CN110724744A - 一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，提供一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，采用Sox9为生殖系体细胞标记基因，标记方法包括采用实时荧光定量PCR检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达变化和采用原位杂交检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达分布。本发明采用实时荧光定量PCR检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达变化和采用原位杂交检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达分布，能够准确地确定曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因变化的准确位置，对曼氏无针乌贼的养殖具有重要的意义。

Description

一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法
技术领域
本发明属于基因标记技术领域，具体涉及一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法。
背景技术
头足类属于软体动物，是海洋生态系统中的重要组成部分，同时对海洋生态平衡有着不可或缺的作用。乌贼属于软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)，广泛分布在各个海域，在生物系统演化中占有重要的地位。其肉质鲜美可口，具有很好的营养价值，蛋白含量极高。除了可以食用以外，还有很高的药用价值，墨囊可以促进血液凝固并且具有抑菌功能，海螵蛸可以药用，耳石可用来分析物种的年龄和海洋环境的时空变化。另外，乌贼还是海洋生态系统中十分重要的生物因子，在生态系统的食物链中扮演着十分重要的角色，对维持海洋生态系的生态平衡起着非常重要的作用。近年来，乌贼作为重要的经济头足类在海洋生态系统中起着关键的作用。由于过度捕捞与环境变化，我国东海的曼氏无针乌贼资源量一度遭到极大破坏，其自然群体明显衰退，产量急剧下降，临近濒危。自上个世纪80年代以来，得益于人工繁育和养成技术的突破，其资源量正处于逐步恢复中。
动物的精子发生过程在生精上皮进行，生精上皮包括生殖细胞(germ cell)和生殖系体细胞(Sertoli cell)。精子发生的过程依赖于生殖细胞和体细胞之间物质及信息的传递，因此，生精上皮的生殖细胞和体细胞的数量和功能直接决定了个体产生精子数量和质量。但是有关头足类生精上皮的研究还十分有限，尚缺乏关键发育阶段生殖细胞及体细胞的有效分子标记，给包括曼氏无针乌贼在内的头足类精子发生研究带来巨大障碍。因此需要一种理想的雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，可以简便、快速地标记雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，采用Sox9为生殖系体细胞标记基因，标记方法包括采用实时荧光定量PCR检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达变化和采用原位杂交检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达分布。
本发明选用Sox9作为标记基因，Sox9(sry-related high mobility group-boxgene9)基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因，是与位于雄性y染色体上的sry基因(y染色体的性别决定区)同源的家族基因。1990年辛克莱等将y染色体上克隆到的人体性别的决定区域称为SRY基因，是当前被确定的睾丸决定因子的主要候选基因，是哺乳动物中睾丸发育的主要诱导者。实时荧光定量PCR方法是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性和精确性、操作简便快捷、安全无污染的优点。原位杂交能使核酸沉淀，组蛋白溶解，可以使探针更容易进入胚胎的细胞内，增加探针与靶核酸结合的机会，且能阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏，提高后续染色过程中组织的着色能力，提高杂交信号。本发明采用实时荧光定量PCR检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达变化和采用原位杂交检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达分布，能够准确地确定曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因变化的准确位置，对曼氏无针乌贼的养殖具有重要的意义。
作为优选，所述实时荧光定量PCR检测包括如下步骤：
(1)提取曼氏无针乌贼基因组总RNA，反转录合成cDNA；
(2)利用引物对cDNA进行实时荧光定量PCR检测，所述实时荧光定量PCR引物为：5’-GCTAGACGGAAGCTAGCTGAT-3’，5’-AAAGGTCGCTTCTCCTTCTCG-3’。本发明首次公开了一种适用于雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的引物，该引物能够与目的基因完全互补，使引物的延伸可以顺利进行，在确保复制准确性的同时大大提高了扩增的效率。
作为优选，所述PCR扩增片段大小为107bp，扩增序列为：GCTAGACGGAAGCTAGCTGATCAATATCCCCATCTCCATAATGCAGAACTTAGTAAAACG CTAGGAAAACTCTGGAGGTTGCTAAACGAGAAGGAGAAGCGACCTTT。
作为优选，所述实时荧光定量PCR扩增采用SYBR Green染料法。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR Green是高灵敏的DNA荧光染料，而且操作简单，无须脱色或冲洗。
作为优选，所述实时荧光定量PCR扩增反应体系为20μL:7.6μL ddH2O、0.4μL 20μMForward Primer、0.4μL 20μM Reverse Primer、10μL 2×SYBR Premix Ex Taq、1.6μLcDNA模板。
作为优选，所述实时荧光定量PCR扩增反应程序选择两步法：
Figure BDA0002203166970000021
Figure BDA0002203166970000031
两步法在同一管中同时扩增两个引物，减少了一些人为误差，将RNA转录为cDNA，易于保存。
作为优选，所述原位杂交包括杂交前处理、预杂交、杂交、杂交后洗涤、杂交后检测、结果判断，杂交前处理包括固定和消化，所述固定步骤为：将组织切片浸入含有0.03％苏氨酸的4％PFA-PBS溶液中，室温固定5-20min，然后用1×PBST溶液洗涤，所述苏氨酸中L-苏氨酸和D-苏氨酸的比例为100:(1-5)。本发明所用固定溶液对细胞的固定渗透效果较佳，增强细胞膜的透过性，能得到组织形态完整、具有合适硬度的胚胎样品，便于后续杂交和显色的进行，同时能避免RNase污染，提高原位杂交的结果的可靠性。
作为优选，所述消化步骤为：将固定后的组织切片置于含11-15μg/ml蛋白酶K和0.8-1.2μg/ml水杨酸的溶液中，消化5-10min。曼氏无针乌贼组织切片的透明性较差，不易于探针的渗透及显色，蛋白酶K具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，可以使探针更容易进入胚胎的细胞内，增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号，但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织脱落，细胞核的消失，从而影响杂交结果，而水杨酸的加入不仅可以避免蛋白酶K产生上述不利影响，而且能使核酸沉淀，组蛋白溶解，阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏，提高后续染色过程中组织的着色能力，提高杂交信号。
作为优选，所述原位杂交用正义和反义探针的序列为：F:ATACAGGACGCAGTTTCGCA，R:GAAGTCGGGTTGGTCTGGTT。探针特异性好。
作为优选，所述原位杂交扩增片段大小为794bp，扩增序列为：ATACAGGACGCAGTTTCGCAGGTGCTAAAAGGCTACGACTGGACACTTGTATCGATGCCTACCCGTCCAAATGGGGGCGAGAAACGGAAACCACATATCAAGCGACCCATGAATGCATTCATGGTGTGGGCCCAGGCCGCTAGACGGAAGCTAGCTGATCAATATCCCCATCTCCATAATGCAGAACTTAGTAAAACGCTAGGAAAACTCTGGAGGTTGCTAAACGAGAAGGAGAAGCGACCTTTTATCGACGAGGCAGAACGACTTCGCTTGCAACATAAGAAGGATTACCCCGATTACAAATACCAGCCCAGACGTCGTAAGCCCCTGAAGGGAGCTGTTAGCAGCGGGTCGTCCGGAGTAGACGGACAGCACCACATGCCCCCAGGAATGATCTTAAAGACCCTGCAGAACTCCTCACCCTCTCCGATGAGCGATGGCGACTCCAGCAATTGCTCTAGTCCCAACAACGGCTCCCACGGACCACCCACGCCGCCAACCACGCCAAACCAACAAGAACTCATCAAATGCATGACCGATCGTTCAAGAATGAGACAAACTATGGGTCAACATTCGCAGGCACATCCT ATCGATTTTAGCCGAGTCGATCTTGCTGATGTCATGAGTTTGGAAAACATTGATGAACACGAATTAGATCAATATTTGGCCATGAATCCTGGCGCCCTACATCCACATCAACACAATGTGGCTGCCGCAGCAGCCGCGGCTGTCGCTGCCGCTGCACAATCCGAAAACGGTGGGTACTCCTGCTACAACCAGACCAACCCGACTTC。
因此，本发明具有如下有益效果：(1)本发明首次公开了一种适用于雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的引物，该引物能够与目的基因完全互补，使引物的延伸可以顺利进行，在确保复制准确性的同时大大提高了扩增的效率，可以简便、快速地标记雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞，给包括曼氏无针乌贼在内的头足类精子发生研究提供了有效方法；(2)本发明利用实时荧光定量PCR检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达变化，能真实反映雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的情况，灵敏度和准确性高，设计合理、操作方便；(3)本发明采用原位杂交检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达分布，原位杂交增加探针与靶核酸结合的机会，且能阻止染色体收缩，提高后续染色过程中组织的着色能力，提高杂交信号，设计的探针特异性好、灵敏度高。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，采用Sox9为生殖系体细胞标记基因，标记方法包括采用实时荧光定量PCR检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达变化和采用原位杂交检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达分布。
一、实时荧光定量PCR检测包括如下步骤：
(1)提取曼氏无针乌贼基因组总RNA：取无RNA酶的2ml EP管，加入500ul Trizol，用酒精泡过的镊子夹取组织样品溶于Trizol液体中，电动匀浆器研磨直到组织完全溶解于液体中，补满Trizol到1mL，然后在频率5kHz、强度8mW/cm2的超声波下进行超声波循环刺激，4℃、12000rpm条件下离心10min；取上清液放进1.5mL EP管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡，室温静置3min，4℃、12000rpm条件下离心15min；取三层中的最上层液体到新的1.5mL EP管中，加入500ul异丙醇，室温下静置10min；4℃、12000rpm条件下离心10min，除去上清液，得到样品RNA；加入1mL的75％乙醇，吹吸混匀，静置5min；4℃，7500rpm条件下离心5min，除去上清液，通风橱干燥10min；加入20ul DEPC水，-20℃条件下保存。
(2)RNA质量检测：溶解于DEPC处理水的RNA利用核酸蛋白检测仪测定其在260nm和280nm处的吸收波长。因为260/280值在1.8-2.0之间显示所提取的RNA质量较纯，含有的杂蛋白以及多糖类物质含量较少，低于此范围的RNA不建议使用，高于2.0则说明所提取的RNA有较多降解，不适合下一步扩增基因全长cDNA实验用。测定完成后，取3ml上样于1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件设定为135V和150mA，电泳15min，在凝胶成像分析仪中观察RNA电泳条带，提取质量较好的RNA能够观察到明显的28S和18S条带，亮度之比为2:1。
(3)反转录合成cDNA：使用M-MLV反转录试剂盒，反应体系为：
RNA处理物 6.0μL
5×M-MLV Buffer 2.0μL
DEPC处理水 1.0μL
dNTP Mixture(10mM) 0.5μL
PRI(40μ/μL) 0.25μL
M-MLV(200μ/μL) 0.25μL
Oligo DT 1.0ul
总RNA 5.0ul
混匀后离心，于PCR仪内设定反应条件为42℃60min，70℃15min，结束后迅速取出冰浴15min，-20℃保存备用，长期保存则放置于-80℃冰箱中；
(4)利用引物对cDNA进行实时荧光定量PCR检测：标记基因为Sox9，引物为5’-GCTAGACGGAAGCTAGCTGAT-3’，5’-AAAGGTCGCTTCTCCTTCTCG-3’。实时荧光定量PCR扩增采用SYBR Green染料法，扩增反应体系为20μL：
ddH2O 7.6μL
Forward Primer(20μM) 0.4μL
Reverse Primer(20μM) 0.4μL
SYBR Premix Ex Taq(2×) 10μL
cDNA模板 1.6μL
Figure BDA0002203166970000051
上述Sox9扩增片段大小为107bp，扩增序列为：GCTAGACGGAAGCTAGCTGATCAATATCCCCATCTCCATAATGCAGAACTTAGTAAAACG CTAGGAAAACTCTGGAGGTTGCTAAACGAGAAGGAGAAGCGACCTTT。
二、原位杂交检测采用限制性内切酶(NcoI、SpeI)分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6RNA转录酶分别合成反义和正义探针，反应体系：
Figure BDA0002203166970000061
反应步骤如下：
混匀后，37℃孵育2h；
加入2μL DNase I，37℃孵育15min；
加入2μL 0.2M EDTA溶液(pH＝8)；
加入3μL 4M LiCl溶液及75μl预冷的100％酒精，-20℃下放2h；
12000rpm，4℃离心10min，70％酒精洗涤2次；室温干燥，用20μl DEPC水溶解，并定量；
用预杂交缓冲液稀释至100ng/μL并于-20℃保存。
杂交前实验所用器皿、离心管、试剂均采用0.1％DEPC处理，并高压消毒。多聚赖氨酸包被载玻片购自武汉博士德生物工程有限公司，可直接用与切片原位杂交。用4％多聚甲醛固定样品过夜，之后使用梯度甲醇脱水。
(1)组织切片、复水：将石蜡包埋好的样品进行组织切片(6μm)，切片用蒸馏水展好之后，37℃烘干过夜，将烘干的片子置于4℃冰箱保存。依次用二甲苯3*5min；100％乙醇2*5min；95％、70％、50％乙醇各5min处理。
(2)预杂交前处理
固定：将复水后的组织切片浸入含有0.03％苏氨酸的4％PFA-PBS溶液中，室温固定15min，然后用1×PBST溶液洗涤3次，每次5min，再用0.2M HCl处理10min后用1×PBST洗涤3次，每次5min；上述苏氨酸中L-苏氨酸和D-苏氨酸的比例为100:4，苏氨酸中L-苏氨酸和D-苏氨酸的合理存在使得含有苏氨酸的PFA-PBS溶液对组织的固定渗透效果较佳，可使得细胞膜的蛋白质发生变性，增强细胞膜的透过性，提高了固定剂对组织的固定渗透效果，能得到组织形态完整、具有合适硬度的样品，便于后续杂交和显色的进行，同时能避免RNase污染，为原位杂交提供完整的RNA，提高原位杂交的结果的可靠性；
消化：将固定后的组织切片置于含12μg/ml蛋白酶K和0.8μg/ml水杨酸的溶液中，消化10min，然后用1×PBST洗涤3次，每次5min，曼氏无针乌贼组织切片的透明性较差，不易于探针的渗透及显色，蛋白酶K具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，可以使探针更容易进入胚胎的细胞内，增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号，但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织脱落，细胞核的消失，从而影响杂交结果，而水杨酸的加入不仅可以避免蛋白酶K产生上述不利影响，而且能使核酸沉淀，组蛋白溶解，阻止染色体收缩，使染色体结构免于破坏，提高后续染色过程中组织的着色能力，提高杂交信号。
(3)预杂交：将固定后的组织切片中滴加1ml预杂交液，于65℃预杂交液中预杂交2h，同时湿盒中含有2*SSCT/50％去离子甲酰胺作为保湿剂。
(4)杂交：将探针用预杂交液稀释至1-2ng/μl，80℃变性10min，每张片子100-200μl杂交夜，封口膜分好置于湿盒内65℃过夜；
(5)杂交后处理洗涤：取出杂交过夜的样品，经由2×SSCT/50％去离子甲酰胺，65℃下洗涤2次、每次洗涤30min，2×SSCT 65℃下洗涤15min，然后用0.2×SSCT在65℃下洗涤2次、每次洗涤30min，最后用1×PBST室温下洗涤3次、每次洗涤5min。洗涤的目的是除去残留的未特异性结合的探针，留下特异性结合的探针，如果背景较深可适当增加洗涤次数，以减少非特异性结合；
封闭：将杂交后洗涤的样品用2％Blocking reagent抗体封闭液，于室温下封闭1-2h；
抗体：将封闭的样品用2％Blocking reagent 1:500稀释抗体，室温2h；
洗涤：用1×PBST洗涤5次、每次洗涤10min，再用1×PBS洗涤5次、每次洗涤10min；
孵育：将洗涤后的样品置于1×plus amplification diluent＝1:150中，室温孵育1h；
洗涤：将样品用1×PBST洗涤5次、每次洗涤10min；
封闭：2％Blocking reagent，室温，1-2h；
抗体：用2％Blocking reagent 1:500稀释抗体，室温2h；
洗涤：用1×PBST洗涤5次、每次洗涤10min；1×PBS洗涤5次、每次洗涤10min。
(6)染细胞核：加DAPI(1×PBS稀释)，避光显色；用1×PBST洗涤3次、每次洗涤5min终止显色；用50％甘油封片，然后拍照观察。
上述原位杂交用正义和反义探针的序列为：F:ATACAGGACGCAGTTTCGCA，R:GAAGTCGGGTTGGTCTGGT T。
原位杂交扩增片段大小为794bp，扩增序列如下：ATACAGGACGCAGTTTCGCAGGTGCTAAAAGGCTACGACTGGACACTTGTATCGATGCCTACCCGTCCAAATGGGGGCGAGAAACGGAAACCACATATCAAGCGACCCATGAATGCATTCATGGTGTGGGCCCAGGCCGCTAGACGGAAGCTAGCTGATCAATATCCCCATCTCCATAATGCAGAACTTAGTAAAACGCTAGGAAAACTCTGGAGGTTGCTAAACGAGAAGGAGAAGCGACCTTTTATCGACGAGGCAGAACGACTTCGCTTGCAACATAAGAAGGATTACCCCGATTACAAATACCAGCCCAGACGTCGTAAGCCCCTGAAGGGAGCTGTTAGCAGCGGGTCGTCCGGAGTAGACGGACAGCACCACATGCCCCCAGGAATGATCTTAAAGACCCTGCAGAACTCCTCACCCTCTCCGATGAGCGATGGCGACTCCAGCAATTGCTCTAGTCCCAACAACGGCTCCCACGGACCACCCACGCCGCCAACCACGCCAAACCAACAAGAACTCATCAAATGCATGACCGATCGTTCAAGAATGAGACAAACTATGGGTCAACATTCGCAGGCACATCCTATCGATTTTAGCCGAGTCGATCTTGCTGATGTCATGAGTTTGGAAAACATTGATGAACACGAATTAGATCAATATTTGGCCATGAATCCTGGCGCCCTACATCCACATCAACACAATGTGGCTGCCGCAGCAGCCGCGGCTGTCGCTGCCGCTGCACAATCCGAAAACGGTGGGTACTCCTGCTACAACCAGACCAACCCGACTTC。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法和引物
<130> 2019
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni de Rochebrune)
<400> 1
gctagacgga agctagctga t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni de Rochebrune)
<400> 2
aaaggtcgct tctccttctc g 21
<210> 3
<211> 107
<212> DNA
<213> 曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni de Rochebrune)
<400> 3
gctagacgga agctagctga tcaatatccc catctccata atgcagaact tagtaaaacg 60
ctaggaaaac tctggaggtt gctaaacgag aaggagaagc gaccttt 107

Claims (10)

1.一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，采用Sox9为生殖系体细胞标记基因，标记方法包括采用实时荧光定量PCR检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达变化和采用原位杂交检测雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的Sox9基因表达分布。
2.根据权利要求1所述的一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测包括如下步骤：
（1）提取曼氏无针乌贼基因组总RNA，反转录合成cDNA；
（2）利用引物对cDNA进行实时荧光定量PCR检测，所述实时荧光定量PCR引物为：5’-GCTAGACGGAAGCTAGCTGAT-3’，5’-AAAGGTCGCTTCTCCTTCTCG -3’。
3.根据权利要求2所述的一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，所述PCR扩增片段大小为107 bp，扩增序列为：GCTAGACGGAAGCTAGCTGATCAATATCCCCATCTCCATAATGCAGAACTTAGTAAAACGCTAGGAAAACTCTGGAGGTTGCTAAACGAGAAGGAGAAGCGACCTTT。
4.根据权利要求1或2所述的一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增采用SYBR Green染料法。
5.根据权利要求1或2所述的一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增反应体系为20 μL:7.6 μL ddH2O、0.4 μL 20 μM ForwardPrimer、0.4 μL 20 μM Reverse Primer、10 μL 2×SYBR Premix Ex Taq、1.6 μL cDNA模板。
6.根据权利要求1或2所述的一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增反应程序选择两步法：
95 ℃ 30 s
95 ℃ 5 s
60 ℃ 34 s
Melting Curve。
7.根据权利要求1所述的一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，所述原位杂交包括杂交前处理、预杂交、杂交、杂交后洗涤、杂交后检测、结果判断，杂交前处理包括固定和消化，所述固定步骤为：将组织切片浸入含有0.03％苏氨酸的4％ PFA-PBS溶液中，室温固定5-20 min，然后用1×PBST溶液洗涤，所述苏氨酸中L-苏氨酸和D-苏氨酸的比例为100:(1-5)。
8.根据权利要求7所述的一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，所述消化步骤为：将固定后的组织切片置于含11-15 μg/ml蛋白酶K和0.8-1.2 μg/ml水杨酸的溶液中，消化5-10 min。
9.根据权利要求1或7所述的一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，所述原位杂交用正义和反义探针的序列为：F:ATACAGGACGCAGTTTCGCA，R:GAAGTCGGGTTGGTCTGGT T。
10.根据权利要求1或7所述的一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法，其特征在于，所述原位杂交扩增片段大小为794 bp，扩增序列为：ATACAGGACGCAGTTTCGCAGGTGCTAAAAGGCTACGACTGGACACTTGTATCGATGCCTACCCGTCCAAATGGGGGCGAGAAACGGAAACCACATATCAAGCGACCCATGAATGCATTCATGGTGTGGGCCCAGGCCGCTAGACGGAAGCTAGCTGATCAATATCCCCATCTCCATAATGCAGAACTTAGTAAAACGCTAGGAAAACTCTGGAGGTTGCTAAACGAGAAGGAGAAGCGACCTTTTATCGACGAGGCAGAACGACTTCGCTTGCAACATAAGAAGGATTACCCCGATTACAAATACCAGCCCAGACGTCGTAAGCCCCTGAAGGGAGCTGTTAGCAGCGGGTCGTCCGGAGTAGACGGACAGCACCACATGCCCCCAGGAATGATCTTAAAGACCCTGCAGAACTCCTCACCCTCTCCGATGAGCGATGGCGACTCCAGCAATTGCTCTAGTCCCAACAACGGCTCCCACGGACCACCCACGCCGCCAACCACGCCAAACCAACAAGAACTCATCAAATGCATGACCGATCGTTCAAGAATGAGACAAACTATGGGTCAACATTCGCAGGCACATCCTATCGATTTTAGCCGAGTCGATCTTGCTGATGTCATGAGTTTGGAAAACATTGATGAACACGAATTAGATCAATATTTGGCCATGAATCCTGGCGCCCTACATCCACATCAACACAATGTGGCTGCCGCAGCAGCCGCGGCTGTCGCTGCCGCTGCACAATCCGAAAACGGTGGGTACTCCTGCTACAACCAGACCAACCCGACTTC。
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