KR100498277B1 - 디오신을 포함하는 식물추출물을 함유한 성장호르몬분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양식품. - Google Patents

Abstract

본 발명은 디오신을 포함하는 식물의 추출물을 함유한 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양 식품에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 토복령 또는 단풍마로부터 추출 및 정제하여 얻은 디오신 그리고 이를 함유한 추출물은 성장호르몬 분비를 촉진시키는 효과를 나타내고, 또한 독성이 적어 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양 식품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

디오신을 포함하는 식물추출물을 함유한 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양 식품.{FUNCTIONAL FOOD FOR PROMOTING SECRETION OF GROWTH HORMONE CONTAINING DIOSCIN OR EXTRACTS OF PLANTS THEREWITH}

본 발명은 디오신 또는 이를 포함하는 식물추출물을 함유한 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양 식품에 관한 것이다.

성장호르몬(growth hormone)은 동물의 뇌하수체에서 분비되는 단백질로서 191개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. 이러한 성장호르몬은 오래 전부터 동물체로부터 분리되어 주로 왜소증(dwarfism, 난장이병) 환자들의 치료에 사용되어 왔는데, 단백질의 손실을 억제하고 나이가 많은 장년 또는 노인에서 생리학적인 노화 현상을 지연시키는 작용이 있으므로 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있다[Horber, F.F. and Haymond, M.W., J. Clin. Invest., 1990, 86, 265∼272]. 또한, 성장호르몬을 인체에 지속적으로 투여하면 체중, 근육 및 지방의 무게 등이 증가하여 노화로 인한 질병을 예방할 수 있고, 일시적으로 투여하는 경우에도 혈장내의 인슐린 및 IGF-1(Insulin-like growth factor-1)의 농도를 증가시키며 소변내의 단백질 농도를 감소시키는 것으로 알려져 있으며[Kohrt, W. M. et al., Med. Sci. Sports Exerc., 1992, 24, 832∼837; Zachweija, J. J. et al., Am. J. Physiol., 1994, 266(Endocrinol. Metab. 29), E840∼844], 이외에도 간의 무게와 크기를 증가시키고 근육, 뼈 및 연결 조직 등의 말단 조직에서 단백질의 합성을 향상시키는 것으로 보고되었다[Kaiser, F. E. et al., J. Am. Geriatr. Soc., 1991, 39, 235∼240; Marcus, R. et al., J. Clin. Endocrino. Metab., 1990, 70, 519∼527].

지금까지의 연구는 선천적으로 뇌하수체 기능부전(hypopituitarism)의 어린이와 성인에게 성장호르몬 분비촉진 호르몬(growth hormone releasing hormone, 이하 "GHRH"라 칭한다)과 아르기닌(arginine)을 동시에 투여했을 때 성인보다도 어린이에게서 성장호르몬의 감응정도가 높은 효과를 나타내었으며, 많은 종류의 뇌하수체호르몬 결핍 환자보다도 성장호르몬 결핍 환자에게서 성장호르몬의 감응정도가 더 높은 효과를 나타내었으며, 또한 완전한 뇌하수체계를 갖는 환자보다도 뇌하수체의 잔여 맥관 성분(residual vascular component)을 가진 환자에게서 효과가 더욱 높은 결과를 얻었다. GHRH와 아르기닌에 대한 성장호르몬의 반응성은 나이에 따라 감소하는 경향이 있고[J. Clin. Endocrinol. Metab., 2001, 86(4), 1574∼1579], 성장호르몬 분비촉진제(secretagogue)에 대한 내생 리간드인 그레린(ghrelin)을 성장호르몬 결핍 쥐에 투여하였을 때 효과가 있었으며[Diabetes, 2001, 50(2), 227∼232], 활성 성장호르몬 분비촉진제인 MK-677과 강력한 골 흡수 저해제인 아렌드로네이트(alendronate)를 함께 투여하면 아렌드로네이트를 단독 투여했을 때보다 상대적으로 더 높은 형성 속도를 유지하여 폐경후 골다공증인 여성에게서 골 무기질 밀도(bone mineral density)를 증가시킨다. 상기 MK-677과 아렌드로네이트의 병행 투여의 IGF-1 레벨에 대한 영향은 MK-677 단독 투여나 아렌드로네이트와 병행 투여 모두 IGF-1 레벨이 증가하고, 골 형성 감소를 완화시켰으며, 대퇴 목(femoral neck)의 골 무기질 밀도는 증가한 반면 요추, 둔부의 골 무기질 밀도는 증가 현상이 나타나지 않았다. MK-677을 통한 성장호르몬의 대사효과는 골 형성에 있어서 아렌드로네이트의 직접적인 억제효과를 줄였다[J. Clin. Endocrinol. Metab., 2001, 86(3), 1116∼25].

과거에 성장호르몬은 주로 사체의 뇌하수체로부터 추출되어 사용되었으나, 이 과정에서 성장호르몬을 투여 받은 환자들에게 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jakob disease)이란 질병을 유발시킴이 밝혀졌다. 이렇게 분리 과정에서 다른 질병의 원인 물질까지 환자에게 유입될 수 있는 위험성이 있어 사체로부터 분리한 성장호르몬은 그 사용이 매우 제한되었다. 유전공학의 발달과 더불어 미생물을 이용하여 생산한 재조합 성장호르몬은 대량 생산 및 공급이 가능하고 다른 질환의 감염 위험성이 적으므로 왜소증 치료제 시장의 대부분을 재조합 성장호르몬을 포함하는 단백질 제제가 차지하게 되었다. 유전자 재조합 방식의 성장호르몬을 체내에 투여하는 방법은 성장호르몬 자체가 거대 단백질이어서 경구투여가 불가능하여 주사기를 이용한 근육주사로 이루어진다. 이와 같이 재조합 성장호르몬은 대량 생산될 수 있음에도 불구하고 일정한 치료 기간동안 요구되는 비용이 상당하고, 경구투여가 불가능하여 주사를 이용해야 하는 불편함으로 인하여 최근에는 경구 투여용 제제를 개발하려는 시도들이 활발히 진행되고 있다.

경구 투여용 성장호르몬 제제의 기본 요건은 체내에서 흡수율이 높아야 하는 동시에, 선택적으로 성장호르몬 분비를 자극할 수 있는 생물학적 활성도를 지니고 있어야 하는 것이다. 경구 투여로 체내에서 높은 흡수율을 갖기 위해서는 분자량이 작을수록 유리하며, 체내에서 생리 활성 작용을 원활하게 수행하려면 구조적으로도 특별한 물리화학적 성질을 가져야 한다. 이와 같은 기본 요건을 갖춘 물질로서 연구되어 임상시험 단계까지 개발된 대표적인 것들로는 유기합성된 L-692, 429(Horm. Res., 1993, 40, 109∼115) 및 L-163, 191(PNAS, 1995, 92, 7001∼7005), 그리고 펩타이드성 화합물 GHRP-2(Endocrinology, 1994, 140, R9∼R13), GHRP-1(J. Neuroendocrinology, 1994, 6, 185) 및 헥사렐린(Hexarelin: His-D-2-methyl-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂) 등이 있다. 상기 물질들은 공통적으로 1980년대 초에 알려진 펩타이드성 화합물인 GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂)의 기본 구조를 이용하여 새로이 연구 개발된 것이다.

원래 체내에는 동물마다 다르지만 사람의 경우 44개의 아미노산으로 구성된 GHRH가 존재한다. 사람의 체내에서 성장호르몬의 분비를 조절하는 것은 성장호르몬의 분비를 촉진하는 GHRH와 성장호르몬의 분비를 억제하는 소마토스타틴 (Somatostatin)이라는 호르몬이며 이들은 상호작용을 통해 성장호르몬을 간헐적 (pulsatile)으로 특이하게 분비하도록 작용하는 것으로 알려져 왔다

상기 GHRP-6는 생물학적 활성도에 있어서 상기 GHRH 보다 효과는 저조하지만 분자량 크기 면에서는 상당히 압축되어 있는 유용한 합성 펩타이드이다[대한 내분비학회지, 1995, 10(1), 1∼9]. GHRP-6의 개발 이후 많은 연구자들에 의해 GHRP-6가 GHRH와 동일한 수용체(receptor)에 작용하여 효과를 나타내는 것이 아니라는 보고가 있었고, 이러한 합성화합물인 성장호르몬 분비촉진제들이 경유하는 새로운 수용체의 존재 가능성이 제기되었다[Endocrinology, 1989, 124, 2791]. 이러한 가능성은 머크(Merck)사의 연구진에 의해 돼지와 사람의 뇌하수체 만곡형상 복층정중(Arcuate ventro-medial) 부위 그리고 시상하부에 존재하는 성장호르몬 분비촉진제 수용체의 cDNA의 염기서열이 밝혀지면서 사실로 입증되었다[Science, 1996, 273, 974∼977]. 이러한 사실을 통해 기존에 밝혀진 성장호르몬 분비촉진호르몬과 합성화합물인 성장호르몬 분비촉진제 사이의 상승작용(synergism)이 입증되었으며, 체내에 존재하여 GHRH와 같은 역할을 수행하리라 추측되는 물질의 규명에 더욱 관심이 증가되고 있는 실정이다.

미국 머크사가 개발한 L-692, 429는 선택적으로 성장호르몬을 분비시키는 것으로 알려졌으며[Science, 1993, 260, 1640∼1643], 동물 실험 단계에서도 효과적인 체내 흡수율을 보여주었다. 그러나 인체 실험 결과는 동물의 그것과 다르게 경구 투여시 흡수가 그리 높지 않은 문제점이 있었다. 이에 이러한 문제를 개선한 L-163, 191 이 개발되었고, 이는 기존에 개발되었던 성장호르몬 분비촉진제들의 가장 큰 문제점이었던 경구 흡수율을 높인 화합물로서 개에 경구 투여시 60% 이상의 흡수율을 나타내는 것으로 보고되었고 이를 바탕으로 임상시험이 진행중이다[PNAS, 1995, 92, 7001∼7005; Endocrinology, 1996, 137, 5284∼5289]. 이들 물질에 관한 연구 결과는 뇌하수체를 자극하여 성장호르몬을 분비시키는 물질 등이 성장호르몬 대체제로서 임상적으로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하고 있는 반면, 새로운 성장호르몬의 결핍에 의해 야기되는 질병치료제를 개발하는 것이 용이하지 않다는 것을 보여준다.

이러한 연구의 일환으로 인체 내에 무해한 천연물 추출물을 이용하여 성장호르몬 분비촉진 역할을 하는 물질을 찾는 연구가 진행되고 있다. 그 예로 황기 뿌리의 알콜 추출물 그리고 7-하이드록시-4'-메톡시-이소플라본(7-hydroxy-4'-methoxy-isoflavone, formononetin) 및 스티그마스트-4-엔-6β-올-3-온(stigmast-4-en-6β-ol-3-one) 등이 성장호르몬 분비를 자극하는 활성이 있음이 본 발명자들에 의해 확인된 바 있고[국내특허등록 제257840호 및 제251519호; Kim, J. S. and Kim, C. S., Kor. J. Pharmacogn., 1997, 28(2), 75∼79; Kim, J. S. et al., Kor. J. Pharmacogn., 1996, 27(4), 336∼341], 원지 추출물, 사상자 추출물, 백합 추출물 및 길경 추출물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 추출물을 함유하는 성장호르몬 분비촉진 조성물에 관한 것[국내특허출원 제1998-0053921호], 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비 자극인자를 추출하는 방법 및 수용성 속단 추출물[국내특허출원 제1998-014589호]과 글리코알카로이드(glycoalkaloids) 계열의 아스퍼로사포닌 H1(asperosaponin H1)의 성장호르몬 분비촉진인자[국내특허출원 제1998-014590호]에 대한 연구가 보고되어 있다.

한편, 토복령(土茯笭)은 청미래덩굴(Smilax china)의 근경을 지칭하는 생약이다. 청미래덩굴은 백합과의 덩굴성 갈잎떨기나무로서 황해, 평남 이남의 산에서 흔히 자라며, 일본, 만주, 중국, 대만, 필리핀에 분포한다. 이러한 청미래덩굴의 근경을 중국에서는 발계, 우리나라에서는 토복령이라고 하며 물을 넣고 달인 액을 관절동통, 근육마비, 설사, 이질, 수종, 임병, 나력, 종독, 치창을 치료하는데 사용한다.

단풍마(Dioscorea quinqueloba, 丹楓)는 외떡잎식물 백합목 마과의 여러해살이 덩굴식물로서, 분포지역은 한국 및 일본으로 주로 산과들에서 서식한다. 이러한 단풍마는 한방에서 뿌리줄기를 천산룡(穿山龍)이라는 약재로 사용되어 어혈이 엉기어 뭉친 증세에 술에 담가서 복용하고, 어혈 때문에 생긴 관상 동맥 장애에 사용되며, 폐의 열 때문에 생긴 기침과 천식을 가라앉히고, 피의 열을 내리므로 종기와 피부가 헐어 생긴 발진에 사용되고 있다. 그러나, 상기 토복령 및 단풍마는 성장호르몬의 결핍에 의해 야기되는 질병치료제의 용도로는 아직 발표된바가 없다.

또한, 디오신에 관한 연구로는 사람 백혈병 암세포주의 성장에 대한 억제 효과(Biol. Pharm. Bull. 2001, 24(2), 159∼162 ), 항진균성과 세포독성의 활성(Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998, 62(10), 1904∼1911), 종양억제제(antineoplastic agents)로서의 활성(Planta Med. 1996, 62(6), 573∼575), 면역조절(immunomodulating) 효과(Anticancer Res. 1992, 12(5), 1475∼1478), 항종양 효과(Anticancer Res. 1991, 11(5), 1911∼1917)가 있음이 보고되었으나, 성장호르몬 분비 촉진용 기능성 식품의 용도로는 아직 발표된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 성장호르몬 분비 촉진용 기능성 식품에 대해 연구하던 중, 디오신 그리고 이를 포함하는 식물추출물이 성장호르몬 분비를 촉진하고, 또한 독성이 적어 성장호르몬 분비 촉진용 기능성 식품으로 사용할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 디오신 또는 이를 포함하는 식물추출물을 유효성분으로 하는 성장호르몬 분비 촉진용 기능성 식품으로서의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 디오신을 유효성분으로 하는 성장호르몬 분비 촉진용 기능성 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 디오신을 포함하는 토복령 추출물 또는 단풍마추출물을 유효성분으로 하는 성장호르몬 분비 촉진용 기능성 식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디오신을 유효성분으로 하는 성장호르몬 분비 촉진용 기능성 식품를 포함한다.

본 발명의 디오신은 통상의 유기합성 및 식물의 추출물에 의해 얻을 수 있으며, 일예로 하기와 같이 토복령 또는 단풍마의 추출물로부터 제조될 수 있다.

토복령(Smilax china)를 메탄올에 용해시켜 추출한 후 여과하고, 얻어진 여액을 감압농축시킨다. 얻어진 메탄올 추출물을 증류수를 첨가한 후 동량의 부탄올을 첨가하여 실온에서 진탕한 후 일야 방치하여 부탄올 분획물을 얻는다. 얻어진 부탄올 분획물을 컬럼을 이용하여 융출시켜 10 개의 소분획으로 나눈다. 이 중 6 번 소분획을 다시 컬럼을 이용하여 용출시켜 디오신을 제조한다.

또한, 단풍마(Dioscorea quinqueloba)를 메탄올에 용해시켜 추출한 후 여과하고, 얻어진 여액을 감압농축시킨다. 얻어진 메탄올 추출물을 컬럼을 이용하여 6 개의 분획으로 나눈다. 이 중 3 번 분획을 물포화 EtOAc-MeOH의 용매로 단계적으로 극성을 높여가며 컬럼크로마토그래피를 실시하여 디오신을 제조한다.

또한, 본 발명의 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품은 디오신을 포함하는 토복령추출물 및 단풍마추출물을 포함할 수 있다.

구체적으로, 토복령 분쇄물을 실온에서 메탄올을 이용하여 여러차례 연속으로 추출하여 메탄올 추출액을 얻는다. 바람직하게는 3회 연속추출한다. 얻어진 메탄올 추출액을 감압농축하여 토복령 메탄올 추출물을 얻는다. 이렇게 얻어진 토복령 메탄올 추출물에 증류수를 가한 후 거의 동량의 부탄올을 가하여 실온에서 진탕한 후 일야를 방치하여 부탄올 분획액을 얻는다. 얻이진 부탄올 분획액을 컬럼을 이용하여 정제한 후 감압증류하여 토복령 부탄올 분획물을 얻는다.

단풍마 분쇄물을 환류냉각장치를 이용하여 메탄올을 이용하여 여러차례 연속으로 추출하여 메탄올 추출액을 얻는다. 바람직하게는 3회 연속추출한다. 얻어진 메탄올 추출액을 감압농축하여 단풍마 메탄올 추출물을 얻는다.

또한, 본 발명은 디오신 그리고 이를 포함하는 토복령 또는 단풍마 추출물을 유효성분으로 하는 성장호르몬 분비 촉진용 기능성 식품을 포함한다.

본 발명에서 얻어진 디오신 그리고 이를 포함하는 토복령 메탄올 추출물, 그의 부탄올 분획물 및 단풍마 메탄올 추출물은 성장호르몬 분비를 촉진시키는 효과를 나타낸다. 하기 실시예에서 보는 바와 같이, 본 발명의 디오신을 랫트의 뇌하수체 세포에 주입하였을 때, 대조군에 대해 30 배 이상의 분비촉진 활성을 나타내었으며, 디오신의 투여 농도가 증가함에 따라 성장호르몬 분비 촉진효과가 증가하였으며, 이 때 ED₅₀은 1.14 ×10^-5 M이었다.

또한, 10 ㎍/㎏의 디오신을 SD 랫트에 정맥투여 후 채혈하여 분리된 플리스마의 성장호르몬을 측정한 결과, 대조군에 비해 약물투여 10 분 후 성장호르몬이 3 배 정도의 증가를 보였으며, 20∼30 분 후 대조군에 비해 2∼6 배 정도 증가하였다(표 3 및 도 1 참조).

상기와 같이 디오신, 이를 포함한 토복령추출물 및 단풍마추출물은 성장호르몬의 분비촉진을 활성시킨다. 이로 인해 촉진된 성장호르몬은 본 기술분야의 기술자들에 의해 알려진 바와 같이, 여러 가지 용도로 사용된다. 이러한 성장호르몬의 다양한 용도들은 하기와 같이 요약할 수 있다: 노인의 성장호르몬 분비촉진; 성장호르몬이 부족한 성인의 치료; 글루코코르티코이드의 이화 부작용의 억제, 골다공증 치료, 면역체계의 촉진, 상처치료 촉진, 뼈골절 재생 촉진, 성장저해의 치료, 급성 또는 만성 신장(腎臟) 쇠약 또는 부전증의 치료, 생리학적으로 짧은 체세(體勢)의 치료, 성장호르몬이 부족한 어린이를 포함하여, 만성병에 의한 짧은 체세의 치료, 비만 및 비만에 의한 성장저해의 치료, 프라더-윌리(Prader-Willi) 증후군 및 터너(Turner) 증후군으로 인한 성장저해의 치료; 몸의 일부가 불편한 환자 또는 위장수술과 같은 주요한 수술후의 회복 촉진 입원기간 감소; 자궁내 성장저해, 골격 형성 장해, 과코르티손증 및 쿠싱 증후군의 치료; 스트레스 환자들에게 성장호르몬의 대체; 골연결이형성증, 누난 증후군, 수면 장애, 알츠하이머병, 상처치료 지연 및 정신사회성 상실의 치료; 호흡기 장애 및 인공호흡기 의존상태의 치료; 주요 기능 후 단백질 이화반응의 감쇠; 흡수불량 증후군의 치료, 암 또는 AIDS와 같은 만성질환에 의한 악액질 및 단백질 손실의 감소; TPN(전체 비경구적 영양공급)으로 환자의 몸무게 증가 및 단백질 증대 촉진; 랑게르한스섬세포증을 포함한 과인슐린증의 치료; 배란 유도 및 위와 십이지장의 궤양의 예방 및 치료를 위한 보조치료; 흉선 기능의 자극 및 흉선기능의 나이에 따른 감소를 예방; 혈액투석하는 환자를 위한 보조치료; 면역 억제된 환자의 치료 및 백신접종 후 항체반응의 증진; 연약한 노인의 근육 강화, 유동성, 피부두께의 유지, 신진대사의 생체항상성, 신장의 생체항상성의 증진; 조골세포의 자극, 뼈 개조 및 연골 성장; 혈관말초 및 마약에 인한 신경장애와 같은 신경병학적 병, 귈랑-바레 증후군, 근위축 측면의 경화증, 다중 경화증, 내혈관 발작 및 탈수병의 치료; 동종의 동물에서 면역계의 자극 및 노화 장애의 치료; 가축류에서 성장촉진제 및 양에서 양털성장의 자극[미합중국특허 제5,578,593호; 제5,767,085호].

본 발명의 디오신 및 이를 포함한 토복령추출물 및 단풍마추출물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 디오신 및 이를 포함한 토복령추출물 및 단풍마추출물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 디오신 및 이를 포함한 맥문동 메탄올 추출물 및 그의 부탄올 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이크 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명에서는 토복령추출물 및 단풍마추출물의 경우, 1∼1000 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 1∼100 ㎎/㎏이다. 또한 상기 디오신의 경우, 0.01∼100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1∼10 ㎎/㎏이다. 상기 디오신 및 이를 포함하는 토복령추출물 및 단풍마추출물은 하루 1∼3 회 투여할 수 있다.

본 발명의 토복령추출물과 단풍마추출물 및 디오신은 실험용 생쥐에 각각 1000 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏을 경구투여시 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 토복령추출물과 단풍마추출물이 10 g/㎏이며, 디오신이 100 ㎎/㎏ 이상으로 생체 안정성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 토복령추출물, 단풍마추출물 및 디오신은 생체에 대해 안정하게 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 디오신, 이를 포함하는 토복령추출물 또는 단풍마추출물을 유효성분으로 하는 기능성 식품, 건강보조 식품 또는 특수영양식품을 제공한다.

본 명세서에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 상기 디오신 및 이를 포함하는 토복령추출물 또는 단풍마추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다.

기능성 식품과 구별하여, 본 명세서에서 '건강보조식품' 또는 '특수영양식품'이란, 상기 디오신 및 이를 포함하는 토복령추출물 또는 단풍마추출물을 일반식품에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 건강식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용등이 없는 장점이 있다.

본 발명에 따른 디오신 및 이를 포함하는 토복령추출물 또는 단풍마추출물을 함유하는 기능성 식품, 건강보조식품 및 특수건강식품의 함량은 사용되는 식품군에 따라 다양하게 변화시킬 수 있으며, 그 함량은 상기 약학적 조성물로의 용도시 측정된 독성 범위내에서 수행한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 토복령 메탄올 추출물의 제조

토복령 3.6 ㎏을 메탄올 6 ℓ로 실온에서 연속적으로 3회 추출한 후 얻어진 메탄올 용액을 감압농축하여 토복령 메탄올 추출물 345 g을 얻었다.

<실시예 2> 토복령 부탄올 분획물의 제조

상기 실시예 1의 토복령 메탄올 추출물을 분액여두에 취한 후 증류수 1400 ㎖를 가하고 거의 동량의 부탄올을 가하였다. 상기 용액을 실온에서 진탕한 후 일야 방치하여 토복령 부탄올 분획물 107 g을 얻었다.

<실시예 3> 디오신의 제조 1

상기 실시예 2의 토복령 부탄올 분획물을 실리카젤 컬럼을 이용하여 CHCl₃-MeOH-H₂O(8:2:0.5, 하층부) 및 CHCl₃-MeOH-H₂O(7:3:1, 하층부)의 용매로 순차적으로 용출시켜 10 개의 소분획으로 나누었다. 이 중 6 번 소분획을 다시 실리카겔 컬럼을 이용하여 CHCl₃-MeOH-H₂O(8:2:0.5, 하층부)의 용매로 용출하여 디오신 2.1 g을 얻었다.

<실시예 4> 단풍마 메탄올 추출물의 제조

단풍마(Dioscorea quinqueloba Thunb.)의 근경 2 ㎏을 세절하고, 환류냉각 장치를 사용하여 메탄올로 3회 연속 추출하였다. 얻어진 메탄올 추출액을 여과한 후 감압농축하여 단풍마 메탄올 추출물 87.3 g을 얻었다.

<실시예 5> 디오신의 제조 2

상기 실시예 4의 단풍마 메탄올 추출물 20 g을 실리카겔 컬럼을 이용하여 CHCl₃-MeOH-H₂O(7:3:1, 하층부)의 용매로 6 개의 분획으로 나누었다. 이 중 3 번 분획을 물포화 EtOAc-MeOH(98:2)로부터 물포화 EtOAc-MeOH(95:5)까지 단계적으로 극성을 높여가며 실리카겔컬럼 크로마토그래피를 실시하여 물질을 분리하였으며, 메탄올로 재결정하여 무색침상 결정인 디오신을 얻었다.

녹는점 : 289∼292℃

{α]_D ²⁵ : -110.5°(c, 0.3 in MeOH)

IR(KBr, ㎝^-1) 3420, 1645, 1100∼1000, 920, 900, 863, 835 (900>920, 25(R)-스피로케탈), 810

¹H NMR(300 ㎒, 피리딘-d₅) δ0.68(d, J=5.2㎐), 0.82(s), 1.05(s), 1.12(d, J=6.9㎐), 1.60(d, J=6.9㎐), 1.74(d, J=6.2㎐), 4.92(d, J=6.7㎐), 5.32(br d, J=4.6㎐), 5.80(s), 6.34(s).

13C NMR(75.5 ㎒, 피리딘-d₅) δ15.01, 16.32, 17.30, 19.40, 21.11, 29.27, 30.16, 30.60, 31.71, 31.84, 32.22, 32.32, 37.14, 37.50, 38.99, 39.88, 40.47, 41.98, 50.33, 56.66, 62.92, 66.88, 78.14, 81.11, 109.26, 121.78, 140.84

<실험예 1> 성장호르몬 분비촉진 활성 실험

(단계 1) 뇌하수체 세포 배양

생후 4∼5 주령의 스프래그-다우리(Sprague-Dawley rat) 랫트로부터 무균 조작하에 뇌하수체를 꺼낸 뒤 콜라게네이즈 타입(collagenase type, Gibco co., Grand Island, NY)과 히알루로니데이즈(hyaluronidase, Sigma co., St. Louis, MO)로 처리하여 뇌하수체 세포(rat pituitary cell)를 분리하였다. 분리된 뇌하수체 세포를 10 % 말 혈청(horse serum), 2.5 % 태아 소 혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 항생제를 함유하는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium)에 부유시킨 후 37 ℃ 및 5 % CO₂의 항습 조건(humidified condition)에서 배양하였다.

(단계 2) 성장호르몬 분비 촉진 활성 실험

상기 단계 1에서 분리한 뇌하수체 세포를 배양한 후에 시험액에 부유시켰다. 약물을 10㎍/㎖ 농도로 뇌하수체 세포에 가하였으며, 비교군으로는 성장호르몬 분비의 기준 물질인 랫트 성장호르몬 분비인자(rat GRF, Bachem Co., Torrance, CA, U.S.A.)를 300 nM, 500 nM, 1,000 nM이 되도록 가한 후에 총 부피가 1 ㎖가 되도록 시험액을 가하여 37℃에서 15분간 배양하였다. 배양한 후 원심분리하여 그 상등액을 분리하였으며, 성장호르몬 활성을 측정하기 위하여 -70℃에 보관하였다.

(단계 3) 성장호르몬 측정

성장호르몬 측정은 쥐 성장호르몬 RIA 키트(rat GH RIA kit, Amersham, Buckinghamshire, England)를 사용하여 수행하였다. 일정한 양의 ¹²⁵I-표지 성장호르몬과 상기에서 보관한 시험물질에 함유된 성장호르몬은 항성장호르몬 항체(anti-GH antibody)에 대한 경쟁적인 반응에 의해서 각기 다른 양의 성장호르몬-항체 복합체(GH-Ab complex)를 형성하게 되고 여기에 2차 항체(second antibody)를 가하여 침전시킨 후 침전으로부터 ¹²⁵I의 방사활성도를 측정하였다. 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

물질	랫트 성장호르몬의 농도(ng/㎖)
디오신	219.391 ±10.443
GRF*(0 nM)	7.633 ±3.551
GRF(100 nM)	20.448 ±4.505
GRF(300 nM)	37.296 ±9.773
GRF(500 nM)	79.014 ±14.757
GRF(1000 nM)	130.174 ±4.000
* 는 성장호르몬 분비인자를 나타낸 것이다.

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 디오신에 의해 랫트 성장호르몬이 219.391 ±10.443 ng/㎖의 농도로 나타났으며, 이는 뇌하수체 세포에 작용하여 대조군의 30배 이상 성장호르몬의 분비를 촉진시킴을 나타내는 것이다.

<실험예 2> 디오신의 농도에 따른 성장호르몬 분비 효과 측정

상기 실험예 1과 같은 방법으로 디오신의 농도에 따라 성장호르몬 분비 효과를 측정하였다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

디오신의 농도(㎎/㎖)	랫트 성장호르몬의 농도(ng/㎖)
10	124.129 ±1.525
5	92.057 ±4.082
2.5	32.936 ±6.759
1.25	28.501 ±4.050
GRF*(0 nM)	8.756 ±0.514
GRF(100 nM)	19.093 ±1.666
GRF(300 nM)	24.893 ±0.621
GRF(500 nM)	37.348 ±2.343
GRF(1000 nM)	82.016 ±7.502
* 는 성장호르몬 분비인자를 나타낸 것이다.

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 디오신의 농도가 1.25 ㎎/㎖일 경우, 랫트 성장호르몬의 농도는 28.501 ±4.050 ng/㎖이 측정되었으며, 디오신의 농도가 점점 증가함에 따라 랫트 성장호르몬의 농도도 점점 증가하였으며, 디오신의 농도가 10 ㎎/㎖일 경우, 랫트 성장호르몬의 농도는 124.129 ±1.525 ng/㎖이 측정되었다. 이는 랫트 성장호르몬의 농도가 디오신의 농도에 의존함을 나타내고 있으며, GRF(1000 nM)에 대한 랫트 성장호르몬 농도의 1.5 배가 되는 농도이다. 이때 계산된 ED₅₀은 1.14 ×10^-5 M이었다.

<실험예 3> 동물 모델을 이용한 성장호르몬 분비촉진 활성실험

8주령의 SD 랫트를 펜토바비탈(pentobarbital) 50 ㎎/㎏ 농도로 마취시킨 후 디오신을 10 ㎍/㎏ 농도로 0.1 % DMSO를 포함한 생리식염수에 용해시켜 랫트의 경정맥에 투여하였으며, 대조군으로는 0.1 % DMSO를 포함한 생리식염수를 투여하였다. 꼬리 경정맥으로부터 일정 시간간격으로 채혈한 후 RIA 키트를 사용하여 분비된 성장호르몬을 측정하였다.

시간(분)	대조군(n=27)(ng/㎖)	디오신 투여군(n=4)(ng/㎖)
10	13.19±2.51	46.18	14.64	11.06	41.10
20	12.88±3.29	21.31	17.72	21.25	76.37
30	12.52±2.94	6.35	17.45	30.99	21.75
45	9.49±3.24	24.01	7.24	4.97	14.59
60	8.19±10.64	3.88	8.18	4.64	38.77

상기 표 3 및 이를 그래프로 나타낸 도 1에서 보는 바와 같이, 동물을 이용하여 본 발명의 디오신을 10 ㎍/㎏의 농도로 랫트의 경정맥에 투여한 후 꼬리 정맥으로부터 일정 시간 간격으로 채혈하여 분리된 플라스마의 성장호르몬을 측정한 결과 대조군에 비해 약물 투여 10분 후 약 3 배 정도의 증가를 보였고, 20∼30분 후에는 2∼6배 증가를 보였으며 1 시간 이내에 디오신의 성장호르몬 분비 촉진 능력이 측정되었다.

<실험예 4> 급성 독성 실험

6 주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 토복령 추출물 또는 단풍마 추출물과 디오신을 각각 0.5 % 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 각각 1000 ㎎/㎏/㎖ 및 100 ㎎/㎏/㎖의 용량으로 1회 경구투여하였다. 실험 물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 핼액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 토복령 추출물 또는 단풍마 추출물 및 디오신은 모두 랫트에서 각각 1000 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 토복령 추출물 또는 단풍마 추출물은 10 g/㎏이며, 디오신은 100 ㎎/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<제제예 1> 캡슐제의 제조방법

디오신 5 ㎎, 토복령 추출물 10 ㎎ 또는 단풍마 추출물 10 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

상기 분말 및 캡슐제의 구성성분은 다음과 같다.

디오신 ······················· 5.0 ㎎

(토복령 추출물 또는 단풍마 추출물 ·········· 10 ㎎)

락토오스 ······················14.8 ㎎

폴리비닐 피롤리돈··················10.0 ㎎

마그네슘 스테아레이트 ··············· 0.2 ㎎

<제제예 2> 주사액제의 제조방법

디오신 10 ㎎, 토복령 추출물 20 ㎎ 또는 단풍마 추출물 20 ㎎, 만니톨 180 ㎎, Na₂HPO₄·12H₂O 26 ㎎ 및 증류수 2974 ㎎을 함유시켜 주사제를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

디오신 ······················· 10 ㎎

(토복령 추출물 또는 단풍마 추출물 ········· 20 ㎎)

만니톨 ······················· 180 ㎎

Na₂HPO₄·12H₂O ····················26 ㎎

증류수 ······················ 0.2 ㎎

<제제예 3> 음료의 제조방법

디오신 0.1 g, 토복령 추출물 0.2 g 또는 단풍마 추출물 0.2 g, 비타민 C, 분말비타민 E, 젓산철, 산화아연, 니코틴산 아미드, 비타민 A, 비타민 B₁ 및 비타민 B₂를 혼합하여 제조하였다.

상기 음료의 구성성분은 다음과 같다.

디오신 ······················· 0.1 g

(토복령 추출물 또는 단풍마 추출물 ········· 0.2 g)

비타민 C ······················· 15 g

분말비타민 E ·····················7.5 g

젓산철 ······················ 19.75 g

산화아연 ······················ 3.5 g

니코틴산아미드···················· 3.5 g

비타민 A ······················ 0.2 g

비타민 B₁ ····················· 0.25 g

비타민 B₂ ····················· 0.3 g

물 ························· 적량

상술한 바와 같이, 본 발명의 디오신 및 이를 포함하는 토복령 추출물 및 단풍마 추출물은 뇌하수체 세포에 작용하여 성장호르몬 분비를 촉진시키며 투입되는 농도가 증가함에 따라 성장호르몬 분비도 촉진된다. 또한, 이를 쥐를 이용한 동물 실험 결과 동일하게 성장호르몬 분비를 촉진시켰으며, 독성실험 결과 독성이 적어 새로운 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양 식품으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 랫트에 디오신을 투여 후 유발된 플라스마 성장호르몬의 피크 농도를 나타낸 그래프이다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 디오신을 유효성분으로 하는 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양 식품.

   화학식 1
2. 제1항에 있어서, 상기 디오신이 토복령(Smilax china)로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양 식품.
3. 제2항에 있어서, 상기 토복령으로부터 디오신의 분리가,

   i) 토복령(Smilax china) 분쇄물을 메탄올에 용해시켜 추출한 후 여과하고 얻어진 여액을 감압농축하여 토복령 메탄올 추출물을 얻는 단계; 및

   ii) i)의 토복령 메탄올 추출물에 증류수를 첨가하고, 부탄올을 첨가하여 실온에서 진탕한 후 추출 여과하고, 얻어진 여액을 감압농축하여 토복령 부탄올 분획물을 얻는 단계를 포함하는 것임을 특징으로 하는 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양 식품.
4. 제1항에 있어서, 상기 디오신이 단풍마(Dioscorea quinqueloba Thunb.) 로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양 식품.
5. 제4항에 있어서, 상기 디오신이 단풍마 분쇄물을 환류 냉각 장치를 사용하여 메탄올로 추출한 후 여과하고 얻어진 여액을 감압농축하여 얻어진 단풍마 메탄올 추출물로부터 분리되는 것임을 특징으로 하는 성장호르몬 분비촉진용 기능성 식품, 건강 보조 식품 또는 특수 영양 식품.