KR19990080969A - 성장호르몬 분비자극 활성을 가지는 수용성지모 추출물 및 그로부터 분리한 성장호르몬 분비촉진 인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 성장호르몬 분비자극 활성을 가지는 지모 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 지모를 알코올로 추출한 다음 물 및 유기용매를 첨가하고 분별 추출하는 과정으로 또는 이에 더하여 고압 역상 크로마토그래피로 분획하는 과정으로 지모 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 지모 추출물은 생체내에 존재하는 성장호르몬 분비촉진 호르몬(Growth Hormone Releasing Hormone)과 유사한 성장호르몬 분비자극 활성을 가지며, 또한 오랜동안 천연약재로 사용되어 그 안전성이 확보된 것으로서 왜소증 등의 성장호르몬 결핍 질환의 치료제, 노화방지제 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

성장호르몬 분비자극 활성을 가지는 수용성 지모 추출물 및 그로부터 분리한 성장호르몬 분비촉진 인자

본 발명은 성장호르몬 분비자극 활성을 가지는 지모 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 지모를 알코올로 추출한 다음 물 및 유기용매를 첨가하고 분별 추출하는 과정으로 또는 이에 더하여 고압 역상 크로마토그래피로 분획하는 과정으로 지모 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 지모 추출물은 생체내에 존재하는 GHRH과 유사한 성장호르몬 분비자극 활성을 가지며, 또한 오랜동안 천연약재로 사용되어 그 안전성이 확보된 것으로서 왜소증 등의 성장호르몬 결핍 질환의 치료제, 노화방지제 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

성장호르몬은 사람과 동물의 뇌하수체 전엽에서 분비되는 단백질성 호르몬으로서 사람의 경우 191개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 분비가 이루어지기 위해서는 뇌하수체에 성장호르몬 분비를 촉진시키는 물질인 성장호르몬 분비촉진 호르몬에 의한 자극이 있어야 한다. 성장호르몬이 생체 내에서 하는 주된 기능은 간 등 말초조직에서 인슐린유사 성장인자(Insulin-like growth factor-I, IGF-1)를 생성케하여 인슐린유사 성장인자가 연골조직에 작용하여 성장을 자극하게 하고, 대사작용을 통해서 단백질 동화작용을 증가시킴과 동시에 지방조직으로부터 지방산의 동화를 증가시킨다. 이러한 기능으로 성장호르몬은 갑상선 호르몬, 인슐린, 부신피질 호르몬, 성 호르몬 등과 함께 개체의 성장과 발달에 주요한 영향을 미치므로 오래전부터 왜소증(矮小症) 환자들의 치료 목적으로 사용되어 왔다.

그러나 과거에 사체의 뇌하수체로부터 얻어진 성장호르몬은 투여받은 환자들에게서 크로이츠펠트-야곱병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)이란 질병을 유발시킴이 밝혀지고, 1985년 후반기에 유전자 재조합 방식의 성장호르몬이 상품화되기 시작하여 대량 생산 및 공급이 가능해지고 타 질환의 감염 위험성도 없어짐에 따라 최근에는 유전자 재조합 방식의 성장호르몬만이 성장호르몬 결핍 질환의 치료제로사용되고 있다. 유전자 재조합 방식의 성장호르몬을 체내에 투여하는 방법은 성장호르몬 자체가 거대 단백질이어서 경구투여가 불가능하여 주사기를 이용한 근육주사로 이루어 지는데, 대량 생산에도 불구하고 치료기간동안 요구되는 비용이 많을 뿐만 아니라, 근육내 주사로 투여하므로 이에 따르는 불편함이 큰 것이 사실이었다.

