CN107892715A - 虎斑乌贼神经肽LFRFamide及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种虎斑乌贼神经肽LFRFamide，其基因cDNA全长860bp，开放阅读框567bp，编码188个氨基酸，5’非编码区91bp，3’非编码区202bp，前体蛋白相对分子质量为21.5kDa，等电点为9.40。神经肽LFRFamide作用机理的探测方法包括神经肽LFRFamide基因克隆和序列分析、神经肽LFRFamide组织特异性表达分析和神经肽LFRFamide脑组织表达定位分析。其验证了LFRFamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。

Description

虎斑乌贼神经肽LFRFamide及其用途

技术领域

本发明涉及神经肽技术领域，本发明具体是一种虎斑乌贼神经肽LFRFamide及其用途。

背景技术

头足类（Cephalopoda）属于软体动物门头足纲，广泛分布在各个海域，在生物的系统演化的过程中占有重要地位。其肉质鲜美可口，肌肉含有相当丰富的营养物质，尤其是蛋白含量非常高。除了可以被食用外，更重要的是还具有重要的研究价值，其墨囊可以促进血液凝固且还含有抗菌成分，海螵蛸可以用作医学药材，耳石可以用来分析物种存在的年轮和海洋环境随时间和空间的变化特点。另外头足类还是海洋生态系统中重要的生物因子，在生态系统食物链中作为捕食者和被捕食者，对维持海洋生态系统的稳定具有重要的作用。

神经肽是广泛存在于动物体内的小分子多肽，由神经组织分泌，具有调节神经活动、机体生长、发育等各种生理功能，神经肽同时还能充当生长因子、营养因子等信息分子。神经肽是一类比较古老的信息分子，真菌乃至细菌体内都存在神经肽。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种虎斑乌贼神经肽LFRFamide，运用分子生物学技术手段探测神经肽LFRFamide对虎斑乌贼生殖行为影响的机制，以及对整个乌贼生殖调控机理。验证LFRFamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性。

本发明的目的之二在于提供一种虎斑乌贼神经肽LFRFamide的用途，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：虎斑乌贼神经肽LFRFamide，其作用机理的探测方法包括神经肽LFRFamide基因克隆和序列分析、神经肽LFRFamide组织特异性表达分析和神经肽LFRFamide脑组织表达定位分析。

神经肽LFRFamide基因克隆和序列分析步骤为：提取成熟虎斑乌贼脑组织总RNA，提取的总RNA必须要测定其吸光度R值，一般R值在1.8-2.0之间说明提取出的RNA为有效的总RNA，可以继续为后续实验使用，如果小于1.8则表明提取出的RNA含有较多的杂质，会影响实验的准确性，所以不能使用；如果R值大于2.0则说明提取出来的RNA已经降解，也不能使用。使用反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成，将合成的cDNA置于-30~-15℃保存备用；根据NCBI数据库中已报道的5种软体生物LFRFamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，设计简并引物来获得虎斑乌贼LFRFamide基因核心片段；以成熟虎斑乌贼脑组织cDNA为模板，利用简并引物LFRFamide-F和LFRFamide-R进行LFRFamide基因核心片段的PCR扩增，PCR扩增程序如下：95℃，5min；94℃，30s，52℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，12min；用1%琼脂糖电泳检测PCR产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化；以虎斑乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增3’RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增3’RACE未知片段，得到3’端RACE模板cDNA；以虎斑乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增5’RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增5’RACE片段，得到5’端RACE模板cDNA；使用Lasergene软件对LFRFamide基因的3’端、5’端和核心片段的序列进行拼接，从而获得完整的虎斑乌贼LFRFamide基因的cDNA全长序列；克隆LFRFamide所需引物为：LFRFamide-F：CAAACGCAACAGCCTCTTCCG；LFRFamide-R：AGTGCGGCTTCGTCCATACC；5’-LFRFamide-outter：GCTGCGTTTTAGTCCTTCG；5’-LFRFamide-inner：TTCGGGGTCGTCCTTGCT；3’-LFRFamide-outter：AGAGACGGACTCGAAGACCTTTACG；3’-LFRFamide-inner：CTCAGCACAACAGGCGGCAGCAAC；5’RACE Adapter：CGAGTCCGTCTCTTTT；5’RACE Outer Primer：ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA；5’RACE Inner Primer：ACUACUACUAGGGGCGTCGA；3’ RACE Adapter：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；3’ RACEOuter Primer；GCGGATCCGAATTAATACGACT；3’ RACE Inner Primer：GCGAGCACAGAATTAATACGACT；M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC；选取45条FLP序列，基于NJ法进行进化树的构建。虎斑乌贼神经肽LFRFamide基因cDNA全长860bp，开放阅读框(open reading frame，ORF )567bp，编码188个氨基酸，5’非编码区(5’-UTR)91bp，3’非编码区(3’-UTR) 202bp，前体蛋白相对分子质量(MW)为21.5kDa，等电点(pI)为9.40。前体蛋白包含一段长22个氨基酸的信号肽和4种不同拷贝数的成熟多肽产物。成熟多肽C-端Phe-Arg-Phe ( FRF)残基较为保守，构建进化树分析后将其归属到LFRFamide亚族。

其中，LFRFamide基因cDNA全长为：

AGCCGAATCGCGTTTCTCATACAGAATACAAAGCAATTCTTAGAACCTGGGCTTAACAAATACAGCGAACCGGCCAACGGTCAGATCAAATATGGAAACAAAAGTGATGAGTTTGTTGGCGACTGTGCTAACCGTGTTCATTGTGCAGATAAATTGCGAAGACCTACACAAAATACAAACAGACACTTCCGGCATTTCTAATTTTATCGGTCTACCAGATGGAGAGGAAGGCGAACTAGTGAGATCCCCGATTGTTGACGAATCAGCGCTCGGCATTGACGATGTCGACAAACGCAACAGCCTCTTCCGATTCGGTAAGCGTGGAAACCTCTTCCGATTCGGTAAACGCGGAAACCTCTTCCGGTTCGGCAAGCGTGGAAACCTCTTCCGTTTTGGACGCGGTGGCAACAAGGACGACCCCGAAAACGAAGGACTCAAACGCACCATCTTTAGATTCGGTAAAAGAGACGGACTCGAAGACCTTTACGACTACGAGGATCCCTCAGTACAACAGGTGGCACCAACAGCTGGAGACAAGCGCGGATCATTCTTCCGGTATGGACGAAGCCGCACTTTCTTCCGATACGGCAGAAGCACTGATAAGAACGCCGAGAAGAGGCCACACACACCCTTCCGATTTGGAAGAGAAGAAGAGTAAACTAATGACTCCATAGAATTTTACCTTAAAAAGATTAAAGAGAGACAAAGAGAGAAAATATACAAAGAAGACTGAGTTGACAAAGCACGGGAAAGCAAAATAACAAAAATTTGGAAAAAAATTATAAATAATAAAATGAATTTTATTAATAATTCTATGCTACTTTAAAAAAAAAAAAAAAAA。

通过对虎斑乌贼LFRFamide基因氨基酸序列与其他同源序列的比对分析，发现LFRFamides 基因C-端的FRF是高度保守的，而N-端氨基酸组成结构多变，推测C-端结构在识别、激活受体过程中是必不可少的。FRF的C-端接着甘氨酸，表明LFRFamide成熟产物可能存在翻译后酰胺化修饰现象，该酰胺化修饰作用可能与防止多肽降解有关，这在静水椎实螺中已经得到证实。虎斑乌贼LFRFamide基因氨基酸序列与曼氏无针乌贼LFRFamide基因氨基酸序列和商乌贼SOFaRP2基因氨基酸相似度均为96%，表明它们亲缘关系较近，而它与静水椎实螺、太平洋牡蛎、海蜗牛LFRFamide同源序列比对相似度分别为54%、40%和41%，且它们的成熟产物的N-端之间存在较大差异，推测LFRFamide基因在软体动物进化过程中，成熟肽C-端FRF结构对动物体起重要作用。

神经肽LFRFamide组织特异性表达分析步骤为：提取3个不同发育阶段(Ⅲ期，Ⅳ期，Ⅴ期，按卵子发生和卵巢发育阶段划分)、不同组织的总RNA，虎斑乌贼雄性乌贼组织包括：脑、视叶、肝、肌肉、精巢、心、鳃；雌性乌贼组织包括：脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺；使用反转录试剂盒，利用提取的总RNA合成cDNA模板；根据已获得的虎斑乌贼LFRFamide基因cDNA序列全长，设计LFRFamide基因荧光定量PCR所需引物，并进行荧光定量PCR；LFRFamide荧光定量PCR所需引物为：RT-LFRF-F：AACGAAGGACTCAAACGCAC；RT-LFRF-R：AACGAAGGACTCAAACGCAC；RT-actin-F：TGAGAGGGAGATTGTGCGTG；RT-actin-R：GAACATAGATTCTGGAGCACGG；使用2^-△△Ct方法测定不同组织LFRFamide基因的表达量水平。荧光定量PCR结果显示LFRFamide基因在三个时期的乌贼脑组织中均有显著表达，在视叶中亦有表达。不同是的，LFRFamide在Ⅳ期，Ⅴ期雌性乌贼缠卵腺、副缠卵腺以及卵巢中有微量表达。

神经肽LFRFamide脑组织表达定位分析步骤为：解剖出虎斑乌贼完整的脑组织，立即放入2~8%多聚甲醛中固定，后放入60~85%乙醇中，于0~5℃下保存备用；制备脑组织切片；根据LFRFamide的cDNA序列设计引物LFRF-probeF/LFRF-probeR，以乌贼脑组织cDNA为模板进行普通PCR扩增，PCR扩增程序如下：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 8min ，PCR产物用作原位杂交探针模板的制备；特异扩增虎斑乌贼LFRFamide基因的引物为：LFRF-probeF：CCCAAGCAGATGGAGAGGAAGGCGAAC和LFRF-probeR：CCGGAAGTGCGGCTTCGTCCATACC；将扩增得到的PCR产物，进行切胶纯化，纯化后使用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，将离心管置于PCR仪内，32~40℃孵育6~10h；pSPT18亦采用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，PCR产物和pSPT18酶切产物使用E.Z.N.A. ^TM Gel ExtractionKit (50)试剂盒再次进行切胶纯化后，使用Takara公司生产的Solution Ⅰ进行连接；转化至DH5α感受态后，涂板，单个挑取合适的菌落，菌体扩大培养；将正确的重组质粒进行EcoRⅠ单酶切，制备反义探针，并进行原位杂交。原位杂交方法检测出LFRFamide基因在乌贼脑的食道上神经团中的脑亚脚叶、亚垂直叶、前基叶、后基叶和上额叶，食道下神经团的的前足叶和腕神经叶、前色素细胞叶、巨细胞叶、外套内脏叶以及视叶中有表达。根据以上数据初步推测LFRFamide可能参与调控色素囊变化、取食和生殖活动。

原位杂交步骤为：

1）前处理：将脑组织石蜡切片浸入2~6%多聚甲醛固定6~15min；PBS漂洗6~15min；0.05~0.15M PBS/甘氨酸中2~7min；0.1~0.5%Triton X-100/PBS中10~20min；PBS漂洗5~15min；

2）通透处理：在32~40℃的蛋白酶K溶液中处理10~30min；0.05~0.15M氨基酸/PBS冲洗0.5~2.0min；PBS漂洗6~15min；在0.05~0.15M三乙醇胺中处理6~15min，三乙醇胺中含0.15%~0.35%醋酸铵；最后用盐溶液2×SSC漂洗6~15min；

3）预杂交和杂交：45℃预杂交液孵育0.5~1.5h；46℃杂交液孵育5~7h；

4）后处理：杂交液孵育后，4×SSC漂洗0.5~1.5min；32~40℃，2×SSC漂洗25~35min；1×SSC漂洗25~35min；

5）抗体杂交：Blocking 缓冲液室温封闭0.5~1.5h；AP标记抗DIG抗体，32~40℃条件下，孵育0.5~1.5h；之后用PBS冲洗0.5~1.5min；

6）显色：加入显色底物NBT/BCIP，暗处显色30min~24h；DEPC水冲洗2~5min，最后用甘油封片，两天后拍照，保存。

虎斑乌贼神经肽LFRFamide，用于丰富我国在头足类中参与生殖调控类神经肽的研究，验证LFRFamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性，优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。

与现有技术相比，本发明的优点在于：首次克隆了虎斑乌贼LFRFamide的神经肽基因cDNA序列全长。对上述基因的开放阅读框进行前体蛋白预测，分析其结构与特征，并对其序列进行了同源比对分析和进化树的构建。通过荧光定量PCR方法对上述神经肽基因进行了不同发育阶段雌雄组织表达特异性分析。利用原位杂交技术对神经肽LFRFamide在虎斑乌贼不同脑组织功能区中的表达位点进行了细胞定位，并通过特异表达的脑组织功能区推测了上述神经肽的功能。初步推测LFRFamide可能参与调控色素囊变化、取食和生殖活动。

附图说明

图1为虎斑乌贼总RNA电泳结果图；

图2为LFRFamide基因PCR电泳结果图；

图3为3′RACE扩增电泳条带图；

图4为5′RACE扩增电泳条带图；

图5为虎斑乌贼LFRFamide基因cDNA全长图；

图6为LFRFamide基因氨基酸序列同源比对图；

图7为与LFRFamide同源氨基酸序列构建的NJ系统进化树；

图8为虎斑乌贼LFRFamide不同组织表达特异性柱形图；

图9为虎斑乌贼LFRFamide基因mRNA的脑组织原位杂交图。

附图标记说明：图5中预测的氨基酸序列显示在碱基序列下方，推测的信号肽序列用实线下划线标出，预测的FLPs用虚线下划线标出，基本剪切位点用六边形框标出，C-端酰胺化的甘氨酸用圆形框标出，用长方形框分别标示了预测的起始密码子（ATG）、终止密码子（TAA）和多腺苷化信号（AATAAA）；图6中相同氨基酸残基用黑色标示，保守氨基酸残基用灰色标示；图9中A：正义探针对照；B：视叶；C：亚垂直叶、脑亚脚叶；D：上额叶；E：前基叶；F：前腕神经叶；G：腕叶；H：中食道下神经团；I：后下食道神经团。缩写：ABL：前基叶；ACL：前色素细胞叶；APL：前足叶；ASEM：前食道下神经团；BL：腕神经叶；IFL：下额叶；MAG：巨细胞叶；MSEM：中食道下神经团；PBL：后基叶；Pobr：后腕神经叶；Prbr：前腕神经叶；PSEM：后食道下神经团；PVL：外套内脏叶SFL：上额叶；SPL：脑亚脚叶；SVL：亚垂直叶，黑色尖头指示阳性区域，黑色标尺表示长度1000μm。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

虎斑乌贼神经肽LFRFamide，作用机理的探测方法包括神经肽LFRFamide基因克隆和序列分析、神经肽LFRFamide组织特异性表达分析和神经肽LFRFamide脑组织表达定位分析。

神经肽LFRFamide基因克隆和序列分析：

①RNA提取准备工作：提RNA过程中所使用的镊子、剪刀于烘箱中 180℃烘烤 4h以上。不能置于烘箱烘烤的枪头、电动匀浆器转头和离心管等实验器材均在配好的0.1% DEPC水中浸泡过夜以确保无RNAase，取出后在高压灭菌条件下 30min，用烘箱烘干备用。

②总RNA提取：取干净的1.5ml离心管(RNAase free)，用无RNAase枪头加入 500μLTrizol（4℃），用 DEPC 处理过的镊子夹取约 30mg 脑组织样品浸入 Trizol，使用电动匀浆器匀浆 30s，补加500μL Trizol；轻轻摇晃离心管，使组织充分溶解到Trizol中，室温静置5分钟；在离心管中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置5分钟；4℃、12000 rpm离心 15min；离心后，离心管内分为3层，取最上层的上清液于新离心管中；向离心管中加500μL的异丙醇，摇匀，室温静置10分钟；离心机中4℃、12000 rpm离心10分钟；离心后，除去上清液，保留沉淀；加入1ml的75%的乙醇，用枪头吹吸沉淀；离心机中4℃、7500 rpm离心5分钟，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；室温静置约20分钟待RNA呈半干的透明状态，用DEPC水溶解后备用（按析出沉淀质量大小加入适量的DEPC水）；取3μL的RNA液将其点样到1%的琼脂糖凝胶上，在200v，150mA的电泳仪下跑胶约15分钟，取出胶在UVP紫外凝胶成像仪中分析RNA条带情况。虎斑乌贼总RNA在UVP紫外凝胶成像仪中呈现的图像如图1所示，28s存在一定降解，但不影响后续实验。进一步经过紫外分光光度计测定，A260/A280值在1.8-2.0之间，可作为模板进一步用于cDNA第一链合成。

③cDNA第一链的合成：使用Takara公司生产的M-MLV（Rnase H^-）反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成实验，具体操作步骤如下：脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成实验，具体操作步骤如下：

0.2ml离心管中加入以下反应体系：

总RNA 5.0μL

Oligo DT 1.0μL

混匀反应体系，离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育10min后立刻冰上静置2min；

在上述离心管中加入以下反应体系：

5×M-MLV Buffer 2.0μL

dNTP Mixture(10mM) 0.5μL

RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.25μL

M-MLV RTase(200U/μL) 0.25μL

DEPC处理水 1.0μL

混匀反应体系，离心，将离心管置于PCR仪内，42℃ 孵育1h，70℃ 孵育15min后，迅速冰上静置15min；将合成的cDNA置于-20℃冰箱保存备用。

④虎斑乌贼LFRFamide核心序列的扩增：根据NCBI数据库中已报道的5种软体生物LFRFamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，设计简并引物来获得虎斑乌贼LFRFamide基因核心片段。利用已获得的核心片段序列设计5’RACE和3’RACE引物，使用primer 5.0软件搜索设计。克隆过程中所需引物信息见表1：

表1：克隆LFRFamide所需引物

Primer Name	Primer sequence(5’-3’)
		LFRFamide-F	CAAACGCAACAGCCTCTTCCG
LFRFamide-R	AGTGCGGCTTCGTCCATACC
		5’-LFRFamide-outter	GCTGCGTTTTAGTCCTTCG
5’-LFRFamide-inner	TTCGGGGTCGTCCTTGCT
		3’-LFRFamide-outter	AGAGACGGACTCGAAGACCTTTACG
3’-LFRFamide-inner	CTCAGCACAACAGGCGGCAGCAAC
		5’RACE Adapter	CGAGTCCGTCTCTTTT
5’RACE Outer Primer	ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA
		5’RACE Inner Primer	ACUACUACUAGGGGCGTCGA
3’ RACE Adapter	GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT
		3’ RACE Outer Primer	GCGGATCCGAATTAATACGACT
3’ RACE Inner Primer	GCGAGCACAGAATTAATACGACT
		M13-F	TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R	CAGGAAACAGCTATGACC

以成熟虎斑乌贼脑组织cDNA为模板，利用简并引物LFRFamide-F和LFRFamide-R进行LFRFamide基因核心片段的PCR扩增。反应体系如下：

灭菌水 15.5μL

10×PCR buffer 2.5μL

MgCl₂(25mM) 2.5μL

dNTP(10mM) 1.0μL

LFRFamide-F 1.0μL

LFRFamide-R 1.0μL

脑组织cDNA 1.0μL

Taq酶 0.5μL

加样完成之后，PCR扩增程序如下：95℃，5min；94℃，30s，52℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，12min；

1.用1%琼脂糖电泳检测PCR产物，电泳结果如图2所示，与预期大小一致，该核心序列长度为263bp。找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化，具体操作步骤如下：

（1）跑胶，利用凝胶成像系统观察目的条带，找到条带后用干净的刀片将其切下，放入RNAase free的1.5 ml离心管中，称其重量，按每克胶加1ml SolutionⅠ的计算量，向装有胶块的离心管中加入SolutionⅠ，56℃水浴10min，每2-3 min震荡一次帮助加速溶解；

（2）将含有琼脂糖胶的SolutionⅠ混合液转移至离心柱中，10000 rpm离心2min，若混合液过多，可分多次进行；

（3）收集（2）中的溶液，并将其移入吸附柱AC中，相同离心率条件下，离心1min，弃废液，后将离心柱放回收集管中；

（4）向吸附柱中加入700μL漂洗液，10000rpm离心1min，弃废液，将离心柱放回到收集管中；

（5）为尽可能地去除漂洗液，再次加入500μL漂洗液至吸附柱中，相同离心率条件下，离心1min，倒废液，将离心柱放回管中，离心 1min；

（6）换一个干净的收集管，在吸附膜的中间部位加30μL DEPC处理水，12000rpm条件下离心2min，收集溶液；

（7）取4μL回收的DNA检测，5μL用于连接，其余-20℃保存；

2. 目的片段的克隆：

（1）PCR产物与pUcm-T载体16℃连接过夜，之后与DH5α感受态混匀，冰上静置30min，42℃处理90s，迅速冰浴静置5min；

（2）加入1ml LB液体培养基，将含有菌液的离心管置于恒温摇床中，37℃ 200 rpm摇床1h；

（3）将离心管从恒温摇床中取出，并置于离心机中，室温4000 rpm离心5min，除去1ml上清液，枪头吹吸重悬菌体；

（4）涂板，培养箱中37℃培养16h；

（5）蓝白斑筛选，重新接种菌落，载体引物M13-F/M13-R进行克隆的阳性检测。筛选克隆的PCR体系如下：

菌液 16.5μL

10×PCR buffer 2.5μL

MgCl₂(25mM) 1.5μL

dNTP(10mM) 1.0μL

M13-F 1.0μL

M13-R 1.0μL

Taq酶 0.5μL

菌液送至上海生工测序。

⑤RACE获得LFRFamide基因cDNA的全长：

1.3’端RACE模板cDNA制备：

以虎斑乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增3’RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增3’RACE未知片段。实验操作根据试剂盒提供说明书进行；

1）0.2ml离心管中加入以下反应体系：

脑组织总RNA 1μg

3’RACE Adapter 1μL

DEPC处理水 补至5μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育2min后，快速移至冰上静置2min；

2）向第一步1）中的反应液中加入以下反应体系：

5×第一链缓冲液 2.0μL

dNTP(10mM) 1.0μL

DTT 1.0μL

PowerScript Reverse Transcriptase 1.0μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，42℃孵育1.5h后，70℃孵育7min，加入100μL灭菌水稀释产物。将稀释后的模板cDNA置于-20℃保存；

3’端RACE的PCR扩增：利用巢式PCR方法，进行两轮PCR反应扩增出LFRFamide基因3’端RACE片段序列。反应体系如下：

1）巢式PCR第一轮反应。0.2ml离心管中加入以下反应体系：

灭菌水 29.1μL

10×Advantage 2PCR缓冲液 4.0μL

dNTP(10mM) 0.8μL

50×Advantage 2Polymerase Mix 0.8μL

3’RACE cDNA 2.5μL

3’-LFRFamide-outter 5.0μL

3' RACE Outer Primer 1.0μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为： 94℃ 2min；94℃ 5s，68℃ 10s，72℃ 3min，20个循环；72℃ 5min；

2）将第一轮1）中扩增产物用作此轮模板。第二轮反应体系如下：

灭菌水 29.1μL

10×Advantage 2PCR缓冲液 4.0μL

dNTP(10mM) 2.5μL

50×Advantage 2Polymerase Mix 0.8μL

第一轮PCR产物 0.8μL

3’-LFRFamide-inner 5.0μL

3' RACE Inner Primer 1.0μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为： 94℃ 2min；94℃ 5s，68℃ 12s，72℃ 3min，20个循环；72℃ 6min。电泳检测PCR产物，扩增后的产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图3所示，由图3可知3′RACE产物为359bp条带；

3）将PCR产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送至上海生工测序；

2. 5’端RACE模板cDNA制备：以虎斑乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增5’RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增5’RACE片段。实验操作根据试剂盒提供说明书进行；

1）0.2ml离心管中加入以下反应体系：

脑组织总RNA 1μg

5’RACE Adapter 1μL

DEPC处理水 补至15.5μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育10min后，快速移至冰上静置2min；

2）向上一步1）中的反应液中加入以下反应体系：

10×PCR buffer 2.5μL

MgCl₂(25mM) 2.5μL

dNTP(10mM) 1.0μL

0.1M DTT 2.5μL

混匀反应液，轻微离心，将离心管置于PCR内，42℃孵育1min；加入1μL的SperScript^TMⅡRT，42℃孵育50min后，70℃孵育15min；加入1μL的RNase mix，37℃孵育30min；

3）纯化cDNA：加入120 μL的SolutionⅠ至cDNA中，将混合液移至离心柱中，在10000 rpm离心率条件下，离心30s，将离心柱取中，吸出液体；加入350μL的SolutionⅡ，12,000 rpm离心20s，除上清，重复2次；70%乙醇洗涤2次； 12000 rpm离心60s，除乙醇；更换离心管，向离心柱中加入50μL灭菌水，相同离心率条件下，离心60s，便可获得纯化产物；

4）加尾反应，反应体系如下：

DEPC处理水 6.5μL

5×Tailing Buffer 5.0μL

2 mM dCTP 2.5μL

已纯化cDNA 10.0μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，94℃孵育3min后，迅速冰上静置1min；加入1μL的TdT；37℃孵育10min，65℃热激TdT 10min；加入100μL灭菌水稀释产物。将稀释后的模板cDNA置于-20℃保存；

5’端RACE的PCR扩增：1）巢式PCR第一轮反应。0.2ml离心管中加入以下反应体系：

灭菌水 31.5μL

10×PCR buffer 5.0μL

MgCl₂(25mM) 3.0μL

dNTP(10mM) 1.0μL

5’RACE Outer Primer 2.0μL

5’-LFRFamide-outter 2.0μL

加尾cDNA 5.0μL

Taq酶 0.5μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为： 94℃ 2min；94℃ 30s，60℃ 35s，72℃ 45s，32个循环；72℃ 8min。

2）将第一轮1）中扩增产物用作此轮模板。第二轮反应体系如下：

灭菌水 31.5μL

10×PCR buffer 5.0μL

MgCl₂(25mM) 3.0μL

dNTP(10mM) 1.0μL

5’RACE Inner Primer 1.0μL

5’-LFRFamide-inner 1.0μL

第一轮PCR产物 5.0μL

Taq酶 0.5μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃ 2min；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 40s，30个循环；72℃ 8min。电泳检测PCR产物，扩增后的产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图4所示，由图4可知5′RACE产物为487bp条带；

3）将PCR产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送至上海生工测序。

⑥序列信息分析方法：使用Lasergene软件对LFRFamide基因的3’端、5’端和核心片段的序列进行拼接，从而获得完整的虎斑乌贼LFRFamide基因的cDNA全长序列。PredictProtein和Scratch Protein Predictor 等在线工具可用来对LFRFamide基因进行开放阅读框（ORF）预测，以及推测该ORF所编码的氨基酸序列。应用在线分析站点SignalP v3.0对氨基酸序列进行信号肽预测。应用NCBI对氨基酸序列进行Blast (blastx and blastn)分析，应用ClustalW2对LFRFamide及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析。LFRFamide前体蛋白相对分子质量同等电点的估算使用的是Expasy-ProtParam 在线分析软件。使用MEGAv5.0软件进行基于NJ法的进化树构建，重复1000次循环。

如图5所示，虎斑乌贼神经肽LFRFamide基因cDNA全长860bp，开放阅读框567bp，编码188个氨基酸，5’非编码序列91bp，3’非编码序列202bp。使用在线信号肽预测工具对LFRFamide基因前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现，LFRFamide基因前体蛋白含有一段长22个氨基酸的信号肽。进一步对开放阅读框序列进行分析后发现，虎斑乌贼LFRFamide基因可能编码4种不同的类LFRFamide多肽（FLPs）成熟产物：1拷贝的六肽NSLFRFamide，3拷贝的六肽GNLFRFamide，1拷贝的五肽TIFRFamide，1拷贝的七肽PHTPFRFamide。前体蛋白相对分子质量(MW)为21.5kDa，等电点(pI)为9.40。在氨基酸序列中，每个FLP的C端均连接精氨酸-脯氨酸-甘氨酸，表明这些FLP可能都可能存在酰胺化后修饰现象。而N-端连接的赖氨酸-精氨酸残基和在C-端连接赖氨酸-精氨酸或精氨酸残基都可能在所有这些FLP的翻译后修饰过程中充当氨基酸序列的内部剪切位点。

⑦LFRFamide基因氨基酸序列同源比对及系统进化分析：用ClustalW2在线分析网站（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）对虎斑乌贼LFRFamide前体蛋白进行保守性分析。如图6所示，比对结果表明同源序列比对结果显示虎斑乌贼（S.pharaonis）LFRFamide基因与曼氏无针乌贼（S.japonica）和商乌贼（S.officinalis）SOFaRP2相似性均为96%，与静水椎实螺（Lymnaea stagnalis）、太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）、海蜗牛（Aplysia californica）相似度分别是 54%、40%和 41%。

⑧虎斑乌贼系统进化分析：选取45条FLP序列，基于NJ法进行进化树的构建。如图7所示，虎斑乌贼LFRFamide与商乌贼的SOFaRP2、曼氏无针乌贼LFRFamide亲缘关系较近，属FLPs的LFRFamide亚族成员。

虎斑乌贼LFRFamide基因cDNA序列全长860bp，编码188个氨基酸，前体蛋白包含一段长22个氨基酸的信号肽和4种不同的成熟肽产物：1拷贝的六肽NSLFRFa、1拷贝的五肽TIFRFa、1拷贝的七肽PHTPFRFa和3拷贝的六肽GNLFRFa。这种由单个基因编码多种不同拷贝产物的特点与典型的软体动物FLPs基因结构相同。虎斑乌贼LFRFamide基因FLPs产物N-端结构与曼氏无针乌贼、静水椎实螺、太平洋牡蛎、海蜗牛的LFRFamide同源序列产物存在差异。如静水椎实螺同源序列的产物有NTLFRFa、QGSLFRFa、GGSLFRFa、GTLLRFa、TLFRFa和pQGSLFRFa海蜗牛的有GGALFRFa、GSLFRFa和STLFRFa。同FLPs家族成员FMRFamide产物的N-端扩展结构同样多变，而在同一物种中发现存在不同FMRFamide受体以及不同FMRFamide对同一组织的不同作用效价等，推测LFRFamide与FMRFamide类似，其N-结构在识别、激活受体过程中起调节作用。

通过对虎斑乌贼LFRFamide基因氨基酸序列与其他同源序列的比对分析，发现LFRFamides 基因C-端的FRF是高度保守的，而N-端氨基酸组成结构多变，推测C-端结构在识别、激活受体过程中是必不可少的。FRF的C-端接着甘氨酸，表明LFRFamide成熟产物可能存在翻译后酰胺化修饰现象，该酰胺化修饰作用可能与防止多肽降解有关，这在静水椎实螺中已经得到证实。虎斑乌贼LFRFamide基因氨基酸序列与曼氏无针乌贼LFRFamide基因氨基酸序列和商乌贼SOFaRP2基因氨基酸相似度均为96%，表明它们亲缘关系较近，而它与静水椎实螺、太平洋牡蛎、海蜗牛LFRFamide同源序列比对相似度分别为54%、40%和41%，且它们的成熟产物的N-端之间存在较大差异，推测LFRFamide基因在软体动物进化过程中，成熟肽C-端FRF结构对动物体起重要作用。

GNLFRFamide在商乌贼外围组织的定位以及静水椎实螺的Northern 杂交实验表明，在软体动物门物种中至少存在2个独立且分属不同亚族的FLPs基因。在过去的研究中，SOFaRP2属于FaRPs亚族，但分析进化树（图7）结果，发现SOfaRP2与属于LFRFamide亚族的曼氏无针乌贼LFRFamide和静水椎实螺LFRFamide基因关系更近，且虎斑乌贼和曼氏无针乌贼、商乌贼同属一支，属FLPs的LFRFamide亚族成员。目前对于FMRFamide和LFRFamide之间的关系尚不清楚，但曼氏无针乌贼LFRFamide的表达模式与商乌贼FMRFamide的表达模式相似，如LFRFamide基因和FMRFamide基因在色素囊的调节作用中都扮演重要角色。

神经肽LFRFamide组织特异性表达分析：

①不同组织总RNA提取：选取3个不同发育阶段(Ⅲ期，Ⅳ期，Ⅴ期，按卵子发生和卵巢发育阶段划分)的虎斑乌贼，提取不同组织总RNA和脑组织总RNA，具体操作步骤参照神经肽LFRFamide基因克隆和序列分析步骤中的①②步。其中，组织包括，雄性乌贼：脑、视叶、肝、肌肉、精巢、心、鳃；雌性乌贼：脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺。

②cDNA模板合成：（1）荧光定量PCR实验所需的不同组织cDNA模板，使用试剂盒合成cDNA。合成方法按试剂盒提供说明书步骤进行，步骤如下：

去除基因组DNA：0.2ml离心管中加入以下反应体系：

5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL

gDNA Eraser 1.0μL

总RNA 1.0μL

DEPC处理水 7.0μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，42℃孵育2min，迅速冰上静置；

（2）反转录：向第一步的反应产物中加入反应体系；

第一步反应产物 10.0μL

5×PrimerScript Buffer2 4.0μL

DEPC处理水 4.0μL

PrimerScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0μL

RT Primer Mix 1.0μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，37℃ 孵育15min，85℃ 孵育5s，迅速冰上静置15min。将反应产物保存至-20℃冰箱中；

（3）使用美国Thermo公司生产的NANODROP 2000型核酸蛋白检测仪对cDNA浓度和质量进行测定，用灭菌水将不同组织的cDNA均稀释至50ng/μL。

③引物设计：根据已获得的虎斑乌贼LFRFamide基因cDNA序列全长，使用Primer5.0软件及Primer 3.0在线引物搜索工具（http://primer3.ut.ee/），设计LFRFamide基因荧光定量PCR所需引物。设计引物时，要求正反向2条引物的退火温度相差1℃以内，且Tm在60℃以上。引物之间不存在互补，PCR反应时不形成引物二聚体。引物进行梯度PCR筛选并测序，最终确定能特异扩增虎斑乌贼LFRFamide基因的引物；

表2：LFRFamide荧光定量PCR所需引物

引物名称	序列
		RT-LFRF-F	AACGAAGGACTCAAACGCAC
RT-LFRF-R	AACGAAGGACTCAAACGCAC
		RT-actin-F	TGAGAGGGAGATTGTGCGTG
RT-actin-R	GAACATAGATTCTGGAGCACGG

LFRFamide荧光定量PCR实验中使用的引物信息见表2。

④荧光定量PCR：使用相对定量方法分别检测三个发育阶段(Ⅲ期，Ⅳ期，Ⅴ期，按卵巢发育阶段划分) 雌、雄虎斑乌贼FMRFamide基因不同组织的表达特异性。将曼氏无针乌贼β-actin基因（JN564496.1）作为实验的内参基因，心脏的基因表达量作为参照标准。荧光定量PCR实验操作按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit (Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行。将八连管置于冰上，并加入以下反应体系：

2×SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ 10.0μL

cDNA模板 0.8μL

灭菌水 7.2μL

RT-FMRF-F 0.8μL

RT-FMRF-R 0.8μL

ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μL

混匀反应体系，轻微离心，将八连管置于ABI 7500 Real Time PCR仪内，设定的程序为： 94℃ 30s；94℃ 5s，60℃ 30s，40个循环；55-95℃逐渐升温2min。实验进行3次重复。

⑤数据处理：标准曲线，Ct值等由ABI 7500 Real Time PCR仪自带的ABI 7500Real time PCR System Detection软件自动完成。使用2^-△△Ct方法测定不同组织LFRFamide基因的表达量水平。使用SPSS 18.0 统计软件的单因素方差分析（one way ANOVA）功能进行方差分析，Duncan法多重比较检验组间差异的显著性，P＜0.05检查差异显著。使用Excel2010软件，进行数据的统计和分析，使用软件Sigma Plot 12.5来制作相关柱形图。如图8所示，LFRFamide基因在三个时期的乌贼脑组织中均有显著表达(P＜0.05)，在视叶中亦有表达。不同是的，第Ⅳ、Ⅴ期，LFRFamide在雌性乌贼缠卵腺、副缠卵腺以及卵巢中有微量表达。根据结果推测LFRFamide与生殖相关。

为了解虎斑乌贼LFRFamide基因组织表达特异性，其不同组织中表达水平是通过荧光定量PCR方法来检测的，该方法灵敏度高、特异性强、结果清晰等特点。在此之前，仅有曼氏无针乌贼通过此方法检测LFRFamide基因水平的报道。由于实验成本等问题，选用荧光定量PCR中的相对定量方法，因此还需要与传统半定量PCR检测中类似的内参基因，如18SrRNA、β-actin、GAPDH等作为参照。本实验中选取Genbank中已收录的曼氏无针乌贼β-actin基因序列作为内参，该基因在不同组织中的表达量相对稳定。为保证结果的准确性，本实验进行了3次不同批次样品的重复。

结果显示，在2种性别的乌贼体内，LFRFamide基因在三个阶段的乌贼脑组织中均有显著表达，在视叶中亦有表达。均仅在脑组织中有显著表达，表明用来检测FMRFamide基因mRNA细胞表达位点的原位杂交实验需在脑组织中进行。此外，在雌性乌贼的缠卵腺、副缠卵腺和卵巢中同样检测出微量的LFRFamide基因表达，但不显著（P＞0.05），推测LFRFamide主要在中枢神经系统表达，其他组织中可能也存在微量表达。在其他软体动物中，研究者还通过其他的一些实验方法检测了LFRFamide同源基因mRNA或成熟肽的表达分布情况。商乌贼中通过MicroLC-ESI-MS/MS组织标记显示除了脑组织，成熟肽GNLFRFamide还存在于输卵管和直肠的神经末梢中，说明GNLFRFamide可能参与卵和排泄物的排出作用。Northernblot方法检测静水椎实螺发现LFRFamide存在于螺的脑组织中，且只存在一种mRNA形式。

此外，放射原位标记方法检测海蜗牛发现LFRFamides存在于B15神经元中，该神经元与肌肉收缩相关。这些除中枢神经表达位点以外的组织部位存在LFRFamide蛋白或mRNA能否说是LFRFamide的标靶位点还需要进一步深入的研究。

神经肽LFRFamide脑组织表达定位分析：

①引物设计：根据已获得的虎斑乌贼LFRFamide基因cDNA序列全长，使用Primer 5.0软件及Primer 3.0在线引物搜索工具（http://primer3.ut.ee/），设计LFRFamide原位杂交所需引物。设计引物时，在LFRFamide基因cDNA序列中筛选限制性内切酶剪切位点，将剪切位点碱基添加到前后引物F/R的5’端。引物进行梯度PCR筛选并测序，最终确定能特异扩增虎斑乌贼LFRFamide基因的引物：LFRF-probeF：CCCAAGCAGATGGAGAGGAAGGCGAAC和LFRF-probeR：CCGGAAGTGCGGCTTCGTCCATACC。

②脑组织切片：

1）固定：将乌贼脑组织浸泡在4%多聚甲醛中，4℃固定16h；PBS中漂洗5min；

2）脱水：将脑组织分别在盛有70%、80%、90%、100%乙醇梯度的染色缸中脱水各1h，期间可更换一次试剂；

3）透明：将脑组织转移至二甲苯：乙醇=1:1中浸泡处理30min，然后浸入有机溶剂二甲苯中30min，使组织透明；

4）浸蜡：先将脑组织转移至石蜡：二甲苯=1:1中1h，后转移至石蜡中1h；

5）包埋：事先预热金属盒，将已充分浸蜡的脑组织放入金属盒进行石蜡包埋；

6）修块：将包埋好的蜡块进行修块；

7）切片：将修好的蜡块置于石蜡切片机上切片，纵切，切片厚度为7μm；

8）展片和烘片：42℃展片机上展片5min；50℃烘片机上烘片30min；可以将烘干的的石蜡切片置于-20℃冰箱保存备用；

9）脱蜡：将切好的脑组织切片置于二甲苯脱蜡30min，期间更换一次试剂；

10）复水：将脑组织分别在盛有100%、90%、80%、70%乙醇梯度的染色缸中复水各10min；PBS中漂洗10min，期间更换一次试剂。

③原位杂交：

（1）杂交探针模板制备

根据LFRFamide的cDNA序列设计引物LFRF-probeF/LFRF-probeR，以乌贼脑组织cDNA为模板进行普通PCR扩增，PCR产物用作原位杂交探针模板的制备；

探针模板的PCR扩增。反应体系如下：

灭菌水 31.5μL

10×PCR buffer 5.0μL

MgCl₂(25mM) 3.0μL

dNTP(10mM) 1.0μL

LFRF-probeF 1.0μL

LFRF-probeR 1.0μL

脑组织cDNA 1.0μL

Taq酶 0.5μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 8min。电泳检测产物；

（2）目的片段和载体的酶切、连接、转化和筛选

1） 扩增得到的PCR产物，进行切胶纯化；

2） 纯化后使用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ在0.2ml离心管中进行双酶切，酶切体系如下：

PCR纯化产物 5.0μL

10×M Buffer 1.0μL

EcoRⅠ 1.0μL

HindⅢ 1.0μL

灭菌水 12.0μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，37℃孵育8h；

3） pSPT18亦采用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切体系同上；

4） PCR产物和pSPT18酶切产物使用E.Z.N.A. ^TM Gel Extraction Kit (50)试剂盒再次进行切胶纯化后，使用Takara公司生产的Solution Ⅰ进行连接。连接体系如下：

GnRH序列片段 2.0μL

pSPT18 3.0μL

灭菌水 5.0μL

5） 转化至DH5α感受态后，涂板，单个挑取合适的菌落，菌体扩大培养。使用D6942-01型Plasmid Mini Kit I(100)质粒提取试剂盒抽提质粒。提取的质粒保存于-20℃冰箱，并送至上海生工进行测序，检测插入序列的正确性；

6） 将正确的重组质粒进行EcoRⅠ单酶切。单酶切反应体系如下：

质粒 5.0μL

10×H Buffer 5.0μL

EcoRⅠ 5.0μL

灭菌水 35.0μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，37℃孵育5h后，用酚/氯仿重新抽提产物，并用乙醇沉淀，将沉淀重溶于15μL DEPC处理水中，取2μL电泳检测；

（3）探针的制备

使用DIG RNA Labeling kit SP6/T7试剂盒制备反义探针；

1）0.2ml离心管中加入以下反应体系：

处理后的质粒 2.0μL

10×Transcription Buffer 2.0μL

10×DIG Labeling mixture 2.0μL

RNA inhibitor(20U/μL) 2.0μL

T7 RNA polymerase(20U/μL) 2.0μL

DEPC处理水 10.0μL

2）混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，37℃孵育2h，加入2.0μL EDTA终止反应；

3）向离心管中加入75μL预冷无水乙醇，混匀反应液，-20℃静置3h；

4）4℃，12,000rpm/min离心15min，除去上清液；

5）加入100μL 70%乙醇，枪头吹吸，4℃，7,500rpm/min离心5min，除去上清，加入50μLDEPC处理水，取2μL用于电泳检测后，保存至-20℃冰箱备用；

6）正义探针制备体系如下：

处理后的质粒 2.0μL

10×Transcription Buffer 2.0μL

10×DIG Labeling mixture 2.0μL

RNA inhibitor(20U/μL) 2.0μL

SP6 RNA polymerase(20U/μL) 2.0μL

DEPC处理水 10.0μL

反义探针的制备步骤同正义探针；

（4）原位杂交实验

1）前处理：将脑组织石蜡切片浸入4%多聚甲醛固定10min；PBS漂洗10min；0.1M PBS/甘氨酸中5min；0.3%Triton X-100/PBS中15min；PBS漂洗，10min；

2）通透处理：37℃，蛋白酶K溶液中处理20min；0.1M氨基酸/PBS冲洗1min；PBS漂洗10min；0.1M三乙醇胺（含0.25%醋酸铵）中10min；最后用盐溶液2×SSC漂洗10min；

3）预杂交和杂交：45℃预杂交液孵育1h；46℃杂交液孵育6h；

4）后处理：杂交液孵育后，4×SSC漂洗1min；37℃，2×SSC漂洗30min；1×SSC漂洗30min；

5）抗体杂交：Blocking 缓冲液室温封闭1h；AP标记抗DIG抗体（1:500），37℃条件下，孵育1h；之后用PBS冲洗1min；

6）显色：加入显色底物NBT/BCIP，暗处显色30min-24h；DEPC水冲洗3min，最后用甘油封片，两天后拍照，得到图9，保存。

利用原位杂交技术对虎斑乌贼LFRFamide基因mRNA在脑组织中的表达位点进行细胞定位。乌贼脑组织的3个部分组成：食道上神经团、食道下神经团和视叶。如图9显示，在乌贼脑组织的多个区域均能观察到清晰的LFRFamide基因mRNA阳性杂交信号，而用正义探针进行杂交的图9A中不能观察到信号。在食道上神经团中能够观察到多处特异的LFRFamide杂交信号，并且这些区域主要集中在髓质区，脑亚脚叶和亚垂直叶（图9C）中能够观察到的阳性信号最为强烈，前基叶和后基叶（图9E）的信号强度次之，上额叶（图9D）的信号强度最弱。食道下神经团在形态学上主要分为3个不同的部分：前食道下神经团（ASEM）、中食道下神经团（MSEM）和后食道下神经团（PSEM），在这3个区域均能观察到强烈的阳性杂交信号。在后食道下神经团中，通过LFRFamide反义探针杂交而形成的有效阳性信号，主要存在于巨细胞叶和外套内脏叶（图9I）这2个区域。在中食道下神经团中，阳性杂交信号在前足叶和前色素细胞叶（图9H）中亦能观察到。在前食道下神经团部分，包括前腕神经叶（prebrachiallobe, Prbr），后腕神经叶（postbrachial lobe, Pobr）和腕神经叶（图9F）的其他2个区域也均能观察到阳性杂交信号。同样，视叶中也存在由LFRFamide反义探针杂交而形成的阳性信号，并且这些阳性信号只在髓质区有观察到，而皮质区、视腺和嗅叶中均没有观察到阳性信号。

虎斑乌贼神经肽LFRFamide基因cDNA全长860bp，开放阅读框(open readingframe，ORF )567bp，编码188个氨基酸，5’非编码区(5’-UTR)91bp，3’非编码区(3’-UTR)202bp，前体蛋白相对分子质量(MW)为21.5kDa，等电点(pI)为9.40。前体蛋白包含一段长22个氨基酸的信号肽和4种不同拷贝数的成熟多肽产物。成熟多肽C-端Phe-Arg-Phe ( FRF)残基较为保守，构建进化树分析后将其归属到LFRFamide亚族。荧光定量PCR结果显示LFRFamide基因在三个时期的乌贼脑组织中均有显著表达，在视叶中亦有表达。不同是的，LFRFamide在Ⅳ期，Ⅴ期雌性乌贼缠卵腺、副缠卵腺以及卵巢中有微量表达。原位杂交方法检测出LFRFamide基因在乌贼脑的食道上神经团中的脑亚脚叶、亚垂直叶、前基叶、后基叶和上额叶，食道下神经团的的前足叶和腕神经叶、前色素细胞叶、巨细胞叶、外套内脏叶以及视叶中有表达。根据以上数据初步推测LFRFamide可能参与调控色素囊变化、取食和生殖活动。

虎斑乌贼神经肽LFRFamide的用途，用于丰富我国在头足类中参与生殖调控类神经肽的研究，验证LFRFamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性，优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.虎斑乌贼神经肽LFRFamide，其特征在于基因cDNA全长860bp，开放阅读框(openreading frame，ORF )567bp，编码188个氨基酸，5’非编码区(5’-UTR)91bp，3’非编码区(3’-UTR) 202bp，前体蛋白相对分子质量(MW)为21.5kDa，等电点(pI)为9.40。

2.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽LFRFamide，其特征在于：所述的神经肽LFRFamide作用机理的探测方法包括神经肽LFRFamide基因克隆和序列分析、神经肽LFRFamide组织特异性表达分析和神经肽LFRFamide脑组织表达定位分析。

3.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽LFRFamide，其特征在于：所述的神经肽LFRFamide基因克隆和序列分析步骤为：提取成熟虎斑乌贼脑组织总RNA，使用反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成，将合成的cDNA置于-30~-15℃保存备用；根据NCBI数据库中已报道的5种软体生物LFRFamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，设计简并引物来获得虎斑乌贼LFRFamide基因核心片段；以成熟虎斑乌贼脑组织cDNA为模板，利用简并引物LFRFamide-F和LFRFamide-R进行LFRFamide基因核心片段的PCR扩增，PCR扩增程序如下：95℃，5min；94℃，30s，52℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，12min；用1%琼脂糖电泳检测PCR产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化；以虎斑乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增3’RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增3’RACE未知片段，得到3’端RACE模板cDNA；以虎斑乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增5’RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增5’RACE片段，得到5’端RACE模板cDNA；使用Lasergene软件对LFRFamide基因的3’端、5’端和核心片段的序列进行拼接，从而获得完整的虎斑乌贼LFRFamide基因的cDNA全长序列；克隆LFRFamide所需引物为：LFRFamide-F：CAAACGCAACAGCCTCTTCCG；LFRFamide-R：AGTGCGGCTTCGTCCATACC；5’-LFRFamide-outter：GCTGCGTTTTAGTCCTTCG；5’-LFRFamide-inner：TTCGGGGTCGTCCTTGCT；3’-LFRFamide-outter：AGAGACGGACTCGAAGACCTTTACG；3’-LFRFamide-inner：CTCAGCACAACAGGCGGCAGCAAC；5’RACE Adapter：CGAGTCCGTCTCTTTT；5’RACE Outer Primer：ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA；5’RACE Inner Primer：ACUACUACUAGGGGCGTCGA；3’ RACEAdapter：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；3’ RACE Outer Primer；GCGGATCCGAATTAATACGACT；3’ RACE Inner Primer：GCGAGCACAGAATTAATACGACT；M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC；选取45条FLP序列，基于NJ法进行进化树的构建。

4.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽LFRFamide，其特征在于：所述的神经肽LFRFamide组织特异性表达分析步骤为：提取3个不同发育阶段、不同组织的总RNA，虎斑乌贼雄性乌贼组织包括：脑、视叶、肝、肌肉、精巢、心、鳃；雌性乌贼组织包括：脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺；使用反转录试剂盒，利用提取的总RNA合成cDNA模板；根据已获得的虎斑乌贼LFRFamide基因cDNA序列全长，设计LFRFamide基因荧光定量PCR所需引物，并进行荧光定量PCR；LFRFamide荧光定量PCR所需引物为：RT-LFRF-F：AACGAAGGACTCAAACGCAC；RT-LFRF-R：AACGAAGGACTCAAACGCAC；RT-actin-F：TGAGAGGGAGATTGTGCGTG；RT-actin-R：GAACATAGATTCTGGAGCACGG；使用2^-△△Ct方法测定不同组织LFRFamide基因的表达量水平。

5.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽LFRFamide，其特征在于：所述的神经肽LFRFamide脑组织表达定位分析步骤为：解剖出虎斑乌贼完整的脑组织，立即放入2~8%多聚甲醛中固定，后放入60~85%乙醇中，于0~5℃下保存备用；制备脑组织切片；根据LFRFamide的cDNA序列设计引物LFRF-probeF/LFRF-probeR，以乌贼脑组织cDNA为模板进行普通PCR扩增，PCR扩增程序如下：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 8min ，PCR产物用作原位杂交探针模板的制备；特异扩增虎斑乌贼LFRFamide基因的引物为：LFRF-probeF：CCCAAGCAGATGGAGAGGAAGGCGAAC和LFRF-probeR：CCGGAAGTGCGGCTTCGTCCATACC；将扩增得到的PCR产物，进行切胶纯化，纯化后使用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，将离心管置于PCR仪内，32~40℃孵育6~10h；pSPT18亦采用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，PCR产物和pSPT18酶切产物使用E.Z.N.A. ^TM Gel Extraction Kit (50)试剂盒再次进行切胶纯化后，使用Takara公司生产的Solution Ⅰ进行连接；转化至DH5α感受态后，涂板，单个挑取合适的菌落，菌体扩大培养；将正确的重组质粒进行EcoRⅠ单酶切，制备反义探针，并进行原位杂交。

6.根据权利要求4所述的虎斑乌贼神经肽LFRFamide，其特征在于：所述的原位杂交步骤为：

1）前处理：将脑组织石蜡切片浸入2~6%多聚甲醛固定6~15min；PBS漂洗6~15min；0.05~0.15M PBS/甘氨酸中2~7min；0.1~0.5%Triton X-100/PBS中10~20min；PBS漂洗5~15min；

2）通透处理：在32~40℃的蛋白酶K溶液中处理10~30min；0.05~0.15M氨基酸/PBS冲洗0.5~2.0min；PBS漂洗6~15min；在0.05~0.15M三乙醇胺中处理6~15min，三乙醇胺中含0.15%~0.35%醋酸铵；最后用盐溶液2×SSC漂洗6~15min；

3）预杂交和杂交：45℃预杂交液孵育0.5~1.5h；46℃杂交液孵育5~7h；

4）后处理：杂交液孵育后，4×SSC漂洗0.5~1.5min；32~40℃，2×SSC漂洗25~35min；1×SSC漂洗25~35min；

5）抗体杂交：Blocking 缓冲液室温封闭0.5~1.5h；AP标记抗DIG抗体，32~40℃条件下，孵育0.5~1.5h；之后用PBS冲洗0.5~1.5min；

6）显色：加入显色底物NBT/BCIP，暗处显色30min~24h；DEPC水冲洗2~5min，最后用甘油封片，两天后拍照，保存。

7.虎斑乌贼神经肽LFRFamide的用途，其特征在于用于丰富我国在头足类中参与生殖调控类神经肽的研究，验证LFRFamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性，优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。