CN114107314A - 一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒 - Google Patents

一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因重组技术领域，具体说是一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒。斑石鲷RhoGEF10重组基因为斑石鲷RhoGEF10基因SEQ ID NO:1中第55位点和56位点之间插入DNA片段获得斑石鲷RhoGEF10重组基因。本发明获得斑石鲷X和Y染色体RhoGEF10基因同源区段且有大片段DNA插入重组标记序列，建立斑石鲷重组RhoGEF10基因快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷RhoGEF10基因是否发生重组，缩短斑石鲷RhoGEF10基因重组准确鉴定时间，提升检测效率，并利用其进行雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。

Description

一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因重组技术领域，具体说是一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒。
背景技术
斑石鲷隶属于鲈形目（Perciformes），石鲷科（Oplegnathidae），石鲷属（Oplegnathus），主要分布于西太平洋温热带海域，由于斑石鲷具有摄食贝壳食性特点，可以清理养殖网箱网衣，节约了大量的人力资源和网衣清理成本，经济效益和生态效益极其显著。斑石鲷又是我国本土自然种类，对其资源开发及可持续利用具长效性，养殖前景广阔。斑石鲷雌鱼染色体核型为2n=48，遗传性别类型为（X1X1X2X2）；雄鱼染色体核型为2n=47，含有1条巨大的异形染色体，遗传性别类型为（X1X2Y）（薛蕊，安皓，刘清华，肖志忠，王彦丰，李军. 斑石鲷（Oplegnathus punctatus）雌、雄鱼核型及Ag-NORs带型分析. 海洋与湖沼，2016，47(3)：626-632）。石鲷科鱼类在养殖过程中存在显著的雌雄生长二态性，雄鱼生长速度快于雌鱼，斑石鲷高雄苗种和全雄苗种的制备将促进斑石鲷养殖产业的提质增效，开展斑石鲷苗种遗传性别快速鉴定技术的研发将有助于斑石鲷优良雄性种质的储备（肖志忠.条石鲷种群遗传学及养殖生物学研究. 中国海洋大学，博士论文，2015）。
插入或缺失多态性是一种分子标记，是DNA或者蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的改变，主要表现为基因组中插入或者缺失了不同大小的片段化DNA。随着比较基因组学的深入研究，插入或缺失多态性标记的挖掘为遗传育种应用研究提供了重要的生物信息。目前，该技术开发研究主要集中在人类疾病、农作物以及畜禽生长性状等具备全基因组信息的物种和类群上，在海洋动物上的研究和应用起步较晚和应用甚少。由此，对海洋鱼类的功能性基因的插入或缺失标记研究亟待开拓和深入。
Rho型鸟嘌呤核苷酸交换因子（RhoGEF）是调控Rho GTPase活性的关键因子，在RhoGTPase信号调节、组织器官的生长发育及免疫应答中起着至关重要的作用；同时与肿瘤、发育及神经类疾病、病原微生物感染等也有密切的关系。RhoGEF主要包括两大类，即弥漫性B细胞淋巴瘤（Diffuse B lymphoma, Dbl）家族鸟嘌呤核苷酸交换因子与非Dbl鸟嘌呤核苷酸交换因子，其中研究比较多的是Dbl家族的GEF（Rossman K，Der J，Sondek J. GEF Meansgo: Turning on Rho GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. NatureReviews Molecular Cell Biology，2005，6(2):167-180；刘明涛，杨军，王志钢. Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子家族及其在疾病发生中的作用. 生物技术通报，2014，1: 63-67）。所有的Dbl家族成员都有一个共同的特点，即含有DH和PH结构域（Zheng Y. Dbl familyguanine nucleotide exchange factors. Trends in Biochemical Sciences，2001，26(12): 724-732）。RhoGEF通过催化结合GDP和GTP的交换来激活Rho GTPase构象变化，从而促使其与下游效应蛋白相互作用（Hart MJ，Eva A，Zangrilli D，Aaronson SA，Evans T，Cerione RA，Zheng Y. Cellular transformation and guanine nucleotide exchangeactivity are catalyzed by a common domain on the dbl oncogene product. TheJournal of Biological Chemistry，1994，269(1):62-65； Verhoeven K，De Jonghe P，Van de Putte T，Nelis E，Zwijsen A，Verpoorten N，De Vriendt E，Jacobs A，VanGerwen V，Francis A，Ceuterick C，Huylebroeck D，Timmerman V. Slowed conductionand thin myelination of peripheral nerves associated with mutant rho guanine-nucleotide exchange factor 10. American Journal of Human Genetics，2003，73:926-932）。最近的证据表明，Rho GTPases参与了神经元形态发生，包括细胞迁移、轴突生长和引导、树突细化和可塑性以及突触形成，在定义神经元细胞内相应GTPase的时空激活方面发挥着核心作用（Etienne-Manneville S，Hall A. Cdc42 regulates GSK3 andadenomatous polyposis coli (APC) to control cell polarity. Nature 2003，421:753-756）。但是，目前尚未见到关于斑石鲷雄性染色体上RhoGEF基因插入重组检测方法及其应用于雌、雄遗传性别鉴定的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服了现有斑石鲷RhoGEF10基因插入重组检测技术不足，提供了一种斑石鲷RhoGEF10重组基因以及利用其对海洋鱼类斑石鲷RhoGEF10基因重组插入进行PCR快速鉴定方法、该方法涉及的特异性引物对、及其在雌雄遗传性别鉴定中的应用和雌雄遗传性别鉴定试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种斑石鲷RhoGEF10重组基因，斑石鲷RhoGEF10重组基因为斑石鲷RhoGEF10基因SEQ ID NO:1（ChX1Rho）中第55位点和56位点之间插入DNA片段获得斑石鲷RhoGEF10重组基因。
所述斑石鲷RhoGEF10重组基因为所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第55位点和56位点之间插入DNA序列片段，即得SEQ ID NO:2（ChY Rho）所示碱基序列。
一种斑石鲷RhoGEF10重组基因的应用，所述斑石鲷RhoGEF10重组基因在斑石鲷雌雄遗传性别中快速鉴定的应用。
一种鉴定斑石鲷RhoGEF10基因重组的方法，
（1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用斑石鲷RhoGEF10基因特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与所述的斑石鲷RhoGEF10基因重组与非重组的特异性标记进行对比；
（2）若从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出326bp（SEQ ID NO:1所示碱基）和879bp（SEQ ID NO:2所示碱基）两个DNA片段，即待测斑石鲷中RhoGEF10基因发生重组；
若从待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出326bp（SEQ ID NO:1所示碱基）单一DNA片段，即待测斑石鲷中RhoGEF10基因未发生重组。
所述斑石鲷RhoGEF10基因特异性引物对为：
ChRho_F:1 : 5’-CAACTACCACTCTGAATGCTGC-3’；
ChRho_R:2 : 5’-GTTCAACCACCACACTTTAGGC-3’。
一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的方法，
（1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用斑石鲷RhoGEF10基因特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与所述的斑石鲷RhoGEF10重组基因与非重组的特异性标记进行对比；
（2）结果判断：若从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出326bp（SEQ ID NO:1所示碱基）和879bp（SEQ ID NO:2所示碱基）两个DNA片段，即待测斑石鲷中RhoGEF10基因发生重组，该待测斑石鲷为遗传雄性个体（X1X2Y）；
或，若从待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出326bp（SEQ ID NO:1所示碱基）单一DNA片段，即待测斑石鲷中RhoGEF10基因未发生重组，该待测斑石鲷为遗传雌性个体（X1X1X2X2）。
所述斑石鲷RhoGEF10基因特异性引物对为：
ChRho_F:1 : 5’-CAACTACCACTCTGAATGCTGC-3’；
ChRho_R:2 : 5’-GTTCAACCACCACACTTTAGGC-3’。
一种检测斑石鲷雌雄遗传性别的特异性引物为：
ChRho_F:1 : 5’-CAACTACCACTCTGAATGCTGC-3’；
ChRho_R:2 : 5’-GTTCAACCACCACACTTTAGGC-3’。
一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含所述的遗传性别特异性引物。
本发明所具有的有益效果：
本发明通过斑石鲷雄鱼融合染色体Y上的RhoGEF10基因与位于雌鱼同源染色体X上的RhoGEF10基因相比较发生了大片段的插入重组，进而高效、快速精准鉴定斑石鲷RhoGEF10基因是否发生重组，对于揭示斑石鲷雌、雄外周神经传导模式及髓鞘发育差异，实现雌、雄遗传性别的快速鉴定，提升斑石鲷遗传育种进程和优质苗种规模化生产具有重要的意义和应用价值。
本发明从斑石鲷全基因组序列中筛选并获得了斑石鲷X和Y染色体RhoGEF10基因同源区段且有大片段DNA插入重组标记序列，进一步建立了斑石鲷重组RhoGEF10基因快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷RhoGEF10基因是否发生重组。该方法利用一对引物在RhoGEF10基因重组个体中扩增出326bp和879bp两个相差553bp的条带，在RhoGEF10基因非重组个体中仅扩增出326bp的单一条带，并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨，缩短了斑石鲷RhoGEF10基因重组准确鉴定的时间，提升了检测效率。在斑石鲷基于RhoGEF10基因神经传导及髓鞘发育研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的获得X染色体RhoGEF10基因与Y染色体RhoGEF10基因的核苷酸序列比对图；图中连接线连接的模块代表RhoGEF10基因在X与Y染色体上的高度同源区域，其中下划线框定的区域为本发明目标序列ChX1Rho和ChYRho所在的位置。
图2为本发明实施例提供的ChX1Rho和ChYRho在X与Y染色体上的具体位置信息；326bp代表ChX1Rho片段的长度，879bp代表ChYRho的长度；ChYRho中间低位区域代表插入的553bp核苷酸序列，该区域与ChX1Rho片段无同源匹配序列。
图3为本发明实施例提供的X染色体ChX1Rho与Y染色体ChYRho核苷酸序列比对图，引物位置位于序列两端处，用单横下划线表示；*：代表ChX1Rho和ChYRho序列同源一致性区域；————：代表与ChYRho相比较ChX1Rho缺失序列，双横下划线指示ChX1Rho缺失序列所在区域。
图4为本发明实施例提供的X染色体ChX1Rho与Y染色体ChYRho核苷酸序列同源插入差异DNA片段模式图；斜线填充区域代表同源区域，空白区域代表缺失或插入位点区域。
图5为本发明实施例提供的斑石鲷雌雄个体PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图，M：DL 2000 DNA Marker；♂：生理雄鱼；♀：生理雌鱼；图中呈现两条带（326bp和879bp）的个体为RhoGEF10基因重组个体，也为遗传雄鱼，并且生理性别组织学鉴定为雄鱼，呈现单条带（326bp）的个体为RhoGEF10基因非重组个体，也为遗传雌性，生理性别组织学鉴定为雌鱼。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明基于斑石鲷雌雄全基因组测序获得斑石鲷X和Y染色体RhoGEF10基因同源区段且有大片段DNA插入重组标记序列，可见斑石鲷雄鱼Y染色体上的RhoGEF10基因发生了DNA长片段的插入重组，进而通过其作为斑石鲷Y染色体上RhoGEF10基因插入重组特有的DNA标记，并利用斑石鲷RhoGEF10基因重组快速鉴定斑石鲷雌雄，采用该方法可以快速、准确和高效的区分受检斑石鲷是否发生RhoGEF10基因重组。该方法会在发生RhoGEF10基因重组的斑石鲷个体中扩增出879bp和326bp两条带，其中879bp条带为特异性目的条带，而在非重组的RhoGEF10基因个体中仅扩增出单一条带（326bp），上述目的条带可以采用琼脂糖凝胶电泳快速准确的分辨带型，实现斑石鲷RhoGEF10基因发生重组与否的快速鉴定。同时由于该特异性目的条带（879bp）位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，可以应用于斑石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定。
实施例1斑石鲷重组RhoGEF10基因特有DNA标记的筛选及验证
斑石鲷X和Y染色体RhoGEF10基因同源区段且含大片段插入目标DNA序列的发现：所用的雄鱼异形染色体（neo-Y）DNA序列及雌鱼的X1染色体DNA序列参见 CNP0001488，Liet al.， 2021，同时以斑石鲷，委托广州基迪奥生物科技有限公司采用第三代PacBio全基因组测序技术完成斑石鲷雌、雄全基因组测序及组装，组装结果与已公布的斑石鲷基因组信息基本一致。采用比较基因组生物信息学分析斑石鲷雌雄基因组序列可见（参见图1和2），斑石鲷雄鱼异形染色体Y上RhoGEF10基因与斑石鲷雌鱼X1染色体RhoGEF10基因同源，且存在大片段DNA插入片段，其中X1染色体上RhoGEF10基因目标DNA片段长度为326bp，命名为ChX1Rho，其序列为SEQ ID NO:1：
CAACTACCACTCTGAATGCTGCTTAATTTATTGTTGGAGGCCAGTGTTAAGAGATTTAAGGACTGGTTCTCTTTACCTTCTGCTCTCTTAAGTAGGTGCAAATGTGAACTTTTATGTGATTTAGAAGGTGTTTTCACACAATTTAATTGCTGTATGTTGAAACTAATGAGTTGACTTGATATTTGTTCTTTCAGTTCTGTCATGAAAAGTCAACTCTTGGGTTGATCCGTACAAGACGGATAAATCAAGGCTCGAAAATAAAACATTTGTTTTAAAATATGAAAATACAAGCTTGAAACAATGGGCCTAAAGTGTGGTGGTTGAAC。
而在雄鱼异形染色体Y上RhoGEF10同源基因的目标DNA片段长度为879bp，其包含了与X1同源序列和插入序列，命名为ChYRho，其序列为SEQ ID NO:2：
CAACTACCACTCTGAATGCTGCTTAATTTATTGTTGTAGGCCAATGTTAAGAGATTTAGGGTGCTTTCACACCTGAGCTGTTTGGTCCGTTTTAATTGAACCCTGGTGCATTCGTTGGATAGTCCGGTTTGTTTGGGGTGGTGTGAAAGCTCATTCGAAATCCAAACAACTTTCAAATCCATAGCTTATTATGATCAAATCTCGCCCGTCTTCTGTCTAACAACGACAACACATCATAATCCCTCTCTCTCATCAGGGCCTGCCTTCTCCTTCTCACTTGCTGTCTTGTCAGCTGCTCATATTGTTTGCCTTCTTGTAAAGCATTTAATTGATGGAAACACCAAAGCAAAACCACAAAAACTCAAGACCACATAAATTTGGTGTTGTTCCATTATTCCTGAGATCAGGAAGTGTCGGCGAGTTTCACTCGGATATTTTGTCCAATTGACGAGCAACCGTTTTGACCGCGTGACATTTGTTTACAATATTTGGTCTGCTTGACAAAGTTACAGTGTGAAAGCGAACCGAACCAAATGAAAAATGCAACAATGTTGCAACTTCACCCCGAATCGCTCCGAGACCACCGAACTACAGATGTGAAAGCGCCCTTAAGGGCAGGTTCTCTTTACCTTCTGCTCTCTTAAGTATGTGCAAATGTGAACTTTTATGTGATTTAGAAGGTGTTTTCACACAATTTAATTGCTGAATGTTGAAACTAATGAGTTGACTTGATCTTTGCTTTTTCAGTTCTGTCATGAAATGTCAACTCTTGGGTTGATCCGTACAAGACGGTTAAATCACGGCTCAAAAATAAAACATTCGTTTTAAAATATGAAAATACAAGCTTGAAACAATGGGCCTAAAGTGTGGTGGTTGAAC。
雌雄全基因组扫描和雌、雄个体RhoGEF10基因定位及DNA序列比对分析显示，与位于X1染色体RhoGEF10基因片段ChX1Rho同源的ChY Rho（Y染色体）第55位点和56位点之间发现一个大片段DNA序列插入，大小为553bp，其中Y染色体上RhoGEF10基因目标区域（ChY Rho）DNA序列比与X1染色体同源DNA区域（ChX1Rho）多插入了553bp大小的DNA序列，这个片段即为斑石鲷RhoGEF10重组基因特有的DNA标记，其存在与否可用来鉴别斑石鲷RhoGEF10基因是否发生重组。同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此ChY Rho这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChX1Rho则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，如图3所示。
由图3可见，与位于X1染色体RhoGEF10基因片段ChX1Rho同源的ChY Rho（Y染色体）第55位点和56位点之间发现一个大片段DNA序列插入重组失活基因，大小为553bp，插入后获得斑石鲷（Oplegnathus punctatus）RhoGEF10 重组基因，改变其开放读码框密码子碱基序列，使得RhoGEF10蛋白氨基酸肽链合成提前终止，为重组失活基因，具体如下：
1 ATSNGSQYSH EQFPEQ*DII NSI*YDI*YF M*HNVCVE*M NEHWYSSLLC LLSLIILCCV
61 FKFYVCIMYN ASPDSS*LNK GSTKNKNSNA ANADFLTC** Q。
并根据X1染色体RhoGEF10基因特定标记的全序列，获得氨基酸序列，参见SEQ IDNO:5。
重组RhoGEF10基因特有DNA标记的序列验证：基于Y染色体RhoGEF10基因的SEQ IDNO:2核苷酸序列与X1染色体上同源基因SEQ ID NO:1核苷酸序列特征，设计两条引物（图4）。选择已知生理性别的雌、雄斑石鲷并提取其高质量DNA，同时使用ChRho_F:1、ChRho_R:2两条引物进行PCR扩增，反应条件及程序如下：PCR反应体系为20µL，包括10 ×Buffer 4.0µL；dNTP（2.5mmol/L） 3.0µL；rTaq酶（5U/µL）0.2µL；ChRho_F:1 1.0µL；ChRho_R:2 1.0 µL；DNA模板1.0µL，9.8µL ddH2O；混匀后离心。PCR扩增程序：95℃ 3分钟，60℃（-1℃，3个循环） 30秒，72℃ 1分钟30秒，3个循环；95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟30秒，28个循环；72℃ 10分钟，15℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可以分辨出重组与非重组RhoGEF10基因个体存在差异。将重组与非重组RhoGEF10基因差异片段产物割胶回收并通过PMD18-T载体转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。测序结果验证了斑石鲷X、Y染色体同源RhoGEF10基因间含大片段插入目标DNA序列片段，如图1和图2所示。
实施例2斑石鲷重组RhoGEF10基因鉴定技术的建立与应用
对于来自山东烟台莱州市莱州明波水产有限公司养殖的斑石鲷（其中，12尾表型为雌鱼，11尾表型为雄鱼）进行遗传重组鉴定：
高质量DNA提取：使用天根海洋动物DNA提取试剂盒提取斑石鲷鳍条DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA的完整性，采用紫外分光光度计测量DNA上清的OD值，调整使得DNA浓度至50ng/µL，于-20℃冻存备用。
PCR反应体系及Touch down PCR扩增鉴定：使用斑石鲷重组RhoGEF10基因特异的DNA片段引物ChRho_F:1和ChRho_R:2通过PCR方法检测斑石鲷RhoGEF10基因重组与否。PCR反应体系20µL：10×Buffer 4.0µL、dNTP 3.0µL、rTaq酶（5U/µL）0.2µL、上下游引物（ChXY_F:1和ChXY_R:2）各1µL、DNA模板1.0µL、ddH2O 9.8µL。Touch down PCR扩增程序：95℃ 3分钟，60℃（-1℃，3个循环） 30秒，72℃ 1分钟30秒，3个循环；95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟30秒，28个循环；72℃ 10分钟，15℃保存。每个待检测的PCR样品中加入10×LoadingBuffer 2.0µL，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在110V恒压电压下30分钟，凝胶成像可清晰的分别斑石鲷重组与非重组RhoGEF10基因个体（参见图5）。
由图5可见，在RhoGEF10基因发生重组的斑石鲷个体中会扩增出两条目的条带（326bp和879bp），其中879bp条带为重组RhoGEF10基因特异性目的条带ChYRho，而在非重组RhoGEF10基因个体中只能扩增出单一带型ChX1Rho（326bp）。由于ChYRho标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此ChY Rho这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChX1Rho则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，进而可将选取的斑石鲷得以区分，采用本发明方法不仅可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷RhoGEF10基因是否发生基因重组，而且在斑石鲷基于RhoGEF10基因神经传导及髓鞘发育研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 326
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caactaccac tctgaatgct gcttaattta ttgttggagg ccagtgttaa gagatttaag 60
gactggttct ctttaccttc tgctctctta agtaggtgca aatgtgaact tttatgtgat 120
ttagaaggtg ttttcacaca atttaattgc tgtatgttga aactaatgag ttgacttgat 180
atttgttctt tcagttctgt catgaaaagt caactcttgg gttgatccgt acaagacgga 240
taaatcaagg ctcgaaaata aaacatttgt tttaaaatat gaaaatacaa gcttgaaaca 300
atgggcctaa agtgtggtgg ttgaac 326
<210> 2
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caactaccac tctgaatgct gcttaattta ttgttgtagg ccaatgttaa gagatttagg 60
gtgctttcac acctgagctg tttggtccgt tttaattgaa ccctggtgca ttcgttggat 120
agtccggttt gtttggggtg gtgtgaaagc tcattcgaaa tccaaacaac tttcaaatcc 180
atagcttatt atgatcaaat ctcgcccgtc ttctgtctaa caacgacaac acatcataat 240
ccctctctct catcagggcc tgccttctcc ttctcacttg ctgtcttgtc agctgctcat 300
attgtttgcc ttcttgtaaa gcatttaatt gatggaaaca ccaaagcaaa accacaaaaa 360
ctcaagacca cataaatttg gtgttgttcc attattcctg agatcaggaa gtgtcggcga 420
gtttcactcg gatattttgt ccaattgacg agcaaccgtt ttgaccgcgt gacatttgtt 480
tacaatattt ggtctgcttg acaaagttac agtgtgaaag cgaaccgaac caaatgaaaa 540
atgcaacaat gttgcaactt caccccgaat cgctccgaga ccaccgaact acagatgtga 600
aagcgccctt aagggcaggt tctctttacc ttctgctctc ttaagtatgt gcaaatgtga 660
acttttatgt gatttagaag gtgttttcac acaatttaat tgctgaatgt tgaaactaat 720
gagttgactt gatctttgct ttttcagttc tgtcatgaaa tgtcaactct tgggttgatc 780
cgtacaagac ggttaaatca cggctcaaaa ataaaacatt cgttttaaaa tatgaaaata 840
caagcttgaa acaatgggcc taaagtgtgg tggttgaac 879
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caactaccac tctgaatgct gc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcaaccac cacactttag gc 22
<210> 5
<211> 1296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ser Thr Val Met Ser Gln Gln Pro Pro Lys Glu Asp Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Asp Glu Glu Gln Gly Glu Glu Phe Leu Phe Glu Asp Ser Thr Asp
20 25 30
Glu Glu Lys Leu Gln Glu Asp Ser Lys Gly Ile Gly Ser Asp Ser Val
35 40 45
Lys Ser Val Gln Leu Ser Lys Lys Glu Asp Ser Lys Thr Ser Asp Ser
50 55 60
Val Ser Gln Thr Gly Thr Asp Ser Thr Pro Leu Pro Lys Thr Ser Pro
65 70 75 80
Pro Ala Gly Gln Glu Gly Val Pro Thr Lys Glu Gly Ala Ser Ile Ser
85 90 95
Ala Ala Asp Cys Ala Asn Ile Trp Val Pro Ser Arg Ala Ser Ala Ala
100 105 110
Ala Ala Glu Pro Arg Thr Ser Ala Pro Cys Val Gly Glu Glu Leu Arg
115 120 125
Gly Leu Pro Val Val Pro Ser Ala Val Glu Thr Leu Ala Asp Ser Gly
130 135 140
Asp His Ser Lys Glu Ile Val Lys Glu Ser Ser Gly Ser Arg Asp Ile
145 150 155 160
Ser Glu Ala Leu His Val Ala Glu Ala Glu Pro Gln Ala Val Glu Ala
165 170 175
Ser Glu Val Ile Tyr Asp Asp Val Pro Ser Glu Asp Pro Leu Ser Pro
180 185 190
Asp Glu Asp Met Ile Tyr Glu Asp Val Gln Arg Asp Ser Gly Pro Leu
195 200 205
Asp Ala Asp Asn Gly Trp Ser Ser Ser Glu Phe Glu Ser Tyr Asp Glu
210 215 220
Gln Ser Asp Asn Glu Thr Lys Leu Pro Thr Arg Ser Lys Leu Ser Pro
225 230 235 240
Glu Val Arg Arg Leu Arg Glu Arg Cys Ala Lys Thr Lys Arg Glu Leu
245 250 255
Ala Met Arg Leu Ser Gly Lys His Asn Tyr Asp Ile Lys Val Gln Gln
260 265 270
Leu Met Lys Ala Ala Arg Ser Gly Thr Lys Asp Gly Leu Glu Lys Thr
275 280 285
Lys Ile Ala Val Met Arg Lys Val Pro Phe Leu Gln Arg Lys Glu Gln
290 295 300
Leu Glu Glu Glu Asp Asp Ala Gly Tyr Leu Asp Val Ala Val Ser Glu
305 310 315 320
Asp Lys His Pro Pro Pro Gln Leu Ser Pro Met Pro Glu Gly Leu Thr
325 330 335
Ser His Gln Val Val Arg Arg His Ile Leu Gly Ser Ile Ile Gln Ser
340 345 350
Glu Arg Ser Tyr Leu Glu Ser Leu Arg Arg Ile Leu Gln Glu Tyr His
355 360 365
Arg Pro Leu Met Glu Ala Asp Pro Arg Ile Leu Ser Pro Arg Lys Ile
370 375 380
Arg Pro Ile Phe Tyr Arg Ile Arg Glu Ile Thr Gln Cys His Ser Met
385 390 395 400
Phe Gln Ile Ala Leu Ala Ser Arg Val Ala Glu Trp Asp Ser Ser Glu
405 410 415
Lys Ile Gly Asp Leu Phe Val Ala Ser Phe Ser Lys Ser Met Val Leu
420 425 430
Asp Val Tyr Ser Asp Tyr Val Asn Asn Phe Thr Asn Ala Met Ala Leu
435 440 445
Ile Lys Lys Ala Cys Met Ser Lys Pro Ala Phe Leu Glu Phe Leu Lys
450 455 460
Lys Lys Gln Ala Ser Ser Val Asp Arg Ile Thr Leu Tyr Gly Leu Met
465 470 475 480
Val Lys Pro Ile Gln Arg Phe Pro Gln Phe Ile Leu Leu Leu Gln Asp
485 490 495
Met Leu Lys Asn Thr Pro Lys Gly His Val Asp Arg Leu Pro Leu Gln
500 505 510
Leu Ala Leu Thr Glu Leu Glu Met Leu Ala Glu Lys Leu Asn Glu Gln
515 520 525
Lys Arg Val Ala Asp Gln Ile Ala Glu Thr Gln Gln Leu Ala Arg Ser
530 535 540
Val Ser Asp Arg Leu Leu Ser Lys Gln Leu Asn Ser Glu Gln Gly Ser
545 550 555 560
Leu Val Leu Cys Glu Thr Leu Ile Glu Thr Val Tyr Gly Glu Arg Gly
565 570 575
Gln Val Leu Lys Ser Lys Glu Arg Lys Val Phe Leu Phe Asp Asp Val
580 585 590
Leu Ile Cys Ala Asn Ile Asn Val Lys Gly Pro Pro Asp Ile Ser Ser
595 600 605
Leu Val Pro Val Gly Pro Lys Tyr Thr Met Lys Trp Ser Ala Pro Leu
610 615 620
Gln Gln Val Gln Val Val Glu Val Gly Gln Glu Gly Ser Gln Ser Lys
625 630 635 640
Asp Thr Phe Phe Pro Gln Ser Gly Ala Lys Arg Pro Ser Gly Ala Cys
645 650 655
Thr Ser Gly Lys Ala Ile Leu Gly Pro Pro Arg Leu Tyr Gln Glu Leu
660 665 670
Gln Glu Leu Gln His Asp Leu Ser Val Val Glu Glu Val Thr Leu Leu
675 680 685
Val Gly Thr Leu Gln Gly Met Tyr Gln Asn Leu Asn Thr Thr Val Ala
690 695 700
Gln Asp Trp Cys Leu Ala Leu Gln Arg Leu Ile Arg Ile Lys Glu Glu
705 710 715 720
Gln Ile Gln Ser Ala Asn Lys Cys Arg Leu Arg Leu Gln Val Pro Gly
725 730 735
Arg Pro Asp Lys Ser Gly Arg Pro Val Ser Phe Met Val Val Leu Asn
740 745 750
Thr Pro Asn Pro Leu Ser Lys Ile Ser Trp Val Asn Arg Leu His Leu
755 760 765
Ala Lys Ile Ala Leu Arg Glu Glu Asn Ser Pro Gly Trp Leu Cys Gly
770 775 780
Glu Asp Glu Gly Lys Thr Met Ala Pro Phe Trp Cys Pro Leu Leu Ala
785 790 795 800
Cys His Met Pro Val Phe Ala Thr Lys Ser Pro Glu Arg Lys Leu Glu
805 810 815
Ala Ala Leu His Asn Pro Val His Cys Ala Leu Leu Gly Phe Ser Ala
820 825 830
Ala Ser Thr Ser Leu Pro Gln Gly Tyr Leu Trp Val Ala Gly Gly Gly
835 840 845
Glu Gly Ser Gln Trp Gln Ile Glu Ile Phe Ser Leu Asn Arg Pro Met
850 855 860
Pro Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Val Gly Ser Ala Val Arg Cys Leu
865 870 875 880
Glu Tyr Val Pro Glu Pro Ser Pro Thr Glu Glu Ala Glu Ala Gly Val
885 890 895
His Lys Ala Pro Ser Glu Ile Gly Ala Asn Ile Cys Val Gly Leu Asp
900 905 910
Asp Gly Arg Ile Leu Val Tyr Gly Ser Val Asp Thr Ala Ala Gln Cys
915 920 925
Leu Leu Thr Leu His Asn Pro Glu Gly Cys Pro Val Leu Cys Leu Lys
930 935 940
His Ser Ser Arg Phe Leu Phe Ala Gly Leu Arg Asn Gly Thr Met Met
945 950 955 960
Val Tyr Gly Arg Ser Asn Ser Asp Asp Leu Trp Asp Pro Asp Ser Cys
965 970 975
Arg Cys Val Ser Leu Gly Ser Glu Pro Val Arg Thr Leu Leu Val Phe
980 985 990
Asp Asp Ser Val Trp Ala Ser Cys Gly Asn Ser Val Thr Val Met Asp
995 1000 1005
Ile Ser Ser Leu Thr Thr Gln Lys Phe Glu Val His Pro Asp Pro Met
1010 1015 1020
Val Ser Val Ala His Met Ala Cys Ala Gly Gly Gly Val Trp Met Ala
1025 1030 1035 1040
Phe Ser Glu Gly Ser Ser Ile Arg Leu Phe His Thr Glu Thr Leu Glu
1045 1050 1055
Leu Leu Gln Glu Ile Asn Ile Ser Thr Arg Ser Thr Leu Leu Asn Thr
1060 1065 1070
Gly Gln Lys Ser Met Arg Val Thr Ser Leu Leu Ile Cys Gln Gly Leu
1075 1080 1085
Leu Trp Val Gly Thr Ala Gln Gly Leu Ile Ile Thr Leu Pro Val Pro
1090 1095 1100
Lys Leu Glu Gly Ile Pro Lys Ile Thr Gly Lys Gly Met Ile Ser Leu
1105 1110 1115 1120
Asn Ala His Cys Gly Pro Val Asp Phe Leu Val Ala Thr Thr Ser Thr
1125 1130 1135
Leu Ser Pro Glu Met Leu Lys Arg Asp Ser Val Gly Asp Gly Pro Asp
1140 1145 1150
Ser Ala Cys Gly Gly Glu Asp Arg Ser Asp Thr Ser Ser Gln Glu Ser
1155 1160 1165
Leu Gln Gln Ser Ser Ser Tyr Gln Gly Glu Gly Arg Gly Lys Gly Arg
1170 1175 1180
Gly Val Leu Leu Gln Tyr Lys Leu Arg Ser Thr Ser Gly Leu Pro Gly
1185 1190 1195 1200
Arg Pro Leu Thr Ala Leu Gly Asp Glu Ala Ser Asp Ser Ser Leu Glu
1205 1210 1215
Ser Leu Glu His Ser Val Glu Asp Gly Ser Ile Tyr Glu Leu Ser Asp
1220 1225 1230
Asp Pro Glu Met Trp Val Arg Gly Arg Pro Cys Glu Arg Asp Gly Gly
1235 1240 1245
Arg Arg Asp Arg Val Ile Ser Ala Ala Val Ile Ser Gly Gly Lys Gly
1250 1255 1260
Phe Arg Arg Leu Lys Glu Gly Ala Ala Ala Gly Thr Arg Thr Ser Gly
1265 1270 1275 1280
Glu Gly Ser Glu Asn Ile Leu Met Val Trp Gln Leu Pro Leu Thr Val
1285 1290 1295

Claims (9)

1.一种斑石鲷RhoGEF10重组基因，其特征在于，斑石鲷RhoGEF10重组基因为SEQ IDNO:1所示碱基序列第55位点和56位点之间插入DNA序列片段。
2.按权利要求1所述的斑石鲷RhoGEF10重组基因，其特征在于，所述斑石鲷RhoGEF10重组基因为所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第55位点和56位点之间插入DNA序列片段，即得SEQ ID NO:2所示碱基序列。
3.一种权利要求1所述的斑石鲷RhoGEF10重组基因的应用，其特征在于，所述斑石鲷RhoGEF10重组基因在斑石鲷遗传性别鉴定中的应用。
4.一种鉴定斑石鲷RhoGEF10基因重组的方法，其特征在于，
（1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用斑石鲷RhoGEF10基因特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与权利要求1所述的斑石鲷RhoGEF10重组基因与非重组的特异性标记进行对比；
（2）结果判断：若从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出326bp和879bp两个DNA片段，即待测斑石鲷中RhoGEF10基因发生重组；
若从待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出326bp单一DNA片段，即待测斑石鲷中RhoGEF10基因未发生重组。
5.按权利要求4所述的鉴定斑石鲷RhoGEF10基因重组的方法，其特征在于，所述斑石鲷RhoGEF10基因特异性引物对为：
ChRho_F:1 : 5’-CAACTACCACTCTGAATGCTGC-3’；
ChRho_R:2 : 5’-GTTCAACCACCACACTTTAGGC-3’。
6.一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的方法，其特征在于，
（1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用斑石鲷RhoGEF10基因特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与权利要求1所述的斑石鲷RhoGEF10重组基因与非重组的特异性标记进行对比；
（2）结果判断：从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出326bp和879bp两个DNA片段，即待测斑石鲷中RhoGEF10基因发生重组，该待测斑石鲷为雄性个体X1X2Y；
或，从待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出326bp单一DNA片段，即待测斑石鲷中RhoGEF10基因未发生重组，该待测斑石鲷为雌性个体X1X1X2X2。
7.按权利要求6所述的一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的方法，其特征在于，所述斑石鲷RhoGEF10基因特异性引物对为：
ChRho_F:1 : 5’-CAACTACCACTCTGAATGCTGC-3’；
ChRho_R:2 : 5’-GTTCAACCACCACACTTTAGGC-3’。
8.一种检测斑石鲷雌雄遗传性别的特异性引物，其特征在于，
ChRho_F:1 : 5’-CAACTACCACTCTGAATGCTGC-3’；
ChRho_R:2 : 5’-GTTCAACCACCACACTTTAGGC-3’。
9.一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含权利要求8所述的遗传性别特异性引物。
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