따라서 경구투여가 가능한 성장호르몬 분비 촉진제의 개발 필요성이 제기되었고, 처음으로 1980년에 미국 툴란(Tulane) 대학교의 바우어(C.Y. Bowers) 등이 생체내의 엔케팔린(enkephalin)을 토대로 성장호르몬 분비 활성을 갖는 6개의 아미노산으로 구성된 새로운 성장호르몬 분비 촉진제인 GHRP-6 (Growth hormone releasing peptide-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂) 를 개발하였다 (Endocrinology, 108, 31-9, 1980). 이 물질은 다른 여러 과학자들에 의해 생체 내에서와 외에서(in vivo&in vitro) 모두 성장호르몬을 분비시키는 활성이 있음이 확인되었고(Endocrinology, 116, 1432-8, 1984; Endocrinology, 117, 97-105, 1985), 비록 적은 흡수율이지만 경구 투여시에도 흡수가 되는 것으로 보고 되었다(Life Science, 47, 29-36, 1990). GHRP-6 가 개발된 이후에 계속적인 연구로 다른 펩타이드성 성장호르몬 분비 촉진제인 GHRP-1(Ala-His-D-β-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂) 과 GHRP-2 (D-Ala-D-β-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂) 이라는 6개의 변화된 펩타이드로 구성된 성장호르몬 분비 촉진제가 개발, 보고되었다. 그러나 이들은 생체내의 활성은 뛰어나지만 경구투여시 그 흡수율이 2-3% 대에 머무르는 등 경구투여에는 개선의 여지가 많은 것으로 보고되었다.

이러한 경구투여의 단점을 개선한 성장호르몬 분비 촉진제가 게르츠 등(Gertz et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 177, 1393-1397, 1993)에 의해 비펩타이드성으로 개발되었는데, 이것은 GHRP-6 의 구조를 분석하여 얻은 벤조융합 락탐(Benzo-fused lactam) 구조의 L-692, 429 라는 화합물이다. 그러나 이 화합물은 동물에서와 달리 사람에 대한 임상 실험에서 경구투여시 흡수가 그리 높지 않은 문제가 있었는데, 이를 개선하여 스피로인돌린 술폰아마이드(Spiroindoline sulfonamide) 구조의 L-163, 191 이라는 화합물이 미국 머크사에 의해 개발되었다. 이 화합물은 기존에 개발되었던 성장호르몬 분비 촉진제들의 가장 큰 문제점이었던 경구 흡수율을 높인 화합물로서 개(Beagle dog)에서 경구투여시 60% 이상의 흡수율을 나타내는 것으로 보고되었고 이를 바탕으로 임상 시험이 진행중이다(Endocrinology, 137, 5284-5289, 1996).

이와 같은 화합물은 경구용 성장호르몬 분비 촉진제가 갖추어야 할 체내에서의 흡수율과 성장호르몬만을 선택적으로 분비시키는 생물학적 활성도를 갖고 있어서 주사제형 성장호르몬제를 대체할 새로운 의약품으로 각광을 받을 수 있을 것이다. 이들 물질에 관한 연구결과들은 뇌하수체를 자극하여 성장호르몬만을 선택적으로 분비시키는 물질들이 주사제형 성장호르몬 대체제로서 임상적으로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하고 있으며, 또한 새로운 성장호르몬 분비자극제의 개발이 용이하지 않다는 것을 보여주고 있다.

사람의 체내에서 성장호르몬의 분비를 조절하는 것은 44개의 아미노산으로 구성된 GHRH 과 성장호르몬의 분비를 억제하는 소마토스타틴(Somatostatin)이라는 호르몬인데, 이들이 상호 작용을 통해 성장호르몬을 간헐적(Pulsatile) 분비라는 특이한 형태로 분비하도록 작용하는 것으로 알려져 왔다.

그런데, GHRP-6의 개발 이후 많은 연구자들에 의해 GHRP-6가 GHRH 과 동일한 수용체(Receptor)를 경유하여 효과를 나타내는 것이 아니라는 보고가 있었고, 이러한 합성 화합물인 성장호르몬 분비 촉진제들이 경유하는 새로운 수용체의 존재 가능성이 제기되었다 (Endocrinology, 114, 1573, 1984)(Endocrinology, 124, 2791, 1989). 이러한 가능성은 머크(Merk)사의 연구진에 의해 돼지와 사람의 뇌하수체, 만곡형상 복층정중(Arcuate ventro-medial) 부위 그리고 시상하부에 존재하는 성장호르몬 분비촉진제 수용체의 대조핵산(cDNA, complementary DNA)의 염기서열이 밝혀지면서 사실로 입증되었다(Science, 273, 974-977, 1996).

이러한 사실을 통해 기존에 밝혀진 성장호르몬 분비촉진 호르몬과 합성 화합물인 성장호르몬 분비촉진제 사이의 상승작용(synergism)이 입증되었으며, 체내에 존재하여 GHRP 와 같은 역할을 수행하리라 추측되는 물질의 규명에 더욱 관심이 증가되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 모델링 기술을 통하여 합성된 기존의 화합물과는 달리 오래 전부터 사용되어져 그 약효와 안전성이 입증된 천연 약재로부터 성장호르몬을 분비시키는 화합물을 검색하게 되었고, 그 결과로 성장호르몬을 분비시키는 복합 생약제제를 대한민국 특허출원 제96-7402 호로 출원하였고, 단일 약초인 감초(Glycyrrhiza uralensisFisher)로 부터 글라브로사이드(Glabroside)를 분리하고 이 물질이 성장호르몬 분비촉진 기능을 갖고 있는 것을 확인하여 대한민국 특허출원 제 97-12797 호로 출원한 바 있다.

또한 본 발명자들은 천연물질을 대상으로 새로운 성장호르몬 분비자극인자를 개발하기 위하여 연구를 계속하던 중, 성장호르몬 분비촉진 기능을 갖고 있는 또다른 생약제인 지모(Anemarrhena asphodeloidesBunge)를 검색하여 유기용매를 이용한 층분할 방법으로 또는 이에 더하여 고압 역상 크로마토그래피로 분획하는 과정으로 지모 추출물을 제조하고 그 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 성장호르몬 분비촉진 활성을 가지며 천연물질에서 분리되어 그 안전성이 확보된 성장호르몬 결핍질환 치료제, 노화방지제 등으로 사용될 수 있는 지모 추출물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

도 1은 지모(Anemarrhena asphodeloidesBunge)의 메탄올 추출물 1㎖를 실험용 흰 쥐(Sprague-Dawley rat)의 정맥 내로 투여하고 동맥에서 일정 시간별로 채혈하여 혈중 성장호르몬 분비의 변화 양상을 방사선면역측정법(radioimmunoassay, 이하 'RIA'로 약칭함)으로 확인하고 양성 대조인 성장호르몬 분비촉진 호르몬(Growth Hormone Releasing Hormone, 이하 'GHRH'로 약칭함)과 비교하여 나타낸 것이고,

도 2는 지모의 메탄올 추출물을 노말헥산(n-Hexane), 메틸렌클로라이드(Methylene Chloride), 에틸아세테이트(Ethyl Acetate)의 순서로 층 분할을 유도한 뒤 남은 수용액 층의 성분을 역상 고압 크로마토그래피를 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 3은 수용성 지모추출물의 성분중 성장호르몬 분비촉진 능력이 높은 분획을 아세토니트릴로 용출하여 모으고 이를 다시 동일한 역상 고압 크로마토그래피를 이용하여 메탄올로 용출한 결과를 나타낸 것이고,

도 4는 메탄올 용출을 통하여 분리하고 수집한 활성 피크를 분석용 프로틴알피(protein-RP) 역상 고압 크로마토그래피로 순도를 분석하여 나타낸 것이고,

도 5a는 지모로부터 분리된 성장호르몬 분비촉진 기능이 있는 피크를 실험용 흰 쥐(Sprague-Dawley rat)의 정맥 내에 15 ㎍/㎖/rat의 농도로 투여하고 시간별로 동맥혈을 취하여 성장호르몬 분비 변화를 RIA 를 통해 확인한 것이고,

도 5b는 실험용 흰 쥐(Sprague-Dawley rat)의 정맥 내에 GHRH (1 ㎍/㎖/rat)를 투여하고 시간별로 동맥혈을 취하여 성장호르몬 분비 변화를 RIA 를 통해 확인한 것이고,

도 6은 본 발명에 따른 지모의 최종 정제 피크를 쥐의 뇌하수체 세포 배양액에 처리하였을 때 농도에 따른 성장호르몬 분비 경향을 GHRH 와 비교, 정량화하여 나타낸 것이다.

1 : 대조군 - HBSS + 25mM HEPES, GHRH - 1μM, 지모 - 452㎎/㎖ ;

2 : GHRH - 500nM, 지모 - 226㎎/㎖ ;

3 : GHRH - 250nM, 지모 - 90㎎/㎖ ;

4 : GHRH - 125nM, 지모 - 18㎎/㎖ ;

5 : GHRH - 62.5nM, 지모 - 9㎎/㎖ ;

상기 목적을 달성하기 위하여, 지모를 알코올로 추출한 다음 물 및 유기용매를 첨가하고 분별 추출하는 과정으로 얻은 성장호르몬 분비자극 활성을 가지는 지모 추출물 및 상기 과정에 더하여 역상 고압 크로마토그래피로 분획한 지모 추출물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 지모 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 지모 추출물을 유효성분으로 하여 성장호르몬 결핍질환 치료제 등으로 이용되는 약제학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 지모를 알코올로 추출한 다음 물 및 유기용매를 첨가하고 분별 추출하는 과정으로 얻은 성장호르몬 분비자극 활성을 가지는 수용성 지모 추출물을 제공한다.

이 때 알코올은 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하고 메탄올을 이용하는 것은 더욱 바람직하다. 유기용매로는 노말헥산, 메틸클로라이드, 에틸아세테이트 군중에서 선택되는 하나 이상을 이용한다.

구체적으로 본 발명에서는 일반 한약방에서 구입한 지모를 과량의 메탄올에 담가 1주일 이상 실온에 방치하면서 간헐적으로 교반시킨다. 상기 과정으로 얻어진 메탄올 추출물을 감압하 40℃에서 증발시켜 침전물이 형성될 때까지 농축하고, 농축된 메탄올 추출물은 분별깔때기에서 3회에 걸쳐 노말헥산으로 추출한 다음 추출되고 남은 메탄올 층에 메틸렌클로라이드를 동량 첨가한 뒤 층이 형성될 때까지 증류수를 조금씩 첨가한다. 이와같이 3회에 걸쳐 메틸렌클로라이드로 추출한 뒤 남은 메탄올 층은 감압하 40℃에서 증발시켜 메탄올을 모두 제거하고 100% 수용액으로 재구성하고, 재구성된 수용액 층은 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 이용하여 다른 용매와 동일한 방법으로 용매 추출을 실시한다. 상기와 같은 용매 추출과정을 통해 천연물내의 성분중 비수용성인 물질과 천연 색소들을 제거한다.

또한, 본 발명에서는 상기 과정에 더하여 역상 고압 크로마토그래피를 실시하여 분획한 지모 추출물을 제공한다.

상기의 용매 추출 과정을 마치고 최종적으로 얻어진 수용액 층은 역상 고압 크로마토그래피로 분획하여 정제함으로써 성장호르몬 분비촉진 활성이 가장 우수한 활성 피크를 검출하고 이를 분리하여 지모 추출물을 얻는다.

이 때 역상 고압 크로마토그래피의 용출용매로는 아세토니트릴, 메탄올 등을 사용할 수 있고, 용출용매로 아세토니트릴을 사용하는 경우에는 20% 아세토니트릴 및 20-100% 아세토니트릴 선형구배을 이용하는 것이 바람직하고, 20% 아세토니트릴을 사용하여 5-15분간 용출시키고 이어서 20-100% 아세토니트릴 선형구배를 사용하여 35-60분간 용출시키는 것이 바람직하다. 용출용매로 메탄올을 사용하는 경우에는 70-100% 메탄올 선형구배를 이용하여 20-45분간 용출시키는 것이 바람직하다.

구체적으로 본 발명에서는 상기 수용성 지모 추출물을 칼럼에 가하고 처음 10분간 20% 아세토니트릴을 이용하여 용출시키고 이어 40분간 용출용매가 최종 100%가 되도록 선형 농도구배를 이루어 분당 4ml의 속도로 용출시킨다. 그 중 가장 성장호르몬 분비촉진 활성이 높은 것으로 나타난 피크를 집중 수집하고 유기용매를 증발시킨 뒤 수용액 상태의 피크를 다시 동일한 역상 고압 칼럼에서 메탄올을 용출용매로 사용하여 분획한다. 이 때 용출 조건은 70% 메탄올을 함유하는 완충액으로 평형되어진 칼럼에 시료를 가하고 30분간 완충액이 100%가 되도록 선형 농도구배를 이루어 용출을 반복 실시하며, 그 결과 모아진 시료를 분석용 역상 고압 칼럼으로 분석하여 도 4에 나타난 바와 같은 순수한 단일 피크가 분리됨을 확인하였다.

본 발명의 수용성 지모 추출물 및 활성 피크의 성장호르몬 분비촉진 활성을 확인하기 위하여 시험관 내·외 실험을 수행한다.

그 결과, 지모 추출물은 배양된 쥐의 뇌하수체 세포에 처리했을 때와 쥐의 혈류 내로 직접 주입하여 처리하였을 때 모두 성장호르몬 분비 유도 활성을 나타내었다.

또한 본 발명은 상기 지모 추출물을 유효성분으로 하여 성장호르몬 결핍질환 치료제로 이용되는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 추출물이 치료용 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 오래전부터 사용되어온 생약재인 지모로부터 분리되어 독성 및 부작용이 없고 안전성이 확보된 것으로서, 화학물질의 사용시에 수반되는 여러 가지 독성과 생리조절 기능의 부조화 등의 문제점이 발생할 염려가 없는 이점이 있다.

또한 본 발명은 상기 지모 추출물을 노화억제나 성장촉진을 위한 음료 또는 음료 첨가물 및 식품 또는 식품 첨가물로 사용하는 용도를 제공한다.

또한 본 발명의 추출물은 성장호르몬 분비 관련 작용 메카니즘 연구나 효능기/억제기 연구 및 구조분석용 시료로서 사용될 수 있으며 노화억제 화장품의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이하 실시예에서 사용되는 %는 별도의 언급이 없는 경우 고체/고체는 중량/중량 %, 고체/액체는 중량/부피% 그리고 액체/액체는 부피/부피%를 각각 나타낸다.

〈실시예 1〉유기용매를 이용한 지모의 분별추출

일반 한약재 판매소에서 구입한 건조 상태의 국내산 지모 200g 을 메탄올 5리터에 담가 간헐적으로 교반하면서 1주일간 상온에서 방치하였다. 이렇게 얻은 베탄올 지모 추출물을 감압하 40℃에서 증발시켜 흰색의 침전물이 형성될 때까지 농축하였다. 농축된 추출물은 마이크로 필터(Glass MicroFibre, Whatman사)로 걸러 침전물을 제거하였다. 걸러진 추출물을 이용하여 첫번째로 노말헥산으로 분별 추출을 시작하였다. 추출물과 노말헥산을 동량 첨가한 뒤 흔들어서 충분히 섞어주고 스텐드에 세워서 자연적으로 층이 분리되도록 방치하였다. 이와 같은 과정을 3회 반복하여 메탄올 층만을 모았다. 다음으로 메틸렌클로라이드 용매를 메탄올 추출물 층에 첨가한 뒤 증류수를 조금씩 가하여 맑은 상태의 두 용매가 깨끗이 층 분리가 되도록 하였다. 이 때 메탄올 층은 약 80%의 메탄올 농도를 유지하였다. 메틸렌클로라이드를 이용하여 동일한 과정을 3회 반복한 뒤 메탄올 층만을 모아 감압하 40℃에서 증발시켜 메탄올을 모두 제거하고 동량의 증류수를 첨가하여 100% 수용액으로 재구성하였다. 여기에 동량의 에틸아세테이트 용매를 첨가하고 잘 섞어준 뒤 다른 용매에서와 마찬가지로 3회에 걸쳐 층 분리를 유도하고 수용액 층만을 모았다. 모아진 지모의 수용액 층은 동결건조를 통하여 분말 상태로 제조하였다.

〈실시예 2〉역상 고압 크로마토그래피를 이용한 분획

상기 실시예 1의 유기용매를 이용한 분별추출을 통해 최종적으로 모아진 파우더 형태의 지모 추출물을 증류수에 녹여 역상 고압 크로마토그래피에 적용하여 순수한 성분의 분리를 시도하였다.

정제를 위한 역상 고압 칼럼 크로마토그래피는 일본 YMC 사의 단백질-PR (Protein-PR) 칼럼(4.6×25cm) 을 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, 이하 "HPLC"로 약칭함)에 장착하여 실시하였다.

칼럼의 용출을 위한 완충액으로는 0.1% 트리플루오로아세트산( Trifluoroacetic acid, TFA) 이 첨가된 증류수를 A완충액으로 사용하였고, 0.1% 트리플루오로아세트산이 첨가된 아세토니트릴을 B완충액으로 사용하여 분당 4ml의 유속으로 용출시키고 217nm 와 230nm 에서 비교하여 검출하였다.

용출조건은 시료를 칼럼에 가하고 처음 10분간 20% B 완충액으로 용출시키고 이어 40분간 B 완충액이 최종 100%가 되도록 선형 농도구배를 이루어 분당 4ml의 속도로 용출시켰다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 *로 표시된 피크가 대한민국 특허출원 제 96-7402 호에 기재된 방법에 따라 실시한 쥐 뇌하수체 세포배양을 통한 성장호르몬 분비 촉진실험에서 가장 활성이 높은 것으로 나타나 집중 수집하였다. 수집되어진 피크는 감압하에서 유기용매를 증발시킨 뒤 남은 수용액은 동결건조기를 이용하여 건조시켰다. 건조가 끝난 분말 상태의 피크는 증류수에 녹여 다시 동일한 역상 고압 칼럼에서 분리를 시도하였다. 이 때, 용출 조건은 A 완충액은 0.1% 트리플루오로아세트산이 첨가된 증류수를 사용하였고 B 완충액은 0.1% 트리플루오로아세트산이 첨가된 100% 메탄올을 사용하였다. 용출시 완충액의 농도구배는 70% B 완충액으로 평형되어진 칼럼에 시료를 가하고 30분간 B 완충액이 100%가 되도록 선형 농도구배를 이루어 도 3에서와 같은 피크를 얻고 동일한 방법으로 용출을 반복 실시하였다. 모아진 시료는 분석용 역상 고압 칼럼으로 분석한 결과 도 4에 나타난 바와 같은 순수한 단일 피크를 분리하였다.

〈실시예 3〉순수 분리된 활성 피크의 생체 내· 외 실험

상기 실시예 2에서 역상 고압 크로마토그래피를 실시하여 분리한 활성분획의 기능을 검증하기 위해서 대한민국 특허출원 제 96-7402 호에 기재된 방법에 따라 생체 외 실험(In vitrotest)을 실시하였다.

약 200g 의 몸무게가 나가는 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 흰 쥐로부터 뇌하수체를 얻은 뒤 이를 수술용 칼로 1mm³의 입방체가 될 때까지 자른 뒤, 이를 모아 히알루로니다아제(Hyaluronidase, typeⅢ)와 콜라그네이즈(Collagenase, typeⅣ)가 각각 0.2% 씩 들어있는 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)에 넣은 뒤 37℃ 항온수조에서 15분간 방치후 꺼내어 5분간 진탕하여 단일 세포로 흩어지도록 하였다. 진탕 후 3분간 실온에 방치하여 상등액을 모으고, 가라앉은 알갱이들은 수거하여 효소가 첨가된 새로운 HBSS에 넣어 다시 한 번 과정을 반복하였다. 여기에서 모아진 상등액과 전에 모았던 상등액을 함께 원심분리를 수행하여 효소가 첨가된 HBSS를 제거하고 가라앉은 세포만을 모은 뒤, 여기에 배양용 배지(DMEM)를 넣어 섞고 이를 다시 미세한 망(cell stainer)에 통과시켜 단일세포만을 모아 37℃ CO₂항온기에서 2일간 배양하였다.

배양 후 3일째 되는 날에 세포를 1.2×10⁵개가 되도록 원심분리 튜브에 모은 뒤 여기에 25mM 농도의 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-e-에탄술폰산 (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-e-ethanesulfonic acid, HEPES) 완충제가 첨가된 HBSS에 녹아있던 시료를 1ml씩 가하여 15분간 37℃ 항온 수조에서 배양하였다. 배양 후 원심분리를 통하여 세포를 제거하고 상등액만을 모아 배지 내로 분비된 성장호르몬의 양을 방사선면역 측정법으로 측정하였다.

도 6은 지모로부터 최종 분리되어진 활성 피크를 상기와 같은 방식으로 쥐의 뇌하수체 세포에 처리하였을 때 농도에 따른 성장호르몬 분비의 변화를 양성대조인 GHRH와 비교하여 나타낸 것이다.

생체 내 실험(In vivotest)을 위해서는 무게 약 250g 정도의 흰 쥐의 대퇴정맥과 동맥에 각각 관을 삽입한 뒤, 정맥 내로 멸균된 생리식염수에 15㎍/㎖의 농도로 녹아 있던 최종 분리된 지모 정제물을 1㎖ 가하고 일정 시간대별로 동맥으로부터 혈액을 취하여 혈액 내로 분비된 성장호르몬의 변화 양상을 방사선 면역측정법으로 확인하였다. 그 결과 도 5에 나타난 바와 같이 양성대조인 GHRH와 유사한 분비 형태를 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따르면 성장호르몬 분비촉진 활성을 갖는 지모 추출물을 간단하게 제조할 수 있으며, 이를 통해 얻어진 추출물은 배양된 쥐의 뇌하수체 세포에 처리했을 때와 쥐의 혈류 내로 직접 주입하여 처리하였을 때 모두 성장호르몬 분비 유도 활성을 나타내었다. 이러한 결과에 의하여 상기 지모 추출물은 향후 성장호르몬 결핍성 질환의 치료제나 성장호르몬 분비관련 작용 기전의 연구 및 성장호르몬 분비를 유도하는 새로운 물질의 합성과 연구에 구조적인 정보를 제공할 수 있으며, 성장호르몬 분비 촉진을 목적으로 하는 드링크류나 화장품류 등의 제조에도 포괄적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 지모 추출물을 유효성분으로 하는 약제학적 조성물은 오랜동안 생약재로 사용되어온 지모로부터 분리되어 독성 및 부작용이 없고 안전성이 확보된 것으로서, 화학물질의 사용시에 수반되는 여러 가지 독성과 생리조절 기능의 부조화 등의 문제점이 발생할 염려가 없는 이점이 있다.

Claims (8)

1. 지모를 알코올로 추출한 다음 물 및 유기용매를 첨가하고 분별 추출하는 과정으로 얻은 성장호르몬 분비자극 활성을 가지는 지모 추출물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 과정에 더하여 고압 역상 크로마토그래피를 실시하여 분획한 성장호르몬 분비자극 활성을 가지는 지모 추출물.
3. 제 1 항에 있어서, 알코올은 메탄올인 것을 특징으로 하는 지모 추출물.
4. 제 1 항에 있어서, 유기용매는 노말헥산, 메틸클로하이드, 에틸아세테이트 군중에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 지모 추출물.
5. 제 2 항에 있어서, 역상 고압 크로마토그래피의 용출용매로 아세토니트릴 또는 메탄올을 사용하는 것을 특징으로 하는 지모 추출물.
6. 제 5 항에 있어서, 역상 고압 크로마토그래피 단계에서 용출용매로 20% 아세토니트릴을 사용하여 5-15분간 용출시키고 이어서 20-100% 아세토니트릴 선형구배를 사용하여 35-60분간 용출시키는 것을 특징으로 하는 지모 추출물.
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 역상 고압 크로마토그래피 단계에서 용출용매로 70-100% 메탄올 선형구배를 이용하여 20-45분간 용출시키는 것을 특징으로 하는 지모 추출물.
8. 제 1 항의 지모 추출물을 유효성분으로 하는 성장호르몬 결핍 질환 치료용 약제학적 조성물.