CN117925862A - 检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 - Google Patents
检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117925862A CN117925862A CN202410330538.2A CN202410330538A CN117925862A CN 117925862 A CN117925862 A CN 117925862A CN 202410330538 A CN202410330538 A CN 202410330538A CN 117925862 A CN117925862 A CN 117925862A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- itih
- inter
- oplegnathus fasciatus
- oplegnathus
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000353172 Oplegnathus fasciatus Species 0.000 title claims abstract description 80
- 238000003780 insertion Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 230000037431 insertion Effects 0.000 title claims abstract description 76
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 62
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 241000353145 Oplegnathus Species 0.000 claims abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract 15
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 claims description 45
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 28
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 16
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 claims description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 abstract 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 abstract 1
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 31
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 20
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 241000473391 Archosargus rhomboidalis Species 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241000269810 Pagrus Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000276618 Perciformes Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 101000609413 Homo sapiens Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039457 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 101000906384 Rattus norvegicus Glutathione S-transferase Mu 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物学技术，具体的说一种检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用。检测斑石鲷串联基因间区插入变异特异性标记为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列，序列为SEQ ID NO:1（ChrX1inter）和SEQ ID NO:2（ChrYinter）所示碱基。本发明分子标记缩短了斑石鲷itih4a/itih4b基因间隔区DNA插入变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在斑石鲷基于itih4a/itih4b基因间区开展雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育研究上具有重要的意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术，具体的说一种检测斑石鲷（itih4a/itih4b）串联基因间区（DNA）插入变异特异性标记、特异性引物、鉴定方法、试剂盒及在雌雄遗传性别鉴定中的应用。
背景技术
斑石鲷是我国具有重要养殖价值的鱼类资源。它属于鲈形目石鲷科石鲷属，主要分布在西太平洋温热带海域。2014年我国首次成功实现斑石鲷人工繁殖和全程人工养殖，并将其引入网箱养殖和工业化养殖模式。现阶段，斑石鲷市场价格每公斤已在200元左右，其养殖效益显著。作为我国本土物种,斑石鲷的资源开发和可持续利用具有长期重要意义。斑石鲷采用X1X1X2X2/X1X2Y性别决定机制，雄鱼拥有一条Y染色体，生长速度更快。养殖中雄鱼和雌鱼生长速度明显不同，高比例雄鱼苗种有利于提升养殖质量和效率。因此，研发斑石鲷苗种快速鉴定性别技术，将有助于选育生长优良的雄性品种。这将促进斑石鲷养殖水平和产值的提高，也更好利用我国这一宝贵的渔业资源。
α-胰蛋白酶抑制剂重链4蛋白（Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain4, Itih4），在机体的炎症反应和免疫系统调节中起着至关重要的作用。该基因编码一种参与蛋白酶抑制的蛋白质，蛋白酶是一种分解蛋白质的酶，如果不加以控制，可能会导致组织损伤。通过调节这些蛋白酶的活性，itih4基因有助于防止过度炎症和预防自身免疫性疾病。研究表明，itih4基因的突变或失调可导致各种健康状况，包括慢性炎症性疾病和癌症。了解这种基因的功能对于开发新的治疗方法和疗法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于克服了现有斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA插入变异检测技术不足，提供了一种检测斑石鲷（itih4a/itih4b）串联基因间区（DNA）插入变异特异性标记、特异性引物、鉴定方法、试剂盒及在雌雄遗传性别鉴定中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种检测斑石鲷串联基因间区插入变异的特异性标记，检测斑石鲷串联基因间区插入变异特异性标记为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列，序列为SEQ ID NO:1（ChrX1inter）和SEQ ID NO:2（ChrYinter）所示碱基。
所述斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列SEQ ID NO:1所示碱基为斑石鲷雌、雄鱼X1染色体共有itih4a/itih4b基因间区未发生DNA插入变异的同源片段，为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区碱基非插入与插入个体共有DNA特征标记；且，所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第188位点和189位点之间、第196位点和197位点之间插入序列片段，即为SEQ ID NO:2所示碱基序列。
一种所述的检测斑石鲷串联基因间区插入变异的特异性标记的应用，所述特异性标记在检测斑石鲷雌雄遗传性别中的应用。
一种利用所述特异性标记鉴定斑石鲷基因间区插入变异的方法，
1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用斑石鲷itih4a/itih4b基因间区特异性引物，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与所述的斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段非插入与插入特异性标记进行对比；
2）结果判断：从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出351bp（SEQ ID NO:1所示碱基）和755bp（SEQ ID NO:2所示碱基）两个DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为itih4a/itih4b基因间区发生DNA片段插入变异个体；
3）待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出351bp（SEQ ID NO:1所示碱基）的单一DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区未发生DNA片段插入变异个体。
所述特异性引物为
Chinter_F:1 : 5’- ACTCTTCTTTCTCTCTCTCCTC-3’；
Chinter_R:2 : 5’- CAATAGTAAACACATCAGCC-3’。
所述步骤2）中待测斑石鲷个体为雄鱼（X1X2Y）；
步骤3）中待测斑石鲷个体为雌性（X1X1X2X2）。
一种检测所述的斑石鲷串联基因间区插入变异的特异性标记的引物：
Chinter_F:1 : 5’- ACTCTTCTTTCTCTCTCTCCTC-3’；
Chinter_R:2 : 5’- CAATAGTAAACACATCAGCC-3’。
一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含所述的引物。
本发明所具有的优点：
本发明通过斑石鲷雄鱼融合染色体Y上的itih4a/itih4b基因间区与位于雌鱼同源染色体X上的itih4a/itih4b基因间区相比较发生了大片段的DNA序列插入，进而高效、快速精准鉴定斑石鲷itih4a/itih4b基因间区是否发生DNA片段插入变异，对于揭示斑石鲷雌、雄病害炎症反应异同和免疫系统调节差异研究，实现雌、雄遗传性别的快速鉴定，提升斑石鲷遗传育种进程和优质苗种规模化生产具有重要的意义和应用价值。
本发明从斑石鲷全基因组序列中筛选并获得了斑石鲷X和Y染色体itih4a/itih4b基因间区同源区段且有大片段DNA片段插入标记序列，进一步建立了斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段插入变异快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷itih4a/itih4b基因间区是否发生DNA序列插入变异。该方法利用一对引物在itih4a/itih4b基因间区DNA序列插入变异个体中扩增出755bp和351bp两个相差404bp的条带，在itih4a/itih4b基因间区非DNA片段插入个体中仅扩增出351bp的单一条带，并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨，缩短了斑石鲷itih4a/itih4b基因间区变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在斑石鲷基于itih4a/itih4b基因间区变异调控雌、雄病害炎症响应异同和免疫系统调节差异研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的获得Y染色体itih4a/itih4b基因间区与X染色体itih4a/itih4b基因间区的核苷酸序列比对图；图中连接线连接的模块代表itih4a/itih4b基因间区在X与Y染色体上的高度同源区域，其中下划线框定的区域为本发明目标序列ChrX1inter和ChrYinter所在的位置。
图2为本发明实施例提供的ChrX1inter和ChrYinter在X与Y染色体上的具体位置信息；351bp代表ChrX1inter片段的长度，755bp代表ChrYinter的长度；ChrYinter中间低位区域代表插入的404bp核苷酸序列，该区域与ChrX1inter片段无同源匹配序列。
图3为本发明实施例提供的获得的X染色体ChrX1inter与Y染色体ChrYinter核苷酸序列比对图，两端引物位置用黑色粗下划线表示；*：代表ChrX1inter和ChrYinter序列一致性，空白区域表示两者碱基不一致序列；_ _ _ ：代表插入缺失序列；黑色下划线代表插入序列所在区域。
图4为本发明实施例提供的X染色体ChrX1inter与Y染色体ChrYinter核苷酸序列同源插入/缺失差异DNA片段模式图；黑色区域代表同源区域，空白区域代表缺失区域及位点信息，灰色区域代表的是插入区域及位点信息。
图5为本发明实施例提供的斑石鲷雌雄个体PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图，M：DL 2000 DNA Maker;♀：生理雌鱼；♂：生理雄鱼；图中呈现单条带（351bp）的个体为itih4a/itih4b基因间区未发生DNA序列插入个体，也为遗传雌性，生理性别组织学鉴定为雌性，呈现两条带（755bp和351bp）的个体为itih4a/itih4b基因间区发生DNA序列插入个体，也为遗传雄鱼，并且生理性别组织学鉴定为雄鱼。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明首先通过采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了斑石鲷雌、雄全基因组测序及组装，获得了斑石鲷雌、雄染色体水平的高质量基因组；通过比较基因组生物信息学分析方法发现相较于雌鱼X1染色体itih4a/itih4b基因间区，斑石鲷雄鱼Y染色体上同源itih4a/itih4b基因间区发生了两处大片段DNA序列插入变异（图1和图2）。选择雌鱼X1染色体上itih4a/itih4b基因间区2000bp~2360bp区及雄鱼Y染色体与之同源且存在DNA序列插入的2000bp~2800bp区为研究目标区域（图2）。X1染色体上DNA片段长度为351bp，命名为ChrX1inter，其序列为X interID No:1；Y染色体上的DNA片段长度为755bp，包含了与X1染色体上itih4a/itih4b基因间区同源序列，命名为ChrYinter，其序列为Y interID No:1；ChrYinter与ChrX1inter同源序列比对发现在与ChrX1inter对应的第188位点和189位点之间（399bp）、第196位点和197位点（5bp）之间发现了2个片段DNA序列缺失，大小为404bp（图3），雄鱼Y染色体itih4a/itih4b基因间区在2000bp~2800bp区域比雌鱼X1染色体上itih4a/itih4b基因间区同源区域插入了404bp大小的DNA序列，这个片段即为检测斑石鲷itih4a/itih4b基因间区是否发生DNA片段插入变异的DNA标记；同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1inter则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记。
本发明基于斑石鲷雄鱼Y染色体itih4a/itih4b基因间区2000bp~2800bp位置发现的长片段DNA插入序列特征标记来确定斑石鲷itih4a/itih4b基因间区是否发生DNA片段插入变异，发明了一种斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA插入变异快速检测方法，并将该方法应用到了斑石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定；具体检测方法，是确定待检测的斑石鲷是否存在YinterID No:1的核苷酸片段（755bp）；通过PCR引物进行快速鉴定；本发明基于对斑石鲷Y染色体上的itih4a/itih4b基因间区序列和X1和X2染色体上的同源基因序列进行比较分析，确定了与X1染色体上itih4a/itih4b基因间区XinterID No:1核苷酸序列同源的Y染色体上YinterID No:1核苷酸序列，利用在上述itih4a/itih4b基因间区同源区域在斑石鲷Y染色体有大片段插入这一特征，设计了两条引物。采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法，快速判断受检斑石鲷itih4a/itih4b基因间区是否发生DNA片段插入变异；同时利用该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，应用于斑石鲷遗传性别的精确鉴定，上下游引物序列分别为：
Chinter_F:1 : 5’- ACTCTTCTTTCTCTCTCTCCTC-3’ (Xinter ID No:2)
Chinter_R:2 : 5’- CAATAGTAAACACATCAGCC-3’ (Xinter ID No:3)。
使用上述引物鉴定斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段插入变异的步骤主要包括：提取高质量的斑石鲷全基因组DNA、扩增Y染色体itih4a/itih4b基因间区DNA插入变异的特异标记DNA片段、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物DNA；其中在斑石鲷雄鱼（X1X2Y）Y染色体和X1染色体中分别扩增出755bp和351bp两个DNA片段，755bp片段为发生DNA插入变异itih4a/itih4b基因间区特有标记片段；而在斑石鲷雌性（X1X1X2X2）个体中仅扩增出351bp的单一DNA片段。
本发明基于斑石鲷雌雄全基因组测序和雌、雄个体itih4a/itih4b基因间区定位及DNA序列比对分析，可见斑石鲷雄鱼Y染色体上的itih4a/itih4b基因间区发生了DNA长片段的插入变异，进而通过其作为斑石鲷Y染色体上itih4a/itih4b基因间区碱基插入变异特有的DNA标记，并利用斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA序列插入变异快速鉴定斑石鲷雌雄，采用该方法可以快速、准确和高效的区分受检斑石鲷是否发生itih4a/itih4b基因间区序列插入变异。该方法会在itih4a/itih4b基因间区发生DNA插入的斑石鲷个体中扩增出755bp和351bp两条带，其中755bp条带为特异性目的条带，而在未发生DNA插入的itih4a/itih4b基因间区个体中仅扩增出单一条带（351bp），上述目的条带可以采用琼脂糖凝胶电泳快速准确的分辨带型，实现斑石鲷itih4a/itih4b基因间区发生DNA序列插入与否的快速鉴定。同时由于该特异性目的条带（755bp）位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，可以应用于斑石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定。
实施例1斑石鲷itih4a/itih4b基因间区序列变异特有DNA标记的筛选及验证
斑石鲷Y和X染色体itih4a/itih4b基因间区同源区段且含大片段插入目标DNA序列的发现：所用的雄鱼异形染色体（neo-Y）DNA序列及雌鱼的X1染色体DNA序列来自中国科学院海洋研究所海水鱼类增养殖与繁育技术研究室李军研究团队，团队委托广州基迪奥生物科技有限公司采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了斑石鲷雌、雄全基因组测序及组装，组装结果与已公布的斑石鲷基因组信息基本一致（CNP0001488，Li et al., 2021）。采用比较基因组生物信息学分析斑石鲷雌雄基因组序列可见（参见图1和2），斑石鲷雄鱼异形染色体Y上itih4a/itih4b基因间区与斑石鲷雌鱼X1染色体itih4a/itih4b基因间区同源，且存在大片段DNA插入片段，其中X1染色体上itih4a/itih4b基因间区目标DNA片段长度为351bp，命名为ChrX1inter，其序列为SEQ ID NO:1：
ACTCTTCTTTCTCTCTCTCCTCTTTCAACAACTCTCTCTCTTTCCCGCATGACAAAACACACAAAAACACACTGCCACCCACCCACACATACACCACGGGTCTCTGAAACAAGAACGCAAGGTATATTCAAAGCACAAGAAAAACTGTCAGTGCTGGAAATGGACAGATTTTACTGAAATATTCTCTCTCTATTTCCCTCTGCTACTCTCAACATGAATAAAGGAAATAAAGAGTCAATAAGAGTAAAGCACAGCTGCATCAGTTATATTGAGGATTAAAACATCAGATCAGAGACATGGGTAAAATTAAACCCATTGATAAGTTGTTGTTGGCTGATGTGTTTACTATTG。
而在雄鱼异形染色体Y上itih4a/itih4b基因间区同源的目标DNA片段长度为755bp，其包含了与X1同源序列，命名为ChrYinter，其序列为SEQ ID NO:2：
ACTCTTCTTTCTCTCTCTCCTCTTTCAACAACTCTCTCTCTTTCCCGCATGACAAAACACACAAAAACACACTGCCACCCACACACACATACACCACGGGTCTCTGAAACAAGAACGCAAGGTATATTCAAAGTACAAGAAAAACTGTCAGTGCTGGAAATGGACAGATTTTACTTAAGTACTCTTACAGTTGGAGAGGCAAGTTGTAAAGGGGGCTCTGTGGGTTCTTCACCGTATATTTGTTTTATATTGCAGCTGCCAAATACACAATTTCCAAGCAATTTGAAATGCAAAATGTGTTTCCTTATAGACCACATTAATCCCACTCAAAATAAGTTATTGAACCCTCAAAAGTATTGCTTATTTATTCATGCTCAAATATAGGCATCCGATTAACAAGTCACAGGGTGAGAGTACAATGAAAATGCAGGCTTCCAAGTGAGGTTGCCACCTTCAATGTGGAAAAATAAGGGACACCTTGTTCACTTGCTCCCATGCCCGGGAGACACAAATCAGTCGGGGGGAGTGGGGATGAGATTTTGAGTGTAAGACAATTAATTTCCTACATTCTGCTGGATTGTTATGCATCAATTTCAAAGTCCTCTGCTACTCTCAACACGAATAAAGGAAATAAAGAGTCAATAAGAGTAAAGCACAGCTGCATCAGTTATATTAAGGATTAAAACATCAGATCAGAGACATGGGTAAAATTAAACCCATTGATAAGTTGTTGTTGGCTGATGTGTTTACTATTG。
雌雄全基因组扫描和雌、雄个体itih4a/itih4b基因间区定位及DNA序列比对分析显示，与位于X1染色体itih4a/itih4b基因间区片段ChrX1inter同源的ChrYinter（Y染色体）发生了2处DNA序列插入，分别对应ChrX1inter的第188位点和189位点之间（399bp）、第196位点和197位点（5bp）之间发现了2个片段DNA序列缺失，大小为404bp（图3和图4）。Y染色体上itih4a/itih4b基因间区目标区域（ChrYinter）DNA序列比与X1染色体同源DNA区域（ChrX1inter）插入了404bp大小的DNA序列，这个片段即为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区碱基插入变异特有的DNA标记，其存在与否可用来鉴别斑石鲷ChrYinter itih4a/itih4b基因间区是否发生DNA序列插入变异。同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYinter这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1inter则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，如图3和图4所示。
itih4a/itih4b基因间区序列变异特有DNA标记的序列验证：基于Y染色体itih4a/itih4b基因间区的SEQ ID NO:2核苷酸序列与X1染色体上同源基因SEQ ID NO:1核苷酸序列特征，设计两条引物（图3）。选择已知生理性别的雌、雄斑石鲷并提取其高质量DNA，同时使用Chinter_F:1、Chinter_R:2两条引物进行PCR扩增，反应条件及程序如下：PCR反应体系为20µL，包括10×Buffer 5.8µL；dNTP（2.5mmol/L） 4.0µL；rTaq酶（5U/µL）0.2µL；Chinter_F:10.4µL；Chinter_R:2 0.4 µL；DNA模板2.0µL，7.2µL ddH2O；混匀后离心。Touch down PCR扩增程序：94℃ 3mins，61.3℃（-1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃ 30s，59.3℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可以分辨出DNA片段插入与非插入itih4a/itih4b基因间区个体存在差异。将插入与非插入DNA序列itih4a/itih4b基因间区差异片段产物割胶回收并通过PMD18-T载体转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。测序结果验证了斑石鲷X、Y染色体同源itih4a/itih4b基因间区含大片段插入目标DNA序列片段，如图1和图2所示。
实施例2斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段插入变异鉴定技术的建立与应用
对于来自山东烟台莱州市莱州明波水产有限公司养殖的斑石鲷（其中，12尾表型为雌鱼，12尾表型为雄鱼）进行遗传鉴定。
高质量DNA提取：使用天根海洋动物DNA提取试剂盒提取斑石鲷鳍条DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA的完整性，采用紫外分光光度计测量DNA上清的OD值，调整使得DNA浓度至60ng/µL，于-20℃冻存备用。
PCR反应体系及PCR扩增鉴定：使用斑石鲷itih4a/itih4b基因间区大片段序列变异特异的DNA片段引物Chinter_F:1和Chinter_R:2通过PCR方法检测斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段插入变异与否。PCR反应体系20µL：10×Buffer 5.8µL、dNTP 4.0µL、rTaq酶（5U/µL）0.2µL、上下游引物（Chinter_F:1和Chinter_R:2）各0.4µL、DNA模板2.0µL、ddH2O 7.2µL。Touch down PCR扩增程序：94℃ 3mins，61.3℃（-1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃ 30s，59.3℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。每个待检测的PCR样品中加入10×Loading Buffer 2.0µL，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在110V恒压电压下30分钟，凝胶成像可清晰的分别斑石鲷itih4a/itih4b基因间区发生DNA插入与非插入变异个体（参见图5）。
由图5可见，在itih4a/itih4b基因间区发生DNA插入的斑石鲷个体中会扩增出两条目的条带（755bp和351bp），其中755bp条带为发生DNA片段插入itih4a/itih4b基因间区特异性目的条带ChrYinter，而在未发生DNA片段插入itih4a/itih4b基因间区个体中只能扩增出单一带型ChrX1inter（351bp）。由于ChrYinter标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYinter这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1inter则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，进而可将选取的斑石鲷得以区分，采用本发明方法不仅可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷itih4a/itih4b基因间区是否发生DNA片段插入变异，而且在斑石鲷基于itih4a/itih4b基因间区雌、雄个体病害炎症反应异同和免疫系统调节差异研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
Claims (8)
1.一种检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记，其特征在于：检测斑石鲷串联基因间区插入变异特异性标记为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列，序列为SEQ ID NO:1（ChrX1inter）和SEQ ID NO:2（ChrYinter）所示碱基。
2.根据权利要求1所述的检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记，其特征在于：所述斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列SEQ IDNO:1所示碱基为斑石鲷雌、雄鱼X1染色体共有itih4a/itih4b基因间区未发生DNA插入变异的同源片段，为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区碱基非插入与插入个体共有DNA特征标记；且，所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第188位点和189位点之间、第196位点和197位点之间插入序列片段，即为SEQ ID NO:2所示碱基序列。
3.一种权利要求1所述的检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记的应用，其特征在于：所述特异性标记在检测斑石鲷雌雄遗传性别中的应用。
4.一种利用权利要求1所述特异性标记鉴定斑石鲷基因间区插入变异的方法，其特征在于，
1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用斑石鲷itih4a/itih4b基因间区特异性引物，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与权利要求1所述的斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段非插入与插入特异性标记进行对比；
2） 结果判断：从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出351bp（SEQ ID NO:1所示碱基）和755bp（SEQ ID NO:2所示碱基）两个DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为itih4a/itih4b基因间区发生DNA片段插入变异个体；
3）待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出351bp（SEQ ID NO:1所示碱基）的单一DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区未发生DNA片段插入变异个体。
5.根据权利要求4所述的鉴定斑石鲷基因间区插入变异的方法，其特征在于，所述特异性引物为
Chinter_F:1 : 5’- ACTCTTCTTTCTCTCTCTCCTC-3’；
Chinter_R:2 : 5’- CAATAGTAAACACATCAGCC-3’。
6.根据权利要求4所述的鉴定斑石鲷基因间区插入变异的方法，其特征在于，步骤2）中待测斑石鲷个体为雄鱼（X1X2Y）；
步骤3）中待测斑石鲷个体为雌性（X1X1X2X2）。
7.一种检测权利要求1所述的斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记的引物，其特征在于：
Chinter_F:1 : 5’- ACTCTTCTTTCTCTCTCTCCTC-3’；
Chinter_R:2 : 5’- CAATAGTAAACACATCAGCC-3’。
8.一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含权利要求7所述的引物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410330538.2A CN117925862B (zh) | 2024-03-22 | 2024-03-22 | 检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410330538.2A CN117925862B (zh) | 2024-03-22 | 2024-03-22 | 检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117925862A true CN117925862A (zh) | 2024-04-26 |
| CN117925862B CN117925862B (zh) | 2024-06-18 |
Family
ID=90752286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410330538.2A Active CN117925862B (zh) | 2024-03-22 | 2024-03-22 | 检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117925862B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286479A (zh) * | 2011-08-10 | 2011-12-21 | 浙江省海洋水产研究所 | 条石鲷性别特异分子标记及其遗传性别鉴定方法 |
| CN109652523A (zh) * | 2019-01-16 | 2019-04-19 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法 |
| CN114107522A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒 |
| CN114107314A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒 |
-
2024
- 2024-03-22 CN CN202410330538.2A patent/CN117925862B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286479A (zh) * | 2011-08-10 | 2011-12-21 | 浙江省海洋水产研究所 | 条石鲷性别特异分子标记及其遗传性别鉴定方法 |
| CN109652523A (zh) * | 2019-01-16 | 2019-04-19 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法 |
| CN114107314A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒 |
| CN114107522A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HAIXIA ZHAO等: ""Genome-wide investigation of the DMRT gene family sheds new insight into the regulation of sex differentiation in spotted knifejaw (Oplegnathus punctatus) with fusion chromosomes (Y)"", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES》, vol. 257, 7 December 2023 (2023-12-07), pages 1 - 16, XP087455029, DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2023.128638 * |
| MING LI等: ""Isolation of a Male-Specific Molecular Marker and Development of a Genetic Sex Identification Technique in Spotted Knifejaw (Oplegnathus punctatus)"", 《MARINE BIOTECHNOLOGY》, 31 December 2020 (2020-12-31), pages 1 - 8 * |
| 江杉等: ""扩增性别基因片段的鹭类性别鉴定方法的研究"", 《厦门大学学报（自然科学版）》, vol. 45, 31 May 2006 (2006-05-31), pages 152 - 155 * |
| 薛蕊等: ""斑石鲷(Oplegnathus punctatus)雌、雄鱼核型及Ag-NORs带型分析"", 《海洋与湖沼》, vol. 47, no. 3, 31 May 2016 (2016-05-31), pages 626 - 632 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117925862B (zh) | 2024-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105594664B (zh) | 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN108018316A (zh) | 一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| WO2017092110A1 (zh) | 芝麻花序有限基因Sidt1及其SNP标记 | |
| CN108192963B (zh) | 一种准确鉴定金钱鱼遗传性别的特异分子标记及其引物 | |
| CN107058516B (zh) | 一种水稻粒宽基因gw2的分子标记及其应用 | |
| CN108048486A (zh) | 一种基因敲除选育fhl1b基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| KR20190085667A (ko) | 무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도 | |
| CN110804628A (zh) | 高特异性无脱靶单碱基基因编辑工具 | |
| CN111719008B (zh) | 一种与小麦白粉病抗病基因Pm5e共分离的SNP及其应用 | |
| CN111394445A (zh) | 用于斑鳢性别鉴定的Indel标记及应用 | |
| CN112111582A (zh) | 一种大口黑鲈性别相关的分子标记 | |
| CN116334248A (zh) | 一种地方鸡遗传资源保护与品种鉴定的液相芯片及其应用 | |
| CN108315444A (zh) | 一种鉴别绿壳蛋鸡基因型的多重pcr引物及鉴别方法 | |
| CN117925862B (zh) | 检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| CN102732514B (zh) | 趋化因子受体9基因作为牛优良超数排卵性状分子标记的鉴定方法及其应用 | |
| CN112359104A (zh) | 一种鳜性别特异标记的开发方法与应用 | |
| CN117965757B (zh) | 斑石鲷遗传性别的分子标记、引物、方法、试剂盒及应用 | |
| CN115948600B (zh) | 一种葡萄白粉病抗性dCAPS分子标记及其应用 | |
| CN117867091B (zh) | 斑石鲷基因间区dna插入变异特异性标记、应用、方法、引物对和试剂盒 | |
| CN117947183B (zh) | 检测条石鲷基因内含子区缺失变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| CN117867138B (zh) | 斑石鲷erc2基因内含子DNA插入变异的分子标记、引物对、检测方法、应用和试剂盒 | |
| CN117867092B (zh) | 斑石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、检测方法、特异性引物和试剂盒 | |
| CN117965711B (zh) | 条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、方法、引物和试剂盒 | |
| CN117947182B (zh) | 检测条石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| CN117947184B (zh) | 检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |