CN107586327A - 虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调节剂，其基因cDNA序列全长约1856 bp，开放阅读框996 bp，编码331个氨基酸，5’非翻译区334 bp，3’非翻译区526 bp，前体蛋白预测相对分子质量38.7kDa，等电点9.09。制备得到的虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，可准确快速的调控虎斑乌贼的生殖活动，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖。

Description

虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂

技术领域

本发明涉及神经肽技术领域，本发明具体是一种虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂。

背景技术

头足类（Cephalopoda）属于软体动物门头足纲，广泛分布在各个海域，在生物的系统演化的过程中占有重要地位。其肉质鲜美可口，肌肉含有相当丰富的营养物质，尤其是蛋白含量非常高。除了可以被食用外，更重要的是还具有重要的研究价值，其墨囊可以促进血液凝固且还含有抗菌成分，海螵蛸可以用作医学药材，耳石可以用来分析物种存在的年轮和海洋环境随时间和空间的变化特点。另外头足类还是海洋生态系统中重要的生物因子，在生态系统食物链中作为捕食者和被捕食者，对维持海洋生态系统的稳定具有重要的作用。

神经肽是广泛存在于动物体内的小分子多肽，由神经组织分泌，具有调节神经活动、机体生长、发育等各种生理功能，神经肽同时还能充当生长因子、营养因子等信息分子。神经肽是一类比较古老的信息分子，真菌乃至细菌体内都存在神经肽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，可准确快速的调控虎斑乌贼的生殖活动，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，其特征在于包括虎斑乌贼神经肽FMRFamide，所述神经肽FMRFamide基因cDNA序列全长约1856 bp，开放阅读框996 bp，编码331个氨基酸，5’非翻译区334 bp，3’非翻译区526 bp，前体蛋白预测相对分子质量38.7kDa，等电点9.09。

神经肽FMRFamide生殖调控剂的制备方法包括总RNA提取、cDNA第一链的合成、虎斑乌贼FMRFamide基因核心序列片段的简并引物合成、虎斑乌贼FMRFamide核心序列的扩增、RACE获得FMRFamide基因cDNA的全长和序列信息分析。

总RNA提取：在虎斑乌贼脑组织中加入质量体积比为0.05~0.07mg：1μL Trizol，匀浆，补加等体积的Trizol，轻轻摇晃后静置；加入氯仿，剧烈震荡后静置，高速离心，取最上层的上清液；加入异丙醇摇匀，静置，离心，除去上清液，保留沉淀；加入70~80%的乙醇，用枪头吹吸沉淀，高速离心，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；室温静置15~25分钟待RNA呈半干的透明状态，用DEPC水溶解后，得到虎斑乌贼总RNA液。

cDNA第一链的合成为：将虎斑乌贼总RNA液点样到1%的琼脂糖凝胶上跑胶，并在UVP紫外凝胶成像仪中呈像，进一步经紫外分光光度计测定其A260/A280值在1.8-2.0之间，可作为模板进一步用于cDNA第一链合成；使用Takara公司生产的M-MLV（Rnase H^-）反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成实验。

虎斑乌贼FMRFamide基因核心序列片段的简并引物合成：将合成的cDNA置于-30~-15℃保存备用；根据NCBI数据库中获得已报道的软体动物物种FMRFamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，合成了多对用来克隆虎斑乌贼FMRFamide基因核心序列片段的简并引物：FMRF-F：GCTGAAGATGAACTGGAAGAG；FMRF-R：CAAAWAACTGAATGWCGCAGG；FMRF-5'outer：GATGTCTCTAGCTTGCTTCC；FMRF-5'inner：GATGGAGCCGCACACACAGAC；FMRF-3'outer：GAAACCCTGAGGACCAAGAAGCTGACAA；FMRF-3'inner：GGCGGTGAAGACGATGACGTGAACT；M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC；5’RACEAdapter ：GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG；5’RACEOuterPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA；5’RACEInnerPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGA；3’RACEAdapter ：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；3’RACEOuterPrimer：GCGGATCCGAATTAATACGACT；3’RACEInnerPrimer：GCGAGCACAGAATTAATACGACT。

虎斑乌贼FMRFamide核心序列的扩增：以虎斑乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物FMRFamide-F和FMRFamide-R进行FMRFamide基因核心片段的PCR扩增；PCR反应程序为：94℃5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 8min；电泳检查产物，用QIAGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后，将其与pMD18-T载体相连接，转化至E.coli5α感受态细胞中，进行PCR检测后，将阳性克隆产物进行测序。

RACE获得FMRFamide基因cDNA的全长：利用目的基因已知序列设计分别用于FMRFamide基因3’端RACE和5’端RACE扩增的特异性引物3’ FMRFamide-outter、3’-FMRFamide-inner和5’-FMRFamide-outter、5’-FMRFamide-inner，对FMRFamide的3’端、5’端和核心片段序列进行拼接，获得虎斑乌贼FMRFamide基因的cDNA全长序列。

神经肽FMRFamide基因克隆和序列分析：对FMRFamide基因进行开放阅读框（ORF）预测，以及推测该ORF所编码的氨基酸序列，对氨基酸序列进行信号肽预测，对FMRFamide及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析。通过对前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现FMRFamide前体蛋白的N端含有一段长36个氨基酸的信号肽。前体蛋白有一段长36 AA的信号肽，通过氨基酸序列分析还发现它编码4种多肽产物：FMRFamide、FLRFamide、FIRFamide,、ALSGDAFLRFamide。将虎斑乌贼FMRFamide氨基酸序列同其他44种动物的FMRFamide序列进行比对并构建基于NJ法系统发育树，统进化表明，虎斑乌贼同曼氏无针乌贼和商乌贼位于同一个进化分支，氨基酸同源性均高达97%，亲缘关系最近，这可能因为生活环境相同，食性相似，且他们在海区的分布交流频繁，长期环境条件的作用使得它们在系统发育进化中处于相同的进化地位；另外，虎斑乌贼与加州鱿鱼、枪乌贼、南方微鳍乌贼聚为一支，氨基酸序列同源性较高，由此推测这几种头足类的FMRFamide神经肽可能来源于共同的祖先；其次虎斑乌贼与其他软体动物贻贝、海蜗牛、静水椎实螺等聚类，最后与果蝇分属于不同的进化支，该进化关系与传统的分类法一致。

FMRFamide基因cDNA全长为：

AGAACAAGGAGAAGATCCCACGTTCCAATCAACGCAAAGGCGAAGAGCACACAGCTAAAAGCAACAACAACAAACAATCATTCCCCCATAAATAAAAAAAGGCTGATTCATTGGACTGAAGAGAAAACAACGCACGTTGGTGCCTTGTTGTTTTCCTCTTGCTCGTAGTTCTCAGCGTGTACCTTCGTATCTTTTTGTCTGTGTGTGCGGCTCCATCACCGTACCCCGTCTTTGCTAGTGTCCCCTACCTCTGTAGTCGGACCTAAGTCATCTTGTTCCTGTAGGAGCGCCCATTTACCCTTGGCAGATTTAGAAAGAATAACGGGACCCCGTGATGCGTTGTTGGAGTCCCTGTAGCCTACTTGTCGTCATCGCCATCTACTGTCTCTCTTCGCATACGTCTGAAGCCTTTGATTTGGCCCAGGCATGCGTCGAGTCTCAGCGAATGAGTCTTCTTCCGATTTGTGATACAATCTTTGCTGTACAGCAAGAAGGAGCTCAGCAAAGTGCGGATGATGGACTGAGAAGCAAACGTTTCATACGCTTTGGAAGAGCCCTGTCAGGAGATGCTTTCTTGCGTTTTGGGAAAAATGTACCAGACCTTCCTTTCGAAGATAAAAGATTCCTTCGATTTGGACGAGCAGCTCCTCAGTTGGATGACTTGCTCAAACAAGCCCTGCAGAGAGTTGAAAGCTTGCAAAAGGCCGACGACACCAGTGTTCGACGAAAGCGATCCACAGACGCCGCTCCCCCAAAGCAAACAGATAGTGCTGAACAGAAAAACGATAGCGCAAAAATCACAAAAAGATACGTCGATGACGTCGAAGATTCTGATGTGAAGAGATTCATGCGCTTCGGTAAGAGATTTATGCGTTTTGGCCGTAACCCGAGCGATGTTGGCAACAAACTGAACGAAAAGCGATTCATGAGATTTGGACGTGATCCCGAAAAAAGGTTCATGCGTTTTGGCAAATCAGATGACAAGAGGTTCATGAGATTCGGTCGAAACCCCGGCGATGCTGAAGATGAACTGGAAGAGGATAAACGTTTTATGAGATTCGGACGTGGAGACGAAGAGGATGAGGAAGAAGCCGAAAAACGATTTATGAGATTTGGACGTGACCCTGAAAAGAAATTCATGAGATTTGGGAAGAACGGCGAAGAAAAGAGGTTCATGCGCTTTGGTCGAAACCCTGAGGACCAAGAAGCTGACAAGAGATTTATGAGATTTGGACGCGGCGGTGAAGACGATGACGTGAACTCAGAGGAAAAACGTTTTATGAGATTTGGTCGATCTGCAGAAAAATGCAAAGGATGTCTGGAAGGTTAATGGCTGATGTCTCTAGCTTGCTTCCTTCTTTGGCTGAACAGAGACAAAAAGAAATACAAAATAAAAGCTTCTGATTAAATACTTTACATTTTACAAAAATGTAATTCAGT。

与现有技术相比，本发明的优点在于：首次克隆了虎斑乌贼FMRFamide的神经肽基因cDNA序列全长。对上述基因的开放阅读框进行前体蛋白预测，分析其结构与特征，并对其序列进行了同源比对分析和进化树的构建。制备得到的虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，可准确快速的调控虎斑乌贼的生殖活动，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖。

附图说明

图1为FMRFamide基因PCR电泳图；

图2为3 ′RACE扩增电泳条带图；

图3为5′RACE扩增电泳条带图；

图4为虎斑乌贼FMRFamide基因cDNA氨基酸序列图；

图5为FMRFamide基因氨基酸序列同源比对图；

图6为基于FMRFamide同源氨基酸序列构建的NJ系统进化树。

附图标记说明：图4中，预测的氨基酸序列显示在碱基序列下方，推测的信号肽序列用黑色下划线标出，预测的FMRFamide成熟肽用虚线下划线及方框标出，基本剪切位点用六边形框标示，C-端酰胺化的甘氨酸用圆形框标示。预测的起始密码子（ATG）、终止密码子（TAA）；图5中，相同氨基酸残基用黑色标出，保守氨基酸残基用灰色标出。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

神经肽FMRFamide生殖调控剂的制备方法：

①RNA提取准备工作：提RNA过程中所使用的镊子、剪刀于烘箱中 180℃烘烤 4h以上。不能置于烘箱烘烤的枪头、电动匀浆器转头和离心管等实验器材均在配好的0.1% DEPC水中浸泡过夜以确保无RNAase，取出后在高压灭菌条件下 30min，用烘箱烘干备用。

②总RNA提取：取干净的1.5ml离心管(RNAase free)，用无RNAase枪头加入 500μLTrizol（4℃），用 DEPC 处理过的镊子夹取约 30mg 脑组织样品浸入 Trizol，使用电动匀浆器匀浆 30s，补加500μL Trizol；轻轻摇晃离心管，使组织充分溶解到Trizol中，室温静置5分钟；在离心管中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置5分钟；4℃、12000 rpm离心 15min；离心后，离心管内分为3层，取最上层的上清液于新离心管中；向离心管中加500μL的异丙醇，摇匀，室温静置10分钟；离心机中4℃、12000 rpm离心10分钟；离心后，除去上清液，保留沉淀；加入1ml的75%的乙醇，用枪头吹吸沉淀；离心机中4℃、7500 rpm离心5分钟，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；室温静置约20分钟待RNA呈半干的透明状态，用DEPC水溶解后备用（按析出沉淀质量大小加入适量的DEPC水）；取3μL的RNA液将其点样到1%的琼脂糖凝胶上，在200v，150mA的电泳仪下跑胶约15分钟，取出胶在UVP紫外凝胶成像仪中分析RNA条带情况。虎斑乌贼总RNA在UVP紫外凝胶成像仪中呈现的图像如图1所示，28s存在一定降解，但不影响后续实验。进一步经过紫外分光光度计测定，A260/A280值在1.8-2.0之间，可作为模板进一步用于cDNA第一链合成。

③cDNA第一链的合成：使用Takara公司生产的M-MLV（Rnase H^-）反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成实验，具体操作步骤如下：脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成实验，具体操作步骤如下：

0.2ml离心管中加入以下反应体系：

总RNA 5.0μL

Oligo DT 1.0μL

混匀反应体系，离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育10min后立刻冰上静置2min；

在上述离心管中加入以下反应体系：

5×M-MLV Buffer 2.0μL

dNTP Mixture(10mM) 0.5μL

RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.25μL

M-MLV RTase(200U/μL) 0.25μL

DEPC处理水 1.0μL

混匀反应体系，离心，将离心管置于PCR仪内，42℃ 孵育1h，70℃ 孵育15min后，迅速冰上静置15min；将合成的cDNA置于-20℃冰箱保存备用。

④虎斑乌贼FMRFamide核心序列的扩增：根据NCBI数据库中获得已报道的软体动物物种FMRFamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，合成了多对用来克隆虎斑乌贼FMRFamide基因核心序列片段的简并引物。5’RACE和3’RACE引物是通过已获得的核心片段序列，使用primer 5软件搜索设计。克隆所需引物信息见表1：

表1 FMRFamide基因克隆所需引物

Table 1 Primers used in GnRH gene clone

以虎斑乌贼脑组织cDNA作为模板，利用简并引物FMRFamide-F和FMRFamide-R进行FMRFamide基因核心片段的PCR扩增。反应体系如下：

灭菌水 15.5μL

10×PCR buffer 2.5μL

MgCl₂(25mM) 2.5μL

dNTP(10mM) 1.0μL

FMRFamide-F 1.0μL

FMRFamide-R 1.0μL

脑组织cDNA 1.0μL

Taq酶 0.5μL

四氯扁桃酸 0.2μL

肉桂酸甲酯 0.3μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 8min。电泳检测产物。用QIAGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后，将其与pMD18-T载体相连接，转化至E.coli5α感受态细胞中，进行PCR检测。所加入的四氯扁桃酸、肉桂酸甲酯与10×PCR buffer具有协同作用，不仅能够提高Taq聚合酶的催化活性，且能够提高DNA合成时的保真性，降低错配率，进而提高了FMRFamide基因核心片段得率。如图1所示，获得的FMRFamide基因核心序列长度为1470bp，与预期大小一致，将阳性克隆产物送至上海英骏公司进行测序。

⑤RACE获得FMRFamide基因cDNA的全长：

1. 3’端RACE模板cDNA制备：

利用目的基因已知序列设计用于FMRFamide基因3’端RACE扩增的特异性引物3’FMRFamide-outter和3’-FMRFamide-inner（见表1）。以3’- FMRFamide -outter和Clontech公司生产的SMART^TM RACE cDNA Amplification kit试剂盒中自带的3’RACE Outer Primer和3’- FMRFamide -inner为引物。以虎斑乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增3’RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR第一轮反应，对FMRFamide基因3’端RACE片段进行扩增。实验操作根据试剂盒提供说明书进行，反应体系为；

1）0.2ml离心管中加入以下反应体系：

脑组织总RNA 1μg

3’RACE Adapter 1μL

DEPC处理水 补至5μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育2min后，快速移至冰上静置2min；

2）向第一步1）中的反应液中加入以下反应体系：

5×第一链缓冲液 2.0μL

dNTP(10mM) 1.0μL

DTT 1.0μL

PowerScript Reverse Transcriptase 1.0μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃ 2min；94℃ 5s，66℃ 10s，72℃ 3min，20个循环；72℃延伸5min；

3）将第一轮1）中扩增产物用作此轮模板。反应体系如下：

0.2ml离心管中加入以下反应体系：

灭菌水 29.1μL

10×Advantage 2PCR缓冲液 4.0μL

dNTP(10mM) 0.8μL

50×Advantage 2Polymerase Mix 0.8μL

3’RACE cDNA 2.5μL

3’ FMRFamide-outter 5.0μL

3' RACE Outer Primer 1.0μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为： 94℃ 2min；94℃ 5s，65℃ 12s，72℃ 3min，20个循环；72℃ 6min。电泳检测产物。

将第二轮反应产物进行切胶回收、克隆。用已测得的虎斑乌贼FMRF的cDNA核心序列设计特异性引物来扩增3′端非编码区序列，扩增产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图2所示，3′RACE产物为619bp条带。将阳性克隆送至上海生工测序。

2. 5′端RACE模板cDNA制备：

利用目的基因已知序列设计用于FMRFamide基因5’端RACE扩增的特异性引物5’-FMRFamide-outter和5’-FMRFamide-inner（表1）。以虎斑乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增5’RACE片段所需的模板cDNA。以5’-FMRFamide-outter/5’-FMRFamide-inner和Clontech公司生产的SMART^TM RACE cDNA Amplification kit试剂盒中自带的5’RACE OuterPrimer/5’RACE Inner Primer为引物，以5’端RACE模板cDNA为模板，进行FMRFamide基因5’端RACE片段扩增。

1）巢式PCR第一轮反应。0.2ml离心管中加入以下反应体系：

灭菌水 31.5μL

10×PCR buffer 5.0μL

MgCl₂(25mM) 3.0μL

dNTP(10mM) 1.0μL

5’RACE Outer Primer 2.0μL

5’-FMRFamide-outter 2.0μL

加尾cDNA 5.0μL

Taq酶 0.5μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为： 94℃ 2min；94℃ 30s，62℃ 35s，72℃ 45s，32个循环；72℃ 8min；

2）将第一轮1）中扩增产物用作此轮模板。第二轮反应体系如下：

灭菌水 31.5μL

10×PCR buffer 5.0μL

MgCl₂(25mM) 3.0μL

dNTP(10mM) 1.0μL

5’RACE Inner Primer 1.0μL

5’-FMRFamide-inner 1.0μL

第一轮PCR产物 5.0μL

Taq酶 0.5μL

混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸8min。电泳检测产物。

将第二轮反应产物进行切胶回收、克隆、测序。用已测得的虎斑乌贼FMRF的cDNA核心序列设计特异性引物来扩增5′端非编码区序列，扩增产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图3所示，5′RACE产物为342bp条带。

⑥序列信息分析方法：使用Lasergene软件对FMRFamide的3’端、5’端和核心片段序列进行拼接，获得虎斑乌贼FMRFamide基因的cDNA全长序列。Predict Protein和ScratchProtein Predictor 等在线工具可用来对FMRFamide基因进行开放阅读框（ORF）预测，以及推测该ORF所编码的氨基酸序列。应用在线分析站点SignalP v3.0对氨基酸序列进行信号肽预测。应用NCBI对氨基酸序列进行Blast (blastx and blastn)分析，应用ClustalW2对FMRFamide及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析。FMRFamide前体蛋白相对分子质量同等电点的估算使用的是Expasy-ProtParam 在线分析软件。使用MEGA v5.0软件进行基于NJ法的进化树构建，重复1000次循环。

如图4所示，用DNAMAN对核心序列片段、5′端序列和3′端序列进行拼接和分析，结果显示，虎斑乌贼神经肽FMRF序列全长约为1856bp，开放阅读框996bp，5’非翻译区334bp，3’非翻译区526bp，其中编码区氨基酸序列包括信号肽和成熟肽的共331个氨基酸。FMRFamide基因前体蛋白预测相对分子质量38.7kDa，等电点9.09。通过对前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现FMRFamide前体蛋白的N端含有一段长36个氨基酸的信号肽。前体蛋白有一段长36 AA的信号肽，通过氨基酸序列分析还发现它编码4种多肽产物：FMRFamide、FLRFamide、FIRFamide,、ALSGDAFLRFamide。

如图5所示，用ClustalW2在线分析网站（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）对虎斑乌贼FMRFamide前体蛋白进行保守性分析。同源序列比对结果显示虎斑乌贼FMRFamide与曼氏无针乌贼和商乌贼相似度都是97%，与枪乌贼（Doryteuthis pealeii）、加州鱿鱼（D.opalescens）、南方微鳍乌贼（Idiosepius notoides）静水椎实螺（Lymnaea stagnalis）相似度分别是 92%、92%、84%和 41%。

用Mega5.0软件将虎斑乌贼FMRFamide氨基酸序列同其他44种动物的FMRFamide序列进行比对并构建基于NJ法系统发育树，分析它们之间在系统进化过程中的亲缘关系。如图6所示，进化树结果显示：虎斑乌贼与曼氏无针乌贼关系最近，其次与商乌贼关系较近，这与传统形态分类一致。

本发明首次从虎斑乌贼中克隆出FMRFamide多肽基因cDNA全长序列，FMRFamide编码331个氨基酸残基，包括14个氨基酸的FaRPs多肽，与前人在曼氏无针乌贼和商乌贼、加州鱿鱼和柔鱼中克隆出FMRFamide基因高度保守，说明FMRFamide神经肽基因同其他头足类在生命活动中功能类似。在线预测FMRFamide氨基酸序列中存在着多个FMRFamide肽，该特征与其他乌贼中FMRFamide的特征肽完全相同。FMRFamide在运动调节特性和在神经传导过程中的具有重要功能，如在商乌贼中FMRF在其色素神经调节中起重要的作用。此外，FMRFamide蛋白在许多其他物种中参与许多不同的生理学功能，包括在无脊椎动物中的昆虫、软体动物，脊椎动物中的两栖类、鸟类和哺乳动物中是一种生殖调控神经肽，在生物的取食、分泌、迁移入侵和繁殖过程中发挥着重要的作用，并对细胞内的神经起到调节要作用。

系统进化表明，虎斑乌贼同曼氏无针乌贼和商乌贼位于同一个进化分支，氨基酸同源性均高达97%，亲缘关系最近，这可能因为生活环境相同，食性相似，且他们在海区的分布交流频繁，长期环境条件的作用使得它们在系统发育进化中处于相同的进化地位；另外，虎斑乌贼与加州鱿鱼、枪乌贼、南方微鳍乌贼聚为一支，氨基酸序列同源性较高，由此推测这几种头足类的FMRFamide神经肽可能来源于共同的祖先；其次虎斑乌贼与其他软体动物贻贝、海蜗牛、静水椎实螺等聚类，最后与果蝇分属于不同的进化支，该进化关系与传统的分类法一致。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 虎斑乌贼(Sepia pharaonis)

<400> 1

agaacaagga gaagatccca cgttccaatc aacgcaaagg cgaagagcac acagctaaaa 60

gcaacaacaa caaacaatca ttcccccata aataaaaaaa ggctgattca ttggactgaa 120

gagaaaacaa cgcacgttgg tgccttgttg ttttcctctt gctcgtagtt ctcagcgtgt 180

accttcgtat ctttttgtct gtgtgtgcgg ctccatcacc gtaccccgtc tttgctagtg 240

tcccctacct ctgtagtcgg acctaagtca tcttgttcct gtaggagcgc ccatttaccc 300

ttggcagatt tagaaagaat aacgggaccc cgtgatgcgt tgttggagtc cctgtagcct 360

acttgtcgtc atcgccatct actgtctctc ttcgcatacg tctgaagcct ttgatttggc 420

ccaggcatgc gtcgagtctc agcgaatgag tcttcttccg atttgtgata caatctttgc 480

tgtacagcaa gaaggagctc agcaaagtgc ggatgatgga ctgagaagca aacgtttcat 540

acgctttgga agagccctgt caggagatgc tttcttgcgt tttgggaaaa atgtaccaga 600

ccttcctttc gaagataaaa gattccttcg atttggacga gcagctcctc agttggatga 660

cttgctcaaa caagccctgc agagagttga aagcttgcaa aaggccgacg acaccagtgt 720

tcgacgaaag cgatccacag acgccgctcc cccaaagcaa acagatagtg ctgaacagaa 780

aaacgatagc gcaaaaatca caaaaagata cgtcgatgac gtcgaagatt ctgatgtgaa 840

gagattcatg cgcttcggta agagatttat gcgttttggc cgtaacccga gcgatgttgg 900

caacaaactg aacgaaaagc gattcatgag atttggacgt gatcccgaaa aaaggttcat 960

gcgttttggc aaatcagatg acaagaggtt catgagattc ggtcgaaacc ccggcgatgc 1020

tgaagatgaa ctggaagagg ataaacgttt tatgagattc ggacgtggag acgaagagga 1080

tgaggaagaa gccgaaaaac gatttatgag atttggacgt gaccctgaaa agaaattcat 1140

gagatttggg aagaacggcg aagaaaagag gttcatgcgc tttggtcgaa accctgagga 1200

ccaagaagct gacaagagat ttatgagatt tggacgcggc ggtgaagacg atgacgtgaa 1260

ctcagaggaa aaacgtttta tgagatttgg tcgatctgca gaaaaatgca aaggatgtct 1320

ggaaggttaa tggctgatgt ctctagcttg cttccttctt tggctgaaca gagacaaaaa 1380

gaaatacaaa ataaaagctt ctgattaaat actttacatt ttacaaaaat gtaattcagt 1440

Claims (8)

1.虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，其特征在于包括虎斑乌贼神经肽FMRFamide，所述神经肽FMRFamide基因cDNA序列全长约1856 bp，开放阅读框996 bp，编码331个氨基酸，5’非翻译区334 bp，3’非翻译区526 bp，前体蛋白预测相对分子质量38.7kDa，等电点9.09。

2.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，其特征在于：所述的神经肽FMRFamide生殖调控剂的制备方法包括总RNA提取、cDNA第一链的合成、虎斑乌贼FMRFamide基因核心序列片段的简并引物合成、虎斑乌贼FMRFamide核心序列的扩增、RACE获得FMRFamide基因cDNA的全长和序列信息分析。

3.根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，其特征在于：所述的总RNA提取：在虎斑乌贼脑组织中加入质量体积比为0.05~0.07mg：1μL Trizol，匀浆，补加等体积的Trizol，轻轻摇晃后静置；加入氯仿，剧烈震荡后静置，高速离心，取最上层的上清液；加入异丙醇摇匀，静置，离心，除去上清液，保留沉淀；加入70~80%的乙醇，用枪头吹吸沉淀，高速离心，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；室温静置15~25分钟待RNA呈半干的透明状态，用DEPC水溶解后，得到虎斑乌贼总RNA液。

4. 根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，其特征在于：所述的cDNA第一链的合成为：将虎斑乌贼总RNA液点样到1%的琼脂糖凝胶上跑胶，并在UVP紫外凝胶成像仪中呈像，进一步经紫外分光光度计测定其A260/A280值在1.8-2.0之间，可作为模板进一步用于cDNA第一链合成；使用Takara公司生产的M-MLV（Rnase H^-）反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成实验。

5. 根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，其特征在于：所述的虎斑乌贼FMRFamide基因核心序列片段的简并引物合成：将合成的cDNA置于-30~-15℃保存备用；根据NCBI数据库中获得已报道的软体动物物种FMRFamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，合成了多对用来克隆虎斑乌贼FMRFamide基因核心序列片段的简并引物：FMRF-F：GCTGAAGATGAACTGGAAGAG；FMRF-R：CAAAWAACTGAATGWCGCAGG；FMRF-5'outer：GATGTCTCTAGCTTGCTTCC；FMRF-5'inner：GATGGAGCCGCACACACAGAC；FMRF-3'outer：GAAACCCTGAGGACCAAGAAGCTGACAA；FMRF-3'inner：GGCGGTGAAGACGATGACGTGAACT；M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC；5’RACEAdapter：GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG；5’RACEOuterPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA；5’RACEInnerPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGA；3’RACEAdapter ：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；3’RACEOuterPrimer ：GCGGATCCGAATTAATACGACT；3’RACEInnerPrimer：GCGAGCACAGAATTAATACGACT。

6. 根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，其特征在于：所述的虎斑乌贼FMRFamide核心序列的扩增：以虎斑乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物FMRFamide-F和FMRFamide-R进行FMRFamide基因核心片段的PCR扩增；PCR反应程序为：94℃5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 8min；电泳检查产物，用QIAGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后，将其与pMD18-T载体相连接，转化至E.coli5α感受态细胞中，进行PCR检测后，将阳性克隆产物进行测序。

7. 根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，其特征在于：所述的RACE获得FMRFamide基因cDNA的全长：利用目的基因已知序列设计分别用于FMRFamide基因3’端RACE和5’端RACE扩增的特异性引物3’ FMRFamide-outter、3’-FMRFamide-inner和5’-FMRFamide-outter、5’-FMRFamide-inner，对FMRFamide的3’端、5’端和核心片段序列进行拼接，获得虎斑乌贼FMRFamide基因的cDNA全长序列。

8.根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽FMRFamide生殖调控剂，其特征在于：所述的神经肽FMRFamide基因克隆和序列分析：对FMRFamide基因进行开放阅读框（ORF）预测，以及推测该ORF所编码的氨基酸序列，对氨基酸序列进行信号肽预测，对FMRFamide及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析。