CN109072481A - 早期乳腺癌内分泌治疗后剩余风险的基因特征 - Google Patents

早期乳腺癌内分泌治疗后剩余风险的基因特征 Download PDF

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Abstract

本文描述了在乳腺癌受试者中预后仅内分泌治疗的方法，所述方法包括：a)提供乳腺癌肿瘤样品；b)确定所述肿瘤样品中表4所列基因中至少40个的表达水平；c)将所述表达水平与来自受试者群组的对照样品的基因组群的参考表达水平相比；和d)确定与乳腺癌有关的剩余风险；其中，与参考表达水平相比，所述基因组群表达中的统计学显著差异或相似性对应于与乳腺癌有关的剩余风险。

Description

早期乳腺癌内分泌治疗后剩余风险的基因特征
相关申请的引证
本发明申请主张2015年12月7日提交的美国临时专利申请No.62/263,805的优先权利益，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
技术领域
本发明公开一般地涉及对乳腺癌受试者的预后或分类。更具体地，本发明公开涉及方法和装置，所述方法和装置涉及在内分泌治疗后，使用生物标志物对乳腺癌受试者的预后或分类。
背景技术
尽管在早期雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌的治疗中已有显著改善，但是仍存在临床问题。与之前30-40年相比，靶向抗内分泌疗法的死亡率降低1,2，但是占乳腺癌80％的ER+疾病仍导致早期乳腺癌的大部分死亡3。越来越多地使用多参数基因测定来指导临床治疗决策4。大部分预后测试治疗选择的预测值2,4。这些多参数测试包括(Genomic Health Inc.)5,6、ProsignaTM(NanoString Technologies,Inc.)7-9、(Agendia Inc.)10,11、乳腺癌指标(BioTheranostics Inc.)12,13和EndoPredict(Sividon Diagnostics GmbH)14，它们均提供了广泛类似的临床应用15,16。尽管每个均来源于RNA丰度研究，但是意外地，在不同RNA特征(RNA signature)之间仍存在少量重叠基因17。Prat等人通过计算机证明组合特征可以更准确地预测结局，从而导致更大的临床显著性18。尽管如此，尽管经历了十余年多个剩余风险(残余风险，residual risk)特征的发展，但是通过这些测试尚未显著加快分层或靶向医学的发展。现有测试无一鉴别出可以形成下一代分层医学方法基础的可执行靶标。
发明内容
在一个方面，提供了在乳腺癌受试者中预后仅内分泌治疗(endocrine-onlytreatment)的方法，所述方法包括：a)提供乳腺癌肿瘤样品；b)确定所述肿瘤样品中表4所列基因中至少40个的表达水平；c)将所述表达水平与来自受试者群组的对照样品的基因组群(基因的组，group of genes)的参考表达水平相比；和d)确定与乳腺癌有关的剩余风险；其中与参考表达水平相比，所述基因组群表达中的统计学显著差异或相似性对应于与乳腺癌有关的剩余风险。
在一个方面，提供了在乳腺癌受试者中预后仅内分泌治疗的计算机-实施的方法，所述方法包括：a)在至少一个处理器接收反映所述肿瘤样品中表4所列基因中的至少40个的表达水平的数据；b)在至少一个处理器构建对应于所述表达水平的表达谱；c)在至少一个处理器，将所述表达水平与来自受试者群组的对照样品的基因组群的参考表达水平相比；d)在至少一个处理器，确定与乳腺癌有关的剩余风险；其中与参考表达水平相比，所述基因组群表达中的统计学显著差异或相似性对应于与乳腺癌有关的剩余风险。
在一个方面，提供了结合具有处理器和连接至所述处理器的存储器的通用计算机(general-purpose computer)使用的计算机程序产品，所述计算机程序产品包含具有在其上所编码的计算机机构(computer mechanism)的计算机可读存储介质，其中所述计算机程序机构可以载入所述计算机的存储器并使所述计算机实施本文所述的方法。
在一个方面，提供了用于存储本文所述的计算机程序产品的在其上已存储数据结构的计算机可读介质。
在一个方面，提供了预后或分类用内分泌疗法治疗的乳腺癌受试者的装置，所述装置包含：至少一个处理器；和与所述至少一个处理器通信的电子存储器，所述电子存储器存储处理器-可执行代码，从而当在所述至少一个处理器执行时，导致所述至少一个处理器：a)接收反映所述肿瘤样品中表4所列基因中的至少40个的表达水平的数据；b)构建对应于所述表达水平的表达谱；c)将所述表达水平与来自受试者群组的对照样品的基因组群的参考表达水平相比；和d)在所述至少一个处理器确定与乳腺癌有关的剩余风险，其中与参考表达水平相比，所述基因组群表达中的统计学显著差异或相似性对应于与乳腺癌有关的剩余风险。
在一个方面，提供了治疗乳腺癌受试者的方法，其包括：a)根据本文所述的方法确定受试者的剩余风险；和b)基于所述剩余风险选择疗法，并且优选地根据所述疗法来治疗所述受试者。在一些实施方式中，如果相对于参考群组的群体中值(population median)，所述患者具有相对高剩余风险，则选择内分泌疗法和化学疗法的组合作为治疗。
在一个方面，提供了包含多个分离的核酸序列的组合物，其中每个分离的核酸序列杂交至：(a)对应于表4中所列的至少40个基因的基因组群的mRNA；和/或(b)与a)互补的核酸，其中所述组合物用于测量基因组群的表达水平。
在一个方面，提供了阵列，其包含与表4所列基因中至少40个的表达产物互补和可杂交的一个或多个多核苷酸探针。
在一个方面，提供了试剂盒，其包含用于从乳腺癌肿瘤样品中检测至少一个表4所列基因中至少40个的mRNA的试剂。
通过结合附图阅读具体实施方式的下列说明，本发明公开的其它方面和特征对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
仅通过举例的方式，参考附图，现将描述本发明公开的实施方式。
图1A-1D是TEAM病理学群组中一组95-基因剩余风险特征的Kaplan Meier存活图。图1A)基于预后模型(包括结节状态(结状态，nodal status))应用于仅接收内分泌疗法的患者验证群组(validation cohort)的存活曲线。图1B)作为四分位数分组的A中所示的风险得分估值，其中每个组与Q1相比。使用Cox比例风险模型估计危险比，并且使用对数秩检验估计存活差异的显著性。图1C)TEAM验证群组中患者风险得分的分布，其显示了作为患者风险得分的函数的预测的5年复发概率(实线)和95％CI(短划线边界阴影区)。垂直的黑色短划线表示训练组中值风险得分(training set median risk score)。图1D)TEAM验证群组中患者风险得分的分布，其显示了作为患者风险得分的函数的预测的10年复发概率(实线)和95％CI(短划线边界阴影区)。垂直的黑色短划线表示训练组中值风险得分。
图2A和2B显示了验证群组中95-基因剩余风险特征与多参数测试的比较。A)验证群组中，除临床协变量外，使用95-基因剩余风险特征及其它当前多参数测试评价的患者的总结信息。根据整体一致性排序的患者样品，在所有测试中，将称为高风险或低风险的所有患者分别安排在热图底部和顶部。包括标准临床协变量，如HER2状态、年龄、等级、结节状态、分期(阶段，stage)。还显示了基于PAM50/Prosigna-样测试的分子亚型分型。B)作为表现指示，还显示了每个多参数测试的接收者工作特征曲线下面积(AUC)。所显示的所有患者为仅接受内分泌治疗的那些患者。
图3A-3G显示了95-基因剩余风险特征内的信号模块(signaling module)。图3A)95-基因剩余风险特征基因中REACTOME相互作用的总结。从95-基因剩余风险特征鉴别了包含52个基因的6个主要相互作用模块。通过连接线显示模块之间和模块内基因间的关系。具有箭头的实线表明了已知和直接的正相关性。以垂直线结束的实线表明了已知的负调控关系。虚线表示通过其它基因连接的关系。具有红色圆圈的基因表示基因靶标，对于所述基因靶标，存在已知的靶向疗法或基于完整性(Integrity)化合物检索工具(ThompsonReuters)和ClinicalTrials.gov(https://clinicaltrials.gov/)处于II/III期开发。图3B-3G)显示了每个模块的Kaplan Meier存活曲线(左图)，并且代表验证群组。每个KaplanMeier曲线右侧为作为四分位数分组的风险得分估值，其中每个组与Q1相比。使用Cox比例风险模型估计危险比，并且使用对数秩检验估计存活差异的显著性。所显示的所有患者为仅接受内分泌治疗的那些。
图4显示了包含95-基因剩余风险特征的基因的单变量结果。热图显示了仅内分泌-治疗患者的训练群组中包含最终剩余风险特征的95个基因的归一化和换算(scaled)mRNA丰度谱。以如下所示顺序列出了在热图上显示的95个基因：BUB1B、CEP55、MYBL2、ANLN、ECT2、MKI67、MCM10、NUSAP1、BIRC5、UBE2T、RRM2、CENPF、PTTG1、ORC6L、CENPA、CDK1、CCNB1、KIF2C、EXO1、CDC20、STK15、PRC1、MELK、STMN1、NEK2、CDC6、CCNB2、MCM6、MCM2、ESPL1、PIk1、KPNA2、ASPM、SLC7AS、KNTC2、GNAZ、CCNE1、CCNE2、MAD2、TYMS、UBE2C、RACGAP1、DTL、CXXC5、CDCA7、RFC4、DIAPH3、CDCA1、C16ort61、ESM1、CK8、MMP9、GMPS、AYTL2、OSCN6L1、MMP11、LIN9。
图5A-5F显示了训练群组(training cohort)中用于模型比较的Kaplan Meier曲线。A)基于无临床协变量建模的95-基因剩余风险特征的预后模型的Kaplan Meier存活曲线，并且其表示仅接受内分泌疗法的患者。B)作为四分位数分组的A中所示的风险得分估值，其中每个组与Q1相比。使用Cox比例风险模型估计危险比，并且使用对数秩检验估计存活差异的显著性。C)基于临床协变量，包括年龄、等级、病理学肿瘤尺寸和结节状态建模的95-基因剩余风险特征的预后模型的Kaplan Meier存活曲线；并且其表示仅接受内分泌疗法的患者。D)作为四分位数分组的C中所示的风险得分估值，其中每个组与Q1相比。使用Cox比例风险模型估计危险比，并且使用对数秩检验估计存活差异的显著性。E)在仅接受内分泌疗法的患者中，基于仅以结节状态作为唯一临床协变量建模的95-基因剩余风险特征的预后模型的Kaplan Meier存活曲线。F)作为四分位数分组的E中所示的风险得分估值，其中每个组与Q1相比。使用Cox比例风险模型估计危险比，并且使用对数秩检验估计存活差异的显著性。
图6A-6D显示了验证群组中用于模型比较的Kaplan Meier曲线。A)基于无临床协变量建模的95-基因剩余风险特征的预后模型的Kaplan Meier存活曲线，并且其表示仅接受内分泌疗法的患者。B)作为四分位数分组的A中所示的风险得分估值，其中每个组与Q1相比。使用Cox比例风险模型估计危险比，并且使用对数秩检验估计存活差异的显著性。C)基于临床协变量，包括年龄、等级、病理学肿瘤尺寸和结节状态建模的95-基因剩余风险特征的预后模型的Kaplan Meier存活曲线；并且其表示仅接受内分泌疗法的患者。D)作为四分位数分组的C中所示的风险得分估值，其中每个组与Q1相比。使用Cox比例风险模型估计危险比，并且使用对数秩检验估计存活差异的显著性。
图7显示了验证群组中化学疗法-治疗和非化学疗法-治疗患者中95-基因剩余风险特征的验证。A)在包含接受辅助化学疗法并对化学疗法进行调整的患者的验证群组中，基于包括结节状态的95-基因剩余风险特征的预后建模的Kaplan Meier存活曲线。B)作为四分位数分组的A中所示的风险得分估值，其中每个组与Q1相比。使用Cox比例风险模型估计危险比，并且使用对数秩检验估计存活差异的显著性。C)如A中所示的存活曲线并且将患者区分为高或低风险和使用辅助化学疗法治疗和对化学疗法进行调整。
图8显示了验证群组中HER2-阳性和HER2-阴性患者中的95-基因剩余风险特征的验证。A)在未接受对HER2状态调整的辅助化学疗法(adjuvant chemotherapy)的患者的验证群组中，基于包括结节状态的95-基因剩余风险特征的预后建模的Kaplan Meier存活曲线。B)在未接受对HER2-阴性患者调整的辅助化学疗法的患者的验证群组中，基于包括结节状态的95-基因剩余风险特征的预后建模的Kaplan Meier存活曲线。C)在未接受对HER2-阳性患者调整的辅助化学疗法的患者的验证群组中，基于包括结节状态的95-基因剩余风险特征的预后建模的Kaplan Meier存活曲线。
图9A-9G显示了当前商业和学术多参数测试的Kaplan Meier存活分析。图中显示了基于对验证群组中多个多参数测试建模的基因表达的Kaplan Meier存活曲线。A)验证群组中患者的Prosigna测试结果。鉴别为低和中等-风险的患者显示出类似的存活，而高风险患者显示出较差的DRFS。B)基于Prosigna多参数算法，根据固有亚型分型结果，患者的Kaplan Meier存活。C)使用风险得分(RS)截止值25二分，基于OncotypeDx-样表达分析的验证群组的Kaplan Meier存活分析。D)基于MammaPrint-样表达分析的验证群组的KaplanMeier存活分析。E)基于基因组学等级指数-样表达分析的验证群组的Kaplan Meier存活分析。F)基于IHC4基因(ER、PgR、Ki67和HER2)的RNA表达值，定义为低-和高-风险的患者的验证群组的Kaplan Meier存活分析。G)基于IHC4基因(ER、PgR、Ki67和HER2)的蛋白表达值，定义为低-和高-风险的患者的验证群组的Kaplan Meier存活分析。
图10显示了使用剩余风险的95-基因特征(gene signature)，患者对新型治疗剂的假定分层。显示了基于95-基因特征，对通过基于表达谱的计算机途径分析鉴别的靶向疗法的假定临床试验设计。在该方案中，通过所述特征鉴别为低风险的患者仅接受内分泌治疗。然后，与其它基因组标志物，如基因突变状态和拷贝数的整合一起，将视为高风险的那些患者分类至针对驱动他们的癌症的途径的靶向治疗。
图11A-11B显示了TEAM试验方案和患者样品。A)他莫昔芬和依西美坦辅助治疗国际联合试验(TEAM)病理学群组的试验方案。将合格患者随机分配以接受2.5年的他莫昔芬，然后剩余2.5年接受依西美坦；或者接受依西美坦5年。B)TEAM群组中统计效力的总结。C)对当前研究所采集和处理的样品总结。
图12显示了归一化策略的预处理方法排序。预处理TEAM群组。热图显示了基于它们使HER2+ve和HER2-ve谱之间分子差异最大、而使批次影响最小的能力的预处理方法的排序。对于预处理方法的252种组合，根据以上标准建立两种排序，并随后使用排序产物集合。基于集合排序对热图分类，其中最有效的预处理参数出现在顶部。
具体实施方式
通过单独的内分泌疗法可以有效控制具有激素受体阳性早期乳腺癌的一些妇女，然而对于其它妇女，额外的全身化学疗法治疗是必需的。控制高风险妇女的临床困难在于鉴别现有的和新型药物靶标，以及鉴别将受益于这些疗法的那些患者。
使用由3,825例激素-受体阳性(ER+和/或PgR+)病例组成的并且包括477例(13％)HER2-阳性病例的他莫昔芬和依西美坦辅助治疗国际联合试验(TEAM)病理学群组19，实施mRNA丰度分析以鉴别基因特征，例如，鉴别并验证了剩余风险的95-基因特征。在内分泌-治疗患者的背景中，95-基因特征在改善风险分层中是有用的。此外，这种基因特征可以用于揭示潜在的药物靶标，改善分层以发展用于这些高风险患者的靶向疗法。
95基因特征和治疗
将从学术研究和商业多参数测试以及对乳腺癌病理发生重要的基因中搜集的一组基因用于绘制3,825位患者的谱图。验证了95个基因的特征，包括结节状态，从而基于无远处复发存活(distant relapse-free survival)(DRFS；HR＝5.05，95％CI 3.53-7.22，p＝7.51×10-22)，将内分泌-治疗患者分层为高和低风险组。还发现这种风险特征的表现优于当前的多参数试验。当在验证群组(包括接受辅助化学疗法的患者)中将95-基因预后特征应用于所有患者时，所述特征保持预后(HR＝4.76，95％CI 3.56-6.2，p＝8.87×10-28)。功能基因互相作用分析鉴别了6个显著模块，其表示参与细胞周期控制、有丝分裂和受体酪氨酸信号的途径；包含使用现有靶向疗法用于乳腺或其它恶性肿瘤的一些基因。因此，使用这种预后特征的高风险患者的鉴别还具有对于使用这些靶向疗法治疗的患者排列优先次序的潜力。
如将显而易见的，本发明的一个方面的优选特性和特征适用于本发明的任何其它方面。应注意，除非上下文明确规定，否则如本文所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数提及对象。
在一个方面，提供了在乳腺癌受试者中预后仅内分泌治疗的方法，所述方法包括：a)提供乳腺癌肿瘤样品；b)确定所述肿瘤样品中表4所列基因中至少40个的表达水平；c)将所述表达水平与来自受试者群组的对照样品的基因组群的参考表达水平相比；和d)确定与乳腺癌有关的剩余风险；其中与参考表达水平相比，所述基因组群表达中的统计学显著差异或相似性对应于与乳腺癌有关的剩余风险。
如本文所使用的术语“受试者”是指动物界的任何成员，优选地人，并且最优选地患有乳腺癌或者怀疑患有乳腺癌的人。
如本文所使用的术语“样品”是指可以测定生物标志物表达产物和/或参考表达谱，例如，液体活组织检查中差异存在的肽的来自受试者的任何液体(流体)、细胞或组织样品。
如本文所使用的术语“预后”是指临床结局组，如与通过参考谱图，如生物标志物参考表达谱所反映的或者通过本文所公开的十五个生物标志物的表达水平所反映的疾病亚型有关的更坏的存活组或更好的存活组。预后提供了疾病发展的指征，并且包括由于癌症死亡的可能性的指征。在一个实施方式中，临床结局分类包括更好的存活组和更坏的存活组。
如本文所使用的术语“预后或分类”表示根据受试者与和预后有关的参考谱图或生物标志物表达水平的相似性，预测或鉴别受试者所属的临床结局组。例如，预后或分类包括确定患有乳腺癌的个体是否具有更好或更坏的存活结局，或者将患有乳腺癌的个体分为更好的存活组或更坏的存活组，或者预测患有乳腺癌的个体是否将对疗法起反应的方法或过程。
如本文所使用的术语“基因”是指多核苷酸，其可以包括编码序列、插入序列和控制转录和/或翻译的调控元件。基因包括编码多态性的基因的正常等位基因，其包括对基因编码的多肽的氨基酸序列无影响的沉默等位基因以及导致产生大体上不影响其功能的编码多肽的氨基酸序列变体的等位基因。这些术语还可以任选地包括具有影响所编码的多肽的功能的一个或多个突变的等位基因。
如本文所使用的短语“确定生物标志物的表达”是指确定或定量所述生物标志物所表达的RNA或蛋白质或者蛋白质活性或者蛋白质-相关代谢产物。术语“RNA”包括mRNA转录本，和/或mRNA特异性剪接或者其它替代变体，包括反义产物。如本文所使用的术语“生物标志物的RNA产物”是指从生物标志物和/或特异性剪接或替代变体转录的RNA转录本。就“蛋白质”而言，它是指从生物标志物转录的RNA转录本翻译的蛋白质。术语“生物标志物的蛋白产物”是指从生物标志物的RNA产物翻译的蛋白质。
如本文所使用的术语“表达的水平”或“表达水平”是指生物标志物产物可测量的表达水平，无限制地如所表达的微小RNA、信使RNA转录本的水平或者转录本的特定外显子或其它部分的水平、生物标志物的所表达的蛋白或其部分的水平、生物标志物的DNA多态性的数目或存在、生物标志物的酶活力或其它活力和特定代谢产物的水平。
如本文所使用的术语“差异表达的”或“差异表达”是指可以通过测量生物标志物产物的表达水平测定的生物标志物表达水平的差异，如所表达的mRNA或其部分的水平差异。在优选的实施方式中，所述差异是统计学显著的。术语“表达水平的差异”是指给定生物标志物可测量的表达水平的升高或降低，例如，如与对照中给定生物标志物可测量的表达水平相比，通过mRNA的量所测量的。
在某些实施方式中，所述基因组群为表4所列基因中的至少40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95个。
在一些实施方式中，所述方法还包括从所述基因组群确定的表达水平构建受试者基因表达谱图。
在一些实施方式中，确定剩余风险包括确定模块失调得分(moduledysregulation score，MDS)，其包含基因组群权重(weight)乘以换算的(折合的，scaled)mRNA丰度的总数(总和，sum)。在一些实施方式中，高MDS得分与较高的剩余风险和/或较差的存活有关，并且其中低MDS得分与较低的剩余风险和/或较好的存活有关。
如本文所使用的“总存活(总存活率、总存活期)”是指研究或处理组中从疾病，如癌症诊断之日或治疗开始时算起仍存活的人的百分比或时间长度。在临床试验中，测量总存活是观察新治疗起作用程度的一种方式。
如本文所使用的，“无复发存活”就癌症来说是指研究或处理组中在对癌症初步治疗之后，无任何癌症病征或症状存活的人的百分比或时间长度。在临床试验中，测量无复发存活是观察新治疗起作用程度的一种方式。将其定义为任何疾病复发(局部、区域或远处)。
如本文所使用的术语“良好的存活”或“较好的存活”是指与“不良存活”组中的患者相比，存活机会提高。例如，本发明申请的生物标志物可以将患者预后或分类至“良好存活组”。这些患者具有较低的术后死亡风险。
如本文所使用的术语“不良存活”或“较差的存活”是指与“良好存活”组中的患者相比，死亡风险提高。例如，本发明申请的生物标志物或基因可以将患者预后或分类至“较差存活组”。这些患者具有更大的由于疾病或对于疾病的手术、治疗或其它原因所造成的死亡或不良反应风险。
在一些实施方式中，所述方法还包括使用至少一个对照，优选地多个对照归一化所述mRNA的丰度。
在一些实施方式中，所述多个对照中的至少一个包括参考受试者或受试者的参考基因的mRNA丰度。
“对照群体”是指限定的个体组或者患有或未患癌症的个体组，并且可以任选地通过(但不限于)地理、种族、人种、性别、一种或多种其它病况或疾病和/或文化指标进一步鉴别。在大多数情况下，对照群体可以涵盖至少10、50、100、1000个或更多的个体。
“阳性对照数据”涵盖了代表在患有本发明的癌症的一个或多个受试者中的每一个中通过本发明的靶标基因所编码的RNA水平的数据，并且涵盖了在患有本发明的癌症的多个受试者中通过本发明的靶标基因所编码的RNA的平均水平的单一数据点。
“阴性对照数据”涵盖了代表在未患本发明的癌症的一个或多个受试者中的每一个中通过本发明的靶标基因所编码的RNA水平的数据，并且涵盖了在患有本发明的癌症的多个受试者中通过本发明的靶标基因所编码的RNA的平均水平的单一数据点。
试验数据“对应”于阳性对照数据或阴性对照数据的可能性分别是指与未患乳腺癌的受试者相比，试验数据更可能表现出患有乳腺癌的受试者中所得数据的特征的可能性，或者与患者乳腺癌的受试者对治疗的反应相比，更可能表现出在未患乳腺癌的受试者对治疗的反应中所得的数据的特征的可能性。
在一些实施方式中，所述方法还包括将受试者的临床指征与多个参考临床指征相比较，其中所述临床指征包括年龄、肿瘤等级、病理肿瘤尺寸或结节状态中的至少一种，优选地结节状态，并且将这些临床指征在MDS上拟合，优选地使用多变量Cox比例风险模型。
因此，除激素疗法之外，高风险患者的预后可以受益于更激烈的疗法，例如，辅助疗法。辅助疗法可以包括化学疗法、放射疗法、激素疗法、靶向疗法或生物学疗法。
在一些实施方式中，所述方法还包括如果相对于参考群组的群体中值(population median)，受试者具有相对高的剩余风险，则用组合的内分泌疗法和化学疗法治疗所述受试者。
在一些实施方式中，所述乳腺癌是激素受体阳性(ER+)。
在一些实施方式中，使用确定表达水平。
在一些实施方式中，所述剩余风险表示无远处复发存活。
在一个方面，提供了治疗乳腺癌受试者的方法，其包括：a)根据本文所述的方法确定受试者的剩余风险；和b)基于所述剩余风险选择疗法，并且优选地根据所述疗法来治疗所述受试者。在一些实施方式中，如果相对于参考群组的群体中值，所述患者具有相对高的剩余风险，则选择内分泌疗法和化学疗法的组合作为治疗。
装置和系统
在一个方面，提供了在乳腺癌受试者中预后仅内分泌治疗的计算机-实施的方法，所述方法包括：a)在至少一个处理器接收反映所述肿瘤样品中表4所列基因中的至少40个的表达水平的数据；b)在至少一个处理器构建对应于所述表达水平的表达谱；c)在至少一个处理器，将所述表达水平与来自受试者群组的对照样品的基因组群的参考表达水平相比；d)在至少一个处理器，确定与乳腺癌有关的剩余风险；其中与参考表达水平相比，所述基因组群表达中的统计学显著差异或相似性对应于与乳腺癌有关的剩余风险。
如本文所使用的，“处理器”可以是任何类型的处理器，如(例如)任何类型的通用微处理器或微控制器(例如，IntelTM x86、PowerPCTM、ARMTM处理器等)、数字信号处理(DSP)处理器、集成电路、现场可编程门阵列(FPGA)或它们的任意组合。
如本文所使用的“存储器”可以包括位于内部或外部的任何类型的计算机存储器的适合的组合，如(例如)随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、光盘只读存储器(CDROM)、电光存储器、磁光存储器、可擦可编程序只读存储器(EPROM)和电可擦可编程序只读存储器(EEPROM)等。可以使用常规文件系统组织存储器102的部分，并通过控制装置整体操作的操作系统来控制和管理。
如本文所使用的，“计算机可读存储介质”(也称为机器可读介质，处理器可读介质或其中编入了计算机可读程序代码的计算机可用介质)是能够以计算机或机器可读形式存储数据的介质。机器可读介质可以是任何适合的有形、非瞬时介质，其包括磁性、光学或电存储介质，其包括磁盘、只读光盘(CD-ROM)、存储装置(易失或非易失)或类似的存储机构。计算机可读存储介质可以含有多组指令、代码序列、配置信息或其它数据，当执行时，其导致处理器根据本发明公开的实施方式执行方法中的步骤。本领域那些技术人员将理解执行所述执行过程所必需的其它指令和操作也可以存储在计算机可读存储介质上。可以通过处理器或其它适合的处理装置执行存储在计算机可读存储介质上的指令，并且所述指令可以与电路相连以执行所述任务。
如本文所使用的，“数据结构”是在计算机中组织数据从而使其可以有效使用的具体方式。数据结构可以执行一个或多个具体的抽象数据类型(ADT)，其指定了可以在数据结构上执行的操作和那些操作的计算复杂性。相比而言，数据结构是通过ADT所提供的技术要求(specification)的具体执行过程。
本发明公开的实施方式可以表示为机器可读介质(也称为计算机-可读介质、处理器-可读介质或其中编入了计算机可读程序代码的计算机可用介质)中存储的计算机程序产品。机器可读介质可以是任何适合的有形、非瞬时介质，其包括磁性、光学或电存储介质，其包括磁盘、只读光盘(CD-ROM)、存储装置(易失或非易失)或类似的存储机构。机器可读介质可以含有多组指令、代码序列、配置信息或其它数据，当执行时，其导致处理器根据本发明公开的实施方式执行方法中的步骤。本领域那些技术人员将理解执行所述执行过程所必需的其它指令和操作也可以存储在机器可读介质上。可以通过处理器或其它适合的处理装置执行存储在机器可读介质上的指令，并且所述指令可以与电路相连以执行所述任务。
在一些实施方式中，所述处理器通过计算模块失调得分(MDS)确定剩余风险，所述模块失调得分(MDS)包含基因组群权重乘以换算的mRNA丰度的总数。
在一些实施方式中，高MDS得分与较高的剩余风险和/或较差的存活有关，并且其中低MDS得分与较低的剩余风险和/或较好的存活有关。
在一些实施方式中，所述处理器还使用至少一个对照，优选地多个对照归一化所述mRNA的丰度。
在一些实施方式中，所述多个对照中的至少一个包括参考受试者或受试者的参考基因的mRNA丰度。
在一些实施方式中，所述处理器还将受试者的临床指征与多个参考临床指征相比较，其中所述临床指征包括年龄、肿瘤等级、病理肿瘤尺寸或结节状态中的至少一种，优选地结节状态，并且将这些临床指征在MDS上拟合，优选地使用多变量Cox比例风险模型。
在一些实施方式中，所述方法还包括如果相对于参考群组的群体中值，受试者具有相对高的剩余风险，则输出使用组合的内分泌疗法和化学疗法治疗所述受试者的建议。
在一些实施方式中，所述乳腺癌是激素受体阳性(ER+)。
在一些实施方式中，所述剩余风险表示无远处复发存活。
在一个方面，提供了结合具有处理器和连接至所述处理器的存储器的通用计算机使用的计算机程序产品，所述计算机程序产品包含具有在其上所编码的计算机机构的计算机可读存储介质，其中所述计算机程序机构可以载入所述计算机的存储器并使所述计算机实施本文所述的方法。
在一个方面，提供了用于存储本文所述的计算机程序产品的在其上已存储数据结构的计算机可读介质。
在一个方面，提供了预后或分类用内分泌疗法治疗的乳腺癌受试者的装置，所述装置包含：至少一个处理器；和与所述至少一个处理器通信的电子存储器，所述电子存储器存储处理器-可执行代码，从而当在所述至少一个处理器执行时，导致所述至少一个处理器：a)接收反映所述肿瘤样品中表4所列基因中的至少40个的表达水平的数据；b)构建对应于所述表达水平的表达谱；c)将所述表达水平与来自受试者群组的对照样品的基因组群的参考表达水平相比；和d)在所述至少一个处理器确定与乳腺癌有关的剩余风险，其中与参考表达水平相比，所述基因组群表达中的统计学显著差异或相似性对应于与乳腺癌有关的剩余风险。
诊断试剂
在一个方面，提供了包含多个分离的核酸序列的组合物，其中每个分离的核酸序列杂交至：(a)对应于表4中所列的至少40个基因的基因组群的mRNA；和/或(b)与a)互补的核酸，其中所述组合物用于测量基因组群的表达水平。
在一个方面，提供了阵列，其包含与表4所列基因中至少40个的表达产物互补和可杂交的一个或多个多核苷酸探针。
在一个方面，提供了试剂盒，其包含用于从乳腺癌肿瘤样品中检测表4所列基因中至少40个至少之一的mRNA的试剂。
引物的实例包括当置于其中催化与多核苷酸互补的引物延伸产物的合成的条件下时，能够作为多核苷酸沿互补链合成的起始点的寡核苷酸。这些条件包括四种不同的核苷三磷酸或核苷类似物和一种或多种用于聚合反应的试剂，如DNA聚合酶和/或反转录酶在适当的缓冲液(“缓冲液”包括作为辅因子，或影响pH、离子强度等的替代物)和在适合的温度下的存在。引物必需足够长，从而在存在用于聚合酶的试剂的情况下促使延伸产物的合成。典型的引物含有大体上与靶标序列互补的至少约5个核苷酸的序列长度，但是稍微更长的引物是优选的。引物将始终含有大体上与靶标序列(即，将扩增的具体序列)互补的序列，并且对所述序列可以退火。
如本文所使用的术语“互补”或者“其互补序列”表示在整个互补区内能够与另一个指定的多核苷酸形成Watson&Crick碱基配对的多核苷酸序列。该术语仅基于它们的序列适用于多核苷酸对，并且不表示两个多核苷酸实际上将结合的任何具体条件。
术语“探针”是指可以可检测地区别靶标分子在结构方面的差异(如等位基因变体)的分子。可以通过多种不同的方式完成检测，但是优选地基于特异性结合的检测。这些特异性结合的实例包括抗体结合和核酸探针杂交。
术语“杂交”或“可杂交的”是指与互补核酸的序列特异性非共价结合相互作用。在优选的实施方式中，所述杂交是在高严格性条件下进行的。促进杂交的适当的严格性条件是本领域技术人员已知的，或者可见于Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1 6.3.6。例如，可以使用约45℃的6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后用2.0×SSC在50℃清洗。
所述多核苷酸组合物可以是引物，可以是cDNA，可以是RNA，可以是与靶标cDNA或其部分互补的DNA、基因组DNA、非剪接RNA、剪接RNA、交替剪接的RNA、合成形式和混合聚合物，包括正义和反义链两者，并且可以化学或生物化学修饰或者可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基，如本领域技术人员将容易地理解的。
当核酸包括RNA时，对所示序列的提及应视为对RNA等价物(用U替代T)的提及。
对于本领域技术人员来说，核酸分离、扩增和分析的方法是常规的，并且可以在例如，分子克隆：实验室手册(3-卷组)Joseph Sambrook,David W.Russel,and JoeSambrook,Cold Spring Harbor Laboratory；第3版(Jan.15,2001),ISBN:0879695773中找到规程实例。对于PCR扩增中使用的方法，特别有用的规程来源为PCR(Basics:FromBackground to Bench)，M.J.McPherson,S.G.Moller,R.Beynon,C.Howe,SpringerVerlag；第1版(Oct.15,2000),ISBN:0387916008。
扩增技术的实例包括链置换扩增，如美国专利No.5,744,311中所公开的；无转录等温扩增，如美国专利No.6,033,881中所公开的；修复链式反应扩增，如WO 90/01069中所公开的；连接酶链式反应扩增，如欧洲专利申请320 308中所公开的；填隙连接酶链式反应扩增(gap filling ligase chain reaction amplification)，如美国专利No.5,427,930中所公开的；和无RNA转录的扩增，如美国专利No.6,025,134中所公开的。
“试剂盒”是指物理元件，例如，探针，其无限制地包括特异性引物、标记的核酸探针、抗体、蛋白质-捕获试剂、反应试剂(reagent)、说明书和对于实践本发明，具体地，对于鉴别样品中特定RNA分子水平有用的其它元件的组合。可以以任何适合于实施本发明的方式布置这些物理元件。例如，可以在一个或多个容器或在阵列或微阵列装置中提供探针和/或引物。
在一个实施方式中，可以在一个分析中确定通过靶标基因所编码的RNA水平。因此，组合试剂盒可以包括能够扩增来源于通过不同靶标基因所编码的RNA的cDNA的引物。可以差异标记引物，例如，使用不同的荧光标记物，从而将来自不同靶标基因的RNA相区分。
多重，如双重实时RT-PCR使得能够在相同反应中同时定量2个靶标，其节省时间、降低成本和保留样品。多重实时RT-PCR的这些优势使得该技术非常适合于高通量基因表达分析。实时形式的多重qPCR测定有利于定量测量并且最大程度降低了假阴性结果的风险。必需要优化多重PCR，从而在PCR的亚平台期(insub-plateau phase)比较所有样品的扩增子。Yun,Z.,I.Lewensohn-Fuchs,P.Ljungman,L.Ringholm,J.Jonsson,andJ.Albert.2003.A real-time TaqMan PCR for routine quantitation ofcytomegalovirus DNA in crude leukocyte lysates from stem cell transplantpatients.J.Virol.Methods 110:73-79.[PubMed]。Yun,Z.,I.Lewensohn-Fuchs,P.Ljungman,and A.Vahlne.2000.Real-time monitoring of cytomegalovirusinfections after stem cell transplantation using the TaqMan polymerase chainreaction assays.Transplantation 69:1733-1736.[PubMed]。同时定量多至2、3、4、5、6、7和8个或更多个靶标可以是有用的。
例如，包含在试剂盒内的引物和探针可以包括能够识别本文所述的95个基因特征的任何基因的那些。
“选择性杂交”至目标多核苷酸的引物是能够仅与或主要与和由样品中的RNA组成或者由与样品内RNA互补的cDNA组成的多核苷酸混合的单一目标多核苷酸杂交的引物。
可以使用多种技术在包含(但优选地不限于)本文所述的任何95个基因的一个或多个基因的RNA水平鉴别或确认存在于样品中的乳腺癌的基因表达谱，所述技术包括(但优选地不限于)PCR法，例如，如在本文的工作实施例中进一步讨论的，Northern分析和微阵列技术、和定量测序。可以使用多种技术，包括(例如)微阵列技术测量样品中的这种基因表达谱。在该方法的实施方式中，可以通过从样品提取的RNA的反转录，通过掺入荧光核苷酸产生荧光标记的cDNA探针。应用于芯片的标记的cDNA探针特异性地杂交至阵列上的每个DNA斑点。每个阵列元素的杂交的定量使得能够评价相应的mRNA丰度。例如，使用双重彩色荧光，从两个RNA源产生的单独标记的cDNA探针成对杂交至所述阵列。因此，同时确定了来自对应于每个指定基因的两个源的转录本的相对丰度。这些方法已显示具有检测以每个细胞几个拷贝数表达的稀有转录本和可重复地检测表达水平中至少约两倍差异所需的灵敏度(Schena等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(2):106-149(1996))。可以按照生产商的规程，通过可商购设备，如通过使用Affymetrix GenChip技术或Incyte's微阵列技术实施微阵列分析。
在本发明说明书中，出于解释的目的，描述了诸多细节以提供对实施方式的彻底理解。然而，对于本领域技术人员显而易见的是这些具体细节是不需要的。例如，对于本文所述的实施方式是否作为软件程序、硬件电路、固件或它们的组合实施，未提供具体细节。
可以将以上所列方面和/或实施方式以不同组合来进行组合，如本领域技术人员所理解的。通过以下实施例，进一步说明了本发明公开的优势。仅出于说明的目的提供了在本文中描述的实施例以及它们的具体细节，并且不应将这些视为对本发明的权利要求的限制。
实施例
材料和方法
TEAM试验为跨国、开放性III期试验，其中将患有激素受体-阳性19早期乳腺癌的经绝后妇女随机分配，从而在前2.5-3年，接受每天一次依西美坦(25mg)或每天一次他莫昔芬(20mg)；随后接受依西美坦(25mg)(总计治疗5年)(参见图11A)。通过免疫组织化学在本地评价激素-受体(ER和PgR)和HER2状态以进入试验，然后集中确认28，并通过免疫组织化学和荧光原位杂交(FISH)确认HER2状态29。根据ASCO/CAP指南30-32，实施所有评价工作。无一患者接受抗-HER2疗法。将无远处复发存活(DRFS)定义为从随机分组至远处复发或由于乳腺癌死亡的时间19。
TEAM试验包括由来自5个国家，平均临床追踪达6.86年的4,736位患者组成的病理学研究。实施效力分析(power analysis)以确认该研究规模在训练和验证群组中分别具有88.6％和100％的检测至少3.0的HR的效力(参见图11B)。RNA可从3,825个样品中获得并成功测定。将来自UK群组的患者分配为训练群组(n＝790)；而剩余的来自德国、比利时、荷兰和希腊的患者构成完全独立的验证群组(n＝3,035)。对所有患者测定mRNA丰度(参见图11C)。为了鉴别仅内分泌治疗后的剩余风险特征，主要分析排除了接受新辅助(新辅助化疗)和辅助化学疗法的那些患者。
TEAM群组的效力计算
为了评价在本研究中是否存在足够的发展预后标志物的能力，对仅内分泌群组以及内分泌+辅助化学疗法群组；完全TEAM群组(n＝2549并且事件＝320；n＝3,825并且事件＝507)；并且分别单独对于训练(n＝576并且事件＝67；n＝790并且事件＝106)和验证(n＝1973并且事件＝253；n＝3,035并且事件＝431)亚组两者实施效力计算。假设相等规模的患者组，使用以下公式(1)获得了表示对上述事件数观察到特定HR的可能性的效力估值37：
其中E代表事件总数(DRFS)并且α代表设置为10-3的显著性水平以表示多重检验校正。通过0.01的步阶(step)38，对范围在1至3的HR计算Z效力(Haider等人,已投稿)。
RNA提取和表达谱绘制
对每个病例5个4μm福尔马林-固定的石蜡-包埋的(FFPE)切片脱石蜡，将肿瘤区域宏观解剖并使用RecoverallTM总核酸分离试剂盒-RNA提取规程(LifeTechnologiesTM,Ontario,Canada)提取RNA。使用Nanodrop-8000分光光度计(Delaware,USA)定量RNA等份。成功测定了从TEAM病理学群组提取的全部3825个RNA。在Technologies(Seattle,Washington,USA)设计并合成了每个基因的探针；并且根据Technologies规程，使用分析系统杂交、处理和分析了每个样品250ng的RNA。
mRNA丰度分析和存活建模
使用来源于最高表达的75个基因的几何平均数的归一化因子，使用NanoStringNorm R软件包33,39(v1.1.19)，对原始mRNA丰度计数数据进行预处理。标记RNA含量|z-得分|>6的样品并作为离群值除去。为了评价该群组中所选择的归一化方法的表现，评价了总计252个预处理方法的组合：包括使用6个阳性对照、8个阴性对照和8个管家基因(RPLP0、TFRC、MRPL19、SF3A1、GAPDH、PSMC4、ACTB和GUS)，然后是全局归一化的归一化方法(参见图12)。为了鉴别最优预处理参数，评价了两种标准。首先，基于使HER2-阳性和HER2-阴性样品之间的ERBB2mRNA丰度的欧氏距离(Euclidean)最大化的能力，将每种预处理方法排序。对于每个预处理方案，对100万个HER2-阳性和HER2-阴性样品的随机子集重复该过程。第二，通过使用从5个随机选择的匿名FFPE乳腺肿瘤样品中提取的RNA混合物的15个重复，基于它们使批内差异最小化的能力，对每种预处理方法进行评价和排序。实施混合效应线性模型，并将残差估计(residual estimate)用作批间差异的估值(R软件包：nlme v3.1-117)。最后，基于两种度量方法的RankProduct40，基于这两种标准估计累积排序。基于排序产物选择最优预处理方法的最终选择，其将原始计数对来源于最高表达的75个基因的几何平均数进行归一化。作为可能的离群值，除去14个样品(RNA含量|z-得分|>5或具有低阵列间相关性)。对十四个样品重复两次，并且将它们的原始计数取平均值并随后在归一化之前作为单一样品处理。在排序产物中，所选方法在最高的10个预处理方法中(参见图12)。
通过将患者中值二分为高和低表达组，实施预处理mRNA丰度数据的单变量存活分析。将临床变量年龄二元建模(在55岁左右二分)，而作为有序变量对等级和结节状态建模，并作为连续变量对病理学大小建模。
基于网络的特征获得(network-based signature derivation)和模块失调得分
在仅内分泌-治疗的训练群组中，首先基于单变量Cox比例风险模型进行基因的特征-选择；保留p<0.25的那些。将这些保留的基因用于计算“模块失调得分”。
使用以下方法(Haider等人，已投稿)计算模块失调得分(MDS)：1)仅基于训练群组，通过拟合单变量Cox比例风险模型计算所有评价的基因的权重(β)；和2)然后，将这些权重乘以换算的mRNA丰度水平以估计每位患者的模块失调得分，如公式(2)所表示的：
本发明中，n代表给定模块中基因的数目，并且Xi代表基因i的换算的(z-得分)丰度。使用通过训练群组估计的参数，产生了验证群组中患者的MDS。
然后，与临床协变量(年龄、等级、病理学大小和结节状态)一起，对MDS进行多变量Cox比例风险模型；实施使用AIC的逐步向后选择法(stepwise backward selectionapproach)以改善多变量模型。在训练群组中训练最终选择的模型，并在完全独立验证群组中验证(参见表1)。将截短至10年的DRFS用作终点。如下所述估计复发概率。使用存活软件包(v2.37-4)，在R统计环境中对DRFS实施全部存活建模。通过接收者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)评价模型表现。
表1：内分泌治疗患者的临床特征
复发概率
通过在25个等段(equal bins)中分解预测风险得分来估计5-和10-年的复发概率。对于每个段(bin)，将复发概率R(t)计算为1-S(t)，其中S(t)为5年或10年的Kaplan-Meier存活估值。将局部多项式回归用于平滑这25段的R(t)估值。然后，将预测估值对除第一和最后一组之外的每组的中值风险得分作图，其中分别使用最低风险得分和第九十九百分位。在R统计环境(R软件包：survival v 2.38-3)中实施所有存活模型。
模型评价
使用接收者工作特征(ROC)曲线下面积评价存活模型的表现。实施排列分析(permutation analysis)以评价不同模型之间的AUC差异显著性(得分混合(shuffled)10,000次，同时保持存活对象的顺序)。
基于商业和基于学术的风险分层得分的获得
使用包含以下多参数测试(Genomic Health Inc.)5,6、ProsignaTM(NanoString Technologies,Inc)7-9、(Agendia Inc.)10,11的基因，获得类似的风险分类。
mRNA-IHC4风险得分：如所述的41,42，计算IHC4-蛋白模型风险得分，并对临床协变量进行调整。通过将ER组织得分(histoscores)除以30计算ER10得分，并且通过将PgR染色百分比除以10计算PgR10得分。将10倍交叉验证法用于训练模型并产生IHC4RNA风险得分。使用多变量Cox比例风险模型，在训练群组中对ESR1、PGR、ERBB2和MKI67的mRNA丰度谱训练mRNA-IHC4模型(表2)。将模型预测(连续风险得分)等分成四组(四分位，quartile)，并使用Kaplan-Meier分析和如上所述的对临床变量调整的多变量Cox比例风险模型进行分析。
OncotypeDX-样复发得分：如前所述43，将来自16个测试基因的数据归一化并将NanoString强度值log2转化以拟合原始发表文献(publication)的0-15的测量范围。然后，基于下式计算未换算的复发得分：RSU＝+0.47×GRB7组得分–0.34×ER组得分+1.04×增殖组得分+0.10×侵袭组得分+0.05×CD68–0.08×GSTM1–0.07×BAG1；并且最后如前所述43换算得分。然后，基于复发得分大于或小于25，将患者分别分为高或低结局组；并对DRFS建模。
Prosigna-样亚型分型和复发风险得分：基于Parker等人44所描述的方法对样品评分，并使用PAM50基因列表45-47的50个基因，在ER-阳性背景中进行训练。从最终亚型分类中除去“正常-样”亚组。从补充文件44获得R脚本(R scripts)，产生得分，然后对DRFS建模。
MammaPrint-样风险得分：基于genefu R软件包(v1.14.0)的基因70功能，对样品评分。根据van de Vijver等人48并基于DRFS的结局对低和高-风险分类的推导建模。
基因组学等级指数-样风险模型：使用MYBL2、KPNA2、CDC2和CDC20，基于Toussaint等人49所列程序，对样品评分。将表达数据用于计算平均表达管家基因(GUS、TBP、RPLPO和TFRC)，并将其用于归一化用于确定GGI得分的4个基因的表达。将患者分为低或高风险组并对DRFS建模。基因组学等级指数34；除了先前通过Prat等人18并在表2中描述了IHC435,36之外。
表2：mRNA-IHC4风险模型的系数和p-值
使用Reactome的途径分析
将最终基因列表加载到Cytoscape(v3.0.2)中Cytoscape Reactome功能相互作用(FI)插件中。作为FI网络2013版的基因组加载符号。通过FI注释和无接头基因构建FI网络。使用Reactome FI插件功能对每个模块计算光谱聚类和通路富集(enrichment)。
结果
对3,825位患者，产生了所有基因的RNA丰度谱。在具有完整疗法信息的患者中，2,549位单独用内分泌疗法治疗，而1,275位还接受了辅助化学疗法。将仅内分泌-治疗的患者分成576位-患者的训练群组(n＝67个事件)和1,973位-患者的验证群组(n＝253个事件)，其分别用于特征发现和验证。为了测试在内分泌-治疗的患者中训练和验证的所述特征对用辅助化学疗法治疗的患者的预后能力，然后对于验证群组中所有患者，对所述特征建模并对辅助化学疗法进行调整(n＝3,035)。每个群组中的平均追踪(中值追踪，medianfollow-up)分别为7.51和6.21年。表1中描述了内分泌-治疗的训练和验证群组的临床特征。表3中总结了3,825位患者的整个群组的临床特征。在训练和验证群组中，高肿瘤等级、结节状态、病理学大小和HER2IHC状态为单变量预后(参见表1和表3)。
表3：训练和验证群组的临床描述(内分泌-治疗和内分泌-治疗与辅助化学疗法)
内分泌治疗后，剩余风险特征的鉴别和验证
165个基因的初始基因列表的单变量评价鉴别了在仅内分泌治疗的患者中预后显著的95个基因(表4，参见图4)。将所述95个基因聚集成功能模块并用于训练剩余风险模型。在使用和不使用临床协变量的情况下，从这95个基因产生的MDS的建模导致包括结节状态作为仅有的临床协变量的最终改善的特征(参见图1)。在训练群组中，当在不使用临床协变量的情况下，使用所述95-基因特征时(HR高＝4.05，95％CI 2.25-7.3,p＝3.28×10-6；10-倍交叉验证)，和当包括临床协变量，如年龄、肿瘤等级、病理学肿瘤大小和结节状态时(HR高＝2.74,95％CI 1.61-4.65,p＝2.06×10-4；10-倍交叉验证)，发现风险模型是相当的(见图5)。当在中值附近二分并应用于验证组时，在内分泌治疗后，所得的95-基因特征是DFRS的稳健预测器(HR高＝5.05,95％CI 3.53-7.22,p＝7.51×10-19，参见图1A)。当在验证群组模型中包括全部临床协变量时，获得了与训练组类似的结果(HR高＝5.56，95％CI 3.85-8.03，p＝5.75×10-20，参见图6)。当将样品四等分时(参见图1B)，所述特征鉴别出具有极低风险的患者(10年时，<5％DRFS)。来自该特征的连续风险得分与5-年(参见图1C)和10-年(参见图1D)复发可能性直接相关，其中较高的风险得分与显著较高的转移性事件的可能性相关。
在存在辅助化学疗法的情况下，剩余风险的95-基因特征的表现
为了确定95-基因剩余特征是否在还接受了辅助化学疗法的患者中继续预后，将所述模型应用于验证群组中除了分层为化学疗法的所有患者(使用和未使用化学疗法)(参见图7A和7B)。结果显示所述95-基因特征在该患者亚型中仍预后(HR高＝4.7，95％CI 3.56-6.2，p＝8.87×10-28)。根据辅助化学疗法的分层显示在通过所述特征定义为低或高风险的患者之间在DRFS中无差异(参见图7C)。
当对HER2状态调整时，剩余风险的95-基因特征的表现
为了确定在HER2-阳性和HER2-阴性患者两者中所述95-基因剩余风险特征是否仍预后，将所述模型应用于未接受任何其它辅助化学疗法的验证群组中的患者并通过HER2-状态分层结果(参见图8)。当将所述模型应用于所有患者并通过HER2-状态分层时(参见图8A)，通过95-基因特征鉴别为低-风险的患者在HER2-阳性或HER-2阴性患者之间在DRFS中显示无显著性差异(p＝0.78)。类似地，对于鉴别为高-风险的患者，在HER2-阳性或HER2-阴性患者之间在DRFS中未观察到统计学显著差异(p＝0.09)，尽管观察到HER2-阳性患者显示出较差结局的趋势。整体上，所述特征可以在HER2-阳性(HR＝5.17；95％CI：1.25-21.38；p＝0.023)或HER2-阴性(HR＝4.75；95％CI：3.23-6.97；p＝2.01×10-15)患者亚型内区分高风险和低风险个体(参见图8B)。
95-基因特征对多参数测试的表现
使用NanoString RNA丰度数据，与已知的预后临床因子一起，产生并在图2A和表5中总结了来自当前多参数测试的风险得分。还显示了分子固有亚型分型结果(参见图2A)。尽管在所有测试中存在高-和低-风险患者的共同组，但是大量患者具有不一致结果(参见图2A，表6)。当与基于商业测试所产生的风险得分相比时(参见图2B，表7)，本研究的95-基因特征的表现优于这些多参数测试，其AUC为0.76。发现商业测试和95-基因风险得分之间的AUC差异是统计学显著的(表8)。表5和6中示出，除测试之间的整体一致性之外，整个验证群组的商业-样风险得分的总结，其中图9中显示并在补充数据中进一步描述了每种商业或学术风险分层测试的Kaplan Meier存活图。整体上，如使用NanoString RNA丰度数据所概括的，每个测试可以统计学显著地区分具有低或高复发风险的患者(参见图9)。
表5：验证群组不同测试的风险得分的总结
表6：验证群组中多参数测试的一致性
表7：验证群组中95-基因剩余风险特征和多参数测试的表现
HR HR.95L HR.95U P N AUC
95-基因特征 5.045 3.528 7.215 7.51×10<sup>-19</sup> 1924 0.76
MammaPrint-样 3.631 2.765 4.767 1.66×10<sup>-20</sup> 1973 0.72
Prosigna-样 3.49 2.592 4.699 1.75×10<sup>-16</sup> 1971 0.70
IHC4-RNA 3.475 2.346 5.148 5.11×10<sup>-10</sup> 1973 0.72
基因组学等级指数-样 3.118 2.341 4.153 7.51×10<sup>-15</sup> 1973 0.67
OncotypeDX-样 2.969 2.232 3.948 7.37×10<sup>-14</sup> 1973 0.71
IHC4-蛋白 2.398 1.851 3.108 3.72×10<sup>-11</sup> 1855 0.68
表8.多参数测试和95-基因剩余风险特征之间AUC的统计学差异
95-基因剩余风险特征和多参数测试的表现：
基因列表的组成使得能够获得代表一些商业和学术剩余风险分层测试的类似的风险分类(参见图2)。整个验证群组中每种商业和学术测试的Kaplan Meier存活率图显示了与那些多参数测试的表现一致的统计学显著结果(参见图9，表5和6)。在直接比较中，95-基因剩余风险分类器产生了0.76的曲线下面积(AUC)，其表现显著优于其它多参数测试结果(表7和8)。表现次优的分类器为MammaPrint-样结果(AUC＝0.72)、OncotypeDx-样(AUC＝0.71)、mRNA-IHC4(AUC＝0.72)、Prosigna-样(AUC＝0.70)、蛋白质-IHC4(AUC＝0.68)和基因组学等级指数-样结果(AUC＝0.67)。95-基因特征的表现显著优于基因组学等级指数-样(2.83×10-9)和Prosigna-样(p＝3.02×10-8)结果；同时表现还优于本研究中通过NanoString表达所产生的OncotypeDx-样(p＝5.10×10-3)和MammaPrint-样(p＝2.98×10-3)测试结果。表9中显示了测试间的一致性，其中95-基因特征显示出与MammaPrint-样和Prosigna-样结果更大的一致性。
Prosigna-样复发风险得分和分子亚型分型：使用包含Prosigna测试的基因，在仅内分泌治疗的验证群组中的1971位患者中，n＝194位鉴别为具有低风险；n＝744位鉴别为具有中等风险；和n＝1033位鉴别为具有高风险(参见表5，图9)。所观察到的验证群组的DRFS确认了上述研究，其显示鉴别为低-和中等-风险的那些患者比高风险患者经历了更长的DRFS(p＝1.65×10-17)(参见图9)。将低-和中等-风险患者组合导致产生了HR高＝3.49，95％CI 2.59-4.7，p＝1.75×10-16(参见图9)。分子亚型分型将777(39.3％)位患者鉴别为Luminal A，502位患者鉴别为Luminal B(25.4％)、352(17.8％)位患者鉴别为具有基底细胞-样分子特征(Basal-like molecular signature)；和342(17.5％)位患者鉴别为具有HER2富集-样分子特征(表5)。在鉴别为HER2富集-样并且对于HER2状态的信息可用的那些患者中，通过IHC发现113/334(33.8％)对于HER2增大或者对于HER2过表达为阳性，而剩余221(66.2％)对于蛋白表达的基因扩增为阴性。分子亚型中DRFS之间的差异显示相比于Luminal B-类患者，Luminal A-类患者经历了更长的DRFS(参见图9)；并且类似地，基底细胞-样患者经历了类似的8年DRFS，而HER2富集-样病例也经历了较短的DRFS(p＝8.88×10-23)(参见图9)
OncotypeDx-样风险得分：根据Paik等人43产生OncotypeDx-样风险得分。与TAILORx研究中所使用的截止值一致50,51，使用风险得分25作为截止值将患者二分为低或高风险组(参见图9)，从而鉴别出936位(47.4％)认为是低风险，1037位患者(52.6％)认为是高风险。对于风险得分大于25的患者，显示出其DRFS比风险得分较低的患者更短(HR高＝2.97，95％CI 2.23-3.95，p＝7.37×10-14)。
MammaPrint-样风险评估：在整个仅内分泌治疗的群组中，MammaPrint-样风险评估将1125(57.0％)位患者鉴别为低风险；并且将848(43％)位患者鉴别为高风险。对于低风险患者，DRFS较长，并且对于MammaPrint-样高-风险患者，DRFS较短(HR高＝3.63，95％CI2.77-4.77，p＝1.66×10-20，参见图9)。
基因组学等级指数-样风险模型：当根据基因组学等级指数分层患者时，995位患者(50.4％)被鉴别为低风险，而剩余1018位患者(49.6％)认为是高风险(HR高＝3.12，95％CI 2.34-4.15，p＝7.51×10-15)，参见图9)。
IHC4-mRNA风险评估：使用编码组内ER、PgR、Ki67和HER2的表达值，蛋白质-基剩余风险分类器IHC4的转化导致在仅内分泌治疗患者内，将569(28.8％)位患者鉴别为低风险，将1404(71.2％)位患者鉴别为高风险。对于通过IHC4-mRNA认为是低-风险的仅内分泌治疗的患者，其DFRS比认为是高风险的那些患者更长(HR高＝3.48，95％CI 2.35-5.15，p＝5.11×10-10，参见图9)。的确，根据原始报告，使用免疫组织化学结果，在HR中，mRNA的使用与IHC4相当(HR高＝2.4，95％CI 1.85-3.11，p＝3.72×10-11，参见图9)。
95-基因特征中药物靶标的鉴别和对于分层的精准医疗的意义
使用在特征方面包含95个基因中的52个的Reactome功能相互作用(FI)工具，鉴别出6个显著的网络模块(参见图3A，表10)。模块1、3和4包括参与有丝分裂(FDR&lt;5.0×10-4)、细胞周期(FDR&lt;3.33×10-4)以及与细胞周期检查点有关的途径(FDR＝0.0001)的基因。模块2包括参与受体-酪氨酸信号传导的基因和途径，包括ERBB途径信号传导(FDR&lt;6.66×10-5)、PI3K-AKT信号传导(FDR&lt;8.33×10-5)、p53信号传导(FDR&lt;5.00×10-4)和细胞凋亡(FDR＝0.00479)。模块内单个基因(表9)的归一化表达显示模块1、3和4内所有基因在分类为高风险的患者中更加高度表达(表9；Wilcoxon秩和检验)。
