamp引物组合物及其相关应用 | |
| CN111676323B (zh) | 一种检测鸡星状病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法和应用 | |
| Wang et al. | Visual detection of porcine epidemic diarrhea virus using a novel reverse transcription polymerase spiral reaction method | |
| CN110438260B (zh) | 一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒 | |
| CN114457197A (zh) | Raa荧光法检测fpv的引物探针组及试剂盒 | |
| CN110819737A (zh) | 一种检测猫肠道感染病原体的引物、试剂盒及应用 | |
| CN113430303A (zh) | 一种基于纳米孔测序仪的23种呼吸道rna病毒快速鉴定方法 | |
| CN111187863A (zh) | 一种双酶法恒温扩增检测covid-19的试剂盒和检测方法 | |
| CN105586438B (zh) | 用于检测赤羽病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 | |
| CN116042370A (zh) | 一种居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN106319091B (zh) | 一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂盒 | |
| CN114196779A (zh) | 基于靶向测序的病原微生物检测方法及试剂盒 | |
| CN106521038A (zh) | 一种高灵敏度的bhv‑2实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 | |
| CN111893213A (zh) | 用于新型冠状病毒快速筛查鉴定的引物及试剂盒和用途 | |
| CN106701961A (zh) | 可视化检测Hobi‑like瘟病毒的反转录环介导等温扩增引物、试剂盒和检测方法 | |
| CN109097497A (zh) | 一种人副流感病毒三联核酸检测试剂盒 | |
| CN102230031A (zh) | 一种狂犬病病毒的rt-lamp检测试剂盒及其检测方法 | |
| RU2744665C1 (ru) | Способ выявления рнк вируса луйо методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени | |
| WO2022246781A1 (zh) | 基于电浸润的crispr的核酸检测系统及其方法 | |
| RU2700477C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя ДНК Bordetella bronchiseptica инфекции у сельскохозяйственных животных | |
| CN117248077A (zh) | 一种检测呼吸道合胞病毒a和/或b亚型的引物组、试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |