CN114457197A

CN114457197A - Raa荧光法检测fpv的引物探针组及试剂盒

Info

Publication number: CN114457197A
Application number: CN202210314762.3A
Authority: CN
Inventors: 吴健敏; 刘金凤; 覃绍敏; 宋瑞鹏; 马玲; 陈凤莲; 林俊; 秦树英; 韦珏; 许力士; 韦珊珊; 杨磊
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2022-05-10

Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及RAA荧光法检测FPV的引物探针组及试剂盒，本发明的引物探针组经过简并设计后，能检测出更多的FPV基因型，经过与其它引物探针组进行对比发现该引物探针组具有灵敏性高、检测效果更好的特点，同时，本发明还制备了相应的RAA试剂盒并建立相应的RAA检测方法，经过试验表明，该试剂盒能在恒温条件下(37‑42℃)进行，5‑30min内即可实现对猫细小病毒的快速、定性检测，具有操作便捷、特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，完全能满足猫细小病毒快速诊断，适合临床快速检测，具有广泛的应用前景。

Description

RAA荧光法检测FPV的引物探针组及试剂盒

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，特别涉及RAA荧光法检测FPV的引物探针组及试剂盒。

【背景技术】

猫瘟热又名猫泛白细胞减少症、猫传染性肠炎等，是由猫细小病毒(FPV)引起的猫的一种急性、高度接触性和致死性传染性传染病。临床上以突发高热、呕吐、腹泻及白细胞严重减少为主要特征，是家猫最常见的传染病。FPV可通过直接或间接接触感染，发病动物通过粪、尿、呕吐物、唾液等排泻物和分泌物排毒，污染环境、器具、饲料等，引起直接和间接传染，常呈地方性流行，其病死率一般为60％～70％，最高可达90％以上(幼兽死亡率可达100％)。FPV常与其他病毒混合感染，也常引起细菌的继发感染，严重威胁着猫科动物的健康，给疫病的防控带来极大的困难。快速、准确的进行猫细小病毒的诊断具重要现实意义。

我国不同疫病的检测技术的研发已经比较完善，主要包括病原学检测技术、免疫学检测技术和分子生物学检测技术。各种检测技术在特异性、灵敏性、稳定性、重复性等方面都显示了各自不同的优势。分子生物学检测技术因其敏感性、特异性在动物病原检测中具有良好的应用前景。猫细小病毒的分子生物学检测技术主要包括普通PCR、实时荧光定量PCR(Q-PCR)及近年发展较快的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。PCR和Q-PCR技术重复性好、灵敏度高、特异性强、检出率高，但操作复杂、对人员和设备有较高的要求，检测时间长；LAMP技术是一种较新的基因诊断技术，其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，运用具有链置换活性的DNA聚合酶在65℃恒温条件下通过自动循环的链置换DNA合成过程，反应约60min，可实现对靶DNA的扩增，但技术存在假阳性高，引物探针设计复杂，不容易设计等问题。重组酶介导扩增(RAA)技术是一种在恒温条件下进行核酸快速扩增的方法，使用RAA技术可在短时间内获得琼脂糖凝胶电泳检测可见的扩增片段，并且在RAA反应体系中加入荧光基团，利用与荧光信号实时监控整个RAA反应过程，半个小时以内可实现对起始模板的定量和定性分析。整个反应过程快速简单，因为不需要高温循环，不需要昂贵的仪器设备，特别适用于非实验室检测场所。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供快速检测FPV的引物、探针、试剂盒和方法，该方法能利用该试剂盒实现对FPV的快速检测。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

RAA荧光法检测FPV的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第34位碱基修饰荧光报告基团，在第36位碱基修饰四氢呋喃残基和在第37位碱基修饰淬灭基团。

进一步的，所述荧光报告基团为FAM的胸腺嘧啶脱氧核苷酸、所述淬灭基团为BHQ的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

本发明还包括包含所述引物探针组的试剂盒。该试剂盒具体由：上述1的引物对，上述2的探针，以及DNA提取试剂，RAA基础荧光通用反应试剂，猫细小病毒阳性及阴性对照品组成。

进一步的，所述猫细小病毒阳性对照为含有猫细小病毒保守区基因部分序列的阳性质粒，其核苷酸序列如SEQ.ID.No.4所示；阴性对照为双蒸水

进一步的，所述试剂盒中上游引物、下游引物和探针的摩尔比为10:10:3。

本发明还包括所述试剂盒在检测FPV上的应用。

本发明还包括非诊断目的用于FPV的检测方法，所述方法包括如下步骤：

收集病猫的肛拭子或病死猫的组织样品，提取样品DNA，将该产物与引物探针组混合进行RAA反应，反应呈阳性说明样品中有FPV；反应呈阴性说明样品中无FPV。

进一步的，所述RAA反应的反应体系为：A Buffer 25μL、10μmol/L的上游引物2μL、10μmol/L的下游引物2μ、10μmol/L的探针0.6μL；DNA模板2μL；补足dd H₂O至47.5μL，混合均匀后短暂离心，再加入2.5μL B Buffer混合均匀即得。其中，A Buffer主要成分为20％的PEG；B Buffer为280mM的MgAc。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明的目的是提供一种用于重组酶介导核酸扩增技术(RAA)检测猫细小病毒的引物、荧光探针以及该引物、荧光探针在检测猫细小病毒中的应用。本发明的引物探针组经过简并设计后，能测试出更多的亚型，经过与其它引物探针组进行对比发现该引物探针组具有灵敏性高、检测效果更好的特点；本发明的RAA检测法相对于其它检测技术，不需依赖PCR仪等昂贵仪器，在37-42℃恒温条件下，5-30min就能出诊断结果，检测时间大大缩短；本发明全封闭反应并能实时监控荧光数据，无后续处理避免环境污染，检测结果可靠；此外，本发明提供的恒温荧光RAA引物和探针特异性强、灵敏性高，能完全满足临床上猫细小病毒感染疫病的快速诊断，可作为养殖场、基层实验室、宠物医院等场所开展快速检测的良好方法。

【附图说明】

图1为不同引物对的荧光反应结果，从左到右依次为：FPV-RAA-F2/R2、FPV-RAA-F2/R1、FPV-RAA-F1/R2、FPV-RAA-F2/R3、FPV-RAA-F3/R1、FPV-RAA-F3/R2；

图2为本发明RAA检测方法敏感性试验结果图；从左到右标准品的浓度依次为：1.0×10⁶copies/μL、1.0×10⁵copies/μL、1.0×10⁴copies/μL、1.0×10³copies/μL、1.0×10²copies/μL、1.0×10¹copies/μL和1copies/μL。

图3为本发明RAA检测方法特异性试验结果图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

本发明用于检测猫细小病毒的荧光RAA引物、探针设计如下：

以猫细小病毒的特异性保守区域设计特异性引物及荧光探针：课题组设计了3对引物具体如表1：

表1引物相关信息

引物名称	引物序列(5’-3’)	简并引物
			FPV-RAA-F1	AAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGG
FPV-RAA-F2	TYGCTACAGGAACATTTTTTTTTGATTGYAAAC	Y＝C/T
			FPV-RAA-F3	CTTACCACCATTTYTAAATTCTTTRCCTCAATC	R＝A/G
FPV-RAA-R1	GTGCTATATATGTAAATCTCTCKGGTGTTTCTC	K＝G/T
			FPV-RAA-R2	CCCTTGTGTAGAYGCTTCAAAAGAATAATATGG	Y＝C/T
FPV-RAA-R3	AGTTACACCACGTCTTTTATCTTGTTGARCTCC	R＝A/G

通过将上述引物进行两两组合得到9对引物，分别为：FPV-RAA-F1/R1、FPV-RAA-F2/R2、FPV-RAA-F3/R3、FPV-RAA-F1/R2、FPV-RAA-F1/R3、FPV-RAA-F2/R1、FPV-RAA-F2/R3、FPV-RAA-F3/R1和FPV-RAA-F3/R2将上述9对引物进行普通的RAA电泳筛选，最后发现，9对引物中仅有6对能进行特异性扩增，这6对分别为：FPV-RAA-F2/R2、FPV-RAA-F2/R1、FPV-RAA-F1/R2、FPV-RAA-F2/R3、FPV-RAA-F3/R1、FPV-RAA-F3/R2；然后在这6对引物之间设计了探针进行荧光反应；探针的相关信息如表2：

表2探针相关信息

具体的探针序列如下：

5’-ATTTYTAAATTCTTTRCCTCAATCTGAAGGAGC[i6FAM-dT]A[THF][iBHQ1-dT]AACTTTGGTGATATAG-3’

在进行荧光反应时，课题组发现，FPV-RAA-F2/R2引物对荧光起最快，具体如图1所示，图中从左到右的引物对依次为：FPV-RAA-F2/R2、FPV-RAA-F2/R1、FPV-RAA-F1/R2、FPV-RAA-F2/R3、FPV-RAA-F3/R1和F3/R2：图中明显可见F2/R2的曲线相对其他引物更陡。

因此，在上述引物中优选F2/R2为检测引物，具体如表3：

表3引物探针组信息

表3中，R表示所述核苷酸序列中的碱基为A或G，Y表示所述核苷酸序列中的碱基为C或T；

将表3的引物和探针送生工生物工程(上海)公司合成，用DEPC处理水溶解，-20℃保存。

实施例2：

本实施例为采用实施例1的引物检测猫细小病毒的荧光RAA方法，具体如下：

(一)恒温荧光RAA反应

1.样品DNA提取：收集病猫的肛拭子或病死猫的组织样品，用AXYGEN病毒DNA/RNA小量提取试剂盒，按照试剂盒说书进行提取DNA，产物直接用于RAA反应或置于-80℃保存备用。

2.使用FPV-RAA-F2、反向引物FPV-RAA-R2和荧光探针FPV-RAA-P，以及RAA干粉管(南宁壮博生物科技有限公司)，以制备的DNA样品为模板进行RAA扩增，反应体系：RAA干粉管中加入A Buffer 25μL；FPV-RAA-F、FPV-RAA-R(10μmol/L)各2μL；探针FPV-RAA-P(10μmol/L)0.6μL；DNA模板2μL；补足dd H₂O至47.5μL，混合均匀后短暂离心，再加入2.5μL BBuffer并混合均匀。以实验室保存的含有目标基因序列(SEQ.ID.No.4)的重组质粒pET-FPV为阳性标准品，dd H₂O为阴性标准品分别设立阳性对照和阴性对照。其中，A Buffer主要成分为20％的PEG；B Buffer为280mM的MgAc。

在研究反应体系时，课题组对引物不同浓度及反应条件进行了实验，具体如下：以浓度为1.0×10⁴copies/μL的阳性重组质粒pET-FPV标准品为模板，根据上述的反应体系进行配制，在37℃～42℃(6个温度)下进行RAA反应，检测起峰时间和荧光强度，通过比对发现在37℃～42℃之间，各温度的荧光强度和起峰时间均没有出现明显的差异，各反应温度均可进行后续实验。分别以0.5、1、2、3、4μL的引物(浓度为10μmol/L)，以及体积分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μL的探针(浓度为10μmol/L)进行RAA反应，通过综合分析比较，筛选出引物体积为2μL、探针体积为0.6μL时，RAA扩增效果最佳。

3.将上述反应管置于荧光基因检测仪或荧光定量PCR仪中，40℃反应20min，进行荧光监测。

阴性对照：FAM通道无扩增曲线，或出峰时间≥20min，且无Ct值或Ct≥35；

阳性对照：FAM通道有典型扩增曲线，出峰时间≤15min，且Ct值≤30；

以阴性对照、阳性对照同时满足上述条件时，判定试验成立条件。所检测样品FAM通道有扩增曲线，判定猫细小病毒阳性，所检测样品FAM通道无扩增曲线且Ct值≥35或显示Undet，判定猫细小病毒阴性。

(二)敏感性试验

制备FPV标准品：测定含有目标基因序列(SEQ.ID.No.4)的阳性标准品重组质粒pET-FPV浓度，并将其分别稀释成含量为1.0×10⁷copies/μL、1.0×10⁶copies/μL、1.0×10⁵copies/μL、1.0×10⁴copies/μL、1.0×10³copies/μL、1.0×10²copies/μL、1.0×10¹copies/μL的标准品。

用前述建立的荧光RAA方法，以1.0×10⁷copies/μL～1.0×10¹copies/μL的标准品为模板进行RAA扩增，试验证明该检测方法的检测限达10copies/μL，敏感性试验结果如图2所示。

(三)特异性试验

用前述建立的荧光RAA方法，分别以猫细小病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)、猫疱疹病毒(FHV)、猫传染性腹膜炎(FIPV)的核酸为模板进行荧光RAA试验，评价荧光RAA方法特异性。结果如图3所示，仅FPV样品出现正常扩增，阴性对照及其他样品均未出现扩增曲线，表明该检测方法具有良好的特异性。

实施例3

临床样品检测试验

从南宁不同宠物医院采集的12份疑似感染猫细小病毒的猫肛拭子，分别按照本发明的荧光RAA检测方法、PCR方法与荧光定量PCR方法进行检测、验证。结果显示，荧光PCR法和荧光RAA法在检测的12份样品中，均为5份样品出现明显的扩增曲线，为阳性，7份样品无明显扩增曲线，为阴性，两种方法的结果符合率为100％；PCR检测的样品中，3份为阳性，9份为阴性，并且荧光RAA法检测为阳性的5份样品中，普通PCR检测为阴性。

综上，本申请的引物探针组的具有灵敏性高，检测范围广，特异性强，检测效果突出的优点，能完全满足临床上猫细小病毒感染疫病的快速诊断，可作为养殖场、基层实验室、宠物医院等场所开展快速检测的良好方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> RAA荧光法检测FPV的引物探针组及试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (2 )..(29)

<223> y is c or g or t

<400> 1

tygctacagg aacatttttt tttgattgya aac 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> y is c or t

<400> 2

cccttgtgta gaygcttcaa aagaataata tgg 33

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> y is c or t

<400> 3

atttytaaat tctttrcctc aatctgaagg agctactaac tttggtgata tag 53

<210> 4

<211> 467

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa tttgctacag gaacattttt 60

ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa acaaatagag cattgggctt 120

accaccattt ctaaattctt tgcctcaatc tgaaggagct actaactttg gtgatatagg 180

agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga aatacagact atattactga 240

agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca ccatattatt cttttgaagc 300

atctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga cgggggggag cgcaaacaga 360

tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt ggtagacaac atggtcaaaa 420

aactactaca acaggagaaa cacccgagag atttacatat atagcac 467

Claims

1.RAA荧光法检测FPV的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第34位碱基修饰荧光报告基团，在第36位碱基修饰四氢呋喃残基和在第37位碱基修饰淬灭基团。

2.根据如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM的胸腺嘧啶脱氧核苷酸、所述淬灭基团为BHQ的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

3.包括如权利要求1或2任意一项所述引物探针组的试剂盒。

4.如权利要求3所述试剂盒在检测FPV上的应用。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中上游引物、下游引物和探针的摩尔比为10:10:3。

6.非诊断目的用于FPV的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述非诊断目的用于FPV的检测方法，其特征在于，所述RAA反应的反应体系为：A Buffer 25μL、10μmol/L的上游引物2μL、10μmol/L的下游引物2μ、10μmol/L的探针0.6μL；DNA模板2μL；补足dd H₂O至47.5μL，混合均匀后短暂离心，再加入2.5μL BBuffer混合均匀即得。