CN117867091B - 斑石鲷基因间区dna插入变异特异性标记、应用、方法、引物对和试剂盒 - Google Patents
斑石鲷基因间区dna插入变异特异性标记、应用、方法、引物对和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117867091B CN117867091B CN202410275540.4A CN202410275540A CN117867091B CN 117867091 B CN117867091 B CN 117867091B CN 202410275540 A CN202410275540 A CN 202410275540A CN 117867091 B CN117867091 B CN 117867091B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- intergenic
- srsf
- oplegnathus fasciatus
- cdkn
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000353172 Oplegnathus fasciatus Species 0.000 title claims abstract description 91
- 238000003780 insertion Methods 0.000 title claims abstract description 82
- 230000037431 insertion Effects 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 106
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 241000353145 Oplegnathus Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 59
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 27
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 8
- 102000002029 Claudin Human genes 0.000 claims 2
- 108050009302 Claudin Proteins 0.000 claims 2
- 241001494106 Stenotomus chrysops Species 0.000 claims 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 4
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 2
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 27
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 22
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 9
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 241001519451 Abramis brama Species 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000269810 Pagrus Species 0.000 description 2
- 102100029665 Serine/arginine-rich splicing factor 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710123508 Serine/arginine-rich splicing factor 3 Proteins 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 108010016788 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p21 Proteins 0.000 description 1
- 102000000578 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p21 Human genes 0.000 description 1
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 description 1
- 230000026109 gonad development Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000009394 selective breeding Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物学技术对物种基因间区DNA插入变异鉴定的定性检测方法，具体说是斑石鲷基因间区DNA插入变异特异性标记、应用、方法、引物对和试剂盒。斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异特异性标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1（ChrX1 intergenic）和SEQ ID NO:2（ChrY intergenic）所示碱基。本发明方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区是否发生DNA插入变异。该方法在斑石鲷基于cdkn1/srsf3基因间区开展雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育研究上具有重要的意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术对物种基因间区DNA插入变异鉴定的定性检测方法，具体说是基于全基因组信息结合分子生物学技术对海洋鱼类斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异进行PCR快速鉴定方法及其在雌雄遗传性别鉴定中的应用。
背景技术
斑石鲷隶属于鲈形目，石鲷科，石鲷属，主要分布于西太平洋温热带海域，雄鱼（2n=47）染色体较雌鱼（2n=48）少一条，并且雄鱼染色体中存在一条体型异常巨大的染色体，为典型的X1X1X2X2/X1X2Y性别决定类型。近期研究发现斑石鲷异形染色体Y与同源染色体X1X2之间存在显著的染色体结构变异。在养殖过程中发现斑石鲷鱼类表现出显著的雌雄生长二态性，其中雄鱼生长速度快于雌鱼。因此，研发斑石鲷雌雄遗传性别标记精准开发技术，创制高雄苗种和全雄苗种技术是斑石鲷苗种产业与育种发展的方向。此外，开展斑石鲷苗种遗传性别快速鉴定技术的研发，将有助于储备斑石鲷优良雄性种质。
基因间区（Intergenic region）是指染色体上基因之间的DNA片段区域。基因间区包含调控基因表达的元件，如启动子、增强子、沉默元件和控制区等功能调控区域，这些调控元件可以影响相邻或更远基因的表达。周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-Dependent KinaseInhibitor 1A，CDK1A）也被称为p21，是一种关键的细胞周期调节蛋白，具有抑制细胞增殖和促进细胞老化的作用。富含丝氨酸/精氨酸剪接因子3（Serine/arginine-rich splicingfactor 3, SRSF3）属于富丝氨酸精氨酸蛋白家族，在前体RNA的剪接过程中发挥关键作用；可以识别前体RNA上的剪接元件，招募并组装剪接体，促进或抑制剪接事件的发生。目前尚未见到关于斑石鲷异性染色体上cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异检测方法及其应用于雌、雄遗传性别鉴定的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服了现有斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异检测技术不足，提供了一种斑石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记及其利用分子标记进行雌雄遗传性别鉴定中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异特异性标记，斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异特异性标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1（ChrX1 intergenic）和SEQ IDNO:2（ChrY intergenic）所示碱基。
所述斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异特异性标记SEQ ID NO:1所示碱基为斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区碱基非插入与插入个体共有DNA特征标记（斑石鲷雌、雄鱼X1染色体共有cdkn1/srsf3基因间区未发生DNA插入变异的同源片段）；且，所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第94位点和95位点之间、第98位点和99位点之间插入序列片段，即为SEQ IDNO:2所示碱基序列，其为斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区碱基插入变异特有的DNA标记。
一种斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异特异性标记的应用，所述特异性标记在鉴定斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异中的应用。
所述鉴定斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异在辨别斑石鲷中的应用。
一种利用所述的分子标记鉴定斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异的方法，
1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA片段非插入与插入特异性标记进行对比；
2） 结果判断：从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出192bp（SEQ ID NO:1所示碱基）和1118bp（SEQ ID NO:2所示碱基）两个DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为cdkn1/srsf3基因间区发生DNA片段插入变异个体；
3）待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出192bp（SEQ ID NO:1所示碱基）的单一DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为cdkn1/srsf3基因间区未发生DNA片段插入变异个体。
所述斑石鲷为cdkn1/srsf3基因间区发生DNA片段插入变异个体为斑石鲷雄鱼（X1X2Y）个体；
所述斑石鲷为cdkn1/srsf3基因间区未发生DNA片段插入变异个体为斑石鲷雌性（X1X1X2X2）个体。
所述斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异的特异性引物对
Chintergenic_F:1 : 5’- TCCCACATACTTGTTGCCTT-3’；
Chintergenic_R:2 : 5’- TGTAGATCAACCAGTGGCTCA-3’。
一种检测所述的斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异的特异性引物对：
Chintergenic_F:1 : 5’- TCCCACATACTTGTTGCCTT-3’；
Chintergenic_R:2 : 5’- TGTAGATCAACCAGTGGCTCA-3’。
一种鉴定斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异并辨别斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含所述的遗传性别特异性引物对。
本发明所具有的优点：
本发明通过斑石鲷雄鱼融合染色体Y上的cdkn1/srsf3基因间区与位于雌鱼同源染色体X上的cdkn1/srsf3基因间区相比较发生了大片段的DNA序列插入，进而高效、快速精准鉴定斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区是否发生DNA片段插入变异，对于揭示斑石鲷雌、雄细胞发育及RNA剪切及性腺发育差异，实现雌、雄遗传性别的快速鉴定，提升斑石鲷遗传育种进程和优质苗种规模化生产具有重要的意义和应用价值。
本发明从斑石鲷全基因组序列中筛选并获得了斑石鲷X和Y染色体cdkn1/srsf3基因间区同源区段且有大片段DNA片段插入标记序列，进一步建立了斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA片段插入变异快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区是否发生DNA序列插入变异。该方法利用一对引物在cdkn1/srsf3基因间区DNA序列插入变异个体中扩增出1118bp和192bp两个相差926bp的条带，在cdkn1/srsf3基因间区非DNA片段插入个体中仅扩增出192bp的单一条带，并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨，缩短了斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在斑石鲷基于cdkn1/srsf3基因间区变异调控雌、雄细胞发育及RNA剪切研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的获得Y染色体cdkn1/srsf3基因间区与X染色体cdkn1/srsf3基因间区的核苷酸序列比对图；图中连接线连接的模块代表cdkn1/srsf3基因间区在X与Y染色体上的高度同源区域，其中下划线框定的区域为本发明目标序列ChrX1intergenic和ChrYintergenic所在的位置。
图2为本发明实施例提供的ChrX1intergenic和ChrYintergenic在X与Y染色体上的具体位置信息；192bp代表ChrX1intergenic片段的长度，1118bp代表ChrYintergenic的长度；ChrYintergenic中间低位区域代表插入的926bp核苷酸序列，该区域与ChrX1intergenic片段无同源匹配序列。
图3为本发明实施例提供的获得的X染色体ChrX1intergenic与Y染色体ChrYintergenic核苷酸序列比对图，两端引物位置用黑色粗下划线表示；*代表ChrX1intergenic和ChrYintergenic序列一致性，空白区域表示两者碱基不一致序列；_ _ _ 代表插入缺失序列；黑色下划线代表插入序列所在区域。
图4为本发明实施例提供的X染色体ChrX1intergenic与Y染色体ChrYintergenic核苷酸序列同源插入/缺失差异DNA片段模式图；黑色区域代表同源区域，空白区域代表缺失区域及位点信息，灰色区域代表的是插入区域及位点信息。
图5为本发明实施例提供的斑石鲷雌雄个体PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图，M：DL 2000 DNA Maker;♀：生理雌鱼；♂：生理雄鱼；图中呈现单条带（192bp）的个体为cdkn1/srsf3基因间区未发生DNA序列插入个体，也为遗传雌性，生理性别组织学鉴定为雌性，呈现两条带（1118bp和192bp）的个体为cdkn1/srsf3基因间区发生DNA序列插入个体，也为遗传雄鱼，并且生理性别组织学鉴定为雄鱼。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明首先通过采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了斑石鲷雌、雄全基因组测序及组装，获得了斑石鲷雌、雄染色体水平的高质量基因组；通过比较基因组生物信息学分析方法发现相较于雌鱼X1染色体cdkn1/srsf3基因间区，斑石鲷雄鱼Y染色体上同源cdkn1/srsf3基因间区发生了两处大片段DNA序列插入变异（图1和图2）。并选择雌鱼X1染色体上cdkn1/srsf3基因间区3740bp~3940bp区及雄鱼Y染色体与之同源且存在DNA序列插入的2350bp~3470bp区为研究目标区域（图2）。X1染色体上DNA片段长度为192bp，命名为ChrX1intergenic，其序列为X intergenicID No:1；Y染色体上的DNA片段长度为1118bp，包含了与X1染色体上cdkn1/srsf3基因间区同源序列，命名为ChrYintergenic，其序列为Y intergenicIDNo:1；ChrYintergenic与ChrX1intergenic同源序列比对发现在与ChrX1intergenic对应的第94位点和95位点之间（696bp）、第98位点和99位点（230bp）之间发现了2个片段DNA序列缺失，大小为926bp（图3），雄鱼Y染色体cdkn1/srsf3基因间区在2350bp~3470bp区域比雌鱼X1染色体上cdkn1/srsf3基因间区同源区域插入了926bp大小的DNA序列，这个片段即为检测斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区是否发生DNA片段插入变异的DNA标记；同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1intergenic则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记。
本发明基于斑石鲷雄鱼Y染色体上cdkn1/srsf3基因间区2350bp~3470bp位置发现的长片段DNA插入序列特征标记来确定斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区是否发生DNA片段插入变异，发明了一种斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异快速检测方法，并将该方法应用到了斑石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定；具体检测方法，是确定待检测的斑石鲷是否存在YintergenicID No:1的核苷酸片段（1118bp）；通过PCR引物进行快速鉴定；本发明基于对斑石鲷Y染色体上的cdkn1/srsf3基因间区序列和X1和X2染色体上的同源基因序列进行比较分析，确定了与X1染色体上cdkn1/srsf3基因间区XintergenicID No:1核苷酸序列同源的Y染色体上YintergenicID No:1核苷酸序列，利用在上述cdkn1/srsf3基因间区同源区域在斑石鲷Y染色体有大片段插入这一特征，设计了两条引物。采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法，快速判断受检斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区是否发生DNA片段插入变异；同时利用该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，应用于斑石鲷遗传性别的精确鉴定，上下游引物序列分别为：
Chintergenic_F:1: 5’- TCCCACATACTTGTTGCCTT-3’ (Xintergenic ID No:2)
Chintergenic_R:2: 5’- TGTAGATCAACCAGTGGCTCA-3’ (Xintergenic ID No:3)。
使用上述引物鉴定斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA片段插入变异的步骤主要包括：提取高质量的斑石鲷全基因组DNA、扩增Y染色体cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异的特异标记DNA片段、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物DNA；其中在斑石鲷雄鱼（X1X2Y）Y染色体和X1染色体中分别扩增出1118bp和192bp两个DNA片段，1118bp片段为发生DNA插入变异cdkn1/srsf3基因间区特有标记片段；而在斑石鲷雌性（X1X1X2X2）个体中仅扩增出192bp的单一DNA片段。
实施例1斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区序列变异特有DNA标记的筛选及验证
斑石鲷Y和X染色体cdkn1/srsf3基因间区同源区段且含大片段插入目标DNA序列的发现：所用的雄鱼异形染色体（neo-Y）DNA序列及雌鱼的X1染色体DNA序列来自中国科学院海洋研究所海水鱼类增养殖与繁育技术研究室李军研究团队，团队委托广州基迪奥生物科技有限公司采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了斑石鲷雌、雄全基因组测序及组装，组装结果与已公布的斑石鲷基因组信息基本一致（CNP0001488，Li et al., 2021）。采用比较基因组生物信息学分析斑石鲷雌雄基因组序列可见（参见图1和2），斑石鲷雄鱼异形染色体Y上cdkn1/srsf3基因间区与斑石鲷雌鱼X1染色体cdkn1/srsf3基因间区同源，且存在大片段DNA插入片段，其中X1染色体上cdkn1/srsf3基因间区目标DNA片段长度为192bp，命名为ChrX1intergenic，其序列为SEQ ID NO:1：
TCCCACATACTTGTTGCCTTTATTTGTTTAGCTTGTTGTCCTTCGTCTTATATTGAAATACATTGAGAGCAATGAAAAAACTGGAGTCAAATTCCTTGTATGTGTACACATACTTGGCCAATAAAGCTGATTCTGATTTACAACGATTTAAAACGCGGGAATCTTTACATTTGAGCCACTGGTTGATCTACA。
而在雄鱼异形染色体Y上cdkn1/srsf3基因间区同源的目标DNA片段长度为1118bp，其包含了与X1同源序列，命名为ChrYintergenic，其序列为SEQ ID NO:2：
TCCCACATACTTGTTGCCTTTATTTGTTTAGCTTGTTGTCCTTCGTCTTATATTGAAATACATTGAGAGCAATGAAAAAACTGGAGTCAAATTCAGTCCTCCTTCCTATGCGTAGCCTGGCGAAATTAAACCGACATAGGACACAGAAATATCTTTTTGGGGTCTTTATGCTGAACAGGAAATTGGGTGGTAGTTCAGATAAATAATAAAAGCTTGAAACAGAGTACACAGAAGTCCCTCTGCTATATGCGCAGTTCTTGTAGATAAACAAAATCAGTACCAGCTGAGGACTCTCCTCTCTACACTGTAACGCTCAGACCTATTTAGACTGCTTAAAGTAAAACACCTCGGCTCTTCACTGTACAGTAGTTGTATTGATAACCATAAACTACTGGTGCTAAAACACTCACTACAAAATGCAGCAGAAATGTCTCTTAGTACAAAAGAGTGCAAAAATATGCAACGTTCTGCTAGTACAAAAGAGTGCAAAAATAACTATAATGGCTCATCCCTATAACACAAAGAGCCCACAAATTCACAATTCACAATCACATTCATATTTCTTGTAATGTTACAATGAATGTATAAAATTTGAACACATACTAACATGTGCATCTGTCCCGGAGCACAAACAGAGTGGTGGCAAGACACTACGCCAATTACATCGGGTTCCTCCCACGACTATGCTCCACACACTGTCTGCATATCTGTCAACATCCAACGAATACAAACACATTAGTGTACCACATTTCACGATCTGCAGGTATGCATTACTTTTAAATGTCTATCACTTGATCTTTCATACCAGCAGTCACATTTTACAAGATATTTACCTTCAAAAAAGCCTATAATACCCGGAAAACAGTGCATGTTTACATCGCGGTAAAGCAAGATGGCTTCCCACTTCCGGGTCTCCCTCTAAGCCGTTCCTCAATATCCTTTGCGCTCACAGGTAGGTACCCAAACTGAGACAGTGCCATCTGGTGGCGTTAATAATTACAGTCACGTTTCCCACCTGGCTACATATGTGTACACATACTTGCCCAATAAAGCTGATTCTGATTTACAACGATTTAAAACGCGGGAATCTTTACATTTGAGCCACTGGTTGATCTACA。
雌雄全基因组扫描和雌、雄个体cdkn1/srsf3基因间区定位及DNA序列比对分析显示，与位于X1染色体cdkn1/srsf3基因间区片段ChrX1intergenic同源的ChrYintergenic（Y染色体）发生了2处DNA序列插入，分别对应ChrX1intergenic的第95位点和96位点之间（696bp）、第98位点和99位点（230bp）之间发现了2个片段DNA序列缺失，大小为926bp（图3和图4）。Y染色体上cdkn1/srsf3基因间区目标区域（ChrYintergenic）DNA序列比与X1染色体同源DNA区域（ChrX1intergenic）插入了926bp大小的DNA序列，这个片段即为斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区碱基插入变异特有的DNA标记，其存在与否可用来鉴别斑石鲷ChrYintergenic cdkn1/srsf3基因间区是否发生DNA序列插入变异。同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYintergenic这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1intergenic则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，如图3和图4所示。
cdkn1/srsf3基因间区序列变异特有DNA标记的序列验证：基于Y染色体cdkn1/srsf3基因间区的SEQ ID NO:2核苷酸序列与X1染色体上同源基因SEQ ID NO:1核苷酸序列特征，设计两条引物（图3）。选择已知生理性别的雌、雄斑石鲷并提取其高质量DNA，同时使用Chintergenic_F:1、Chintergenic_R:2两条引物进行PCR扩增，反应条件及程序如下：PCR反应体系为20µL，包括10×Buffer 5.8µL；dNTP（2.5mmol/L） 4.0µL；rTaq酶（5U/µL）0.2µL；Chintergenic_F:1 0.4µL；Chintergenic_R:2 0.4 µL；DNA模板2.0µL，7.2µL ddH2O；混匀后离心。PCR扩增程序：94℃ 3mins，59.5℃（-1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃30s，57.5℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可以分辨出DNA片段插入与非插入cdkn1/srsf3基因间区个体存在差异。将插入与非插入DNA序列cdkn1/srsf3基因间区差异片段产物割胶回收并通过PMD18-T载体转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。测序结果验证了斑石鲷X、Y染色体同源cdkn1/srsf3基因间区含大片段插入目标DNA序列片段，如图1和图2所示。
实施例2斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA片段插入变异鉴定技术的建立与应用
对于来自山东烟台莱州市莱州明波水产有限公司养殖的斑石鲷（其中，12尾表型为雌鱼，12尾表型为雄鱼）进行遗传鉴定。
高质量DNA提取：使用天根海洋动物DNA提取试剂盒提取斑石鲷鳍条DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA的完整性，采用紫外分光光度计测量DNA上清的OD值，调整使得DNA浓度至60ng/µL，于-20℃冻存备用。
PCR反应体系及PCR扩增鉴定：使用斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区大片段序列变异特异的DNA片段引物Chintergenic_F:1和Chintergenic_R:2通过PCR方法检测斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA片段插入变异与否。PCR反应体系20µL：10×Buffer 5.8µL、dNTP 4.0µL、rTaq酶（5U/µL）0.2µL、上下游引物（Chintergenic_F:1和Chintergenic_R:2）各0.4µL、DNA模板2.0µL、ddH2O 7.2µL。Touch down PCR扩增程序：94℃ 3mins，59.5℃（-1℃，3个循环） 1min，72℃1min30s，3个循环；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。每个待检测的PCR样品中加入10×Loading Buffer 2.0µL，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在110V恒压电压下30分钟，凝胶成像可清晰的分别斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区发生DNA插入与非插入变异个体（参见图5）。
由图5可见，在cdkn1/srsf3基因间区发生DNA插入的斑石鲷个体中会扩增出两条目的条带（1118bp和192bp），其中1118bp条带为发生DNA片段插入cdkn1/srsf3基因间区特异性目的条带ChrYintergenic，而在未发生DNA片段插入cdkn1/srsf3基因间区个体中只能扩增出单一带型ChrX1intergenic（192bp）。由于ChrYintergenic标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYintergenic这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1intergenic则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，进而可将选取的斑石鲷得以区分，采用本发明方法不仅可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区是否发生DNA片段插入变异，而且在斑石鲷基于cdkn1/srsf3基因间区雌、雄细胞发育及RNA剪切调控研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
Claims (8)
1.一种斑石鲷基因间区DNA插入变异特异性标记，其特征在于：斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异特异性标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基。
2.按权利要求1所述的斑石鲷基因间区DNA插入变异特异性标记，其特征在于：所述斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异特异性标记SEQ ID NO:1所示碱基为斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区碱基非插入与插入个体共有DNA特征标记。
3.一种权利要求1所述的斑石鲷基因间区DNA插入变异特异性标记在鉴定斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异中的应用；
所述的鉴定斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA插入变异在辨别斑石鲷性别中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的特异性标记鉴定斑石鲷基因间区DNA插入变异的方法，其特征在于，
1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与斑石鲷cdkn1/srsf3基因间区DNA片段非插入与插入特异性标记进行对比；
2） 结果判断：从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出192bp和1118bp两个DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为cdkn1/srsf3基因间区发生DNA片段插入变异个体；192bp为SEQ IDNO:1所示碱基，1118bp为SEQ ID NO:2所示碱基；
3）待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出192bp的单一DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为cdkn1/srsf3基因间区未发生DNA片段插入变异个体；192bp为SEQ ID NO:1所示碱基。
5.按权利要求4所述的鉴定斑石鲷基因间区DNA插入变异的方法，其特征在于：
所述斑石鲷为cdkn1/srsf3基因间区发生DNA片段插入变异个体为斑石鲷雄鱼X1X2Y个体；
所述斑石鲷为cdkn1/srsf3基因间区未发生DNA片段插入变异个体为斑石鲷雌性X1X1X2X2个体。
6.按权利要求4所述的鉴定斑石鲷基因间区DNA插入变异的方法，其特征在于：
所述特异性引物对
Chintergenic_F:1 : 5’- TCCCACATACTTGTTGCCTT-3’；
Chintergenic_R:2 : 5’- TGTAGATCAACCAGTGGCTCA-3’。
7.一种检测权利要求1所述的斑石鲷基因间区DNA插入变异特异性标记的引物对，其特征在于：
Chintergenic_F:1 : 5’- TCCCACATACTTGTTGCCTT-3’；
Chintergenic_R:2 : 5’- TGTAGATCAACCAGTGGCTCA-3’。
8.一种鉴定斑石鲷基因间区DNA插入变异并辨别斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含权利要求7所述的特异性标记的引物对。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410275540.4A CN117867091B (zh) | 2024-03-12 | 2024-03-12 | 斑石鲷基因间区dna插入变异特异性标记、应用、方法、引物对和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410275540.4A CN117867091B (zh) | 2024-03-12 | 2024-03-12 | 斑石鲷基因间区dna插入变异特异性标记、应用、方法、引物对和试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117867091A CN117867091A (zh) | 2024-04-12 |
| CN117867091B true CN117867091B (zh) | 2024-06-04 |
Family
ID=90595219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410275540.4A Active CN117867091B (zh) | 2024-03-12 | 2024-03-12 | 斑石鲷基因间区dna插入变异特异性标记、应用、方法、引物对和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117867091B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286479A (zh) * | 2011-08-10 | 2011-12-21 | 浙江省海洋水产研究所 | 条石鲷性别特异分子标记及其遗传性别鉴定方法 |
| CN109652523A (zh) * | 2019-01-16 | 2019-04-19 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法 |
| CN114107314A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒 |
| CN114107522A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒 |
-
2024
- 2024-03-12 CN CN202410275540.4A patent/CN117867091B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286479A (zh) * | 2011-08-10 | 2011-12-21 | 浙江省海洋水产研究所 | 条石鲷性别特异分子标记及其遗传性别鉴定方法 |
| CN109652523A (zh) * | 2019-01-16 | 2019-04-19 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法 |
| KR102086984B1 (ko) * | 2019-01-16 | 2020-05-15 | 옐로우 씨 피셔리즈 리서치 인스티튜트, 차이니즈 아카데미 오브 피셔리 사이언시즈 | 강담돔 웅성 특이적 dna 마커 및 유전적 성별 감식 방법 |
| CN114107314A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒 |
| CN114107522A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "Genome-wide investigation of the DMRT gene family sheds new insight into the regulation of sex differentiation in spotted knifejaw (Oplegnathus punctatus) with fusion chromosomes (Y)";Haixia Zhao等;《International Journal of Biological Macromolecules》;20231207;第257卷;第1-16页 * |
| "Isolation of a Male-Specific Molecular Marker and Development of a Genetic Sex Identification Technique in Spotted Knifejaw (Oplegnathus punctatus)";Ming Li等;《Marine Biotechnology》;20201231;第1-8页 * |
| "扩增性别基因片段的鹭类性别鉴定方法的研究";江杉等;《厦门大学学报（ 自然科学版）》;20060531;第45卷;第152-155页 * |
| "斑石鲷(Oplegnathus punctatus)雌、雄鱼核型及Ag-NORs带型分析";薛蕊等;《海洋与湖沼》;20160531;第47卷(第3期);第626-632页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117867091A (zh) | 2024-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107760715B (zh) | 一种转基因载体及其构建方法和应用 | |
| CN108103235B (zh) | 一种苹果砧木抗寒性鉴定的snp分子标记、引物及其应用 | |
| CN110804628A (zh) | 高特异性无脱靶单碱基基因编辑工具 | |
| CN112457386A (zh) | 一种控制玉米穗长和行粒数相关的蛋白ead1及其编码基因与应用 | |
| CN107267660B (zh) | 检测甜菜雄蕊育性的ssr分子标记及其应用 | |
| CN102732514B (zh) | 趋化因子受体9基因作为牛优良超数排卵性状分子标记的鉴定方法及其应用 | |
| CN117867091B (zh) | 斑石鲷基因间区dna插入变异特异性标记、应用、方法、引物对和试剂盒 | |
| CN108642209B (zh) | 一种小麦植株千粒重判断标记及其应用 | |
| CN117867092B (zh) | 斑石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、检测方法、特异性引物和试剂盒 | |
| CN117925862B (zh) | 检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| CN117965757B (zh) | 斑石鲷遗传性别的分子标记、引物、方法、试剂盒及应用 | |
| CN117867138B (zh) | 斑石鲷erc2基因内含子DNA插入变异的分子标记、引物对、检测方法、应用和试剂盒 | |
| CN117844913B (zh) | 斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记、方法、引物对、应用和鉴定试剂盒 | |
| CN117965711B (zh) | 条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、方法、引物和试剂盒 | |
| CN114317780A (zh) | 一种与鸡早熟性状相关的snp分子标记及应用 | |
| CN117947183B (zh) | 检测条石鲷基因内含子区缺失变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| CN117947182B (zh) | 检测条石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| CN112143830A (zh) | 水稻剑叶宽调控基因nal1的分子标记及其应用 | |
| CN117947184B (zh) | 检测条石鲷基因内含子区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用 | |
| CN112280870B (zh) | 一种光唇鱼雄性分子标记 | |
| CN112852996B (zh) | 鉴定万寿菊舌状花花瓣裂片性状的scar分子标记、检测引物及其应用 | |
| CN114480602B (zh) | 一种鉴定红螯螯虾遗传性别的snp标记及其所用引物对和应用 | |
| CN116694655B (zh) | 一个陆地棉油分蛋白品质关联的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶基因的应用 | |
| CN110616256B (zh) | 一种基于SNaPshot技术的多位点半滑舌鳎真伪雄鱼甄别体系和应用 | |
| CN114921472B (zh) | 一种控制高粱籽粒形状的基因及其分离、克隆方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |