KR102288716B1

KR102288716B1 - 항비만 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102288716B1
Application number: KR1020200143492A
Authority: KR
Inventors: 배성문; 김지혜; 정광희; 이슬비; 김종원; 황연현; 최시림; 홍광표; 이상대
Original assignee: 경상남도
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2021-08-12
Also published as: KR20210052381A; KR102537908B1; KR20210052382A; KR102537907B1; KR20210052360A

Abstract

본 발명은 항비만 효능을 나타내는 펩타이드 또는 이를 함유하는 항비만 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 조성물은 지방세포에 대한 유의적인 분화 억제 효과 뿐만 아니라, 동물 실험에서도 체지방량 증가를 억제하는 효과를 나타내었는바, 비만의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

항비만 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도{Peptide for anti-obesity and use thereof}

본 발명은 항비만 효능을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

비만은 내분비적 요인, 유전적 요인, 사회 환경적 요인 등에 의해 대사 과정의 불균형이 발생하는 경우, 체내에 과잉된 에너지가 지방으로 축적됨으로써 야기되는 피하지방 조직의 이상 비대화에 기인한다. 지방조직의 비대화는 지방세포의 크기가 커지거나(지방세포 비대화) 그 수가 증가하는(지방세포 과형성) 현상으로, 이는 국소 정맥-림프 체계의 정체에도 영향을 미쳐 진피-피하 조직의 혈관조직 질환도 유발할 수 있다. 따라서 비만은 그 자체로서 독립된 질병으로 인식되며, 세계보건기구에서는 비만을 세계적인 영양문제로 다루어 건강을 해치는 단순 위험인자가 아닌 치료해야 할 질병으로 인식하고 있다.

현재 비만 치료제는 작용기전에 따라, 중추 신경계에 작용하여 식욕에 영향을 주는 약제와 위장관에 작용하여 흡수를 저해하는 약제로 분류될 수 있다. 중추 신경계에 작용하는 약물로는 세로토닌 (5-HT) 재흡수를 억제하는 펜플루라민과 덱스펜플루라민, 노르아드레날린 재흡수를 억제하는 에페드린 및 카페인, 및 최근에는 세로토닌과 노르아드레날린 신경계에 동시 작용하는 시부트라민 등이 있다. 위장관에 작용하여 비만을 저해하는 약물로는, 췌장에서 생성되는 리파아제를 저해하여 지방의 흡수를 줄여줌으로써 비만 치료제로 허가된 오를리스타트(orlistat)가 있다. 그러나 기존에 사용된 약물 중 식욕억제제인 펜플루라민은 마약 성분으로 분류되었을 뿐 아니라 원발성 폐고혈압이나 심장 판막 병변과 같은 부작용을 일으켜 사용이 금지되었으며, 다른 식욕억제 약물들도 혈압 감소 또는 유산 산증을 발생시킬 수 있어 심부전, 신장 질환 환자에는 사용이 제한되고 있다. 지방분해 억제제인 오를리스타트도 위장관 부작용을 일으켜 불쾌감을 유발하고 지용성 비타민의 흡수를 저해하며, 미국 FDA에 장기적 비만치료를 목적으로 승인받은 시부트라민은 심계 항진과 같은 심혈관계 질환 또는 현기증 등을 초래하여 시판이 금지되었다.

상기 약물들의 부작용을 줄이고, 보다 근본적인 비만의 예방 및 억제를 위한 대안으로서 제시되고 있는 것 중 하나가 지방세포 분화 억제제이다. 현재 밝혀진 분비 물질로, TNF-α, IL-6, IL-8, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1, 안지오텐신-Ⅱ, 렙틴(leptin) 및 아디포넥틴(adiponectin) 등이 있으나, 이들은 각종 대사성 질환 및 심혈관 질환을 야기하는 것으로 알려졌다. 지방 조직에서의 에너지 저장 및 내분비 물질 분비는 지방세포의 분화 및 성장과 밀접한 관련이 있으며, 지방생성 과정과 동시적으로 발생한다. 지방세포의 성장은 지방세포 수에는 변화가 없이, 분화된 지방세포에 중성지방이 축적되어 비대형 지방세포가 형성되는 과정으로서, 비대형 지방세포 증가로 인한 비만은 성인에서 빈번하며 식이요법으로 조절 가능하다.

이러한 기술적 배경하에서, 새로운 항비만 물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 (한국 등록특허 10-1662062), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명의 목적은 항비만 효능을 나타내는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 세포 독성이 없고 항비만 효능을 나타내는 펩타이드를 합성하고 이들의 유의적인 지방세포 분화 억제 효능, 즉 항비만 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이에 따라, 본 발명은 항비만 효능을 나타내는 펩타이드를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “비만”은 체내에 체지방이 과도하게 축적되는 것을 의미한다.

구체적으로, 본 발명은 항비만 활성을 나타내는 서열번호 1 내지 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열 중 하나 이상으로 이루어진 펩타이드일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술 (US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니하며, 공지된 펩타이드 합성 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체내 투여시의 반감기를 증가시킨 높은 반감기를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂) 등으로 변형되어 있으며, 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

상기 조성물에서 펩타이드와 관련한 내용은 전술한 바와 동일하므로, 중복된 내용에 대해서는 기술을 생략한다.

상기 약학 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 전신 또는 국소 투여될 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.

상기 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 사용될 수 있고, 상기 고형제제는 상기 화합물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또한, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있고, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 약학적으로 유효한 양이 투여될 수 있으며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 상이해질 수 있다,

상기 비만의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용 가능하다. 예컨대, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물 및 인간 등 어느 개체에나 적용할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법 이라면 제한 없이 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 바람직하게는 건강기능식품일 수 있다.

상기 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 상기 기능성은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미할 수 있다.

상기 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 적합성 여부를 판단할 수 있다.

상기 식품 첨가물 공전에 기재된 품목은 예컨대 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류를 들 수 있다.

상기 건강기능식품은 비만의 예방 또는 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품은 비만의 예방 또는 개선을 목적으로 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조 및 가공될 수 있다.

구체적으로 상기 정제 형태의 건강기능식품은 상기 화합물, 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.

상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 상기 화합물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 상기 화합물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 솔비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

상기 환 형태의 건강기능식품은 상기 화합물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

상기 과립형태의 건강기능식품은 상기 화합물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

또한, 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함할 수 있다.

본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 기재내용에 기초하여 각 구성의 종류, 도입 비율 등을 변화시켜 적용할 수 있을 것이며, 상기 변형에도 불구하고 동등한 기술적 효과가 구현되는 경우라면, 본 발명의 기술적 사상에 포괄된다고 할 것이다.

본 발명은 항비만 효능을 나타내는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물은 지방세포에 대한 유의적인 분화 억제 효과를 나타내었는바, 비만의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은, 펩타이드들의 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포로부터 지방세포로의 분화율 및 지방축적의 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 펩타이드들의 처리에 따른 3T3-L1 지방 전구세포의 생존률을 측정함으로써, 세포 독성 테스트를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 펩타이드(서열번호 8) 처리에 따른 마우스 조직학적 특성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 펩타이드(서열번호 15) 처리에 따른 마우스 조직학적 특성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험예]

실험예 1. 실험 재료 및 실험 방법

1-1 펩타이드의 합성

펩타이드를 (주) 펩트론에 합성의뢰하여 23종의 펩타이드 시료를 획득하였다. 구체적인 펩타이드 합성 방법은 다음과 같다. 펩타이드 합성은 유기화학적 반응을 이용하여, 연속적인 Flow Condition을 통한 고상 Fmoc Chemistry 방법을 이용하였다. 이는 각각의 아미노산을 정해진 순서에 따라 레진(Resin)에 하나씩 합성해 가는 방법으로, ㈜ 펩트론에서는 자체 개발한 자동 합성기를 이용하여 하나의 기계가 동시에 48개의 서로 다른 펩타이드를 합성하였다. 합성한 Crude 펩타이드는 역상 HPLC를 이용하여 정제하고 동결건조기를 이용하여 건조하였다(표 1).

서열번호	아미노산 서열정보	사슬길이	분자 조성	분자량 (Da)
1	KLPFQR (Lys-Leu-Pro-Phe-Gln-Arg)	6	C37H61N11O8	787
2	STELLIR (Ser-Thr-Glu-Leu-Lue-Ile-Arg)	7	C36H66N10O12	830
3	EIAQDFK(Glu-Ile-Ala-Gln-Asp-Phe-Lys)	7	C38H59N9O13	849
4	HLQLAIR(His-Leu-Gln-Leu-Ala-Ile-Arg)	7	C38H67N13O9	849
5	AVQGLLK(Ala-Val-Gln-Gly-Leu-Leu-Lys)	7	C33H61N9O9	727
6	IAQGGVLP(Ile-Ala-Gln-Gly-Gly-Val-Leu-Pro)	8	C34H59N9O10	753
7	NDEELNKLL(Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu)	9	C46H78N12O18	1,086
8	AGLQFPVGR(Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Pro-Val-Gly-Arg)	9	C43H69N13O11	943
9	YRPGTVALR(Tyr-Arg-Pro-Gly-Thr-Val-Ala-Leu-Arg)	9	C46H77N15O12	1,031
10	KSTGGKAPR(Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys-Ala-Pro-Arg)	9	C37H68N14O12	900
11	KQLATKAAR(Lys-Gln-Leu-Ala-Thr-Lys-Ala-Ala-Arg)	9	C42H79N15O12	985
12	RFQSSAVMA(Arg-Phe-Gln-Ser-Ser-Ala-Val-Met-Ala)	9	C42H69N13O13S1	995
13	TLSDYNIQK(Thr-Leu-Ser-Asp-Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys)	9	C47H76N12O17	1,080
14	NKLLSGVTIA(Asn-Lys-Leu-Leu-Ser-Gly-Val-Thr-Ile-Ala)	10	C45H82N12O14	1,014
15	EIAQDFKTDL(Glu-Ile-Ala-Gln-Asp-Phe-Lys-Thr-Asp-Leu)	10	C52H82N12O19	1,178
16	ALNQAWAFLK (Ala-Leu-Asn-Gln-Ala-Trp-Ala-Phe-Leu-Lys)	10	C56H84N14O13	1,160
17	AERVGAGAPVYAla-Glu-Arg-Val-Gly-Ala-Gly-Ala-Pro-Val-Tyr	11	C48H76N14O15	1,088
18	RIVDFHMLESRArg-Ile-Val-Asp-Phe-His-Met-Leu-Glu-Ser-Arg	11	C61H99N19O17S1	1,401
19	SGVTIAQGGVLP Ser-Gly-Val-Thr-Ile-Ala-Gln-Gly-Gly-Val-Leu-Pro	12	C48H83N13O16	1,097
20	APRKQLATKAARAla-Pro-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Thr-Lys-Ala-Ala-Arg	12	C56H103N21O15	1,309
21	QNIIPASTGAAK Gln-Asn-Ile-Ile-Pro-Ala-Ser-Thr-Gly-Ala-Ala-Lys	12	C50H87N15O17	1,169
22	HLQLAIRNDEELNK (His-Leu-Gln-Leu-Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys)	14	C72H121N23O24	1,691
23	VTIAQGGVLPNIQA (Val-Thr-Ile-Ala-Gln-Gly-Gly-Val-Leu-Pro-Asn-Ile-Gln-Ala)	14	C61H105N17O19	1,379

1-2 세포배양 및 지방적 측정 방법

비만세포인 3T3-L1 세포주는 ATCC에서 분양받아 사용하였으며, 10% calf serum을 포함하는 DMEM에 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL)을 첨가하여 37˚C, 5%, CO₂에서 배양, 유지하였다. 3T3-L1 지방전구세포의 지방 세포로의 분화를 위해 6 well plate에 5×10⁵ cell/well의 세포를 분주하여 세포가 충분히 밀집되게 배양하였다. 2일 후 0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin (MDI solution), 및 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 2일 동안 배양함으로써 분화를 개시한 다음, 10 μg/mL insulin 및 10% FBS (fetal bovine serum)를 포함하는 DMEM으로 교환하여 3일 동안 분화를 진행시켰다. 그 이후로는 10% FBS만을 포함하 는 DMEM에서 배양함으로써 세포 내 지방적(lipid droplet)을 형성하는 지방세포로 분화시켰으며, 지방적의 양은 Oil Red O를 사용하여 확인하였다. 구체적으로, 분화 후 배지를 제거한 뒤 10% formaldehyde 용액으로 세포를 고정하였다. 상온에서 30분 동안 고정한 뒤 용액을 제거하고 PBS로 2번 세척하고 70% 알코올로 2번 세척한 후 Oil Red O 용액을 이용하여 염색하였다. 염색된 세포는 현미경 관찰 후 isopropyl alcohol에 4% NP-40가 첨가된 용액을 이용하여 용해한 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

1-3 세포 독성 측정 방법

3T3-L1 세포(5×105cells)를 96-well microplate의 각 well에 분주하고, 3T3-L1 세포가 포함된 각 well에 펩타이드 시료를 62.5㎍/mL농도로 처리하여, 24시간 동안 세포를 배양시킨 후 각 well에 MTT (1.0 mg/ml)용액 50 μL를 처리하고 4시간 더 배양하였다. 배양된 세포는 원심분리 (3000rpm, 10min, 20℃)하여 상층액을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)용액 200 μL를 처리하여 생성된 formazan 결정을 pipetting하여 용해시킨 후 10분 뒤 에 96-well microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 결과 분석은 군충시료군의 평균 흡광도를 구하여 대조군의 평균 흡광도에 대한 백분율로 산출하였다.

1-4 펩타이드 항비만 효능 동물시험 평가(고지방식단 마우스 급이 실험)

생후 4주 된 C57BL/6 마우스를 나라바이오동물센터(나라바이오텍, 대한민국, 서울)에서 구입하여 무병 상태의 플라스틱 우리 안에 사육하면서 실험하였다. 동물실 환경은 20~21°C에서 12시간 암조명 주기, 상대습도 40~45%로 제어되었다. 모든 실험은 건국대학교 동물보호 및 사용위원회의 승인을 받았다.

적응 1주일 후 생쥐는 무작위로 대조군과 실험군으로 두그룹으로 나누었으며, 대조군은 8개체로 정상적인 식단을 먹였다(제어, 10% kcal 지방 함량), 실험군은 30개체로 고지방 식단을 먹였다(HFD, 60% kcal 지방 함량). 쥐의 음식 섭취량은 매일 기록되었고, 쥐의 체중은 매주 두 번 측정되었다. 5주 후 체중이 대조군보다 20% 높은 생쥐를 선택하여 무작위로 세 그룹(n = 8/group)으로 나누었다. 식염수로 처리된 HFD(고지방식단) 마우스, HFD + 펩타이드(서열번호 8 또는 15, 100mg/kg), HFD + 오르리스타트(Orlistat, 60mg/kg)로 처리하였고 오르리스타트는 양성 대조군으로 사용되었다. 12주 후, 하루 절식 후 도축하여 조사하였다.

추가 분석을 위해 혈액 샘플을 채취했다. 지방 조직(피질, 피하, 내장, 간경)의 무게를 측정하였고, 피부외 지방 조직과 간 조직을 수집하여 액체 질소에 냉동시키고, 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에 저장하였다. 조직학적 분석을 위해 10% 포름알데히드에 경피 지방질과 간조직 부분을 고정했다.

1-5 체지방 조성 분석

체지방을 비교하기 위하여 이중 에너지 x선 흡수계측법(Dual-energy X-ray absorptiometry, DXA)을 실시하여, 실험 4주차에 전신 스캐너를 이용하여 뼈와 조직을 저에너지 1회, 고에너지 1회 각각 측정하여 지방과 제지방 체중을 산출하였다.

1-6 조직학적 분석

간 및 경막외 지방조직은 해부하여 10% 포르말린(netural buffered formalin)으로 고정하고, 조직검사를 위해 파라핀을 내장했다. 포르말린 고정되고 파라핀이 내장된 조직은 4μm 두께로 잘라 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색했다. 냉동된 간 부위는 10% 포름알데히드 용액으로 10분간 고정시킨 후 흐르는 물로 헹구었다. 증류수로 몇 초간 세척한 후 20~30초간 이소프로판올 용액에 담갔다가 oil red O 시약으로 15~20분 동안 염색하고 증류수로 헹군다. 최종적으로, 헤마톡시린으로 40초간 염색 후 5분간 수돗물에 담갔다. 간 조직은 200배 이하로 촬영하였고, 지방세포는 현미경을 이용하여 분석하였다.

1-7 혈액의 생물학적 분석

혈액샘플은 마우스의 심장으로 얻었으며 혈청은 원심분리(20분당 3000rpm)로 분리해 추가 분석이 있을 때까지 -80℃에서 보관했다. 혈액 요소 질소, 알라닌 아미노트란스페라제(ALT), 알칼리성 인산염, 아스파테이트 아미노트란스페라제(AST), 총 단백질, 혈청 알부민, 전해질의 혈청 수치를 자동분석기(Abaxis VETSVAN VS2 Chemical Analyzer, CA, USA)로 측정했다. 총콜레스테롤, 저밀도 리포단백질콜레스테롤(LDL), 고밀도 리포단백질콜레스테롤(HDL), TG를 고속혈액 지질분석기(OSAN 헬스케어 리피드 프로, 대한민국 안양시)로 측정했다. 아디포넥틴은 서부 블로팅에 의해 분석되었고, 렙틴은 렙틴 효소연계 면역항암제(ELISA) 키트(MERCK, DHB, 독일)를 사용하여 정량화되었다.

[실시예]

실시예 1. 항비만 효능의 확인(In vitro)

본 발명에 따른 펩타이드의 항비만 효과를 평가하기 위하여, 상기 실험예 1-1에 개시된 총 23종의 펩타이드 시료를 3-L1 지방세포에 처리한 뒤, 이에 따른 lipid droplet 형성을 Oil red O 시험방법을 통하여 확인하였다. 한편, 비교군으로는 별도의 펩타이드 처리를 하지 않았다 (이하, 상기 비교군은 무처리구로 명명함).

그 결과, 하기 표 2, 또는 도 1의 실험결과를 확인할 수 있었다.

	지방세포 분화율 (%)
CON.	99.8 ± 0.36
1	57.9 ± 0.60
2	59.0 ± 0.60
3	52.2 ± 0.72
4	63.3 ± 0.12
5	48.4 ± 0.36
6	38.0 ± 0.72
7	39.4 ± 0.36
8	33.7 ± 0.84
9	40.6 ± 0.60
10	48.4 ± 0.36
11	94.3 ± 0.24
12	57.5 ± 0.60
13	68.0 ± 0.60
14	77.8 ± 0.24
15	30.2 ± 1.44
16	57.5 ± 0.60
17	35.1 ± 0.84
18	41.9 ± 0.24
19	68.0 ± 0.60
20	94.8 ± 0.60
21	44.4 ± 1.32
22	83.1 ± 1.80
23	74.4 ± 0.96

시료농도 62.5㎍/mL 농도로 처리한 실험에서 23종 대부분의 시료에서 지방전구세포의 성장을 억제하였다. 대조구는 99.8%로 지방세포가 분화된 반면, 15번(30.2%), 8번(33.7%), 17번(35.1%), 6번(38%), 7번(39.4%) 등이 40%이하로 지방세포가 분화되어 우수한 지방세포 분화억제능을 보였고, 9번(40.6%), 18번(41.9%), 21번(44.4%), 5번(48.4%), 10번(48.4%), 3번(52.2%), 12번(57.5%), 16번(57.5%), 12번(57.5%), 1번(57.9%), 2번(59%) 이 40~60% 대의 지방세포 분화율을 보였다. 그 외 4번(63.3%), 13번(68%), 19번(68%), 23번(74.4%), 14번(77.8%), 22번(83.1%), 11번(94.3%), 20번(94.8%)이 대조구와 유사하거나 약간 우수한 정도의 지방세포 분화억제능을 보였다.

실시예 2. 펩타이드 시료의 세포독성 확인

본 발명에 따른 펩타이드의 항비만 효과를 평가하기 위하여, 상기 실험예 1-1에 개시된 총 23종의 펩타이드 시료를 3-L1 지방세포에 처리한 뒤, 이에 따른 지방전구세포의 생존률을 측정하였다. 한편, 비교군으로는 별도의 펩타이드 처리를 하지 않았다 (이하, 상기 비교군은 무처리구로 명명함.)

그 결과, 하기 표 3, 또는 도 2의 실험결과를 확인할 수 있었다.

시료	세포 생존율(%)
시료	24hr	48hr
무처리	100.0 ± 0.01	100.0 ± 0.01
1 (KLPFQR)	90.2 ± 0.95	81.5 ± 0.84
2 (STELLIR)	95.6 ± 0.35	81.3 ± 0.92
3 (EIAQDFK)	94.1 ± 0.94	84.7 ± 0.78
4 (HLQLAIR)	97.1 ± 1.38	91.0 ± 1.20
5 (AVQGLLK)	97.4 ± 0.93	89.9 ± 1.67
6 (IAQGGVLP)	96.0 ± 1.23	86.1 ± 1.60
7 (NDEELNKLL)	89.1 ± 0.69	82.6 ± 0.77
8 (AGLQFPVGR)	97.8 ± 0.49	87.6 ± 0.93
9 (YRPGTVALR)	91.7 ± 0.34	86.5 ± 0.19
10 (KSTGGKAPR)	90.6 ± 0.76	79.8 ± 1.43
11 (KQLATKAAR)	95.7 ± 0.67	86.7 ± 0.40
12 (RFQSSAVMA)	90.7 ± 1.14	74.7 ± 0.64
13 (TLSDYNIQK)	86.8 ± 0.15	80.3 ± 0.97
14 (NKLLSGVTIA)	93.8 ± 0.45	87.4 ± 1.12
15 (EIAQDFKTDL)	96.6 ± 0.26	82.7 ± 0.60
16 (ALNQAWAFLK)	109.6 ± 0.52	90.0 ± 0.42
17 (AERVGAGAPVY)	105.4 ± 0.59	88.0 ± 1.95
18 (RIVDFHMLESR)	89.7 ± 0.40	88.6 ± 0.53
19 (SGVTIAQGGVLP)	91.0 ± 1.99	83.1 ± 0.66
20 (APRKQLATKAAR)	95.0 ± 1.24	85.4 ± 0.91
21 (QNIIPASTGAAK)	91.7 ± 0.94	76.9 ± 0.94
22 (HLQLAIRNDEELNK)	94.7 ± 0.79	86.2 ± 0.70
23 (VTIAQGGVLPNIQA)	88.7 ± 0.30	76.5 ± 0.76

시료농도 62.5㎍/mL에서 비만 억제활성 분석에 사용된 3T3-L1 지방 전구세포에 처리하여 세포에 대한 독성 테스트를 시행하였다. 실험 결과, 처리 후 24시간 경과시까지 세포 생존율은 85% 이상이었으며, 48시간 경과 후에도 80% 이상으로 세포에 대한 시료의 독성은 미미한 것으로 판단되었다.상기의 실험결과를 종합하면, 본 발명의 펩타이드들은 각각 지방세포의 분화를 효과적으로 억제시킬 수 있었는바, 비만의 예방, 개선, 또는 치료에 활용될 수 있을 것이다.

실시예 3. 고지방 영양섭취 마우스의 체성분 변화

펩타이드 급이에 따른 고지방식이 마우스의 체중 및 지방조성 변화

처리구	체중(g/마리)			지방무게 (g/마리)
처리구	실험전	5주차	증가량	지방무게 (g/마리)
정상식이군(대조)	22.37	28.82	6.45	4.0
고지방식이	22.95	43.16	20.21^##	18.2^##
고지방식이+ Orlistat(양성대조)	23.46	36.08	12.62^**	13.7^**
고지방식이+peptide(서열번호 8)	23.85	35.15	11.30^**	12.7^**
고지방식이+peptide(서열번호 15)	25.06	36.97	11.91^**	14.5^**

Significant differences at ^## p < 0.01 compared with the Con group.

Significant differences at ^* p < 0.05, ^** p < 0.01 compared with the HFD group.

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 체중증가율은 정상식이 쥐는 5주간 6.45g증가한 반면, 고지방식을 섭취한 쥐는 20.21g 증가하였고, 고지방식과 양성대조구인 Orlistat을 동시에 섭취한 쥐는 12.62g으로 고지방식 대비 37.6%의 체중증가 억제율을 보였다. 고지방식과 peptide (서열번호 8)을 동시에 섭취하는 쥐는 11.3g의 증가량으로 44.1%체중증가 억제율을 보였으며, peptide(서열번호 15)를 동시에 섭취한 쥐는 11.91g의 증가량으로 41.1%의 체중증가 억제율을 보여 펩타이드를 동시에 섭취한 군에서 비만억제 효능이 우수하였다.

고지방 식이에 따른 마우스 체지방 조성(이중 에너지 x선 흡수계측법)

처리구	체 구성(%)
처리구	지방	제지방
정상식이군(대조)	13.9	80.4
고지방식이	41.7	53.6
고지방식이+ Orlistat(양성대조)	36.9	59.0
고지방식이+peptide(서열번호 8)	35.6	59.9
고지방식이+peptide(서열번호 15)	38.5	57.3

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 이중 에너지 x선 흡수계측법으로 측정한 마우스의 체지방 조성 분석결과, 지방조성은 정상식이 쥐가 13.9%인 반면, 고지방식을 섭취한 쥐는 41.7%로 매우 높았고, 고지방식과 양성대조구인 Orlistat을 동시에 섭취한 쥐는 36.9%로 고지방식 대비 지방구성을 11.5%로 낮추는 효과를 보였다. 고지방식과 peptide(서열번호 8)를 동시에 섭취하는 쥐는 지방 조성이 35.6%로 고지방식 대비 지방구성을 14.6% 낮추는 효과를 보였으며, peptide(서열번호 15)를 동시에 섭취한 쥐는 지방조성이 38.5%로 고지방식 대비 지방구성을 7.7% 낮추는 효과를 보여, 펩타이드가 지방조성 증가를 억제하는 비만억제 효능을 보였다.

실시예 4. 혈액 생물학적 분석

펩타이드 급이한 고지방식이 마우스의 혈액 성분 비교

처리구	혈액 성분 변화
처리구	TG^a (mg/dL)	TC^b (mg/dL)	HDL^c (mg/dL)	LDL/VLDL^d (mg/dL)
정상식이군(대조)	108.3	96.1	79.8	16.3
고지방식이	232.6^##	119.7^##	47.4^##	72.3^##
고지방식이+ Orlistat(양성대조)	117.9^**	119.3^**	77.8^**	44.2^**
고지방식이+ peptide(서열번호 8)	138.8^**	120.5^**	75.1^**	42.7^**
고지방식이+ peptide(서열번호 15)	140.3^**	107.5^**	74.5^**	33.0^**

Significant differences at ^## p < 0.01 compared with the Con group.

^a중성지방(TG, Triglyceride), ^b총콜레스테롤(TC, total cholesterol), ^c고밀도지단백(HDL, high density lipoprotein), ^d저밀도지단백(LDL, low density lipoprotein)

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 고지방식으로 사육한 마우스의 중성지방(TG)은 232.6mg/dL, 총콜레스테롤(TC)는 119.7mg/dL, 고밀도지단백(HDL)은 47.4mg/dL, 지밀도지단백(LDL)은 72.3mg/dL이었다. 고지방식과 peptide(서열번호 8)을 동시 섭취한 마우스의 중성지방(TG)은 138.8mg/dL, 총콜레스테롤(TC)는 120.5mg/dL, 고밀도지단백(HDL)은 75.1mg/dL, 지밀도지단백(LDL)은 42.7mg/dL로 펩타이드 섭취에 따른 중성지방과 저밀도지단백을 감소시켰고, 동맥경화등 혈관성 질환을 감소시켜주는 HDL은 증가시켜주는 효과를 보였다.

고지방식과 peptide(서열번호 15)를 동시 섭취한 마우스의 경우도 중성지방(TG)은 140.3mg/dL, 총콜레스테롤(TC)는 107.5mg/dL, 고밀도지단백(HDL)은 74.5mg/dL, 지밀도지단백(LDL)은 33.0mg/dL로 펩타이드 섭취에 따른 중성지방과 총콜레스테롤, 저밀도지단백을 감소시켰고, HDL은 증가시켜주는 효과를 보였다.

실시예 5. 고지방 영양섭취 마우스의 조직학적 특성 비교

<peptide(서열번호 8)>

고지방식이를 한 마우스는 정상식이군과 비교시 간 크기가 커지(도 3A) 백색 지방조직의 양이 많아졌으며(도 3B), oil red o 염색시 붉은색의 지방조직이 증가하였으며(도 3C), 지방의 크기 또한 정상쥐에 비해 매우 커진 것을 알 수 있었다(도 3D). 고지방식과 양성 대조구 orlistat을 동시 섭취한 마우스는 고지방식이군과 비교시 간의 크기가 현저히 작고, 백색 지방조직의 양도 적었으며, oilred o 염색시에도 붉은색의 지방세포가 상대적으로 적었고, 지방세포의 크기 또한 상대적으로 작은 것을 알 수 있었다. peptide 8을 동시 급이한 군도 orilistat 섭취군과 유사하게 고지방식이 군과 비교시 간의 모양과 크기가 정상에 가깝고, 백색지방조직의 숫자와 지방의 크기 또한 정상에 가까울 정도로 지방증가를 억제한 효과를 보였다.

<peptide(서열번호 15)>

고지방식이와 peptide(서열번호 15)를 동시 급이한 군도 고지방식이 군과 비교시 간의 모양과 크기가 정상에 가깝고, 백색지방조직의 숫자와 지방의 크기 또한 정상에 가까울 정도로 지방증가를 억제한 효과를 보였다(도 4).

<110> Republic of Korea <120> Peptide for anti-obesity and use thereof <130> P19G19C1435 <150> KR 10-2019-0136552 <151> 2019-10-30 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 1 <400> 1 Lys Leu Pro Phe Gln Arg 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 2 <400> 2 Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 3 <400> 3 Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 4 <400> 4 His Leu Gln Leu Ala Ile Arg 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 5 <400> 5 Ala Val Gln Gly Leu Leu Lys 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 6 <400> 6 Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 7 <400> 7 Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 8 <400> 8 Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 9 <400> 9 Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu Arg 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 10 <400> 10 Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro Arg 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 11 <400> 11 Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 12 <400> 12 Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 13 <400> 13 Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 14 <400> 14 Asn Lys Leu Leu Ser Gly Val Thr Ile Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 15 <400> 15 Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr Asp Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 16 <400> 16 Ala Leu Asn Gln Ala Trp Ala Phe Leu Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 17 <400> 17 Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala Pro Val Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 18 <400> 18 Arg Ile Val Asp Phe His Met Leu Glu Ser Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 19 <400> 19 Ser Gly Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 20 <400> 20 Ala Pro Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 21 <400> 21 Gln Asn Ile Ile Pro Ala Ser Thr Gly Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 22 <400> 22 His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 23 <400> 23 Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile Gln Ala 1 5 10

Claims

서열번호 5, 6, 7, 9, 10, 17, 18, 및 21로 표시되는 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 항비만 활성을 나타내는 펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 펩타이드는 지방 세포 내 지방 축적을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1항 또는 제 2항의 펩타이드를 하나 이상 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항의의 펩타이드를 하나 이상 포함하는 비만 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물.
제 1항 또는 제 2항의 펩타이드를 하나 이상 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.