KR100763620B1 - 산조인 추출물 또는 베툴린산을 유효성분으로 함유하는성장호르몬 분비촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산조인 추출물 또는 베툴린산을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬 분비촉진용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 산조인 추출물 또는 이로부터 분리하여 수득한 베툴린산을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬 분비촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 산조인 추출물 또는 베툴린산은 뇌하수체 세포에 작용하여 성장호르몬의 분비를 촉진시키며, 시험관 뿐만 아니라 생체내에서도 성장호르몬 분비량을 현저하게 증가시키므로, 소인증, 왜소증, 소아의 발육부진 및 성장저하와 같은 성장 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

베툴린산, 산조인, 성장호르몬

Description

산조인 추출물 또는 베툴린산을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬 분비촉진용 조성물{The composition to secreat growth hormone containing Zizyphus jujuba Mill extract or betulinic acid}

도 1은 본 발명의 베툴린산을 랫트의 경정맥에 투여한 후 꼬리 정맥으로부터 일정 시간 간격으로 성장호르몬을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 산조인 추출물 또는 베툴린산을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬 분비촉진제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 산조인 추출물 또는 이로부터 분리하여 수득한 베툴린산을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬 분비촉진용 조성물에 관한 것이다.

성장호르몬(growth hormone, GH)은 동물의 뇌하수체에서 분비되는 단백질로서 191개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. 이러한 성장호르몬은 오래 전부터 동물에서 분리되어 주로 왜소증(dwarfism) 환자들의 치료에 사용되어 왔다. 또한, 성장호르몬을 지속적으로 투여하면 체중, 근육 및 지방의 무게 등이 증가하여 노화로 인한 질병을 예방할 수 있고, 일시적으로 투여하는 경우에도 혈장내의 인슐린 및 IGF-1(Insulin-like growth factor-1)의 농도를 증가시키며 소변 내의 단백질 농도를 감소시키는 것으로 알려져 있다(Kohrt, W. M. et al., Med. Sci. Sports Exerc., 24: 832-837, 1992; Zachweija, J. J. et al., Am. J. Physiol., 266: E840-844, 1994; Horber, F. F. and Haymond, M.W., J. Clin. Invest., 86: 265-272, 1990). 이외에도 간의 무게와 크기를 증가시키고 근육, 뼈 및 연결 조직 등의 말단 조직에서 단백질의 합성을 향상시키는 것으로 보고되어있다(Kaiser, F. E. et al., J. Am. Geriatr. Soc., 39: 235-240, 1991; Marcus, R. et al., J. Clin. Endocrino. Metab., 70: 519-527, 1990).

지금까지의 연구로는 선천적인 뇌하수체 기능부전(hypopituitarism)인 어린이와 성인에게 성장호르몬 분비촉진 호르몬(growth hormone releasing hormone, 이하 "GHRH"라 칭한다)과 아르기닌(arginine)을 동시에 투여했을 때 성인보다도 어린이에게서 성장호르몬의 감응정도가 높았으며 많은 종류의 뇌하수체호르몬 결핍 환자보다도 성장호르몬 결핍 환자에게서 감응정도가 더 높았고 완전한 뇌하수체계를 갖는 환자보다도 뇌하수체의 잔여 맥관 성분(residual vascular component)을 가진 환자에게서 더 높은 결과를 얻었다.

GHRH와 아르기닌에 대한 성장호르몬의 반응성은 나이에 따라 감소하는 경향(J. Clin. Endocrinol. Metab., 86(4): 1574-79, 2001)이 있었고, 성장호르몬 분비 촉진제(secretagogue)에 대한 내생 리간드인 그레린(ghrelin)을 성장호르몬 결핍 쥐에 투여하였을 때 효과가 있었으며(Shintani M. et al., Diabetes, 50(2): 227-32, 2001), 활성 성장호르몬 분비촉진제인 MK-677과 강력한 골 흡수 저해제인 아렌드로네이트(alendronate)를 함께 투여하면 아렌드로네이트를 단독 투여했을 때보다 상대적으로 더 높은 골형성 속도를 유지하므로 폐경후 골다공증인 여성에게서 골 무기질 밀도(bone mineral density)를 증가시킨다. MK-677과 아렌드로네이트의 병행 투여의 IGF-1 레벨에 대한 영향은 MK-677 단독 투여나 아렌드로네이트와 병행 투여 모두 IGF-1 레벨이 증가하고 골형성 감소를 완화시켰으며 대퇴 목(femoral neck)의 골 무기질 밀도는 증가한 반면 요추, 둔부의 골 무기질 밀도는 증가 현상이 나타나지 않았다. MK-677을 통한 성장호르몬의 대사효과는 골 형성에 있어서 아렌드로네이트의 직접적인 억제효과를 줄였다(J. Clin. Endocrinol. Metab., 2001, 86(3), 1116-25).

과거에 성장호르몬은 주로 사체의 뇌하수체로부터 추출되어 사용되었으나, 이 과정에서 성장호르몬을 투여받은 환자들에게 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jakob disease)이란 질병을 유발시킴이 밝혀졌다. 이렇게 분리 과정에서 다른 질병의 원인 물질까지 환자에게 유입될 수 있는 위험성이 있어 사체로부터 분리한 성장호르몬은 그 사용이 매우 제한되었다. 유전공학의 발달과 더불어 미생물을 이용하여 생산한 재조합 성장호르몬은 대량 생산 및 공급이 가능하고 다른 질환의 감염 위험성이 적으므로 왜소증 치료제 시장의 대부분을 재조합 성장호르몬을 포함하는 단백질 제제가 차지하게 되었다. 유전자 재조합 방식의 성장호르 몬을 체내에 투여하는 방법은 성장호르몬 자체가 거대 단백질이어서 경구투여가 불가능하여 주사기를 이용한 근육주사로 이루어진다. 이와 같이 재조합 성장호르몬은 대량 생산될 수 있음에도 불구하고 일정한 치료 기간동안 요구되는 비용이 상당하고, 경구투여가 불가능하여 주사를 이용해야 하는 불편함으로 인하여 최근에는 경구 투여용 제제를 개발하려는 시도들이 활발히 진행되고 있다.

경구 투여용 성장호르몬 제제의 기본 요건은 체내에서 흡수율이 높아야 하는 동시에, 선택적으로 성장호르몬 분비를 자극할 수 있는 생물학적 활성도를 지니고 있어야 하는 것이다. 경구 투여로 체내에서 높은 흡수율을 갖기 위해서는 분자량이 작을수록 유리하며, 체내에서 생리 활성 작용을 원활하게 수행하려면 구조적으로도 특별한 물리화학적 성질을 가져야 한다.

이와 같은 기본 요건을 갖춘 물질로서 연구되어 임상시험 단계까지 개발된 대표적인 것들로는 유기합성된 L-692, 429(Cheng K et al., Horm. Res., 40: 109-115, 1993) 및 L-163, 191(Patchett AA., PNAS, 92: 7001-7005, 1995) 그리고 펩타이드성 화합물 GHRP-2 (Wu D et al., Endocrinology, 140; R9-R13, 1994), GHRP-1(J. Neuroendocrinology, 1994, 6, 185 및 헥사렐린(Hexarelin: His-D-2-methyl-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂) 등이 있다. 상기 물질들은 공통적으로 1980년대 초에 알려진 펩타이드성 화합물인 GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂)의 기본 구조를 이용하여 새로이 연구 개발된 것이다.

최근에는 새로운 물질을 개발하는 접근 방식으로 화학물질 라이브러리 (chemical library)를 이용하여 후보 물질들을 대량 검색하는 방법이 각광을 받고 있으며, 이외에도 길이가 짧은 펩타이드들로 구성된 펩타이드 라이브러리(peptide library) 및 자연계에 존재하는 여러 물질들로 구성된 천연물질 라이브러리 (natural library)도 이러한 새로운 물질을 개발하기 위하여 활용되고 있다. 이와 같이 다양하고 광범위한 라이브러리를 이용하여 신약을 개발하는 것은 개발에 소요되는 기간 및 비용 면에서 기존의 접근 방식보다 상당히 효율적이므로 선진 제약기업에서는 이미 오래 전부터 자사의 라이브러리를 이용한 신약 개발에 적극적으로 참여하여 왔다. 구체적으로 상기 L-163, 191 및 헥사렐린도 이러한 접근 방식으로 개발된 물질이라 할 수 있다.

원래 체내에는 동물마다 다르지만 사람의 경우 44개의 아미노산으로 구성된 GHRH가 존재한다. 사람의 체내에서 성장호르몬의 분비를 조절하는 것은 성장호르몬의 분비를 촉진하는 GHRH와 성장호르몬의 분비를 억제하는 소마토스타틴 (Somatostatin)이라는 호르몬이며 이들은 상호작용을 통해 성장호르몬을 간헐적 (pulsatile)이고 특이적으로 분비하도록 작용하는 것으로 알려져 왔다.

GHRP-6는 생물학적 활성도에 있어서 상기 GHRH 보다 효과는 저조하지만 분자량 크기 면에서는 상당히 압축되어 있는 유용한 합성 펩타이드이다(대한 내분비학회지, 10(1), 1-9, 1995). GHRP-6의 개발 이후 많은 연구자들에 의해 GHRP-6가 GHRH와 동일한 수용체(receptor)에 작용하여 효과를 나타내는 것이 아니라는 보고가 있었고, 이러한 합성화합물인 성장호르몬 분비촉진제들이 경유하는 새로운 수용체의 존재 가능성이 제기되었다(Endocrinology, 1989, 124, 2791). 이러한 가능성 은 머크(Merck)사의 연구진에 의해 돼지와 사람의 뇌하수체 만곡형상 복층정중 (Arcuate ventro-medial) 부위 그리고 시상하부에 존재하는 성장호르몬 분비촉진제 수용체의 cDNA의 염기서열이 밝혀지면서 사실로 입증되었다( Howard AD.et al., Science, 273, 974-977, 1996). 이러한 사실을 통해 기존에 밝혀진 성장호르몬 분비촉진 호르몬과 합성 화합물인 성장호르몬 분비촉진제 사이의 상승작용(synergism)이 입증되었으며, 체내에 존재하여 GHRH와 같은 역할을 수행하리라 추측되는 물질의 규명에 더욱 관심이 증가되고 있는 실정이다.

미국 머크사가 개발한 L-692, 429(Science, 1993, 260, 1640-1643)는 선택적으로 성장호르몬을 분비시키는 것으로 알려졌으며, 동물 실험 단계에서도 효과적인 체내 흡수율을 보여주었다. 그러나 인체 실험 결과는 동물의 그것과 다르게 경구 투여시 흡수가 그리 높지 않은 문제점이 있었다. 이에 이러한 문제를 개선한 L-163, 191이 개발되었고, 이는 기존에 개발되었던 성장호르몬 분비촉진제들의 가장 큰 문제점이었던 경구 흡수율을 높인 화합물로서 개에 경구 투여시 60% 이상의 흡수율을 나타내는 것으로 보고되었고 이를 바탕으로 임상시험이 진행중이다(PNAS, 7001-7005; Endocrinology, 137, 5284-5289, 1996). 이들 물질에 관한 연구 결과는 뇌하수체를 자극하여 성장호르몬을 분비시키는 물질 등이 성장호르몬 대체제로서 임상적으로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하고 있는 반면, 새로운 성장호르몬 분비촉진제를 개발하는 것이 용이하지 않다는 것을 보여준다.

이러한 연구의 일환으로 인체 내에 무해한 천연물 추출물을 이용하여 성장호르몬 분비촉진 역할을 하는 물질을 찾는 연구가 진행되고 있다. 그 예로 황기 뿌리 의 알콜 추출물 그리고 7-하이드록시-4'-메톡시-이소플라본(7-hydroxy-4'-methoxy-isoflavone, formononetin) 및 스티그마스트-4-엔-6β-올-3-온(stigmast-4-en-6β-ol-3-one) 등이 성장호르몬 분비를 자극하는 활성이 있음이 본 발명자들에 의해 확인된 바 있고(대한민국 등록특허 제 257840호 및 제 251519호; Kim, J. S. and Kim, C. S., Kor. J. Pharmacogn., 28(2), 75-79, 1997; Kim, J. S. et al., Kor. J. Pharmacogn., 27(4), 336-341, 1996), 원지 추출물, 사상자 추출물, 백합 추출물 및 길경 추출물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 추출물을 함유하는 성장호르몬 분비촉진 조성물(대한민국 공개특허 제 502389호), 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비 자극인자를 추출하는 방법 및 수용성 속단 추출물(대한민국 특허출원 제 378904호)과 글리코알카로이드(glycoalkaloids) 계열의 아스퍼로사포닌 H1(asperosaponin H1)의 성장호르몬 분비촉진인자(대한민국 특허출원 제 436219호)에 대한 연구가 보고되어 있다.

한편, 산조인(酸棗仁, Zizyphus jujuba Mill)은 갈매나무과 식물로 성분이 고르고 맛이 달며 독이 없고 심이 번(煩)하여 잠을 못자는 것과 배꼽 위나 아래의 동통(疼痛)과 혈설(血泄) 및 허한(虛汗)을 낫게 하고 간기(肝氣)를 더해주며 근골(筋骨)을 튼튼히 하고 비건(肥健)하며 또 근골의 풍을 치료한다. 또한, 심장과 소화기를 돕고 정신을 맑고 편하게 하며, 양간, 지한, 불면, 건망증에 효과가 있으며, 아사론(asarone)성분 등을 함유하고 있어, 예로부터 진정, 최면작용, 불면증, 신경쇄약, 잠잘 때 식은땀이 흐르는 증상, 신경성 스트레스 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

산조인 추출물 또는 베툴린산 관련 특허로는 신규한 베툴린산 유도체, 그의 제조 방법 및 암 성장억제제로서의 그의 용도(대한민국 공개특허 제2001-0080507호)와 항맥관형성 활성을 가지는 새로운 베툴린산 유도체, 이러한 유도체의 제조방법 및 종양 관련 맥관형성증의 치료를 위한 이들의 용도(대한민국 공개특허 제2002-0092908호)가 있다. 그러나 상기 특허 모두 베툴린산이 성장호르몬 분비를 촉진하는 용도에 대해서는 기재하고 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비를 촉진하는 물질을 연구한 결과, 산조인의 성분인 베툴린산이 성장호르몬 분비촉진제로 작용하여 성장호르몬의 생산을 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 산조인 추출물 또는 베툴린산을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬 분비 촉진제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 베툴린산 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 상기 베툴린산을 포함하는 산조인 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 베툴린산 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 상기 베툴 린산을 포함하는 산조인 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장 촉진용 건강식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 베툴린산(화학식 1), 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 상기 베툴린산을 포함하는 산조인 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

본 발명의 베툴린산이 성장호르몬 분비촉진에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 래트로부터 뇌하수체를 적출하여 뇌하수체 세포를 분리, 배양하고 여기에 베툴린산을 가하여 계속 배양하였다. 일정 시간이 지난 후 상등액을 취하여 성장호르몬의 양을 측정한 결과, 본 발명의 베툴린산은 뇌하수체 세포에 작용하여 성장호르몬의 분비를 촉진시키며, 비교군으로 사용한 랫트 성장호르몬 분비인자보다 성장호르몬 분비촉진 효과가 뛰어남을 확인하였다(표 1 참조).

상기와 더불어, 래트의 경정맥에 생리식염수와 함께 베툴린산을 투여하고 꼬리 경정맥으로부터 채혈하여 분비된 성장호르몬을 측정한 결과, 베툴린산 투여군은 대조군에 비해 10 ㎍/㎏은 약 6배, 20 ㎍/㎏ 약 8배 정도의 성장호르몬 농도가 증가되는 것을 확인하였다(도 1 참조).

따라서, 본 발명의 베툴린산은 뇌하수체 세포에 작용하여 성장호르몬의 분비를 촉진시키며, 시험관(in vitro) 뿐만 아니라 생체내(in vivo)에서도 성장호르몬을 강력하게 증가시키므로, 소인증, 왜소증, 소아의 발육부진 및 성장저하와 같은 성장 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 베툴린산은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 베툴린산은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 베툴린산에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형 제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 산조인 추출물을 유효성분으로 함유하는 경우, 그 유효용량은 10 mg 내지 1000 mg/kg/day 이고, 바람직하기로는 30 내지 3,000 mg /kg/day 이며, 하루 1-3 회로 나누어 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물에서 베툴린산을 유효성분으로 함유하는 경우, 그 유효용량은 0.01 내지 100 mg/kg/day 이고, 바람직하기로는 0.1 내지 10 mg /kg/day 이며, 하루 1-3 회로 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 산조인 추출물의 원료인 산조인은 천연약재로서 안전성이 확보되어 있으며, 특히 본 발명의 산조인 추출물을 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 산조인 추출물 10 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

또한, 본 발명은 베툴린산 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 상기 베툴린산을 포함하는 산조인 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장 촉진용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 산조인 추출물을 식품으로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 산조인 추출물을 식품 또는 음료의 제조 시에 원료에 대하여 15 중량%, 바람직하게는 10 중량 %의 양으로 첨가할 수 있고 베툴린산은 15 중량%, 바람직하게는 10 중량 %의 양으로 첨가할 수 있다. 본 발명의 산조인 추출물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 최종 제품의 상품성과 소비자 기호도에 따라 여러가지 식품소재를 첨가할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 산조인 추출물의 제조

산조인 건조분말(베트남산, 정도물산) 50g을 70% 에탄올 수용액 3ℓ에 넣고 실온에서 2일 동안 교반시켰다. 2일 후 상기 용액을 거름종이로 여과한 후, 이 과정을 3회 반복하였다. 여과액은 감압 농축하여 에탄올을 제거한 뒤 동결 건조하여 수분을 제거하여 산조인 추출물을 수득하였다.

<실시예 2> 베툴린산의 제조

산조인 2.4 kg을 분쇄기로 분쇄하여 얻은 검체를 n-헥산(n-hexane)으로 실온에서 4회 추출한 후 헥산 추출물 281.1 g을 수득하고, 남은 잔사를 MeOH로 실온에서 4회 추출하여 메탄올 추출물을 수득하였다. 상기 메탄올 추출물에 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동량의 n-헥산을 가하여 진탕 방치하여 헥산 분획 7.4 g을 수득하였다. 이를 헥산-EtOAc 구배(gradient)의 용매로 실리카겔 컬럼크로마토그라피(Merck, 7734)를 실시하여 수득한 소분획 ZSH-15(1.1 g)에 대하여 CH₂Cl₂-MeOH 구배의 용매로 다시 실리카겔 컬럼크로마토그라피(Merck, 7729)를 실시하여 소분획 ZSH-15-156으로부터 MeOH로 재결정을 반복하여 화합물 1(11 mg)을 수득하였다. 화합물 1에 대하여 각종 분광학적 데이터를 분석한 결과, 베툴린산임을 확인하였다(화학식 1).

EI-MS m/z 456 [M⁺]

¹ H-NMR (pyridine- d ₅ , 300 MHz) δ : 0.81 (3H, s, CH₃), 1.00 (3H, s, CH₃), 1.05 (3H, s, CH₃), 1.06 (3H, s, CH₃), 1.21 (3H, s, CH₃), 1.78 (3H, s, CH₃), 2.62 (1H, td, J = 3.3, 12.9 Hz, H-16b), 3.44 (1H, t, J = 8.4 Hz, H-3), 3.52 (1H, dd, J = 6.6, 11.1 Hz, H-19), 4.76 (1H, dd, J = 1.2, 2.1 Hz, H-29a), 4.94 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-29b)

¹³ C-NMR (pyridine- d ₅ , 75.5 MHz) δ : 39.3 (C-1), 28.3(C-2), 78.1 (C-3), 39.5 (C-4), 55.9 (C-5), 18.8 (C-6), 34.8 (C-7), 41.1 (C-8), 50.9 (C-9), 37.6 (C-10), 21.2(C-11), 26.1 (C-12), 38.6 (C-13), 42.8 (C-14), 30.2 (C-15), 32.9 (C-16), 56.6 (C-17), 47.6 (C-18), 49.8 (C-19), 151.3 (C-20), 31.2 (C-21), 37.6 (C-22), 28.6 (C-23), 16.3 (C-24), 16.4 (C-25), 16.4 (C-26), 14.9 (C-27), 178.9 (C-28), 109.9 (C-29), 19.5 (C-30)

<화학식 1>

<실험예 1> 베툴린산을 이용한 성장호르몬 분비촉진 활성실험(In vitro)

상기 실시예 1에서 수득한 베툴린산이 성장호르몬 분비촉진에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<1-1> 뇌하수체 세포 배양

생후 4 내지 5 주령의 스프래그-다우리 랫트(Sprague-Dawley rat)로부터 무균 조작하에 뇌하수체를 적출하여 콜라게네이즈(collagenase, Gibco co.)와 히알루로니데이즈(hyaluronidase, Sigma co.)로 처리한 후 뇌하수체 세포(rat pituitary cell)를 분리하였다. 분리된 뇌하수체 세포를 10% 말 혈청(horse serum), 2.5% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS), 및 항생제를 함유하는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium)에 부유시킨 후 항습 조건(humidified condition, 37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다.

<1-2> 성장호르몬 분비 촉진 활성 실험

상기 <1-1>에서 분리한 뇌하수체 세포를 배양한 후에 시험액(Hank's Balanced Salts, Sigma)에 부유시켰다. 여기에 상기 <실시예 1>에서 제조한 베툴린산을 10 ㎍/㎖ 농도로 가하였으며, 비교군으로는 성장호르몬 분비의 기준 물질인 랫트 성장호르몬 분비인자(rat GRF, Bachem Co., U.S.A.)를 300nM, 500nM 및 2,000nM이 되도록 가한 후에 총 부피가 1㎖가 되도록 시험액을 가하여 37℃에서 15분간 배양하였다. 배양한 후 원심분리하여 그 상등액을 분리하였으며, 성장호르몬의 양을 측정하기 위하여 -70℃에 보관하였다.

성장호르몬의 양 측정은 쥐 성장호르몬 RIA 키트(rat GH RIA kit, Amersham, Buckinghamshire, England)를 사용하여 수행하였다. 상기 키트에서 일정한 양의 ¹²⁵I-표지 성장호르몬과 상기에서 수득한 시험액에 함유된 성장호르몬은 항 성장호르몬 항체(anti-GH antibody)에 대한 경쟁적인 반응에 의해서 각기 다른 양의 성장호르몬-항체 복합체(GH-Ab complex)를 형성하게 되고 여기에 2차 항체(second antibody)를 가하여 침전시킨 후 침전으로부터 ¹²⁵I의 방사활성도를 측정하여 표준곡선을 이용하여 해당 농도를 계산하였다. 결과는 표 1에 나타내었다.

	첨가한 농도	성장호르몬 농도 (ng/㎖)
대조군	0	6.26
비교군 (랫트 성장호르몬 분비인자)	300 nM	5.73
	500 nM	6.14
	2,000 nM	24.12
베툴린산	21.89μuM	87.28

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 베툴린산은 뇌하수체 세포에 작용하여 성장호르몬의 분비를 촉진시키며, 비교군으로 사용한 랫트 성장호르몬 분비인자보다 성장호르몬 분비촉진 효과가 뛰어남을 확인하였다.

<실험예 2> 랫트의 성장호르몬 분비촉진 활성실험(In vivo)

6주령의 SD 랫트를 펜토바비탈(pentobarbital, 한림제약) 50 ㎎/㎏ 농도로 마취시킨 후, 상기 실시예에서 수득한 베툴린산을 10 ㎍/㎏과 20 ㎍/㎏ 농도로 생리식염수에 용해시켜 랫트의 경정맥에 투여하였다. 대조군으로는 생리식염수를 투여하였다. 랫트의 꼬리 경정맥으로부터 일정 시간간격으로 채혈한 후 RIA 키트를 사용하여 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 분비된 성장호르몬을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 베툴린산을 투여한 군은 주사한 후 10～20분 사이에 성장호르몬 분비가 증가하였는데 대조군에 비해 10 ㎍/㎏은 약 6배, 20 ㎍/㎏ 약 8배 정도의 성장호르몬 농도가 증가되는 것을 확인하였다.

<제제예 1> 연질캅셀제의 제조

실시예 1에 따라 조제된 산조인 추출물 100.0mg(베툴린산의 경우 1.00mg), 콩기름 175.0mg, 황납 45.0 mg, 야자경화유 127.5mg, 대두인지질 21.0mg, 젤라틴 212.0mg, 글리세린 (비중 1.24) 50.0mg, 디-소르비톨 76.0mg, 파라옥시안식향산메칠 0.54mg, 파라옥시안식향산프로필 0.90mg, 메칠바닐린 0.56mg, 황색 203호 적량의 성분이 1 캅셀 중에 함유되도록 약전 제제총칙중 연질캅셀의 제법에 따라 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

실시예 1에 따라 조제된 산조인 추출물 100.0mg(베툴린산의 경우 1.00mg), 옥수수전분 90.0mg, 유당 175.0mg, 엘-하이드록시프로필셀룰로오스 15.0mg, 폴리비닐피롤리돈90 5.0mg 및 에탄올 적량의 원료를 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 1.8mg을 가하여 혼합한 후 1정이 400mg이 되도록 타정하였다.

<제제예 3> 캅셀제의 제조

실시예 1에 따라 조제된 산조인 추출물 100.0mg(베툴린산의 경우 1.00mg), 옥수수전분 83.2mg, 유당 175.0mg 및 스테아린산 마그네슘 1.8mg의 원료를 균질하게 혼합하여 1캅셀에 360mg이 함유되도록 충전하였다.

<제제예 4> 음료의 제조

본 발명자들은 산조인 추출물을 유효성분으로 함유하는 음료 조성물을 하기와 같이 제조하였다.

실시예 1에 따라 제조된 산조인 추출물 0.48 ∼ 1.28㎎(베툴린산의 경우 0.0048 ~ 0.0128㎎), 꿀 522㎎, 치옥토산아미드 5㎎, 니코틴산아미드 10㎎, 염산리보플라빈나트륨 3㎎, 염산피리독신 2㎎, 이노시톨 30㎎, 오르트산 50㎎ 및 물 200㎖의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

본 발명의 베툴린산은 뇌하수체 세포에 작용하여 성장호르몬의 분비를 촉진시키며, 시험관(in vitro) 뿐만 아니라 생체내(in vivo)에서도 성장호르몬을 강력하게 증가시키므로, 소인증, 왜소증, 소아의 발육부진 및 성장저하와 같은 성장 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 베툴린산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 성장 촉진용 약학적 조성물:

   <화학식 1>

   

   .
2. 제 1항에 있어서, 성장 촉진은 성장호르몬의 분비를 촉진시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 성장 촉진용 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 베툴린산은 산조인(Zizyphus jujuba Mill)으로부터 분리 및 정제되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 삭제
5. 1) 산조인(Zizyphus jujuba Mill)을 분쇄한 후 n-헥산(n-hexane)으로 추출하여 수득되는 헥산 추출물을 제거하는 단계;

   2) 단계 1에서 추출하고 남은 잔사를 메탄올로 추출하는 단계;

   3) 단계 2의 메탄올 추출물에 n-헥산을 가하여 진탕하는 단계;

   4) 단계 3에서 수득한 헥산 분획으로 크로마토그래피를 실시하는 단계; 및

   5) 단계 4로부터 수득한 분획에 메탄올로 재결정을 반복하여 베툴린산을 수득하는 단계; 및

   6) 단계 5에서 수득한 베툴린산 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 조성물에 함유시키는 단계를 포함하는 제 1항의 성장 촉진용 약학적 조성물의 제조 방법.
6. 제 5항에 있어서, 단계 4의 크로마토그래피는 헥산-에틸아세테이트를 용매로 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시한 다음, 수득한 분획을 디클로로메탄-메탄올을 용매로 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 베툴린산 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 성장 촉진용 건강식품.

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