CN106589070A - 虎斑乌贼神经肽GnRH及其用途 - Google Patents

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迟长凤
孙连莲
曹子豪
吕振明
徐梅英
吴常文
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
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Abstract

本发明提供一种虎斑乌贼神经肽GnRH及其用途，制备步骤如下：1）预处理：取活体虎斑乌贼解剖取脑组织于保存液，超低温保存，保存温度为‑70~‑90℃；2）取上清液：取脑组织加入等体积生理盐水，匀浆，离心，取上清液A，再加入等体积蒸馏水，离心，取上清液B，合并上清液A、B得上清液C；3）柱层析：将上清液C经柱层析，层析，显色，收集组分，冷冻干燥。本发明可冷冻保存组织且效果优异，可有效防止乌贼脑部组织降解，提取物可用于预防或治疗激素依赖疾病药物中。

Description

虎斑乌贼神经肽GnRH及其用途
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种虎斑乌贼神经肽GnRH及其用途。
背景技术
虎斑乌贼（Sepia pharaonis）是重要的经济头足类，在海洋生态系统中占有重要地位。其肉质新鲜可口，富含丰富的营养元素，还具有潜在的药用价值，经常食用对提高身体的免疫力有重要作用。
GnRH是一种古老而广泛分布于动物体内的生殖激素。GnRH对动物体的生殖调控起非常重要的作用。人体若缺乏GnRH将会引起一系列机体病变的发生，如卡尔曼式综合症（Kallmann Syndrome，KS），该病有多种发病机制，但主要是由于缺少GnRH导致可能伴有嗅觉缺失的促性腺激素型性腺功能衰退。然而对养殖动物注射GnRH或GnRH类似物能够降低动物体自身产生的相关激素水平，最终丧失全部或部分生育能力。GnRH除了调控动物体生殖生理功能外，同时还有一些其他的生理功能。在鱼类中，GnRH能够影响生长激素的分泌，在中枢和周围神经系统中充当神经递质，行使神经调节的功能。在鱼的性腺及消化道中，起到旁分泌的调节因子作用。在斑马鱼早期发育时期中，GnRH-Ⅲ的缺乏能够导致脑和心脏发育缺陷。
现有技术公告号CN1285607C 中华硬蜱神经肽及其制备方法和应用 中国发明授权文献 本该发明涉及一种中华硬蜱神经肽及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。中华硬蜱神经肽是从中国节肢类动物中华硬蜱神经节中分离得到的一种单链小肽，分子量1005.22道尔顿，等电点8.59，小肽全序列一级结构为：NH2-LVVYPWTK-COOH。其制备方法是把中华硬蜱粘于表面皿的底部并置于冰上20min，接着沿背侧缘切开硬蜱取出神经节，将取出的神经节匀浆、离心去除沉淀、过滤膜过滤，经两次反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分离纯化得到。中华硬蜱神经肽具有很强镇痛活性，可作为制备镇痛药物的应用。该发明具有序列简单、镇痛活性强等优点，但是前期组织保存方面有待改进，提取工艺还具有提升空间。
发明内容
本发明针对上述技术问题提供一种可冷冻保存组织且效果优异，神经肽提取率较高，可用于预防或治疗激素依赖疾病药物中，工艺简单高效的虎斑乌贼神经肽GnRH及其用途。
本发明针对上述技术问题所采取的方案为：虎斑乌贼神经肽GnRH，制备步骤如下：
1）预处理：取活体虎斑乌贼解剖取脑组织于保存液，超低温保存；
2）取上清液：取脑组织加入等体积生理盐水，匀浆，离心，取上清液A，再加入等体积蒸馏水，离心，取上清液B，合并上清液A、B得上清液C；
3）柱层析：将上清液C经柱层析，层析，显色，收集组分，得神经肽，冷冻干燥；
4）催化：将神经肽在硝酸铵和金属镉的催化下与GnRH衍生物发生取代反应，生成虎斑乌贼神经肽GnRH。
步骤1中超低温保存温度为-70~-90℃，防止乌贼脑部组织降解影响提取效果，且保存效果优异。
步骤2中匀浆5~10min，离心转速为2500~4000r/min，离心15~25min，取上清液A，再加入等体积蒸馏水，离心转速为2800~4500r/min,离心18~30min ,取上清液B，将杂质去除，为后续的柱层析作工艺准备。
步骤3中将上清液C经直径为10~20cm，高度为40~60cm，的Sephadex G50柱层析，对层析液进行硅胶薄层层析和茚三酮显色，收集Rf值为0.45~0.55的组分，达到分离物质获得Rf值在0.45~0.55的组分。
步骤3中冷冻温度为-10~-35℃，可实现提取物长期不变质保存。
步骤1中的保存液由以下成分及重量份组成：枸橼酸钾1~10份、枸橼酸钠10~50份、硫酸镁1~15份、腺嘌呤核苷1~10份、磷酸腺嘌呤1~15份、氢氧化钠10~60份、磷酸二氢钠10~60份、盐酸萘乙二胺0.002~0.006份、海藻糖25~250份、葡萄糖酸内酯5~150份、山梨坦三油酸酯0.004~0.009份、聚乙二醇0.01~0.15份、左旋精氨酸1~10份、色氨酸1~10份、盐酸川芎嗪0.005~0.075份、还原型谷胱甘肽1~10份、共轭亚油酸0.008~0.012份、双蒸水700~860份。保存效果好，可实现组织在常温或超低温下贮存。
步骤2中的生理盐水由以下成分及重量份组成：氯化钠0.7~1份、β-丙氨酸0.001~0.002份、薁0.002~0.003份、蒸馏水100份。防治物质失水损失活性。
步骤4中GnRH衍生物为GnRH-a，GnRH-a对垂体具有双作用。
虎斑乌贼神经肽GnRH用于预防或治疗激素依赖疾病药物中。
有益效果：本发明可冷冻保存组织且效果优异，可有效防止乌贼脑部组织降解，可随时使用冷冻保存的组织作实验，效果和新鲜获得的组织相同，神经肽提取率较高，使用的生理盐水可很好的防止组织失水损失活性，提取物可用于预防或治疗激素依赖疾病药物中。
具体实施例
以下结合实施例作进一步详细描述：
实施例1：
虎斑乌贼神经肽GnRH，制备步骤如下：
1）预处理：取活体虎斑乌贼解剖取脑组织于保存液，超低温保存；
2）取上清液：取脑组织加入等体积生理盐水，匀浆，离心，取上清液A，再加入等体积蒸馏水，离心，取上清液B，合并上清液A、B得上清液C；
3）柱层析：将上清液C经柱层析，层析，显色，收集组分，得神经肽，冷冻干燥；
4）催化：将神经肽在硝酸铵和金属镉的催化下与GnRH衍生物发生取代反应，生成虎斑乌贼神经肽GnRH。
步骤1中超低温保存温度为-70~-90℃，防止乌贼脑部组织降解影响提取效果，且保存效果优异。
步骤2中匀浆5~10min，离心转速为2500~4000r/min，离心15~25min，取上清液A，再加入等体积蒸馏水，离心转速为2800~4500r/min,离心18~30min ,取上清液B，将杂质去除，为后续的柱层析作工艺准备。
步骤3中将上清液C经直径为10~20cm，高度为40~60cm，的Sephadex G50柱层析，对层析液进行硅胶薄层层析和茚三酮显色，收集Rf值为0.45~0.55的组分，达到分离物质获得Rf值在0.45~0.55的组分。
步骤3中冷冻温度为-10~-35℃，可实现提取物长期不变质保存。
步骤1中的保存液由以下成分及重量份组成：枸橼酸钾1~10份、枸橼酸钠10~50份、硫酸镁1~15份、腺嘌呤核苷1~10份、磷酸腺嘌呤1~15份、氢氧化钠10~60份、磷酸二氢钠10~60份、盐酸萘乙二胺0.002~0.006份、海藻糖25~250份、葡萄糖酸内酯5~150份、山梨坦三油酸酯0.004~0.009份、聚乙二醇0.01~0.15份、左旋精氨酸1~10份、色氨酸1~10份、盐酸川芎嗪0.005~0.075份、还原型谷胱甘肽1~10份、共轭亚油酸0.008~0.012份、双蒸水700~860份。保存效果好，可在常温或超低温下贮存。
步骤2中的生理盐水由以下成分及重量份组成：氯化钠0.7~1份、β-丙氨酸0.001~0.002份、薁0.002~0.003份、蒸馏水100份。防治物质失水损失活性。
步骤4中GnRH衍生物为GnRH-a，GnRH-a对垂体具有双作用。
虎斑乌贼神经肽GnRH用于预防或治疗激素依赖疾病药物中。
实施例2：
虎斑乌贼神经肽GnRH，制备步骤如下：
1）预处理：取活体虎斑乌贼解剖取脑组织于保存液，超低温保存；
2）取上清液：取脑组织加入等体积生理盐水，匀浆，离心，取上清液A，再加入等体积蒸馏水，离心，取上清液B，合并上清液A、B得上清液C；
3）柱层析：将上清液C经柱层析，层析，显色，收集组分，得神经肽，冷冻干燥；
4）催化：将神经肽在硝酸铵和金属镉的催化下与GnRH衍生物发生取代反应，生成虎斑乌贼神经肽GnRH。
步骤1中超低温保存温度优选为-80℃，防止乌贼脑部组织降解影响提取效果，且保存效果优异。
步骤2中匀浆时间优选喂6min，离心转速优选为3000r/min，离心时间优选为20min，取上清液A，再加入等体积蒸馏水，离心转速优选为3000r/min,离心时间优选为20min ,取上清液B，将杂质去除，为后续的柱层析作工艺准备。
步骤3中将上清液C经直径优选为10cm，高度优选为50cm，的Sephadex G50柱层析，对层析液进行硅胶薄层层析和茚三酮显色，收集Rf值优选为0.5的组分，达到分离物质获得Rf值在0.5的组分。
步骤3中冷冻温度优选的为-20℃，可实现提取物长期不变质保存。
步骤1中的保存液由以下成分及优选的重量份组成：枸橼酸钾7份、枸橼酸钠30份、硫酸镁8份、腺嘌呤核苷9份、磷酸腺嘌呤12份、氢氧化钠30份、磷酸二氢钠45份、盐酸萘乙二胺0.004份、海藻糖80份、葡萄糖酸内酯70份、山梨坦三油酸酯0.005份、聚乙二醇0.012份、左旋精氨酸7份、色氨酸8份、盐酸川芎嗪0.006份、还原型谷胱甘肽8份、共轭亚油酸0.01份、双蒸水800份。保存效果好，可在常温或超低温下贮存。
步骤2中的生理盐水由以下成分及优选的重量份组成：氯化钠0.9份、β-丙氨酸0.0015份、薁0.0026份、蒸馏水90份。防治物质失水损失活性。
步骤4中GnRH衍生物为GnRH-a，GnRH-a对垂体具有双作用。
虎斑乌贼神经肽GnRH用于预防或治疗激素依赖疾病药物中，激素依赖疾病例如：性激素依赖的癌症：前列腺癌，宫颈癌，乳腺癌，垂体腺瘤；良性前列腺肥大，子宫肌瘤，子宫内膜异位等。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (9)

1.虎斑乌贼神经肽GnRH，其特征在于：制备步骤如下：
1）预处理：取活体虎斑乌贼解剖取脑组织于保存液，超低温保存；
2）取上清液：取脑组织加入等体积生理盐水，匀浆，离心，取上清液A，再加入等体积蒸馏水，离心，取上清液B，合并上清液A、B得上清液C；
3）柱层析：将上清液C经柱层析，层析，显色，收集组分，得神经肽，冷冻干燥；
4）催化：将神经肽在硝酸铵和金属镉的催化下与GnRH衍生物发生取代反应，生成虎斑乌贼神经肽GnRH。
2.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽GnRH，其特征在于：所述步骤1中超低温保存温度为-70~-90℃。
3.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽GnRH，其特征在于：所述步骤2中匀浆5~10min，离心转速为2500~4000r/min，离心15~25min，取上清液A，再加入等体积蒸馏水，离心转速为2800~4500r/min,离心18~30min ,取上清液B。
4.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽GnRH，其特征在于：所述步骤3中将上清液C经直径为10~20cm，高度为40~60cm，的Sephadex G50柱层析，对层析液进行硅胶薄层层析和茚三酮显色，收集Rf值为0.45~0.55的组分。
5.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽GnRH，其特征在于：所述步骤3中冷冻温度为-10~-35℃。
6.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽GnRH，其特征在于：所述步骤1中的保存液由以下成分及重量份组成：枸橼酸钾1~10份、枸橼酸钠10~50份、硫酸镁1~15份、腺嘌呤核苷1~10份、磷酸腺嘌呤1~15份、氢氧化钠10~60份、磷酸二氢钠10~60份、盐酸萘乙二胺0.002~0.006份、海藻糖25~250份、葡萄糖酸内酯5~150份、山梨坦三油酸酯0.004~0.009份、聚乙二醇0.01~0.15份、左旋精氨酸1~10份、色氨酸1~10份、盐酸川芎嗪0.005~0.075份、还原型谷胱甘肽1~10份、共轭亚油酸0.008~0.012份、双蒸水700~860份。
7.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽GnRH，其特征在于：所述步骤2中的生理盐水由以下成分及重量份组成：氯化钠0.7~1份、β-丙氨酸0.001~0.002份、薁0.002~0.003份、蒸馏水100份。
8.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽GnRH，其特征在于：所述步骤4中GnRH衍生物为GnRH-a。
9.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽GnRH用于预防或治疗激素依赖疾病药物中。
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