CN117844913B - 斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记、方法、引物对、应用和鉴定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学，具体说是一种斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记、方法、引物对、应用和鉴定试剂盒。斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1（ChrX1amhr2）和SEQ ID NO:2（ChrYamhr2）所示碱基。本发明方法缩短了斑石鲷amhr2基因内含子缺失准确鉴定的时间，提升了检测效率。在斑石鲷基于amhr2基因性别决定和分化发育调控研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学，具体说是一种斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记、检测方法、引物对、应用和鉴定试剂盒。。
背景技术
斑石鲷隶属于鲈形目，石鲷科，石鲷属，主要分布于西太平洋温热带海域，2014年，我国首次成功突破了斑石鲷生殖调控和苗种全人工繁育技术，将其纳入海水网箱和工厂化养殖的重要对象。目前，斑石鲷的市场销售价格已达到每斤200元，其养殖经济效益显著。作为我国本土自然种类，斑石鲷的资源开发及可持续利用具有长期重要意义，其养殖前景广阔。斑石鲷具典型的X1X1X2X2/X1X2Y性别决定类型，雄鱼比雌鱼少一条染色体，但却具有一条异形染色体Y，性别类型为X1X2Y。石鲷科鱼类在养殖过程中表现出显著的雌雄生长二态性，其中雄鱼生长速度快于雌鱼。因此，制备斑石鲷的高雄苗种和全雄苗种将推动斑石鲷养殖产业的提质增效。此外，开展斑石鲷苗种遗传性别快速鉴定技术的研发，将有助于储备斑石鲷优良雄性种质。
内含子（intron）是在真核生物基因组中存在的一种基因组片段，内含子的存在增加了真核生物基因的复杂性和可变性。在基因组中具有多种重要功能，其包含增强子和抑制子等功能元件可以影响基因的转录水平和模式。内含子中的剪接位点、剪接调控序列和剪接因子可以影响剪接的准确性和效率，进而驱动产生不同的mRNA转录产物，从而增加真核生物基因的功能多样性和遗传多样性。此外，内含子的存在还可以调节染色体结构的稳定性和完整性，其存在与否会影响染色体重组、染色质结构和基因组的三维构架，从而影响基因的表达和性状表征。由于对海洋动物上基因组内含子变异检测研究和应用起步较晚和应用甚少，由此，对海洋鱼类的功能性基因的内含子变异标记研究亟待开拓和深入。
抗缪勒试管激素受体II（Anti-Müllerian Hormone Receptor Type II，Amhr2）是调控动物雌、雄性腺发育的关键因子，属于转化生长因子β（Transforming growth factor-β,TGF-β）超家族，在哺乳动物的卵原细胞、初级卵母细胞以及精巢发育过程中具有重要的调控作用，同时也是红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）和黄金鲈（Perca flavescens）的性别决定基因。近期的研究表明，amhr2基因位于斑石鲷雄鱼异形性染色体Y上以及跟异形染色体同源的染色体X1上。amhr2基因是否对于斑石鲷的性别决定和性别分化具有重要调控作用？目前尚未见到关于斑石鲷雄性染色体上amhr2基因内含子缺失检测方法及其应用于雌、雄遗传性别鉴定的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服了现有斑石鲷amhr2基因内含子缺失检测技术不足，提供了一种斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记、检测方法、引物对、应用和鉴定试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记，斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记（斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失特异性标记）的核苷酸序列为SEQ IDNO:1（ChrX1amhr2）和SEQ ID NO:2（ChrYamhr2）所示碱基。
所述斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失特异性标记SEQ ID NO:1所示碱基为斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失个体共有DNA特征标记；且，所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第92位点和169位点之间、第172位点和177位点、第182位点和225位点、第257位点和第266位点缺失序列片段，即为SEQ ID NO:2所示碱基序列，其为斑石鲷amhr2内含子缺失基因特有的DNA标记。
所述斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失特异性标记SEQ ID NO:1所示碱基为斑石鲷雌、雄鱼X1染色体共有amhr2非内含子缺失基因上的同源片段，为斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失个体共有DNA特征标记。
一种所述的斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记的应用，所述分子标记在鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失中的应用。
所述鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失在辨别斑石鲷雌雄中的应用。
一种利用所述的分子标记鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失的方法，
1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用斑石鲷amhr2基因特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与所述的斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失的特异性标记进行对比；
2） 结果判断：从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出317bp（SEQ ID NO:1所示碱基）和190bp（SEQ ID NO:2所示碱基）两个DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为amhr2基因发生内含子缺失个体；
3）待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出317bp（SEQ ID NO:1所示碱基）的单一DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为斑石鲷amhr2基因未发生内含子缺失个体。
所述斑石鲷为amhr2基因发生内含子缺失个体即为斑石鲷雄鱼（X1X2Y）个体；
所述斑石鲷为斑石鲷amhr2基因未发生内含子缺失个体为斑石鲷雌性（X1X1X2X2）个体。
所述斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失的特异性引物对
Chamhr2_F:1 : 5’- GAAAAAAAGATGTGTGGTGA-3’；
Chamhr2_R:2 : 5’- CACACAAATCCTGAGGAAAC-3’。
一种检测所述的斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失的特异性引物对，
Chamhr2_F:1 : 5’- GAAAAAAAGATGTGTGGTGA-3’；
Chamhr2_R:2 : 5’- CACACAAATCCTGAGGAAAC-3’。
一种鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失并辨别斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒：所述试剂盒含遗传性别特异性引物。
本发明所具有的优点：
本发明通过斑石鲷雄鱼融合染色体Y上的amhr2基因与位于雌鱼同源染色体X上的amhr2基因相比较发生了大片段的内含子序列缺失，进而高效、快速精准鉴定斑石鲷amhr2基因是否发生内含子缺失，对于揭示斑石鲷雌、雄性别决定和性别分化调控模式及性腺发育差异，实现雌、雄遗传性别的快速鉴定，提升斑石鲷遗传育种进程和优质苗种规模化生产具有重要的意义和应用价值。
本发明从斑石鲷全基因组序列中筛选并获得了斑石鲷X和Y染色体amhr2基因同源区段且有大片段DNA缺失/插入标记序列，进一步建立了斑石鲷缺失内含子amhr2基因快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷amhr2基因是否发生内含子缺失。该方法利用一对引物在amhr2基因缺失内含子个体中扩增出317bp和190bp两个相差127bp的条带，在amhr2基因非缺失内含子个体中仅扩增出317bp的单一条带，并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨，缩短了斑石鲷amhr2基因内含子缺失准确鉴定的时间，提升了检测效率。在斑石鲷基于amhr2基因雌、雄性别决定和性别分化研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的获得X染色体amhr2基因与Y染色体amhr2基因的核苷酸序列比对图；图中连接线连接的模块代表amhr2基因在X与Y染色体上的高度同源区域，其中下划线框定的区域为本发明目标序列ChrX1amhr2和ChrYamhr2所在的位置。
图2为本发明实施例提供的ChrX1amhr2和ChrYamhr2在X与Y染色体上的具体位置信息；317bp代表ChrX1amhr2片段的长度，190bp代表ChrYamhr2的长度；ChrX1amhr2中间低位区域代表缺失的127bp核苷酸序列，该区域与ChrYamhr2片段无同源匹配序列。
图3为本发明实施例提供的获得的X染色体ChrX1amhr2与Y染色体ChrYamhr2核苷酸序列比对图，两端引物位置用黑色粗下划线表示；|：代表ChrX1amhr2和ChrYamhr2序列一致性；…：代表两者碱基不一致序列；_ _ _ _ _ ：代表缺失序列；黑色下划线代表缺失序列所在区域。
图4为本发明实施例提供的X染色体ChrX1amhr2与Y染色体ChrYamhr2核苷酸序列同源缺失差异DNA片段模式图；黑色区域代表同源区域，空白区域代表缺失区域及位点信息。
图5为本发明实施例提供的斑石鲷雌雄个体PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图，M：DL 2000 DNA Maker;♂：生理雄鱼；♀：生理雌鱼；图中呈现两条带（317bp和190bp）的个体为amhr2基因缺失内含子个体，也为遗传雄鱼，并且生理性别组织学鉴定为雄鱼，呈现单条带（317bp）的个体为amhr2基因非缺失内含子个体，也为遗传雌性，生理性别组织学鉴定为雌性。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明首先通过采用PacBio第三代全基因组测序技术完成了斑石鲷雌、雄全基因组测序及组装，获得了斑石鲷雌、雄染色体水平的高质量基因组；通过比较基因组生物信息学分析方法发现相较于雌鱼X1染色体amhr2基因，斑石鲷雄鱼Y染色体上同源amhr2基因发生了两处大片段DNA序列插入/缺失（图1）。并选择雌鱼X1染色体上amhr2基因9400bp~9700bp区及雄鱼Y染色体与之同源且存在DNA序列缺失的1bp~200bp区为研究目标区域，为内含子区（图2）。X1染色体上DNA片段长度为317bp，命名为ChrX1amhr2，其序列为Xamhr2ID No:1；Y染色体上的DNA片段长度为190bp，包含了与X1染色体上amhr2基因同源序列序列（不含缺失序列），命名为ChrYamhr2，其序列为Yamhr2ID No:1；ChrYamhr2与ChrX1amhr2同源序列比对发现在与ChrX1amhr2对应的第92位点和169位点之间（76bp）、第172位点和177位点（4bp）、第182位点和225位点（42bp）、第257位点和第266位点（8bp）之间发现了4个片段DNA序列缺失，大小为130bp；ChrX1amhr2与ChrYamhr2同源序列比对发现在与ChrYamhr2对应的第63位点和67位点（3bp）之间发现了1个片段的DNA序列缺失，大小为3bp（图3），雄鱼Y染色体amhr2基因在1bp~200bp内含子区域比雌鱼X1染色体上amhr2同源基因内含子区域缺失了127bp大小的DNA序列，这个片段即为检测斑石鲷amhr2基因是否发生内含子缺失的DNA标记；同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1amhr2则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记。
本发明基于斑石鲷雄鱼Y染色体上amhr2基因1bp~200bp内含子区域发现的长片段DNA缺失序列特征标记来确定斑石鲷amhr2是否发生基因内含子缺失，由此提供斑石鲷amhr2基因内含子缺失快速检测方法，并将该方法应用到了斑石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定；具体检测方法，是确定待检测的斑石鲷是否存在Yamhr2ID No:1的核苷酸片段（190bp）；通过PCR引物进行快速鉴定；本发明基于对斑石鲷Y染色体上的amhr2基因序列和X1和X2染色体上的同源基因序列进行比较分析，确定了与X1染色体上amhr2基因Xamhr2ID No:1核苷酸序列同源的Y染色体上Yamhr2ID No:1核苷酸序列，利用在上述同源内含子区域amhr2基因在斑石鲷Y染色体有大片段缺失这一特征，设计了两条引物。采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法，快速判断受检斑石鲷amhr2基因是否发生内含子缺失；同时利用该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，应用于斑石鲷遗传性别的精确鉴定，上下游引物序列分别为：
Chamhr2_F:1 : 5’- GAAAAAAAGATGTGTGGTGA-3’ (Xamhr2ID No:2)
Chamhr2_R:2 : 5’- CACACAAATCCTGAGGAAAC-3’ (Xamhr2ID No:3)。
使用上述引物鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失的步骤主要包括：提取高质量的斑石鲷全基因组DNA、扩增Y染色体amhr2基因上内含子缺失的特异标记DNA片段、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物DNA；其中在斑石鲷雄鱼（X1X2Y）Y染色体和X1染色体中分别扩增出190bp和317bp两个DNA片段，317bp片段为非缺失内含子amhr2基因特有标记片段；而在斑石鲷雌性（X1X1X2X2）个体中仅扩增出317bp的单一DNA片段。
本发明基于斑石鲷雌雄全基因组测序和雌、雄个体amhr2基因定位及DNA序列比对分析，可见斑石鲷雄鱼Y染色体上的amhr2基因内含子区发生了DNA长片段的缺失变异，进而通过其作为斑石鲷Y染色体上amhr2基因内含子缺失特有的DNA标记，并利用斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异快速鉴定斑石鲷雌雄，采用该方法可以快速、准确和高效的区分受检斑石鲷是否发生amhr2基因内含子缺失变异。该方法会在发生amhr2基因缺失内含子的斑石鲷个体中扩增出317bp和190bp两条带，其中190bp条带为特异性目的条带，而在非缺失内含子的amhr2基因个体中仅扩增出单一条带（317bp），上述目的条带可以采用琼脂糖凝胶电泳快速准确的分辨带型，实现斑石鲷amhr2基因发生内含子缺失与否的快速鉴定。同时由于该特异性目的条带（190bp）位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，可以应用于斑石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定。
实施例1斑石鲷amhr2基因内含子缺失特有DNA标记的筛选及验证
斑石鲷X和Y染色体amhr2基因同源区段且含大片段缺失目标DNA序列的发现：所用的雄鱼异形染色体（neo-Y）DNA序列及雌鱼的X1染色体DNA序列来自中国科学院海洋研究所海水鱼类增养殖与繁育技术研究室李军研究团队，团队委托广州基迪奥生物科技有限公司采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了斑石鲷雌、雄全基因组测序及组装，组装结果与已公布的斑石鲷基因组信息基本一致（CNP0001488，Li et al., 2021）。采用比较基因组生物信息学分析斑石鲷雌雄基因组序列可见（参见图1和2），斑石鲷雄鱼异形染色体Y上amhr2基因与斑石鲷雌鱼X1染色体amhr2基因同源，且存在大片段DNA缺失片段，其中X1染色体上amhr2基因目标DNA片段长度为317bp，命名为ChrX1amhr2，其序列为SEQ ID NO:1：
GAAAAAAAGATGTGTGGTGACTTGTTTGATTTAGATTGGATCCAAACCCACATACAAAATTAT---GTTAGATACAGTGTAGTTACACCCTTAATCAGCCTGTGAATATTCTCATTCATCCAGGTCATAGTTATCTCAAGGAAATTGAATCGAACGCAACTGGATGGAACCAAAAATCCAGTTGCGTTCGATTTCCTTGAGTCACACCCTTAATAAAACGTTGGGTTTTTTTACATATAACGTAATATTATTATAATGTAATTATAATATTATAATATTCATTGTGTTTACTTTCTCACTGTTTCCTCAGGATTTGTGTG。
而在雄鱼异形染色体Y上amhr2同源基因的目标DNA片段长度为190bp，其包含了与X1同源序列序列（不含缺失序列），命名为ChrYamhr2，其序列为SEQ ID NO:2：
GAAAAAAAGATGTGTGGTGACTTGTTTGATTTAGATTGGATCCAAACCCACATATGAAATTATATGATAAGATACAGTGTAGTTACGCCCTTAAT------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AAAA----AGTTGC-----------------------------------------------------------TTTTTATATGTAACATAATATTATTAAAATGTA--------------------------ATTATAATATTCATTGTGTTTACTTTCTCACTGTTTCCTCAGGATTTGTGTG。
雌雄全基因组扫描和雌、雄个体amhr2基因定位及DNA序列比对分析显示，与位于X1染色体amhr2基因片段ChrX1amhr2同源的ChrYamhr2（Y染色体）发生了4处内含子DNA序列缺失，分别对应ChrX1amhr2的第92位点和169位点之间（76bp）、第172位点和177位点（4bp）、第182位点和225位点（42bp）、第257位点和第266位点，大小为130bp；与此同时，与ChrYamhr2同源序列比对发现在ChrX1amhr2的第63位点和64位点（3bp）之间发现了1个片段的DNA序列缺失，大小为3bp（图3和图4）。Y染色体上amhr2基因目标区域（ChrYamhr2）DNA序列比与X1染色体同源DNA区域（ChrX1amhr2）缺失了127bp大小的DNA序列，这个片段即为斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异特有的DNA标记，其存在与否可用来鉴别斑石鲷ChrYamhr2基因是否发生内含子缺失变异。同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYamhr2这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1amhr2则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，如图3和图4所示。
缺失内含子amhr2基因特有DNA标记的序列验证：基于Y染色体amhr2基因的SEQ IDNO:2核苷酸序列与X1染色体上同源基因SEQ ID NO:1核苷酸序列特征，设计两条引物（图3）。选择已知生理性别的雌、雄斑石鲷并提取其高质量DNA，同时使用Chamhr2_F:1、Chamhr2_R:2两条引物进行PCR扩增，反应条件及程序如下：PCR反应体系为25µL，包括艾科瑞生物2×Accurate Taq Master Mix 12.5µL；ChRho_F:1 1.0µL；ChRho_R:2 1.0 µL；DNA模板1.0µL，9.5µL ddH2O；混匀后离心。PCR扩增程序：94℃ 30s预变性，98℃ 10s，50℃ 30s，72℃1min，30个循环；72℃ 2min，15℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可以分辨出内含子缺失与非缺失amhr2基因个体存在差异。将内含子缺失与非缺失amhr2基因差异片段产物割胶回收并通过PMD18-T载体转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。测序结果验证了斑石鲷X、Y染色体同源amhr2基因间含大片段缺失目标DNA序列片段，如图1和图2所示。
实施例2斑石鲷缺失内含子amhr2基因鉴定技术的建立与应用
对于来自山东烟台莱州市莱州明波水产有限公司养殖的斑石鲷（其中，6尾表型为雌鱼，6尾表型为雄鱼）进行遗传鉴定。
高质量DNA提取：使用天根海洋动物DNA提取试剂盒提取斑石鲷鳍条DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA的完整性，采用紫外分光光度计测量DNA上清的OD值，调整使得DNA浓度至70ng/µL，于-20℃冻存备用。
PCR反应体系及PCR扩增鉴定：使用斑石鲷内含子缺失amhr2基因特异的DNA片段引物Chamhr2_F:1和Chamhr2_R:2通过PCR方法检测斑石鲷amhr2基因内含子缺失与否。PCR反应体系25µL： 2×Accurate Taq Master Mix 12.5µL；上下游引物（Chamhr2_F:1和Chamhr2_R:2）各1µL、DNA模板1.0µL、ddH2O 9.5µL。PCR扩增程序：94℃预变性30s；98℃ 10s，50℃ 30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸2min，4℃保存。使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在110V恒压电压下20分钟，凝胶成像可清晰的分别斑石鲷内含子缺失与非缺失amhr2基因个体（参见图5）。
由图5可见，在amhr2基因发生内含子缺失的斑石鲷个体中会扩增出两条目的条带（317bp和190bp），其中190bp条带为内含子缺失amhr2基因特异性目的条带ChrYamhr2，而在非内含子缺失amhr2基因个体中只能扩增出单一带型ChrX1amhr2（317bp）。由于ChrYamhr2标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此ChrYamhr2这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1amhr2则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，进而可将选取的斑石鲷得以区分，采用本发明方法不仅可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷amhr2基因是否发生基因内含子缺失变异，而且在斑石鲷基于amhr2基因雌、雄性别决定和性别分化研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
Claims (8)
1.一种斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记，其特征在于：斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基。
2.根据权利要求1所述的斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记，其特征在于：所述斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失特异性标记SEQ ID NO:1所示碱基为斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失个体共有DNA特征标记。
3.一种权利要求1所述的斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记的应用，其特征在于：所述分子标记在鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失中的应用；
所述鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失在辨别斑石鲷雌雄中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的分子标记鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失的方法，其特征在于，
1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用斑石鲷amhr2基因特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与权利要求1所述的斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失的特异性标记进行对比；
2） 结果判断：从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出317bp和190bp两个DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为amhr2基因发生内含子缺失个体；317bp为SEQ ID NO:1所示碱基，190bp为SEQ ID NO:2所示碱基；
3）待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出317bp的单一DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为斑石鲷amhr2基因未发生内含子缺失个体；317bp为SEQ ID NO:1所示碱基。
5.根据权利要求4所述的鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失的方法，其特征在于，所述斑石鲷为amhr2基因发生内含子缺失个体即为斑石鲷雄鱼X1X2Y个体；
所述斑石鲷为斑石鲷amhr2基因未发生内含子缺失个体为斑石鲷雌性X1X1X2X2个体。
6.根据权利要求4所述的鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失的方法，其特征在于，
所述斑石鲷amhr2基因内含子缺失与非缺失的特异性引物对
Chamhr2_F:1 : 5’- GAAAAAAAGATGTGTGGTGA-3’；
Ch amhr2_R:2 : 5’- CACACAAATCCTGAGGAAAC-3’。
7.一种检测权利要求1所述的斑石鲷amhr2基因内含子缺失变异分子标记的特异性引物对，其特征在于：
Chamhr2_F:1 : 5’- GAAAAAAAGATGTGTGGTGA-3’；
Ch amhr2_R:2 : 5’- CACACAAATCCTGAGGAAAC-3’。
8.一种鉴定斑石鲷amhr2基因内含子缺失并辨别斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，其特征在于：试剂盒含权利要求7所述的特异性引物对。
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN102286479A (zh) * | 2011-08-10 | 2011-12-21 | 浙江省海洋水产研究所 | 条石鲷性别特异分子标记及其遗传性别鉴定方法 |
| CN109652523A (zh) * | 2019-01-16 | 2019-04-19 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法 |
| CN114107314A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒 |
| CN114107522A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286479A (zh) * | 2011-08-10 | 2011-12-21 | 浙江省海洋水产研究所 | 条石鲷性别特异分子标记及其遗传性别鉴定方法 |
| CN109652523A (zh) * | 2019-01-16 | 2019-04-19 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法 |
| KR102086984B1 (ko) * | 2019-01-16 | 2020-05-15 | 옐로우 씨 피셔리즈 리서치 인스티튜트, 차이니즈 아카데미 오브 피셔리 사이언시즈 | 강담돔 웅성 특이적 dna 마커 및 유전적 성별 감식 방법 |
| CN114107314A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种斑石鲷RhoGEF10重组基因及性别鉴定方法和试剂盒 |
| CN114107522A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-03-01 | 中国科学院海洋研究所 | 斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "Genome-wide investigation of the DMRT gene family sheds new insight into the regulation of sex differentiation in spotted knifejaw (Oplegnathus punctatus) with fusion chromosomes (Y)";Haixia Zhao等;《International Journal of Biological Macromolecules》;20231207;第257卷;第1-16页 * |
| "Isolation of a Male-Specific Molecular Marker and Development of a Genetic Sex Identification Technique in Spotted Knifejaw (Oplegnathus punctatus)";Ming Li等;《Marine Biotechnology》;20201231;第1-8页 * |
| "扩增性别基因片段的鹭类性别鉴定方法的研究";江杉等;《厦门大学学报（自然科学版）》;20060531;第45卷;第152-155页 * |
| "斑石鲷(Oplegnathus punctatus)雌、雄鱼核型及Ag-NORs带型分析";薛蕊等;《海洋与湖沼》;20160531;第47卷(第3期);第626-632页 * |
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