CN117965711B - 条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、方法、引物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，具体说是一种条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、方法、引物和试剂盒。以条石鲷ndc80基因内含子区DNA插入与非插入作为条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记。并且，进一步建立条石鲷ndc80基因内含子区变异快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测条石鲷ndc80基因内含子是否发生DNA片段插入变异。该方法在条石鲷基于ndc80基因雌、雄染色体着丝粒形成以及染色体配对及分离研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体说是一种条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记、检测方法、引物和试剂盒。
背景技术
我国近年来在条石鲷的人工繁殖、苗种养殖等方面取得了长足进步。现养殖年产值可达5000多万元，苗种年产增加到100多万尾。此外，它作为混养对象还可降低其他水产养殖的成本。据研究条石鲷采用性别决定机制为X1X1X2X2/X1X2Y。雄鱼生长速度更快是因为带有Y染色体。未来如果能研发快速鉴定鱼苗性别的技术，有助于选育生长更快的雄性品种，从而提高养殖效率和产值，更好地开发利用这一重要渔业资源。
NDC80 着丝粒复合体成分（NDC80 kinetochore complex component，Ndc80），也称为 HEC1，在细胞分裂和染色体分离中起着至关重要的作用。ndc80基因编码的蛋白质是Ndc80 复合体的一部分，该复合体对于细胞分裂过程中染色体正确附着到有丝分裂纺锤体至关重要。如果没有这种附着，染色体就无法正确分离到子细胞中，从而导致潜在的遗传异常和细胞死亡。对 Ndc80 基因的研究表明其在维持基因组稳定性和预防癌症等疾病方面的重要性。该基因的突变与染色体不稳定和非整倍性有关，这两者都是癌细胞的共同特征。了解 Ndc80 基因的功能及其在细胞分裂中的作用可能为癌症发展和潜在治疗靶点提供有价值的见解。
发明内容
本发明的目的在于克服了现有条石鲷ndc80基因内含子DNA插入变异检测技术不足，提供了一种检测条石鲷遗传性别分子标记、引物对、检测方法、试剂盒及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记，以条石鲷ndc80基因内含子区DNA插入与非插入作为条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记。
所述分子标记为条石鲷ndc80基因内含子区DNA插入与非插入的特异性标记的核苷酸序列；其中，核苷酸序列为SEQ ID NO:1（ChrX1ndc80）和SEQ ID NO:2（ChrYndc80）所示碱基。
所述条石鲷ndc80基因内含子区DNA插入与非插入的特异性标记中SEQ ID NO:1所示碱基为条石鲷雌、雄鱼X1染色体共有ndc80基因内含子区未发生DNA插入的同源片段；其为条石鲷ndc80基因内含子区DNA插入与非插入个体共有DNA特征标记；且，所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第66位点和67位点之间、第99位点和100位点之间插入序列片段，即为SEQID NO:2所示碱基序列，其为条石鲷ndc80基因内含子区变异特有的DNA标记。
一种所述的检测条石鲷遗传性别的分子标记的应用，所述分子标记在检测条石鲷遗传性别中的应用。
一种鉴定所述的条石鲷遗传性别的分子标记的方法，
1）PCR扩增：取待测条石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用条石鲷分子标记的特异性引物对，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与所述的特异性标记进行对比；
2） 结果判断：从待测条石鲷的基因组DNA中扩增出208bp（SEQ ID NO:1所示碱基）和749bp（SEQ ID NO:2所示碱基）两个DNA片段，即为判断该待测条石鲷为ndc80基因内含子区发生DNA插入变异个体，即为条石鲷雄性（X1X2Y）个体；
3）待测条石鲷的基因组DNA中仅扩增出208bp（SEQ ID NO:1所示碱基）的单一DNA片段，即为判断该待测条石鲷为条石鲷ndc80基因内含子区未发生DNA插入个体，即为条石鲷雌性（X1X1X2X2）个体。
所述的所述分子标记鉴定条石鲷雌雄的方法，所述引物为
Chndc80_F:1 : 5’-AAGTGAAGAAAGTTCATGATGGC-3’；
Chndc80_R:2 : 5’-TCTGCCAATGTGCTTGGTCTACG -3’。
所述的条石鲷雌雄遗传性别的特异性标记的遗传性别特异性引物，
Chndc80_F:1 : 5’-AAGTGAAGAAAGTTCATGATGGC-3’；
Chndc80_R:2 : 5’-TCTGCCAATGTGCTTGGTCTACG -3’。
一种鉴定条石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含所述的遗传性别特异性引物。
本发明所具有的优点：
本发明通过条石鲷雄鱼融合染色体Y上的ndc80基因与位于雌鱼同源染色体X上的ndc80基因相比较发生了大片段的内含子序列插入，进而高效、快速精准鉴定条石鲷ndc80基因内含子是否发生DNA插入变异，对于揭示条石鲷的雌、雄染色体着丝粒形成以及染色体配对及分离规律，实现雌、雄遗传性别的快速鉴定，提升条石鲷遗传育种进程和优质苗种规模化生产具有重要的意义和应用价值。
本发明从条石鲷全基因组序列中筛选并获得了条石鲷X和Y染色体ndc80基因内含子同源区段且有大片段DNA插入标记序列，进一步建立了条石鲷ndc80基因内含子DNA插入变异快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测条石鲷ndc80基因内含子是否发生DNA插入。该方法利用一对引物在ndc80基因内含子DNA插入个体中扩增出749bp和208bp两个相差541bp的条带，在ndc80基因内含子为发生DNA插入个体中仅扩增出208bp的单一条带，并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨，缩短了条石鲷ndc80基因内含子变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在条石鲷基于ndc80基因雌、雄染色体着丝粒形成以及染色体分离研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的获得X染色体ndc80基因与Y染色体ndc80基因的核苷酸序列比对图；图中连接线连接的模块代表ndc80基因在X与Y染色体上的高度同源区域，其中标注的区域为本发明目标序列ChrX1ndc80和ChrYndc80所在的位置。
图2为本发明实施例提供的ChrX1ndc80和ChrYndc80在X与Y染色体上的具体位置信息；208bp代表ChrX1ndc80片段的长度，749bp代表ChrYndc80的长度；ChrYndc80中间低位区域代表插入的541bp核苷酸序列，该区域与ChrX1ndc80片段无同源匹配序列。
图3为本发明实施例提供的获得的X染色体ChrX1ndc80与Y染色体ChrYndc80核苷酸序列比对图，两端引物位置用黑色粗下划线表示；*：代表ChrX1ndc80和ChrYndc80序列一致性，空白区域表示两者碱基不一致序列；_ _ _ _ ：代表插入缺失序列；黑色下划线代表插入序列所在区域。
图4为本发明实施例提供的X染色体ChrX1ndc80与Y染色体ChrYndc80核苷酸序列同源插入差异DNA片段模式图；黑色区域代表同源区域，空白区域代表缺失区域及位点信息。
图5为本发明实施例提供的条石鲷雌雄个体PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图，M：DL 2000 DNA Maker;♂：生理雄鱼；♀：生理雌鱼；图中呈现两条带（749bp和208bp）的个体为ndc80基因内含子发生DNA插入个体，也为遗传雄鱼，并且生理性别组织学鉴定为雄鱼，呈现单条带（208bp）的个体为ndc80基因内含子未发生DNA插入个体，也为遗传雌性，生理性别组织学鉴定为雌性。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明首先通过采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了条石鲷雌、雄全基因组测序及组装，获得了条石鲷雌、雄染色体水平的高质量基因组（SRP160016，SRP220007，Xiao et al., 2019, 2020）；通过比较基因组生物信息学分析方法发现相较于雌鱼X1染色体ndc80基因内含子区，条石鲷雄鱼Y染色体上同源ndc80基因内含子区发生了1处大片段DNA序列插入变异（图1）。选择雌鱼X1染色体上ndc80基因内含子区6650bp~6900bp区及雄鱼Y染色体与之同源且存在DNA序列插入的5300bp~6200bp区为研究目标区域（图1）。X1染色体上DNA片段长度为208bp，命名为ChrX1ndc80，其序列为X ndc80ID No:1；Y染色体上的DNA片段长度为749bp，包含了与X1染色体上ndc80基因内含子区同源序列，命名为ChrYndc80，其序列为Y ndc80ID No:1；ChrYndc80与ChrX1ndc80同源序列比对发现在与ChrX1 ndc80r对应的第66位点和67位点、第99位点和100位点之间发现了2个片段DNA序列缺失，大小共计为541bp（图2和图3），雄鱼Y染色体ndc80基因内含子区在5300bp~6200bp区域比雌鱼X1染色体上ndc80基因内含子区同源区域插入了541bp大小的DNA序列，这个片段即为检测条石鲷ndc80基因内含子区是否发生DNA片段插入变异的DNA标记；同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrYndc80则为条石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记。
本发明基于条石鲷雄鱼Y染色体ndc80基因内含子区5300bp~6200bp位置发现的长片段DNA插入序列特征标记来确定条石鲷ndc80基因内含子区是否发生DNA片段插入变异，发明了一种条石鲷ndc80基因内含子区DNA插入变异快速检测方法，并将该方法应用到了条石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定；具体检测方法，是确定待检测的条石鲷是否存在Yndc80IDNo:1的核苷酸片段（749bp）；通过PCR引物进行快速鉴定；本发明基于对条石鲷Y染色体上的ndc80基因内含子区序列和X1和X2染色体上的同源基因序列进行比较分析，确定了与X1染色体上ndc80基因内含子区Xndc80ID No:1核苷酸序列同源的Y染色体上Yndc80ID No:1核苷酸序列，利用在上述ndc80基因内含子区同源区域在条石鲷Y染色体有大片段插入这一特征，设计了两条引物。采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法，快速判断受检条石鲷ndc80基因内含子区是否发生DNA片段插入变异；同时利用该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，应用于条石鲷遗传性别的精确鉴定，上下游引物序列分别为：
Chndc80_F:1 : 5’-AAGTGAAGAAAGTTCATGATGGC-3’ (Xndc80 ID No:2)
Chndc80_R:2 : 5’-TCTGCCAATGTGCTTGGTCTACG-3’ (Xndc80 ID No:3)。
使用上述引物鉴定条石鲷ndc80基因内含子区DNA片段插入变异的步骤主要包括：提取高质量的条石鲷全基因组DNA、扩增Y染色体ndc80基因内含子区DNA插入变异的特异标记DNA片段、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物DNA；其中在条石鲷雄鱼（X1X2Y）Y染色体和X1染色体中分别扩增出749bp和208bp两个DNA片段，749bp片段为发生DNA插入变异ndc80基因内含子区特有标记片段；而在条石鲷雌性（X1X1X2X2）个体中仅扩增出208bp的单一DNA片段。
本发明基于条石鲷雌雄全基因组测序和雌、雄个体ndc80基因内含子区定位及DNA序列比对分析，可见条石鲷雄鱼Y染色体上的ndc80基因内含子区发生了DNA长片段的插入变异，进而通过其作为条石鲷Y染色体上ndc80基因内含子区碱基插入变异特有的DNA标记，并利用条石鲷ndc80基因内含子区DNA序列插入变异快速鉴定条石鲷雌雄，采用该方法可以快速、准确和高效的区分受检条石鲷是否发生ndc80基因内含子区序列插入变异。该方法会在ndc80基因内含子区发生DNA插入的条石鲷个体中扩增出749bp和208bp两条带，其中749bp条带为特异性目的条带，而在未发生DNA插入的ndc80基因内含子区个体中仅扩增出单一条带（208bp），上述目的条带可以采用琼脂糖凝胶电泳快速准确的分辨带型，实现条石鲷ndc80基因内含子区发生DNA序列插入与否的快速鉴定。同时由于该特异性目的条带（749bp）位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，可以应用于条石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定。
实施例1条石鲷ndc80基因内含子区序列变异特有DNA标记的筛选及验证
条石鲷Y和X染色体ndc80基因内含子区同源区段且含大片段插入目标DNA序列的发现：所用的雄鱼异形染色体（neo-Y）DNA序列及雌鱼的X1染色体DNA序列来自中国科学院海洋研究所海水鱼类增养殖与繁育技术研究室李军研究团队，团队委托武汉菲沙基因信息有限公司采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了条石鲷雌、雄全基因组测序及组装，组装结果已公布（SRP160016，SRP220007， Xiao et al., 2019, 2020）。采用比较基因组生物信息学分析条石鲷雌雄基因组序列可见（参见图1），条石鲷雄鱼异形染色体Y上ndc80基因内含子区与条石鲷雌鱼X1染色体ndc80基因内含子区同源，且存在大片段DNA插入片段，其中X1染色体上ndc80基因内含子区目标DNA片段长度为208bp，命名为ChrX1ndc80，其序列为SEQ ID NO:1：
AAGTGAAGAAAAGTTCATGATGGCACTTAGAACAGTCAGAGTCTTCTGTTTTTTCTGGAAAGGAAGAACACCATTGTCCAGTTATCAGATGTGCAAATAAGTGATATACTTTCAGAAAAAATTCGGACATATAAAACTGAAAAACATATACTTACTTGGAGCTAGAAGGTCATTCAGTGAAAAATCGTAGACCAAGCACATTGGCAGA。
而在雄鱼异形染色体Y上ndc80基因内含子区同源的目标DNA片段长度为749bp，其包含了与X1同源序列，命名为ChrYndc80，其序列为SEQ ID NO:2：
AAGTGAAGAAAAGATCATGATGGCACTTAGAACAGTCAGAGTCTTCTGTTTTTTCTGGAAAGGAAGAACAACACCGCTATCCAGTTATCAGATGTGCAAATAAGTGACAGTGTTTCCCACACATTGGTTATTGGTTTGTGGCGGCCCGGCACAATATTAACATTGACCGCCACATATTGATTTTCTATTTTTTTAAACTCCTTGCCCCACTCTTGCGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCACAAACAGCTTGACAACAGACCTGTCTGTGAAGAGCCCCTCCTCTCCGTACACACTCTAAATCAAAACTATGGCGTTTAATTAGTCTCAAAACTGTGCACATATATAAAACAGGTGCGTGCACGTGATACGAGCACACTGAACAGAATCCGCGAAACCCGTGCATGTACAAGCGCGGTCCCGCAAACACGGGGCTCTGACGACCATGAGCTCGACCCTCCCTACGTGCTCGCAACTGCTCAACACTCGCTCGCTCATGAAGTTGACTTTTGAGACTTTGGAGGTGGGGATGGAATATAAGTGAAGAAAGCTGATGATGGCACTTAGAACAGTCAGAGTTTTCTGTTTTTCTGGAAAGCCAGCTAACACCATTGTAATACAGTTAATTCAGATGTGCAAAATGAGTGATATACTTTCAGAAAAAATTTGGACATATAAAACTGAAAAACATACACTTACTTGGAGCTAGAAGGTCATTCAGTGAAAGATCGTAGACCAAGCACATTGGCAGA。
雌雄全基因组扫描和雌、雄个体ndc80基因内含子区定位及DNA序列比对分析显示，与位于X1染色体ndc80基因内含子区片段ChrX1ndc80同源的ChrYndc80（Y染色体）发生了1处DNA序列插入，分别对应ChrX1ndc80的第66位点和67位点、第99位点和100位点之间发现了2个片段DNA序列缺失，大小共计为541bp（图2和图3）。Y染色体上ndc80基因内含子区目标区域（ChrYndc80）DNA序列比与X1染色体同源DNA区域（ChrX1ndc80）插入了541bp大小的DNA序列，这个片段即为条石鲷ndc80基因内含子区碱基插入变异特有的DNA标记，其存在与否可用来鉴别条石鲷ndc80基因内含子区是否发生DNA序列插入变异。同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYndc80这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1ndc80则为条石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，如图1和图2所示。
ndc80基因内含子区序列变异特有DNA标记的序列验证：基于Y染色体ndc80基因内含子区的SEQ ID NO:2核苷酸序列与X1染色体上同源基因SEQ ID NO:1核苷酸序列特征，设计两条引物（图3）。选择已知生理性别的雌、雄条石鲷并提取其高质量DNA，同时使用Chncd80_F:1、Chncd80_R:2两条引物进行PCR扩增，反应条件及程序如下：PCR反应体系为20µL，包括10×Buffer 5.8µL；dNTP（2.5mmol/L） 4.0µL；rTaq酶（5U/µL）0.2µL；Chncd80_F:1 0.4µL；Chncd80_R:2 0.4 µL；DNA模板2.0µL，7.2µL ddH2O；混匀后离心。Touch down PCR扩增程序：94℃ 3mins，59℃（-1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃ 30s，58.5℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可以分辨出DNA片段插入与非插入ndc80基因内含子区个体存在差异。将插入与非插入DNA序列ndc80基因内含子区差异片段产物割胶回收并通过PMD18-T载体转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。测序结果验证了条石鲷X、Y染色体同源ndc80基因内含子区含大片段插入目标DNA序列片段，如图3和图4所示。
实施例2条石鲷ndc80基因内含子区DNA片段插入变异鉴定技术的建立与应用
对于来自山东威海市文登区海和水产育苗有限公司养殖的条石鲷（其中，12尾表型为雌鱼，12尾表型为雄鱼）进行遗传鉴定。
高质量DNA提取：使用天根海洋动物DNA提取试剂盒提取条石鲷鳍条DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA的完整性，采用紫外分光光度计测量DNA上清的OD值，调整使得DNA浓度至60ng/µL，于-20℃冻存备用。
PCR反应体系及PCR扩增鉴定：使用条石鲷ndc80基因内含子区大片段序列变异特异的DNA片段引物Chncd80_F:1和Chncd80_R:2通过PCR方法检测条石鲷ndc80基因内含子区DNA片段插入变异与否。PCR反应体系20µL：10×Buffer 5.8µL、dNTP 4.0µL、rTaq酶（5U/µL）0.2µL、上下游引物（Chncd80_F:1和Chncd80_R:2）各0.4µL、DNA模板2.0µL、ddH2O 7.2µL。Touchdown PCR扩增程序：94℃ 3mins，59℃（-1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃30s，58.5℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。每个待检测的PCR样品中加入10×Loading Buffer 2.0µL，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在110V恒压电压下30分钟，凝胶成像可清晰的分别条石鲷ndc80基因内含子区发生DNA插入与非插入变异个体（参见图5）。
由图5可见，在ndc80基因内含子区发生DNA插入的条石鲷个体中会扩增出两条目的条带（749bp和208bp），其中749bp条带为发生DNA片段插入ndc80基因内含子区特异性目的条带ChrY ndc80，而在未发生DNA片段插入ndc80基因内含子区个体中只能扩增出单一带型ChrX1ndc80（208bp）。由于ChrYndc80标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYndc80这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1ndc80则为条石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，进而可将选取的条石鲷得以区分，采用本发明方法不仅可以快速、准确和高效的鉴定待检测条石鲷ndc80基因内含子区是否发生DNA片段插入变异，而且在条石鲷基于ndc80基因内含子区雌、雄染色体着丝粒形成以及染色体配对及分离研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
Claims (6)
1.一种条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记，其特征在于：条石鲷雌鱼与雄鱼染色体的特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：其中SEQ ID NO:1所示碱基序列为条石鲷雌、雄鱼X1染色体共有的DNA特征标记；SEQ ID NO:2所示碱基序列为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA特征标记。
3.一种利用权利要求1所述分子标记鉴定条石鲷雌雄的方法，其特征在于，
1）PCR扩增：取待测条石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用条石鲷分子标记的特异性引物，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与权利要求1所述的分子标记进行对比；
2）结果判断：从待测条石鲷的基因组DNA中扩增出208bp和749bp两个DNA片段，即判断该待测条石鲷为条石鲷雄性X1X2Y个体；208bp为SEQ ID NO:1所示碱基，749bp为SEQ ID NO:2所示碱基；
3）待测条石鲷的基因组DNA中仅扩增出208bp的单一DNA片段，即判断该待测条石鲷为条石鲷雌性X1X1X2X2个体；208bp为SEQ ID NO:1所示碱基。
4.根据权利要求3所述的鉴定条石鲷雌雄的方法，其特征在于，所述特异性引物为：
Chndc80_F:1 : 5’-AAGTGAAGAAAGTTCATGATGGC-3’；
Chndc80_R:2 : 5’-TCTGCCAATGTGCTTGGTCTACG -3’。
5.一种检测权利要求1所述的条石鲷雌雄遗传性别鉴定分子标记的引物，其特征在于，所述引物为：
Chndc80_F:1 : 5’-AAGTGAAGAAAGTTCATGATGGC-3’；
Chndc80_R:2 : 5’-TCTGCCAATGTGCTTGGTCTACG -3’。
6.一种鉴定条石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求5所述的引物。
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