CN107739738A

CN107739738A - 一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1及其表达蛋白和应用

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Publication number: CN107739738A
Application number: CN201711258288.2A
Authority: CN
Inventors: 陈金慧; 金磊磊; 施季森; 钟山; 成铁龙; 杨立明
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2018-02-27
Anticipated expiration: 2037-12-04
Also published as: CN107739738B

Abstract

本发明公开了一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1及其表达蛋白和应用，LcCESA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明以模式植物拟南芥为研究对象，将克隆得到的中国鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1利用农杆菌介导转化至拟南芥中，通过筛选与培育，最终获得T3代纯合转基因植株；通过观察野生型拟南芥与转基因拟南芥的显微结构，发现转基因拟南芥的茎段维管束组织细胞细胞壁和叶片组织细胞细胞壁的厚度，均与野生型拟南芥存在差异，可见LcCESA1基因对拟南芥茎段维管束组织细胞细胞壁和叶片组织细胞细胞壁均有影响，可促进纤维素的积累，将具有广泛的应用。

Description

一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1及其表达蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因技术领域。具体涉及一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1及其表达蛋白和应用。

背景技术

植物中的纤维素由多聚蛋白复合物合成，其由质膜中的六聚体，类似玫瑰花结构组成。每个六聚体组分的单个单元称为纤维素合酶A（cellulose synthase-A，CESA），其中字母A代表催化亚基。纤维素分子的基本结构单位是吡喃式D-葡萄糖，是由β-1,4糖苷键连接而成的高分子聚合物，并通过分子内氢键使其形成一种类螺旋状的结构。其葡萄糖残基约为2000-25000个。细胞中的高尔基体中产生半纤维素和果胶前体低聚物，然后通过胞吐分泌到质膜而在质膜上合成纤维素。植物体中的纤维素以小纤维形式存在，由36个糖苷链组成。植物细胞壁中多糖的结构、糖基组成、糖基间的连接键及糖基的修饰作用等已研究的较为清楚，但对涉及多糖合成的酶与多糖聚合还知之甚少。由单糖聚合成多糖涉及大量的糖苷转移（glycosyltransferase）反应。虽然多糖构成细胞壁的绝大部分，但细胞壁上也含有许多蛋白质。位于植物细胞壁的相对明确定义的蛋白质组是结构糖蛋白，例如富脯氨酸糖蛋白（HRGP），富含脯氨酸蛋白（PRPs），富含甘氨酸蛋白（GRP）和阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP）。这些蛋白质的功能尚不清楚。然而，蛋白质的聚糖部分很可能与细胞壁多糖形成氢键和盐桥，从而为细胞壁提供机械强度以支撑起细胞的结构。

随着社会的快速发展，人类对植物纤维的需求激增，而过度利用自然界的植物纤维资源将对人类生存造成极大的破坏。植物纤维素生物合成机制的研究对材质改良，木材定向培育以及农业、造纸等化工业都十分重要。而纤维素主要由纤维素合酶来合成，所以对植物纤维素合酶基因及其蛋白的研究显得更有价值。要掌握纤维素合成酶基因的调控也显得格外重要。近年来，随着基因组学研究的进展，植物纤维素合酶的研究取得了很大的进展。

在自然界中，许多生物可以合成纤维素。除植物以外，一些细菌、真菌与少量的低等动物也可以合成纤维素，但它们的基因之间的相似性较低。纤维素合酶基因首先是在木醋杆菌( Acetobacter xylinum) 中发现的。1996年，研究人员首次在棉花基因中克隆出纤维素合酶基因，之后研究者们从40多种植物中克隆了1400多个相关的序列，包括拟南芥、玉米、大麦、杨树、松、水稻、细叶桉、紫花苜蓿等。纤维素合酶是一个庞大的基因家族，家族内的每个酶彼此相关，协同作用。同时，利用突变体研究已经了解到CESA在纤维素合成中的作用及表达调控。此外，在植物中还存在大量的纤维素合成酶相似蛋白。研究表明，纤维素生物合成是纤维素合成基因、非纤维素多糖合成基因以及结构蛋白与非结构蛋白基因等在细胞发育信号调控下进行协同表达、相互作用的过程。

纤维素合酶超家族，属于糖基转移酶(GT)家族。主要包含纤维素合酶与类纤维素合酶两个成员。研究发现纤维素合酶在质膜上催化纤维素的生物合成，而类纤维素合酶是在高尔基体体腔中介导半纤维素合成的，而后再运出细胞壁。除了纤维素合酶之外，植物体内还有一些类纤维素合酶(cellulose synthase-like，CSL)也被鉴定出来。对CSL的免疫定位研究表明，它们位于细胞质中(例如高尔基体)，并在高尔基体内介导了半纤维素主链的合成。CSL和CESA基因具有很高的序列相似性，他们编码的蛋白质都具有糖基转移酶的活性。虽然目前对纤维素合酶的研究已经较为成熟，但两者之间的对纤维素及类纤维素的全部催化合成产物研究尚不足够。

杂交鹅掌楸（Liriodendron chinensis-Liriodendron tulipifera）是由分布在我国的鹅掌楸（L. chinensis）和分布在北美的北美鹅掌楸（L. tulipifera）杂交选育而成，是由叶培忠教授于上世纪创造的优秀的造林、观赏和加工树种。其树木高大，纤维素含量丰富，是非常理想的工业经济树种。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1，满足使用需求。本发明的另一目的是提供上述一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1的表达蛋白。本发明还有一目的是提供上述一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1的表达载体或宿主菌。

