CN102061297A - 转基因提高丹参中丹酚酸b含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种转基因提高丹参中丹酚酸B含量的方法，由下述步骤组成：采用基因克隆获得拟南芥花青色素生成转录因子1基因的cDNA全长；构建含有所述基因的植物表达载体；将上述载体转化根癌农杆菌EHA105，获得含所述基因的根癌农杆菌菌株；用根癌农杆菌菌株转化丹参，培养并获得经聚合酶链式反应检测的转基因丹参植株；半定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参中拟南芥花青色素生成转录因子1基因的表达；对所述基因表达的转基因丹参中丹酚酸B含量进行高效液相色谱测定，筛选得到丹酚酸B含量提高的转基因丹参植株。采用本发明获得的转基因丹参植株，生长165天的干燥根中，丹酚酸B的含量高达73.27mg/g，是非转化普通丹参干燥根中丹酚酸B含量的2倍。

Description

转基因提高丹参中丹酚酸B含量的方法

技术领域

本发明属于药用植物基因工程技术领域，具体涉及到在丹参中转化拟南芥花青色素生成转录因子1基因提高丹酚酸B含量的方法。

背景技术

丹参是我国常用大宗道地药材，为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，对心脑血管疾病、癌症及各种炎症具有显著的临床治疗作用。丹参的主要活性成分分为两大类：一类为脂溶性的丹参酮类化合物，另一类为水溶性的酚酸类成分，主要包括丹参素、迷迭香酸和丹酚酸B等。丹参水溶性化合物因与传统用药多以水煎为主的一致性，越来越多地受到人们的关注。丹酚酸B是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一，也是丹参中含量最高、抗氧化活性最强的化合物，其结构上含有多个酚羟基，具有清除自由基、保护心脑血管、抗肝纤维化、抗肿瘤和抗衰老等功能，是《中华人民共和国药典》(2010年版)中丹参药材质量控制的重要指标性成分。据统计，丹参年需求量近2.4万吨，销售价格近年来一直维持在10元/千克左右，仅药材生产销售近2.3亿元，以丹参为主要原料制成的中成药有100多种，其产值超过100亿元，其中以丹酚酸B为药效基础的新药研发倍受人们关注，蕴藏着巨大的市场潜力。由于丹参野生资源几乎耗尽，目前药用丹参以人工栽培为主，而栽培中人们对丹参优良品种的选育重视不够，导致丹参质量良莠差异较大。因此，提高丹参中有效成分，特别是丹酚酸B的含量，培育优异的丹参资源具有重要意义。

经对现有技术的文献检索发现，国内外科学家尝试组织培养和细胞工程的方法，通过生物/非生物诱导子诱导、原位吸附、半连续培养等方式提高丹参酮类物质的含量取得了较明显的进展。然而这些手段仅在一定程度上能提高丹参某一时期酮类物质的含量，没有涉及丹参酚酸类成分，特别是丹酚酸B含量的提高。另外，此类方法筛选带有一定的盲目性，很难获得持续稳定高产的丹参新品系，使其应用受到了限制。在诸多方法之中，利用基因工程技术对药用植物次生代谢途径的遗传特性进行改造，提高药用植物有效成分含量，培育能够大量积累目标次生代谢物的新品种，愈来愈受到人们的关注。以转基因技术为核心的现代分子育种技术在改良药用植物、丰富中药资源、提高抗病性和抗逆性、培养高天然药物含量的新型转基因药材中有着诱人的应用前景。但目前利用转基因技术提高丹参中丹参酚酸类成分，特别是丹酚酸B含量的方法尚无报道。

植物代谢途径是由多种酶参与的多步反应，受发育、环境等因素的影响，而对单个基因进行修饰有时难以奏效。转录调控因子可调控植物次生代谢物合成途径中多个关键酶基因的表达，有效地激活或抑制整条代谢途径，从而调节特定次生代谢物质的合成与否以及积累量的多少。转录因子通常指由核基因编码的一类蛋白质，它们主要以同源或异源二聚体的形式同顺式作用因子发生特异性的结合，通过和某些辅助调控子发生作用而影响转录复合体的形成，从而调节植物基因的特异性表达。改变转录因子的表达往往可导致植物中该转录因子所控制性状发生较大改变，因此，利用基因工程的方法调控转录因子是具有应用价值的植物遗传操作手段。本发明通过构建转录因子过表达载体，将拟南芥花青色素生成转录因子1基因导入丹参中，提高丹参中丹酚酸B的含量，可以填补该领域研究的空白，因而该技术路线具有较强的创新性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述技术中的不足，提供一种提高丹参中丹酚酸B含量的新方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是由下述步骤组成：

1、采用基因克隆方法获得拟南芥花青色素生成转录因子1基因的cDNA全长。

2、把拟南芥花青色素生成转录因子1基因连接于表达调控序列，形成含有所述基因的植物表达载体。

3、将拟南芥花青色素生成转录因子1基因转化根癌农杆菌EHA105，获得用于转化丹参的含有所述植物表达载体的根癌农杆菌菌株。

4、用所构建的根癌农杆菌菌株转化丹参，培养并获得经聚合酶链式反应检测的转基因丹参植株。

5、半定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参植株中拟南芥花青色素生成转录因子1基因的表达。

6、对获得的转基因丹参植株中丹酚酸B含量进行高效液相色谱测定，筛选获得丹酚酸B含量显著提高的转基因丹参植株。

本发明的采用基因克隆方法获得拟南芥花青色素生成转录因子1基因的cDNA全长方法为：设计可扩增出拟南芥拟南芥花青色素生成转录因子1基因完整编码框的引物，并在上游和下游引物上分别引入BglII和BstEII限制性酶切位点，上游引物为5’-AGATCTATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3’，下游引物为5’-GGTAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC-3’，以拟南芥cDNA为模板，经聚合酶链式反应扩增，获得的扩增产物进行电泳分离，回收连接，转入大肠杆菌DH5α，测序验证并得到所述基因的cDNA编码序列。

本发明的把拟南芥花青色素生成转录因子1基因连接于表达调控序列，形成含有所述基因的植物表达载体的方法为：用BglII和BstEII双酶切所述的拟南芥花青色素生成转录因子1基因的pGEM T-easy载体和pCAMBIA1302植物表达载体，回收连接转化，挑取单克隆，提取质粒做聚合酶链式反应检测和酶切验证，得到含有所述基因的植物表达载体。

本发明的将拟南芥花青色素生成转录因子1基因转化根癌农杆菌，获得用于转化丹参的含有所述植物表达载体的根癌农杆菌菌株的方法为：将所述的含拟南芥花青色素生成转录因子1基因的植物表达载体转化根癌农杆EHA105，进行聚合酶链式反应验证，获得含有所述植物表达载体的根癌农杆菌菌株。

本发明的经聚合酶链式反应检测的转基因丹参植株为：用所述的根癌农杆菌菌株转化丹参叶片，置于由MS培养基、4.4μM BAP、0.5μM NAA、200mg/L头孢霉素、5mg/L潮霉素组成的固体培养基上进行选择培养，长出抗性芽后将其转入附加5mg/L潮霉素的1/2MS培养基上生根，获得潮霉素抗性的再生丹参植株，用拟南芥花青色素生成转录因子1基因的特异性检测引物聚合酶链式反应扩增再生丹参植株DNA，紫外线下观察到747bp目的条带的阳性株系即为转基因丹参植株。

本发明的半定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参植株中拟南芥花青色素生成转录因子1基因的表达方法为：用拟南芥花青色素生成转录因子1基因和丹参管家基因延长因子1-α的检测引物，进行半定量逆转录-聚合酶链式反应扩增，用相对定量法分析拟南芥花青色素生成转录因子1基因相对表达量。

本发明的对获得的转基因丹参植株中丹酚酸B含量进行高效液相色谱测定方法为：用Phenomenex硅胶基质C18反向色谱柱，以质量分数为0.4％的醋酸水溶液、乙腈和甲醇为流动相梯度洗脱，流动相梯度洗脱程序为0.01～5分钟，质量分数为0.4％的醋酸水溶液体积由95％降为90％，乙腈体积由5％升至10％；5～25分钟，质量分数为0.4％的醋酸水溶液体积由90％降为67％，乙腈体积由10％升至30％，甲醇体积由0升至3％；25～40分钟，质量分数为0.4％的醋酸水溶液体积由67％降为60％，乙腈体积由30％升至35％，甲醇体积由3％升至5％。柱温30℃，流速1.0mL/分钟，检测波长280nm，进样量20μL，丹酚酸B的含量根据其峰面积由标准曲线回归方程

y＝5E-8x-0.0134(r²＝0.9997)

进行计算，式中x表示样品中丹酚酸B的峰面积，y表示丹酚酸B的浓度，单位mg/mL，r表示相关系数。

本发明将拟南芥花青色素生成转录因子1基因转入丹参植株，筛选获得了丹酚酸B含量显著提高的转基因丹参植株。在生长165天的转基因的丹参干燥根中，丹酚酸B的含量高达73.27mg/g，是同时期非转化普通丹参干燥根中丹酚酸B含量(36.98mg/g)的2.0倍，高于《中华人民共和国药典》(2010年版)中规定的丹参药材质量标准，为提高丹参中丹酚酸B含量提供了一种新方法，可在丹参的培育中推广使用。

附图说明

图1是聚合酶链式反应检测的转基因丹参植株的电泳图。

图2是半定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参植株中拟南芥花青色素生成转录因子1基因表达量的电泳图。

图3是高效液相色谱测定转基因丹参植株中丹酚酸B含量的色谱图。

具体实施方案

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

本实施例中未注明具体条件的实验方法，按照已知的方法进行操作，例如Sambrook等《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。

1、拟南芥花青色素生成转录因子1基因cDNA全长的克隆

(1)拟南芥总RNA的提取

选取新鲜、健壮的拟南芥幼苗全株，利用杭州博日科技有限公司生产的Biozol总RNA提取试剂盒分离提取其总RNA。提取方法参照Biozol总RNA提取试剂盒(Cat^# BSC51S1)说明书。

(a)提取拟南芥总RNA的实验前准备工作

所使用的各种玻璃仪器、枪头、离心管、全部洗净，浸泡于经过夜摇匀的体积分数为0.1％的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液中，浸泡24小时以上，取出后在121℃，1.034×10⁵Pa蒸汽灭菌40分钟，50℃烘干备用。

(b)向洗净的研钵中加入适量酒精烧研钵和药匙，待研钵冷却后，取1g丹参材料，置于液氮中研磨成粉末，加入1mL Biozol RNA提取试剂，剧烈震荡后室温下孵育15分钟，使样品充分裂解至透明。

上述的Biozol RNA提取试剂由杭州博日科技有限公司生产。

(c)将匀浆液4℃，12000转/分钟离心5分钟，取上清弃去沉淀。

(d)按照氯仿与Biozol RNA提取试剂的体积比为1∶5加入氯仿，盖紧管盖，颠倒振荡混匀，冰上孵育15分钟。

(e)4℃，12000转/分钟离心15分钟，取上清层。

(f)将上清层转移到干净的离心管中，按Biozol RNA提取试剂与氯仿、水饱和酚的体积比为5∶1∶1加入氯仿、水饱和酚，振荡混匀15秒。

(g)4℃，12000转/分钟离心15分钟，取上清层。

(h)将上清层转移到干净的离心管中，加入等体积冰浴的异丙醇，温和颠倒振荡混匀，-20℃条件下孵育20分钟以上。

(i)4℃，12000转/分钟离心10分钟，弃去上清，留沉淀，RNA沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁或者管底。

(j)用冰浴的1mL体积分数为75％的乙醇水溶液洗涤RNA沉淀，颠倒洗涤离心管管壁，并涡旋振荡样品，尽可能让沉淀悬浮。

(k)4℃，12000转/分钟离心5分钟，再次去除上清，于阴凉处适度晾干沉淀。

(l)加入100μL的无RNA酶水溶解沉淀，抽提好的RNA，保存于-80℃或者立即以120伏电压，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)cDNA第一链的合成

选取质量较好的RNA利用TaKaRa公司的M-MLV(RNase H-)反转录酶合成cDNA第一链。步骤如下：

(a)在反应管中加入1ng-1μg总RNA，以及1μL oligo(dT)₁₈(50mM)，加入体积分数为0.1％的DEPC水溶液至12μL，将反应液混匀，70℃孵育10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。

(b)3000转/分钟离心30秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于反应管底部。

(c)反应液中依次加入

5×M-MLVBuffer                    4μL

dNTP Mixture(各10mM)              1μL

RNase Inhibitor(40U/μL)          0.5μL

RTase M-MLV(RNase H^-)(200U/μL)   1μL

RNase free dH₂O                   加至20μL

(d)将反应混合液混匀，42℃孵育60分钟，70℃孵育15分钟终止反应；

(e)将反转录所得的cDNA稀释10倍，-20℃保存备用。

(3)拟南芥花青色素生成转录因子1基因cDNA的聚合酶链式反应扩增

根据所述的拟南芥花青色素生成转录因子1基因的cDNA序列(核苷酸序列表)，利用Premier Primer 5.0软件，设计1对引物，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入BglII和BstEII限制性酶切位点，以便构建表达载体。构建上游引物AtPAP1-F为：5’-AGATCTATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3’；下游引物AtPAP1-R为：5’-GGTAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC-3’。以拟南芥cDNA为模板，经聚合酶链式反应扩增，将获得的扩增产物于1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，目标片段回收后与pGEMT-easy载体连接，转入大肠杆菌DH5α，随机挑选所得阳性克隆经菌落聚合酶链式反应检测后送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的拟南芥花青色素生成转录因子1基因的cDNA编码序列(核苷酸序列表)一致。

所述的采用基因克隆方法从拟南芥中获得序列正确的拟南芥花青色素生成转录因子1基因，为通过转基因提高丹参中丹酚酸B含量提供了一个重要的转录因子基因。

2、含拟芥花青色素生成转录因子1基因的植物表达载体的构建

以pCAMBIA1302(为市场销售的生物材料，由澳大利亚CAMBIA公司生产)为植物表达载体，用拟南芥花青色素生成转录因子1基因替换其上的绿色荧光蛋白基因，即用BglII和BstEII双酶切含有拟南芥花青色素生成转录因子1基因的pGEM T-easy载体和pCAMBIA1302植物表达载体，回收拟南芥花青色素生成转录因子1基因和pCAMBIA1302大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做聚合酶链式反应和酶切验证，得到含有所述基因的植物表达载体。

上述的将拟南芥花青色素生成转录因子1基因连接于表达调控序列，形成含有所述基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过基因工程策略来提高丹参中丹酚酸B的含量。

3、含拟南芥花青色素生成转录因子1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株的获得

将含拟南芥花青色素生成转录因子1基因的植物表达载体转入根癌农杆菌EHA105，根癌农杆菌EHA105为市场出售的生物材料，由澳大利亚CAMBIA公司生产，菌株编号为Gambar1，并进行聚合酶链式反应验证。验证结果表明，含拟南芥花青色素生成转录因子1基因的植物表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。具体的构建方法如下：

用氯化钙法制备感受态农杆菌EHA105，在50mL的无菌离心管中加入5mL LB液体培养基(含利福霉素20mg/L)，用灭菌的牙签从平板上挑取生长良好的EHA105单菌落接种于该离心管中，在恒温培养箱内28℃180转/分钟培养16～18小时，次日取2mL培养物接种到含100mL LB液体培养基的锥形瓶中，恒温培养箱内28℃180转/分钟快速培养至OD₆₀₀为0.4～0.6，无菌条件下转移菌液至两只高压灭菌的50mL离心管中，立即冰浴30分钟，4℃5000转/分钟离心8分钟收集细胞，弃上清，加10mL预冷的0.1moL CaCl₂溶液温和重悬菌体，冰浴20分钟，4℃保存10小时备用。采用以下方法获得含拟南芥花青色素生成转录因子1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株：

取一管EHA105感受态细胞置冰上溶化，将含拟南芥花青色素生成转录因子1基因植物表达载体30ng加入到100μL溶化后的感受态细胞中，冰浴40分钟，42℃热激90秒，移至冰上放置1～2分钟，向试管中加入400μL LB液体培养基，28℃100转/分钟恢复培养3～4小时，将菌液均匀涂布于含有利福霉素(40mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB固体培养基上，28℃恒温培养箱中倒置培养18～36小时，挑取抗性单菌落，接种于10mL LB液体培养基中(含壮观霉素50mg/L，利福霉素20mg/L)，28℃180转/分钟振荡培养16小时，用菌落聚合酶链式反应扩增拟南芥花青色素生成转录因子1基因。结果表明，含有拟南芥花青色素生成转录因子1基因植物表达载体已经成功地构建到根癌农杆菌菌株中。

4、转基因丹参植株的获得

(1)根癌农杆菌介导拟南芥花青色素生成转录因子1基因转化丹参

(a)外植体的预培养

丹参种子用流水冲洗，用体积分数为75％乙醇水溶液表面灭菌20秒，二次蒸馏水冲洗2次，每次4分钟，用体积分数为0.1％的升汞水溶液表面灭菌10分钟，二次蒸馏水冲洗5次，种子用滤纸吸干表面残存的水分后置于MS基本培养基上萌发，25℃，16小时/8小时3000Lux光/暗培养，获得的无菌试管苗，从节间切断，将带有2个腋芽的茎段扦插于1/2MS培养基上，每四周继代繁殖一次。转化所用的材料均为继代2～4次的丹参试管苗，其中继代培养20天的幼苗用于基因转化，继代培养30天的幼苗用于核酸提取及各种检测。

选取继代培养20天的丹参无菌苗，将其叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，转入预培养培养基中(MS培养基附加4.4μM BAP和0.5μM NAA)，在正常培养条件下预培养1天。

(b)浸染及共培养

将预培养的丹参叶片取出，3/4丹参叶片放入含拟南芥花青色素生成转录因子1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌液中浸染25～30分钟，取出丹参叶片，将其表面的菌液用滤纸吸干，转移到预培养培养基上培养2～3天。1/4丹参叶片不在菌悬液中进行浸染，直接在预培养培养基上生芽后，将芽剥落，置于1/2MS培养基上生根，作为实验未转化的对照植株。

(c)选择培养

共培养2～3天后，将外植体从原培养基上取出，转接到选择培养基上。选择培养基为预培养培养基附加200mg/L头孢霉素和5mg/L潮霉素。每10天更换一次选择培养基。

(d)不定芽生根及植株再生

待抗性芽长到0.5cm左右时，将抗性芽切下，转入附加5mg/L潮霉素的1/2MS培养基上生根，完整的植株从节间切断，将带有2个腋芽的茎段扦插于1/2MS培养基上继代培养，获得潮霉素抗性的再生丹参植株。

(2)转基因丹参植株的聚合酶链式反应检测

采用改良的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)方法提取上述转基因和对照丹参植株的DNA，利拟南芥花青色素生成转录因子1基因完整编码框的上下游引物对目的基因进行聚合酶链式反应检测，电泳图见图1，在图1中M为DNA分子量标准，从上到下依次为100，250，500，750，1000bp.第1泳道为非转化丹参株系，第2泳道为阳性对照即含拟南芥花青色素生成转录因子1基因的植物表达载体，第3-16泳道为不同的转基因株系，B为未加DNA模板的阴性对照，由图1可见，用聚合酶链式反应特异引物，能扩增出747bp的特异DNA片段，而以非转化丹参基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，说明所述的载体构建和转化策略是正确的，目的基因已插入丹参基因组中。转基因丹参植株的获得为筛选较高丹酚酸B含量的丹参株系提供了基本材料。

5、半定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参植株中拟南芥花青色素生成转录因子1基因的表达

(1)引物的设计与合成

用Premier Primer 5.0软件，设计合成拟南芥花青色素生成转录因子1基因和和丹参管家基因延长因子1-α的引物，进行半定量逆转录-聚合酶链式反应扩增，聚合酶链式反应产物凝胶电泳后与非转化对照丹参株系比较目标片段的扩增。

(2)丹参总RNA的提取

采用OMEGA公司的植物RNA提取试剂盒按照试剂盒说明书进行：

(a)实验准备：实验所用的玻璃、金属制品于210℃烘烤12小时以上，塑料制品用体积分数为0.1％的DEPC水溶液于37℃浸泡12小时以上，121Pa灭菌，50℃烘干。电泳缓冲液用体积分数为0.1％DEPC水溶液配制。研钵用氯仿润洗后加入1/3体积的无水乙醇，充分燃烧，并加液氮冷却。

(b)取-80℃保存的丹参叶片用液氮迅速研磨，取100mg加入500μL提取缓冲液，剧烈震荡。

(c)室温14000转/分钟离心5分钟，取上清转移至Homogenization Spin Column，室温14000转/分钟离心2分钟；

(d)将收集液转移至新的离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇(室温)涡旋20秒；

(e)将全部混合液加入HiBind RNA Mini column中，室温10000转/分钟离心1分钟；

(f)弃掉收集管中的液体，HiBind RNA Mini column中加入400μLRNA洗脱液I，室温10000转/分钟离心1分钟；

(g)将柱子转移至新的收集管中，加入500μL RNA洗脱液Ⅱ，室温10000转/分钟离心1分钟；

(h)重复步骤(g)；

(i)将收集管中的液体倒掉，柱子放回空收集管中，室温10000转/分钟离心2分钟；

(j)将柱子转移至一个新的离心管中，在柱子膜的中间部位加50μL体积分数为0.1％的DEPC水溶液，室温静置2分钟，10000转/分钟离心1分钟，洗脱获得的RNA溶液，用于DNA酶消化；

(k)DNase消化

在离心管中依次加入：

总RNA                             50μg

10×DNase I Buffer                5μL

DNase I(RNase-free，5U/μL)       2μL

RNase Inhibitor(40U/μL)          0.5μL

RNase Free H₂O                    加至50μL

37℃恒温培养箱中放置1.5小时；

(1)加入50μL的体积分数为0.1％的DEPC水溶液至100μL，加入25μL苯酚、24μL氯仿和1μL异戊醇，充分混匀，4℃10000转/分钟离心7分钟，取上层移至另一离心管中；

(m)加入96μL氯仿和4μL异戊醇，混匀，4℃10000转/分钟离心7分钟，上层移至另一离心管中；

(n)加入10μL的3moL醋酸钠水溶液(pH为5.2)，250μL的预冷的无水乙醇，-20℃放置1小时以上

(o)4℃，10000转/分钟离心20分钟，弃上清，沉淀用体积分数为70％的乙醇水溶液洗两次，4℃10000转/分钟离心5分钟，弃上清；

(p)沉淀干燥后，用体积分数为0.1％的DEPC水溶液溶解，电泳检测，-80℃保存备用。

(3)cDNA第一链的合成

cDNA第链的合成利用Takara公司PrimeScript^TM反转录试剂盒进行。

在反应管中依次加入下列溶液：

5×PrimeScript^TM Buffer(for real time)     2μL

PrimeScript^TM RT Enzyme Mix 1              0.5μL

Oligo dT Primer(50μM)                     0.5μL

Random 6 mers(100μM)                      0.5μL

Total RNA(1μg)                            1μL

RNase free dH₂O                            加至10μL

将反应混合液混匀，37℃孵育30分钟，85℃反应5秒，将反转录所得的cDNA稀释10倍，-20℃保存备用。

(4)半定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参植株中拟南芥花青色素生成转录因子1基因的表达

用非转化丹参株系为对照，用半定量逆转录-聚合酶链式反应测定拟南芥花青色素生成转录因子1基因的表达量。半定量逆转录-聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、2分钟，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、25秒，30个循环。结果见图2，在图2中，第1泳道为非转化丹参株系，第2～6泳道为不同的转基因株系，由图2可见，在相同的丹参管家基因延长因子1-α基因(SmEF1-α)表达水平下，相比非转化对照丹参株系，3、5、6泳道的转基因丹参株系中均有拟南芥花青色素生成转录因子1基因的转录，表明所述的目的基因已在丹参中超量表达。

6、利用高效液相色谱测定转基因丹参株系中丹酚酸B的含量

(1)高效液相色谱条件及系统适用性以及标准溶液的配制

(a)高效液相色谱条件

采用日本SHIMADZU公司LC-2010高效液相色谱仪(包括自动进样器，紫外检测器，LCsolution色谱工作站等)，色谱柱为Phenomenex硅胶基质柱(5μm C18反向柱，4.6mm×250mm)，以质量分数为0.4％的醋酸水溶液、乙腈和甲醇为流动相梯度洗脱，流动相梯度洗脱程序为0.01～5分钟，质量分数为0.4％的醋酸水溶液体积由95％降为90％，乙腈体积由5％升至10％；5～25分钟，质量分数为0.4％的醋酸水溶液体积由90％降为67％，乙腈体积由10％升至30％，甲醇体积由0升至3％；25～40分钟，质量分数为0.4％的醋酸水溶液体积由67％降为60％，乙腈体积由30％升至35％，甲醇体积由3％升至5％；柱温30℃，流速1.0mL/分钟，检测波长280nm，进样量20μL。

(b)对照品溶液的制备

配制标准溶液：称取丹酚酸B标准品10.0mg，置10mL容量瓶，加体积分数为70％的甲醇水溶液定容，作为标准品母液，4℃冰箱中保存。实验时，分别取标准品母液稀释成浓度梯度的标准品溶液，0.45μm微孔滤膜过滤后进样分析。

本发明中采用的流动相梯度洗脱程序，丹酚酸B保留时间为32.8分钟，峰形良好，可保证丹酚酸B与丹参中其它酚酸类成分的分离。

(2)绘制标准曲线

吸取丹酚酸B标准品10、20、40、60、80、100μL分置于具塞试管中，依次加蒸馏水使最终体积均为2.0mL，在相应的色谱条件下进样，记录图谱及色谱参数，分别以丹酚酸B峰面积对标准品浓度进行回归分析，得到丹酚酸B的线性回归方程为：

y＝5E-8x-0.0134(r²＝0.9997)

式中x表示样品中丹酚酸B的峰面积，y表示丹酚酸B的浓度，单位mg/mL，r表示相关系数。

(3)样品溶液的制备

将丹参干燥根30℃烘至恒重，置于研钵中磨碎，精密称取20mg粉末于离心管中，加入1.5mL体积分数为70％的甲醇水溶液，以功率800W、频率750Hz的超声提取30分钟，将提取液转入新的离心管中，4000转/分钟离心5分钟，上清经0.45μm的微孔滤膜过滤后进样分析，记录各样品中丹酚酸B峰面积，代入线性回归方程，计算即得丹酚酸B的含量。

用高效液相色谱测定转基因丹参株系中丹酚酸B的含量，结果见图3，由图3可见，在生长165天的转基因的丹参干燥根中，丹酚酸B的含量高达73.27mg/g，是同时期非转化普通丹参干燥根中丹酚酸B含量(36.98mg/g)的2.0倍，高于《中华人民共和国药典》(2010年版)中规定的丹参药材质量标准。

本实施例用转化拟南芥花青色素生成转录因子1基因的基因工程策略获得了丹酚酸B高产的转基因丹参植株，用高效液相色谱法测定了转基因丹参中丹酚酸B的含量，为规模化生产丹酚酸B并最终解决丹参资源紧缺问题提供了一种理想方法。

Claims (7)

1.一种转基因提高丹参中丹酚酸B含量的方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：

(1)采用基因克隆方法获得拟南芥花青色素生成转录因子1基因的cDNA全长；

(2)把拟南芥花青色素生成转录因子1基因连接于表达调控序列，形成含有所述基因的植物表达载体；

(3)将拟南芥花青色素生成转录因子1基因转化根癌农杆菌EHA105，获得用于转化丹参的含有所述植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)用所构建的根癌农杆菌菌株转化丹参，培养并获得经聚合酶链式反应检测的转基因丹参植株；

(5)半定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参植株中拟南芥花青色素生成转录因子1基因的表达；

(6)对获得的转基因丹参植株中丹酚酸B含量进行高效液相色谱测定，筛选获得丹酚酸B含量显著提高的转基因丹参植株。

2.按照权利要求1所述的转基因提高丹参中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的采用基因克隆方法获得拟南芥花青色素生成转录因子1基因的cDNA全长方法为：设计可扩增出拟南芥拟南芥花青色素生成转录因子1基因完整编码框的引物，并在上游和下游引物上分别引入BglII和BstEII限制性酶切位点，上游引物为5’-AGATCTATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3’，下游引物为5’-GGTAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC-3’，以拟南芥cDNA为模板，经聚合酶链式反应扩增，获得的扩增产物进行电泳分离，回收连接，转入大肠杆菌DH5α，测序验证并得到所述基因的cDNA编码序列。

3.按照权利要求1所述的转基因提高丹参中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的把拟南芥花青色素生成转录因子1基因连接于表达调控序列，形成含有所述基因的植物表达载体的方法为：用BglII和BstEII双酶切所述的拟南芥花青色素生成转录因子1基因的pGEM T-easy载体和pCAMBIA1302植物表达载体，回收连接转化，挑取单克隆，提取质粒做聚合酶链式反应检测和酶切验证，得到含有所述基因的植物表达载体。

4.按照权利要求1所述的转基因提高丹参中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的将拟南芥花青色素生成转录因子1基因转化根癌农杆菌，获得用于转化丹参的含有所述植物表达载体的根癌农杆菌菌株的方法为：将所述的含拟南芥花青色素生成转录因子1基因的植物表达载体转化根癌农杆EHA105，进行聚合酶链式反应验证，获得含有所述植物表达载体的根癌农杆菌菌株。

5.按照权利要求1所述的转基因提高丹参中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的经聚合酶链式反应检测的转基因丹参植株为：用所述的根癌农杆菌菌株转化丹参叶片，置于由MS培养基、4.4μM BAP、0.5μM NAA、200mg/L头孢霉素、5mg/L潮霉素组成的固体培养基上进行选择培养，长出抗性芽后将其转入附加5mg/L潮霉素的1/2MS培养基上生根，获得潮霉素抗性的再生丹参植株，用拟南芥花青色素生成转录因子1基因的特异性检测引物聚合酶链式反应扩增再生丹参植株DNA，紫外线下观察到747bp目的条带的阳性株系即为转基因丹参植株。

6.按照权利要求1所述的转基因提高丹参中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的半定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参植株中拟南芥花青色素生成转录因子1基因的表达方法为：用拟南芥花青色素生成转录因子1基因和丹参管家基因延长因子1-α的检测引物，进行半定量逆转录-聚合酶链式反应扩增，用相对定量法分析拟南芥花青色素生成转录因子1基因相对表达量。

7.按照权利要求1所述的转基因提高丹参中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的对获得的转基因丹参植株中丹酚酸B含量进行高效液相色谱测定方法为：用Phenomenex硅胶基质C18反向色谱柱，以质量分数为0.4％的醋酸水溶液、乙腈和甲醇为流动相梯度洗脱，流动相梯度洗脱程序为0.01～5分钟，质量分数为0.4％的醋酸水溶液体积由95％降为90％，乙腈体积由5％升至10％；5～25分钟，质量分数为0.4％的醋酸水溶液体积由90％降为67％，乙腈体积由10％升至30％，甲醇体积由0升至3％；25～40分钟，质量分数为0.4％的醋酸水溶液体积由67％降为60％，乙腈体积由30％升至35％，甲醇体积由3％升至5％；柱温30℃，流速1.0mL/分钟，检测波长280nm，进样量20μL，丹酚酸B的含量根据其峰面积由标准曲线回归方程

y＝5E-8x-0.0134(r²＝0.9997)

进行计算，式中x表示样品中丹酚酸B的峰面积，y表示丹酚酸B的浓度，单位mg/mL，r表示相关系数。

Images