所述的鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1在促进植物生长中的应用。

所述的应用，促进植物茎段维管束组织细胞细胞壁和叶片组织细胞细胞壁的厚度的生长。

有益效果：与现有技术相比，本发明以模式植物拟南芥为研究对象，将克隆得到的中国鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1利用农杆菌介导转化至拟南芥中，通过筛选与培育，最终获得T3代纯合转基因植株；通过观察野生型拟南芥与转基因拟南芥的显微结构，发现转基因拟南芥的茎段维管束组织细胞细胞壁和叶片组织细胞细胞壁的厚度，均与野生型拟南芥存在差异，可见LcCESA1基因对拟南芥茎段维管束组织细胞细胞壁和叶片组织细胞细胞壁均有影响，可促进纤维素的积累，将具有广泛的应用。

附图说明

图1是菌液PCR检测结果图；图中，M：DL 15000 Marker，1~10：菌液样品；

图2是转LcCESA1基因拟南芥T1代植株DNA结果图；图中，M：DL 15000 Marker；1-4：LcCESA1转基因拟南芥株系1-4；5、6：野生型拟南芥；

图3是转LcCESA1基因拟南芥T1代植株检测引物PCR鉴定结果图；图中，M：DL 2000Marker；P：重组质粒，阳性对照；1-4：LcCESA1转基因拟南芥株系1-4；5、6：野生型拟南芥；

图4是转LcCESA1基因拟南芥T3代植株PCR检测结果图；图中，M：DL 15000Marker；1:重组质粒，阳性对照；2-4：LcCESA1转基因拟南芥株系1、2、4；5：WT野生型拟南芥植株。6、7：阴性对照；

图5是40天WT野生型与转基因拟南芥茎横面切扫描电镜观察结果图；图中，第二列和第三列是第一列的放大图；第一列图放大倍数为100倍，第二列为400倍，第三列为1600倍。图中红框表示放大部分。图中①：代表维管束组织中初生木质部部分；②：代表髓部薄壁细胞；③：代表初生韧皮部；④代表导管；

图6是WT野生型与转基因拟南芥茎段维管束细胞壁细胞壁厚度统计图；

图7是WT野生型与转基因拟南芥叶片横切面扫描电镜观察图；第二列为第一列的放大图，第一列图放大倍数为1600倍，第二列图放大倍数为3000倍。图中方框表示放大部位；

图8是40天WT野生型和LcCESA1转基因拟南芥叶肉细胞细胞壁厚度统计结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的材料和试剂如下：

感受态细胞和质粒载体：感受态细胞：大肠杆菌菌株（Escherichia coli）

Top 10，农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens) EH105；质粒载体：pBI121，

pBI121-LcCESA1载体。

酶：Gibson Assembly^® Master Mix, 购自NEB公司;Q5^®超保真2×Master

Mix，购自NEB公司; EmeraldAmp^® PCR Master Mix，购自Takara公司；2×Vayme LAmp^®Master Mix，购自诺唯赞公司。通用总RNA提取试剂盒（离心柱型），购自Bioteke公司。

培养基：LB液体培养基：酵母浸膏5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，pH调至7.0；LB固体培养基：酵母浸膏5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，琼脂15g/L，pH调至7.0。1/2MS培养基：25mL/L大量元素母液、10mL/L微量元素母液、10mL/L有机物质、10mL/L铁盐、20g/L蔗糖、0.5g/LMES，pH调至5.8；琼脂糖悬浮液：加入0.1%琼脂糖,去离子水定容。

抗生素：卡那霉素50mg/mL、链霉素60mg/mL

植物材料：-20℃干燥保存的哥伦比亚型拟南芥种子。

培养基质：营养土、蛭石、珍珠岩以3:1:1的体积混匀，筛分后，装入育苗盆中。

营养液：25mL/L大量元素母液、10mL/L微量元素母液、10mL/L有机物质、10mL/L铁盐。

固定液：2.5%戊二醛固定液配方（100mL）：25%戊二醛10mL；0.2M PBS(pH7.2)溶液50mL；ddH₂O至100mL。

脱水液：0.1M磷酸缓冲液；30%乙醇；50%乙醇；70%乙醇；100%乙醇。

冷冻切片预处理液：卡诺固定液（乙醇与乙酸以3:1体积混合，现配）；20%的蔗糖-PBS保护液（每100mL PBS溶液含20g蔗糖）。

实施例1 LcCESA1的克隆以及LcCESA1过表达载体构建

1、引物设计：根据鹅掌楸的转录组数据，比对拟南芥的CESA1基因的CDS序列预测LcCESA1基因序列，并设计适用于Gibson Assembly的特异性CDS全长引物。

LcCESA1的CDS全长引物：Primer-F：5'-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGAGGCGAATGCTGGAATGGT-3'；Primer-R：5'-ATAAGGGACTGACCACCCGGGGCAGTTGATGCCACATTGGTTTGC-3'。

2、目的基因的克隆：利用Q5超保真酶对鹅掌楸的cDNA样品进行PCR扩增，获得目的基因条带。

（1）体系：3μL ddH₂O，5μL Q5^®超保真2×Master Mix，0.5μL Primer-F(10μM)，0.5μL Primer-R(10μM)，1μLcDNA。

（2）PCR反应程序：98℃30s；98℃10s，72℃30s，72℃2min，35 cycles；

72℃2min；4℃保存。

3、连接载体与目的基因：5μL Gibson Assembly^® Master Mix(2×)，1.55μLpBI121(0.02pmol)，1.46μL LcCESA1的PCR样品(0.2pmol)，ddH₂O补齐到10

μL，在PCR仪中，50℃反应1h，产物于-20℃保存。

4、载体转化：取连接产物放置于超净工作台中将其稀释4倍，加入到50μL的感受态细胞中（每100μL中含有目的DNA 1ng），轻弹混匀，在冰浴中静置30min；冰浴后，将其放置在42℃水浴中热激90s，再快速转移到冰上，冰浴静置3min；在超净工作台中将冰浴后的样品加入至900μL LB培养基，置于37℃，180rpm恒温摇床中培养3h。

5、涂板：将转化后的感受态细胞中吸取出150~200μL，均匀涂在含卡那霉素（50mg/L）的LB平板培养基中，倒置于37℃培养箱中培养16h。

6、挑斑：挑取最先长出来的单克隆菌斑，放置于600μL含卡那霉素（50mg/L）的LB液体培养基中，置于37℃，180rpm恒温摇床中培养3h。

7、菌液扩大培养与保存：按1∶1000的体积比，接种3mL含卡那霉素（50mg/L）的LB的液体培养基。其余菌液加入1/3体积的50%的甘油，置于-80℃冰箱保存。

8、菌液PCR检测：以菌液为模板，进行菌液PCR检测。

（1）体系：3.2μL ddH₂O，5μL EmeraldAmp^® PCR Master Mix，0.4μL

Primer-F10μM)，0.4μL Primer-R(10μM)，1μL菌液。

（2）PCR反应程序：94℃2min；98℃10s，55℃30s，72℃4min，35 cycles；72℃7min；4℃保存。

9、重组质粒提取：将扩大培养后的菌液置于离心机中，5000rpm离心5min，倒去上清液。在菌体沉淀中加入300μL Solution I, 换到1.5mLEP管中涡旋充分。加入300μLSolution II，上下颠倒混匀，静置5min。加入300μL Solution III，上下颠倒混匀，冰上静置5min。12000rpm离心15min，取上清液并置于新的管子中。加入600μL的异丙醇，上下颠倒混匀10次，静置2min。12000rpm离心

15min，去倒去上清液。70%酒精清洗两次，12000rpm离心2min，倒去上清液。吸去多余液体，置于超净工作台吹干。加入20μL ddH₂O溶解。

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测菌液PCR结果，如图1所示，利用全长引物对菌液进行了PCR检测，发现1、2、4、5、6、8、9、10样品均能扩增得到3kb片段, 与转录组分析测序结果一致。选取第4、5、6号菌液样本进行扩大摇菌，提取质粒，质粒经PCR检测后送去公司测序。获得鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。同时，获得的pBI121-LcCESA1的过表达载体为接下来转化拟南芥做准备。

实施例2 LcCESA1转基因拟南芥鉴定与筛选

1、拟南芥培养

1）拟南芥种子消毒：取适量野生型拟南芥种子放入灭菌后的EP管中，加入适量75%乙醇，振荡消毒30s后吸出；加入同等量0.1%升汞，消毒2.5min后吸出（弃于专用废液缸）；加入同等量去离子水，振荡洗涤后吸出并将种子放于新EP管中；重复水洗四次。

2）拟南芥的培养：将消毒完毕后的种子置于悬浮液中，利用移液枪均匀播入1/2MS培养基中；密封好培养基，放入4℃冰箱中春化3天；将春化后的培养基置于23℃恒温培养室培养7天；待拟南芥幼苗长出2片真叶时，将拟南芥移栽至事先准备好的基质培养土中，并放入光照培养箱中培养，光照培养箱设置参数为：23℃恒温、光强5LS，湿度75%，光照时间16h/d；待拟南芥进入盛花期前用于转化。

2、拟南芥的转化：将农杆菌感受态细胞冰浴融化，每管200μL的感受态细胞中加入1~5μL（100ng）回收纯化的pBI121-LcCESA1植物表达载体重组质粒，轻轻吸打混匀，置于冰上，冰浴静置30min；取液氮适量，速冻1min，后37℃热激5min，再迅速置于冰上静置2min；加入800μL LB液体培养基，于28℃，100rmp恒温摇床上振荡培养2~4h；将振荡培养后的液体置于400rmp离心机中离心3min，去除上清液；混匀剩余菌液，并均匀涂在含卡那霉素（50mg/mL）和链霉素（30mg/mL）的LB平板培养基中，倒置于28℃培养箱中培养30~48h，直至长出菌落；挑斑：挑取单菌落，接种于5mL含卡那霉素（50mg/μL）和链霉素（30mg/μL）的LB液体培养基中，置于28℃，250rmp恒温摇床中摇菌液8~10h，至菌液刚刚变浑浊后取出；吸取1mL刚变浑浊的菌液，接种到50mL LB液体培养基中继续摇菌24h，至菌液OD_600nm值约为0.8；将菌液置于5000rmp离心机中离心5min，收集菌体，并置于重悬液中悬浮；加入SilwetL-77，浓度为0.05%(500μL/L)，直至晃出泡沫；将拟南芥地上部分在悬浮液中浸泡15~30s，并轻轻晃动；将浸过菌液的拟南芥平放在托盘里，敷以保鲜膜以保湿，锡箔纸密封遮光24h；揭开锡箔纸，继续放回光照培养箱中正常培养，直至种子成熟时便停止浇水；收集拟南芥的种子为T1代种子，并于37℃烘干一周后保存。

3、转LcCESA1基因的拟南芥T1代阳性植株的筛选

1）Neff-法提取拟南芥DNA：（1）在1.5mL的EP管中放入1~2片拟南芥叶片，并将叶片组织粉碎；（2）加入500μL提取缓冲液，混匀；（3）混匀后置于13000rpm离心机中，离心10min；（4）吸取上清液并转移至新的EP管中；（5）加入450μL 异丙醇，混匀；（6）混匀后置于13000rpm离心机中，离心

20min；（7）加入70%冰乙醇洗两次，再置于13000rpm离心机中，离心10min；（8）吹干，加20μL ddH₂O溶解。

2）LcCESA1转基因拟南芥PCR检测

PCR体系：3.2μL ddH₂O，5μL 2×Vayme LAmp^® Master Mix，0.4μL

Primer-F (10μM )，0.4μL Primer-R(10μM)，1μL DNA。

LcCESA1转基因拟南芥的PCR检测引物含部分35S和部分目的基因片段。

Primer-F：5'-GACCTAACAGAACTCGCCGTA-3'，Primer-R： 5'-CGTAAGCCCAACAGTATCTCC-3'。

PCR程序：94℃2min；98℃10s，55℃30s，72℃1min，35 cycles；72℃

4min；4℃保存。

农杆菌侵染转化过的拟南芥的种子经消毒后播入含卡那霉素（50mg/L）的

1/2MS培养基中，春化3d开始发芽后，转入光照培养室，观察植株生长变化。由于卡那霉素的影响，非转基因植株与对照组植株幼苗逐渐黄化枯萎，转基因幼苗正常生长。10d左右转基因植株与对照组植株全部黄化死亡。经卡那霉素筛选后获得4棵植株，分别命名为T1-1、T1-2、T1-3、T1-4。Neff-法提取这4个转基因拟南芥株系的DNA后（图2），进行PCR检测，T1-1、T1-2、T1-4分别获得了相应条带（图3），即成功转入基因LcCESA1。

4、转基因拟南芥T3代的RT-PCR检测

1）将上述T1代种子进行消毒处理后（方法同上），播入含卡那霉素（50mg/L）的1/2MS培养基中，春化3d后，放入适宜环境中培养（培养条件同上）。然后移入基质土中，收取种子为T2代转基因拟南芥种子。将所得T2代转基因拟南芥种子进行如上述步骤的培养，筛选T3代纯合转基因拟南芥种子及植株，将这3个转基因株系命名为T3-1、T3-2、T3-4。

将T3代转基因拟南芥植株移入基质土后，放于光照培养箱中培养（设置参数为：23℃恒温光照、光强5LS，湿度75%，光照时间16h/d）培养，提取T3代转基因拟南芥总RNA，经反转录成cDNA后进行PCR检测。

RNA提取方法：分株剪取拟南芥叶片，每株叶片约取100mg，加入液氮充分研磨，待植物叶片研成粉末后，在研钵中加入1mL的裂解液PL后匀浆；转移样品至1.5mL RNase-Free离心管中，在65℃条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解；室温条件下12000rpm离心10min，小心取上清转入一个新的RNase-

Free过滤柱中；10000rpm离心45s。收集下滤液于收集管中，进行下一步操作；在收集管中加入1倍体积70%乙醇，颠倒混匀。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中；10000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管；加入500μL漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液；将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；加入已配置好的消化液100μL（消化液组成：RNase-Free DNase 3μL，DNase 10×Reaction Buffer 1μL，RNase-

Free Water 87μL）于吸附膜的中间部分，37℃保温15~30min。加入500μL去蛋白液RE，室温放置2min，12000rpm离心45s，弃掉废液；加入500μL漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液；重复步骤K；将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；取出吸附柱RA，放入一个RNase-Free离心管中，在吸附膜的中间部位加入50μL RNase-FreeWater（事先在65~70℃水浴中加热），室温放置2min，12000rpm离心1min。

2）RNA浓度及纯度检测后，进行第一条cDNA链合成。

逆转录反应体系：2μL 5×HiScript^@ⅡqRT SuperMix，1pg~500ng模板

RNA， RNase-Free ddH₂O补至10μL。

逆转录反应程序：25℃10min，50℃30 min，85℃5min。

按照以上体系获得T3代转基因拟南芥cDNA，并以该cDNA为模板，以阳性克隆菌液为阳性对照，无菌水为阴性对照，用全长引物进行PCR检测。

PCR反应如下：

PCR体系：5μL 2×Vayme LAmp^® Master Mix，0.8μL Primer-F (5μM)，0.8μL Primer-R(5μM)，1μL cDNA，2.4μL ddH₂O。

PCR程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35 cycles；72℃7min；4℃保存。

PCR扩增后，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

将获得的T3代纯合转基因3个株系植株分别进行栽植，从其叶片中提取RNA，反转录合成第一条cDNA后进使用全长引物行PCR检测（图4），检测结果显示T3代转基因植株均出现相应条带（目的条带约3.2kb，图中P为5kb，O为2.5kb），说明LcCESA1已成功导入拟南芥中，并在T3代拟南芥植株中稳定表达。

本实施例采用农杆菌介导的方法，将含有LcCESA1基因的农杆菌菌液侵染拟南芥花序。荚果成熟后，收取种子灭菌，点种于1/2MS培养基中培养出第一代转基因拟南芥植株，并进行阳性植株的筛选，获得T1-4四棵植株后进行PCR验证，获得T1-1、T1-2、T1-4三个株系的目的条带，初步认定基因成功导入至这三个株系中，经过第二代和第三代的培养筛选后，提取T3代纯合植株的RNA，经过RT-PCR检测验证，T3-1、T3-2、T3-4三个转基因株系中均能表达LcCESA1基因。

实施例3 LcCESA1转基因拟南芥再生植株的显微结构观察

以实施例2制备的LcCESA1转基因拟南芥T3代种子为植物材料，并以野生型拟南芥为对照，进行LcCESA1转基因拟南芥再生植株的显微结构观察比较。

1、拟南芥培养

1）拟南芥种子消毒：取野生型拟南芥种子适量放入灭菌后的EP管中，加入75%乙醇适量，振荡消毒30s后吸出；加入等量0.1%升汞，振荡消毒2.5min后吸出（弃于专用废液缸）；加入等量去离子水，振荡洗涤后吸出并将种子放于新EP管中，重复水洗四次。

2）拟南芥的培养：将消毒完毕后的种子置于悬浮液中，利用移液枪均匀播入1/2MS培养基中；密封好培养基，放入4℃冰箱中春化3天；将春化后的培养基置于23℃恒温培养室培养7天；待拟南芥幼苗长出2片真叶时，将拟南芥移栽至事先准备好的基质培养土中，并放入光照培养箱中培养。每个株系设置20个重复，共种植了80棵植株。光照培养箱设置参数为：23℃恒温、光强5LS，湿度75%，光照时间16h/d。

2、拟南芥扫描电镜显微结构观察

1）取材部位：茎段：从主茎距离基部（地上部分）5cm处开始剪取，剪至6cm处，长约1cm的茎段：每个株系取3个重复。叶片：大小和部位相一致外围莲座叶各一片，作电镜观察；每个株系取3个重复。

2）扫描电镜样品固定：现配好2.5%戊二醛固定液，将拟南芥茎段放入固定液中，固定液以没过茎段顶部为宜，放入4℃冰箱，固定3~5d。

3）扫描电镜样品脱水与干燥：pH7.2，0.1M磷酸缓冲液清洗，20min；pH 7.2，0.1M磷酸缓冲液清洗，20min；pH7.2，0.1M磷酸缓冲液清洗，20min；30%乙醇梯度脱水，15min；50%乙醇梯度脱水，15min；70%乙醇梯度脱水，15min；90%乙醇梯度脱水，20min；100%乙醇梯度脱水，20min；100%乙醇梯度脱水，20min；100%乙醇梯度脱水，20min；装篮，干燥篮孔底垫上适当大小滤纸片；适当大小的滤纸盖片；进行临界点干燥。

4）扫描电镜样品切片与粘片：扫描电镜样品切片厚度上没有冷冻切片要求严格，即要求样品切面完整平整即可，每个茎段样品切取3个切面，做为3个重复；叶片样品切片时沿垂直于叶片主脉方向横切，同样切取3个切面，做为3个重复。

5）扫描电镜样品观察：茎段：主要观察茎段的整个横断面的结构，同倍数下细胞数量、大小以及细胞壁厚度在野生型与转基因型植株间的差异，利用统计软件分析比较维管束组织细胞的细胞壁厚度的统计学差异。叶片：主要观察叶片横断面中的组织结构，同倍数下细胞数量、大小以及细胞壁厚度在野生型与转基因型植株间的差异，利用统计软件分析比较叶肉细胞的细胞壁厚度的统计学差异。

拟南芥茎段和叶片样品在戊二醇固定、乙醇梯度脱水临界点干燥后，利用

FEI Quanta 200环境扫描电镜观察茎段和叶片横切面，如图5和图7所示。

在扫描电镜下，主要观察比较了野生型与转基因拟南芥茎段面的直径以及维管束细胞的细胞壁增厚情况。植物维管束组织主要包括初生韧皮部（③）、束中形成层和初生木质部（①），其中初生木质部包括导管分子（④）或管胞、薄壁组织细胞和纤维等所组成。在前人的报道中，有指出CESA1基因参与初生细胞壁纤维素的合成，故在扫描电镜下测量了相同部位维管束细胞初生木质部部分细胞壁厚度，数据利用SPSS分析如图6所示。

从图中数据分析可以得出，转基因型T3-1，T3-2，T3-4维管束组织细胞的细胞壁厚度显著要比野生型WT要高（株系2最厚），可见LcCESA1基因促进纤维素的合成，在细胞壁中积累增加，从而导致维管束组织细胞壁发生局部加厚的情况。

同时，观察并统计了野生型拟南芥与转基因型拟南芥茎横切面的直径，计算四个株系的平均值，WT：891.71μm，T3-1：909.19μm，T3-2：885.87μm，T3-4：924.14μm，野生型拟南芥与转基因型拟南芥在茎横切面没有出现显著性差异，初步推断LcCESA1基因对茎的粗细没有显著性影响。

在扫描电镜下观察40天野生型与转LcCESA1基因拟南芥叶片叶肉细胞（图7），发现T3-4株系的叶肉细胞细胞壁厚度显著高于野生型。

通过数据分析，如图8所示，转基因T3-4株系叶肉组织细胞细胞壁与野生型WT相比发生一定程度的加厚，推断断LcCESA1基因也参与了叶肉组织细胞的细胞壁增厚。

本实施例利用转LcCESA1基因拟南芥植株为研究材料，借助扫描电镜，通过测量高倍数下脱水拟南芥茎段维管束组织细胞，发现相同部位转基因拟南芥茎段中维管束组织细胞壁的厚度较野生型拟南芥中细胞壁厚度有显著增厚，初步判断LcCESA1基因的过表达对拟南芥茎段维管束细胞的细胞壁增厚有一定影响，这与LcCESA1基因的过表达促进了纤维素的合成相关。通过叶片横切面的扫描电镜观察，发现转基因株系T3-4的叶片细胞厚度较野生型拟南芥有显著增厚，初步判断LcCESA1基因的过表达对拟南芥叶片中叶肉细胞细胞壁增厚有一定影响。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1及其表达蛋白和应用

<130> 100

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3266

<212> DNA

<213> 杂交鹅掌楸(Liriodendron chinense × tulipifera)

<400> 1

atggaggcga atgctggaat ggtggccggt tcccacaaac gaaacgagtt cgtaatgatt 60

cggcacgaag gagaagtcgg gcctaagcct cttaaacatt tgaatggcca agtatgtcag 120

atatgtggag atactgttgg gcttacggcc acgggtgatg tctttgtcgc ttgcaatgag 180

tgtgccttcc cagtttgccg ggcttgttat gaatatgagc ggaaggacgg gaaccgctct 240

tgccctcagt gcaagactag atacaaaaga cacagaggaa gtcctcgagt ggagggtgac 300

gatgaagagg atgatgttga tgatctagag aatgagttca attacacaca tggcaatgga 360

aaggcggtgc gtcagtggca gatgcaaggg cagggagaag atgttgatct gtcgtcttca 420

tcaagacacg attctcaaca cccgattcca cttcttacca atgggcaacc ggtgtctggg 480

gaaatacctg atgctacacc tgacaatcag tctgtgagaa ctacatccgg tccattaggg 540

tctggagaaa aacgtgccca ttcgcttcct tacattgatc ctagcctgcc agttccagtg 600

aggattgtgg acccctcgaa ggacttaaat tcttatgggc ttggaaatgt tgactggaag 660

gagagagttg aaggttggaa acttaaacaa gagaaaaata tgatgcaaat gactagccga 720

tacactgatg gtaaaggtga tatggaaggg actggttcga atggcgaaga tctgcagatg 780

gctgatgatg ctcgtcaacc tttgagccga atagtgccta tttcttcttc tcaccttacc 840

ccttatcggg ttgtgatcat acttcggctt atcatcttag gcttctttct acagtatcgt 900

gtgacccacc ccgtgaagga tgcataccca ttgtggctaa catctgttat atgtgagatc 960

tggtttgctc tgtcttggct attggatcag ttcccaaaat ggttcccatc aaccgtgaaa 1020

cctacctcga caggcttgca ctgagatatg atcgggaggg ggagccttct cagctagctc 1080

ctattgatat ctttgttagt acagtggatc ctctcaaaga gcctcctctt gtgacggcca 1140

acactgtgct gtctatcctt tccgtggact accctgtcga caaagtctcg tgctatgttt 1200

ctgatgatgg gtccgccatg ttaacatttg aagccctctc ggagacttca gagtttgcca 1260

ggaagtgggt cccgttttgc aagaagcaca atatcgagcc cagggctcca gaattttact 1320

ttgctcaaaa gatagattac ttgaaggata aaatacagcc ttcttttgtg aaagagcgaa 1380

gggcaatgaa aagggaatat gaagagttca aagtacgaat caatgctctt gttgccaaag 1440

cgcaaaagac acccgaagag ggctggacga tgcaggatgg cactccttgg cccggaaaca 1500

atcctagaga tcatcccggc atgatccagg tgttcttggg ccacagcgga gggcttgata 1560

cggatggcaa tgagttacct cgacttgttt atgtgtcccg tgagaagcgg ccgggcttcc 1620

agcatcacaa gaaagctgga gcaatgaatg cactgattcg ggtatcggct gtcctgacca 1680

atggtgccta tcttctgaat gtcgactgtg atcattactt caataacagc aaagctcttc 1740

gtgaagcaat gtgtttcatg atggatcctg cctacggaaa gaaaacgtgc tatgttcagt 1800

tccctcagcg atttgacggc attgatctac acgatcgtta tgccaaccgt aacattgtct 1860

ttttcgatat caacttgaaa ggcctggacg gcatccaggg cccagtgtac gtgggtacag 1920

gatgttgttt caacaggcaa gcattgtatg ggtacgatcc ggtcctaact gaggctgacc 1980

tggaacccaa catcattgtc aagagctgtt gtggttcgag aaagaaggga aggaacggga 2040

acaagaaata tattgataaa aagcgggcaa tgagaagaac tgaatccact gttcccatct 2100

tcaatatgga agacattgag gagggggtcg aaggctttga ggatgagagg tcgctgctta 2160

tgtctcagaa aagtctagaa aagcgatttg gccagtcccc agttttcatt gcgtcaacct 2220

tcatggaaca gggagggata ccgcagtcca ctaatccagc atcactgctg aaagaagcca 2280

tccatgtcat cagctgcggt tatgaggata agactgagtg gggaaaagag attgggtgga 2340

tttatggttc tgtgacagaa gatattctta ctggttttaa aatgcatgct cggggatgga 2400

tatcaattta ctgcatgcct tcgcgccctg cgttcaaggg atctgctcca atcaatcttt 2460

ctgatcgttt gaatcaagtc cttcgatggg ctttgggatc aattgagatc ttgctgagta 2520

ggcattgccc catttggtat ggttacagcg gaaggttgaa gctgttggag aggcttgctt 2580

acatcaacac tatagtttat cctctcacct ccatcccact gcttgcatac tgcacgcttc 2640

cagccgtctg tcttcttact ggaaaattca tcattcctga gataagcaac tttgccagca 2700

tgtggttcat tctgctgttt atttccattt ttgcaactgg gattctagag ctcagatgga 2760

gtggagttgg gatcgaagac tggtggagga acgagcagtt ctgggtcatc ggtggtacat 2820

cggcccatct ctttgctgtt ttccaagggt tgctaaaagt tcttgctggg atagatacaa 2880

acttcactgt cacatccaaa gcatctgatg aagatgggga tttcgcggag ctgtacgtgt 2940

tcaagtggac ctcacttctt atccctccaa ccacagtcct cgtggtgaac atggtgggca 3000

tagtggctgg cgtttcgtat gccataaaca gtgggtacca gtcgtggggc cctctttttg 3060

gaaagctatt ctttgccata tgggtcattg tccatctata ccctttcctc aaaggtctgc 3120

tgggccggca aaatcgcact cccaccattg ttattgtctg gtcaattctc ctcgcttcca 3180

tcttctcctt gctgtgggtg cggattgatc ctttcacctc ttctacacaa aaagctgcag 3240

caaaccaatg tggcatcaac tgctaa 3266

<210> 2

<211> 1088

<212> PRT

<213> 杂交鹅掌楸(Liriodendron chinense × tulipifera)

<400> 2

Met Glu Ala Asn Ala Gly Met Val Ala Gly Ser His Lys Arg Asn Glu

1 5 10 15

Phe Val Met Ile Arg His Glu Gly Glu Val Gly Pro Lys Pro Leu Lys

20 25 30

His Leu Asn Gly Gln Val Cys Gln Ile Cys Gly Asp Thr Val Gly Leu

35 40 45

Thr Ala Thr Gly Asp Val Phe Val Ala Cys Asn Glu Cys Ala Phe Pro

50 55 60

Val Cys Arg Ala Cys Tyr Glu Tyr Glu Arg Lys Asp Gly Asn Arg Ser

65 70 75 80

Cys Pro Gln Cys Lys Thr Arg Tyr Lys Arg His Arg Gly Ser Pro Arg

85 90 95

Val Glu Gly Asp Asp Glu Glu Asp Asp Val Asp Asp Leu Glu Asn Glu

100 105 110

Phe Asn Tyr Thr His Gly Asn Gly Lys Ala Val Arg Gln Trp Gln Met

115 120 125

Gln Gly Gln Gly Glu Asp Val Asp Leu Ser Ser Ser Ser Arg His Asp

130 135 140

Ser Gln His Pro Ile Pro Leu Leu Thr Asn Gly Gln Pro Val Ser Gly

145 150 155 160

Glu Ile Pro Asp Ala Thr Pro Asp Asn Gln Ser Val Arg Thr Thr Ser

165 170 175

Gly Pro Leu Gly Ser Gly Glu Lys Arg Ala His Ser Leu Pro Tyr Ile

180 185 190

Asp Pro Ser Leu Pro Val Pro Val Arg Ile Val Asp Pro Ser Lys Asp

195 200 205

Leu Asn Ser Tyr Gly Leu Gly Asn Val Asp Trp Lys Glu Arg Val Glu

210 215 220

Gly Trp Lys Leu Lys Gln Glu Lys Asn Met Met Gln Met Thr Ser Arg

225 230 235 240

Tyr Thr Asp Gly Lys Gly Asp Met Glu Gly Thr Gly Ser Asn Gly Glu

245 250 255

Asp Leu Gln Met Ala Asp Asp Ala Arg Gln Pro Leu Ser Arg Ile Val

260 265 270

Pro Ile Ser Ser Ser His Leu Thr Pro Tyr Arg Val Val Ile Ile Leu

275 280 285

Arg Leu Ile Ile Leu Gly Phe Phe Leu Gln Tyr Arg Val Thr His Pro

290 295 300

Val Lys Asp Ala Tyr Pro Leu Trp Leu Thr Ser Val Ile Cys Glu Ile

305 310 315 320

Trp Phe Ala Leu Ser Trp Leu Leu Asp Gln Phe Pro Lys Trp Phe Pro

325 330 335

Ile Asn Arg Glu Thr Tyr Leu Asp Arg Leu Ala Leu Arg Tyr Asp Arg

340 345 350

Glu Gly Glu Pro Ser Gln Leu Ala Pro Ile Asp Ile Phe Val Ser Thr

355 360 365

Val Asp Pro Leu Lys Glu Pro Pro Leu Val Thr Ala Asn Thr Val Leu

370 375 380

Ser Ile Leu Ser Val Asp Tyr Pro Val Asp Lys Val Ser Cys Tyr Val

385 390 395 400

Ser Asp Asp Gly Ser Ala Met Leu Thr Phe Glu Ala Leu Ser Glu Thr

405 410 415

Ser Glu Phe Ala Arg Lys Trp Val Pro Phe Cys Lys Lys His Asn Ile

420 425 430

Glu Pro Arg Ala Pro Glu Phe Tyr Phe Ala Gln Lys Ile Asp Tyr Leu

435 440 445

Lys Asp Lys Ile Gln Pro Ser Phe Val Lys Glu Arg Arg Ala Met Lys

450 455 460

Arg Glu Tyr Glu Glu Phe Lys Val Arg Ile Asn Ala Leu Val Ala Lys

465 470 475 480

Ala Gln Lys Thr Pro Glu Glu Gly Trp Thr Met Gln Asp Gly Thr Pro

485 490 495

Trp Pro Gly Asn Asn Pro Arg Asp His Pro Gly Met Ile Gln Val Phe

500 505 510

Leu Gly His Ser Gly Gly Leu Asp Thr Asp Gly Asn Glu Leu Pro Arg

515 520 525

Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro Gly Phe Gln His His Lys

530 535 540

Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Ile Arg Val Ser Ala Val Leu Thr

545 550 555 560

Asn Gly Ala Tyr Leu Leu Asn Val Asp Cys Asp His Tyr Phe Asn Asn

565 570 575

Ser Lys Ala Leu Arg Glu Ala Met Cys Phe Met Met Asp Pro Ala Tyr

580 585 590

Gly Lys Lys Thr Cys Tyr Val Gln Phe Pro Gln Arg Phe Asp Gly Ile

595 600 605

Asp Leu His Asp Arg Tyr Ala Asn Arg Asn Ile Val Phe Phe Asp Ile

610 615 620

Asn Leu Lys Gly Leu Asp Gly Ile Gln Gly Pro Val Tyr Val Gly Thr

625 630 635 640

Gly Cys Cys Phe Asn Arg Gln Ala Leu Tyr Gly Tyr Asp Pro Val Leu

645 650 655

Thr Glu Ala Asp Leu Glu Pro Asn Ile Ile Val Lys Ser Cys Cys Gly

660 665 670

Ser Arg Lys Lys Gly Arg Asn Gly Asn Lys Lys Tyr Ile Asp Lys Lys

675 680 685

Arg Ala Met Arg Arg Thr Glu Ser Thr Val Pro Ile Phe Asn Met Glu

690 695 700

Asp Ile Glu Glu Gly Val Glu Gly Phe Glu Asp Glu Arg Ser Leu Leu

705 710 715 720

Met Ser Gln Lys Ser Leu Glu Lys Arg Phe Gly Gln Ser Pro Val Phe

725 730 735

Ile Ala Ser Thr Phe Met Glu Gln Gly Gly Ile Pro Gln Ser Thr Asn

740 745 750

Pro Ala Ser Leu Leu Lys Glu Ala Ile His Val Ile Ser Cys Gly Tyr

755 760 765

Glu Asp Lys Thr Glu Trp Gly Lys Glu Ile Gly Trp Ile Tyr Gly Ser

770 775 780

Val Thr Glu Asp Ile Leu Thr Gly Phe Lys Met His Ala Arg Gly Trp

785 790 795 800

Ile Ser Ile Tyr Cys Met Pro Ser Arg Pro Ala Phe Lys Gly Ser Ala

805 810 815

Pro Ile Asn Leu Ser Asp Arg Leu Asn Gln Val Leu Arg Trp Ala Leu

820 825 830

Gly Ser Ile Glu Ile Leu Leu Ser Arg His Cys Pro Ile Trp Tyr Gly

835 840 845

Tyr Ser Gly Arg Leu Lys Leu Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Ile Asn Thr

850 855 860

Ile Val Tyr Pro Leu Thr Ser Ile Pro Leu Leu Ala Tyr Cys Thr Leu

865 870 875 880

Pro Ala Val Cys Leu Leu Thr Gly Lys Phe Ile Ile Pro Glu Ile Ser

885 890 895

Asn Phe Ala Ser Met Trp Phe Ile Leu Leu Phe Ile Ser Ile Phe Ala

900 905 910

Thr Gly Ile Leu Glu Leu Arg Trp Ser Gly Val Gly Ile Glu Asp Trp

915 920 925

Trp Arg Asn Glu Gln Phe Trp Val Ile Gly Gly Thr Ser Ala His Leu

930 935 940

Phe Ala Val Phe Gln Gly Leu Leu Lys Val Leu Ala Gly Ile Asp Thr

945 950 955 960

Asn Phe Thr Val Thr Ser Lys Ala Ser Asp Glu Asp Gly Asp Phe Ala

965 970 975

Glu Leu Tyr Val Phe Lys Trp Thr Ser Leu Leu Ile Pro Pro Thr Thr

980 985 990

Val Leu Val Val Asn Met Val Gly Ile Val Ala Gly Val Ser Tyr Ala

995 1000 1005

Ile Asn Ser Gly Tyr Gln Ser Trp Gly Pro Leu Phe Gly Lys Leu Phe

1010 1015 1020

Phe Ala Ile Trp Val Ile Val His Leu Tyr Pro Phe Leu Lys Gly Leu

1025 1030 1035 1040

Leu Gly Arg Gln Asn Arg Thr Pro Thr Ile Val Ile Val Trp Ser Ile

1045 1050 1055

Leu Leu Ala Ser Ile Phe Ser Leu Leu Trp Val Arg Ile Asp Pro Phe

1060 1065 1070

Thr Ser Ser Thr Gln Lys Ala Ala Ala Asn Gln Cys Gly Ile Asn Cys

1075 1080 1085

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> LcCESA1的CDS全长引物：Primer-F(Artificial)

<400> 3

gagaacacgg gggactctag aatggaggcg aatgctggaa tggt 44

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> LcCESA1的CDS全长引物：Primer-R(Artificial)

<400> 4

ataagggact gaccacccgg ggcagttgat gccacattgg tttgc 45

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> PCR检测引物Primer-F(Artificial)

<400> 5

gacctaacag aactcgccgt a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> PCR检测引物Primer-R(Artificial)

<400> 6

cgtaagccca acagtatctc c 21

Claims

1.一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1的表达载体或宿主菌。

4.权利要求1所述的鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1在促进植物生长中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：促进植物茎段维管束组织细胞细胞壁和叶片组织细胞细胞壁的厚度的生长。