发现这些差异是统计学显著的(表9)。作为单个模块，它们是结局的统计学显著预测器(参见图3B)。虽然非统计学显著，但是当将全部95个基因一起用作剩余风险特征组时，观察到了较高的AUC，并因此作为最终列表继续(HR高＝5.05，95％CI 3.53-7.22，p＝7.51×10-19)。模块1由很大程度上与有丝分裂和细胞周期控制有关的基因，如BIRC5、BUB1B、CCNB1和PTTG1(表10)组成；并且可以将验证群组中的患者分类为低-或高-风险(HR高＝3.01，95％CI，p＝1.81×10-18)。类似地，来自模块3和4的基因，包括AURKA、CDK1、CCND1、CCNE2、CDC6和PLK1将患者分别分为低和高风险类：HR高＝3.3，95％CI 2.47-4.42，p＝9.82×10-16和HR高＝3.84，95％CI 2.83-5.21，p＝5.12×10-18(参见图3B)。将模块2内归一化的RNA丰度混合(表9)，其中一些在高风险患者中显示出表达减少(即TP53和BCL2)，而其它显示出表达增加(即CCNE1和RRM2)；但是当作为组建模时，模块2还可以鉴别具有更差预后的患者(HR高＝4.03，95％CI 2.98-5.45，p＝1.03×10-19)。最终，包含CDH3和MMP9的模块5(HR高＝1.33，95％CI1.04-1.71，p＝0.022)以及包含两种基因：KPNA2和KRT8的模块6(HR高＝2.65，95％CI 2.01-3.49，p＝5.43×10-12)也是DRFS的显著预测器。
表10：包含95-基因剩余风险特征的途径模块总结
错误发现率(FDR)p&lt;0.001的所选途径
*使用Thomson Reuters IntegritySM和ClinicalTrials.gov(https://clinicaltrials.gov/)进行的化合物检索
对于这些模块内的基因使用完整性化合物检索(Integrity Compound Search)(Thomson Reuters)，将一些靶标化合物鉴别为目前在临床上正用于治疗乳腺癌或其它肿瘤；或者处于II期和/或III期开发(https://clinicaltrials.gov/)(参见图3，表11)。在这些化合物中，在早期luminal乳腺癌背景中，对于通过在本研究中所使用的分类器认为是高风险的那些，一些化合物具有用于分层使用的潜力(表10)。因此，这些化合物保持了将靶标疗法再用于早期luminal乳腺癌的潜力(参见图10)。
内分泌治疗后的复发仍是显著的临床问题，这是因为在ER+疾病的治疗后，妇女死亡人数多于任何其它乳腺癌亚型3。因此，仍需要鉴别内分泌疗法后具有复发风险的妇女。更重要地，同时鉴别未来治疗性干预的靶标以及对于这些靶向疗法有效分层妇女的方式将改善这些患者的临床管理，并且潜在地降低她们的过度治疗，或者相反地，鉴别目前治疗不足的患者。使用来自TEAM病理学群组的3825位患者，获得了显著改善风险分层并且鉴别出目前在其它恶性肿瘤中存在正在对其使用或进行评价(https://clinicaltrials.gov/)的药物的基因的特征。可以将这些患者潜在地与该95基因特征内的具体功能模块相匹配(表10，表11)。如通过单个模块的预后能力所提及的(参见图3)，基于她们癌症的分子驱动，该方法具有将患者更好地分层至现有靶向疗法和/或用于体外验证研究的新型/假定靶标的潜力(参见图10)。尽管基于NanoString RNA丰度谱获得了商业风险得分和亚型分类，但是本研究确认了近期UK-OPTIMA prelim试验的发现17：大多数当前的乳腺癌多参数风险测试对患有ER+乳腺癌的妇女群体提供了广泛相当的风险信息(参见图9)，但是在个体患者水平上，在测试间可以显示出不一致(参见图2，表5和6)。如通过特征中基因所揭示的，除了鉴别可能对当前标准细胞毒化学疗法敏感的那些患者之外，应考虑和鉴别针对这些高风险患者的分子驱动的靶向疗法。
尽管当前多参数测试可以鉴别可能受益于当前辅助化学疗法方案的那些患者，但是这些测试无一能够预测对药物-特异性化学疗法的反应。除全局和个体化学疗法反应的复杂性之外，该问题还受到驱动分子途径鉴别的阻碍。使用通过该数据产生的信息，可以开发用于靶向包含95-基因特征的基因模块的候选药物的检查和验证的模型(参见图10，表11)。
以这种方式，可以靶向与G2/M检查点有关的基因，如模块1中所鉴别的，如BIRC5(存活素)。在II期多中心开放性2-组研究中20，在转移性乳腺癌背景中，评价了与多西他赛结合的存活素抑制剂YM155。然而，在本研究中，对于YM155益处，前期(up-front)患者分层的缺少可能有助于发现在其对多西他赛的加入中无显著益处，因此模糊了靶向该途径的潜在益处。尽管已知在乳腺癌中过表达，但是在高风险患者中观察到的BIRC5相对较高的表达(p＝7.23×10-180)(表9)表明存在mRNA丰度的临界点(tipping point)，从而导致风险提高。在高复发风险患者中，观察到模块1、3和4中所有基因显示出更高的表达，这是统计学显著的(表9)，其反映了细胞周期和增殖在乳腺癌病理发生中的显著作用。
模块3的特征在于涉及晚期有丝分裂事件的途径。通过使用当前处于III期试验评价的Dinacilib或类似分子，CDK1的过表达提供了治疗诊断学靶标(表11)。回到细胞周期和有丝分裂的检查点控制是导向疗法的另一个有吸引力的机制，其中在临床前和临床背景中，用抑制剂处理治疗诊断学靶标，如PLK1(参见图3)21,22。模块4的S-期和DNA复制途径的调控，包括CCND1支持将患者潜在分层至帕博西尼(Palbociclib)或其它CDK抑制剂(表11)。PALOMA-1试验的发现23导致在转移性乳腺癌背景中帕博西尼(Palbociclib)(CDK4/6抑制剂)结合来曲唑的准许；从而为PENELOPE-B试验中患有ER+/HER2-癌症和残留疾病的高风险患者的随机化铺平了道路。尽管在晚期和转移性背景中是有前景的，但是既尚未充分评价CDK抑制剂在早期乳腺癌背景中的使用，又没有分层将最受益于该治疗的患者的验证的方法。有趣地，近期帕博西尼(Palbociclib)与他莫昔芬之间的体外协同证据显示了ER-耐受性细胞系中对他莫昔芬的再敏化24，从而表明通过使用内分泌疗法和CDK抑制剂的组合使用，可能是ER-耐受性的那些患者的鉴别可以经历更大的益处。模块2的基因的特征在于在基因ERBB家族成员中，受体酪氨酸激酶信号转导、细胞凋亡和细胞周期的控制具有药物靶标。抗-HER疗法在ERBB2/HER2-阳性患者中是有效的，但是与EGFR/ERBB家族其它成员之间的交互作用表明在没有HER2扩增的情况下，除ERBB2/HER2之外的成员的异常表达可以证明它们的用处。EGFR抑制剂，如吉非替尼和拉帕替尼已在其它恶性肿瘤中显示出效力，但是在乳腺癌中仅取得了一般的成功，表明需要患者选择的改进方法来鉴别将最受益的那些患者。有趣地，通过在本研究中使用的分类器，将296/342(86.5％)的HER2-富集-样患者鉴别为高风险。
然而，通过33.8％的HER2-富集-样患者具有确认的HER2基因扩增或蛋白质过表达，这些结果表明一些患者可能受益于靶向ERBB-家族和相关途径的疗法。事实上，在日期早于抗-ERBB2/HER2疗法的使用的该患者群体中，不考虑ERBB2/HER2-状态，95-基因特征仍是预后的(参见图8)。此外，发现ERBB3和ERBB4是单变量预后的并且是部分最终特征，ERBB2/HER2表达却不是(表4)。该数据将表明在当前临床实践中，一些ERBB2/HER2-阳性低风险患者将接受抗-ERBB2/HER2疗法，从而产生了潜在不优于ERBB2/HER2-阴性患者的结局。相对于还是ERBB2/HER2-阳性的高风险患者，抗-ERBB2/HER2治疗将对该组中的亚型具有一些益处，但是很明显在该高-风险群体中存在其它复发的分子驱动。通过本发明的分析鉴别为显著途径的ERBB的下游途径，如PIK3/AKT/mTOR支持在鉴别为高风险的患者中潜在使用依维莫司25,26。有趣地，通过基因特征，将鉴别为基底细胞-样的352位患者中的278位(78.9％)分类为高风险，尽管临床上分类为ER+；从而强调需要在激素受体阳性癌症中识别分子不均一性的重要性和新型治疗的涵义(意义)。
据证实与目前可用的多参数测试相比，整合了结节状态的剩余风险的95-基因特征对于早期复发具有显著更好的临床应用。该特征似乎对晚期复发仍保持预后。不同于这些多参数测试，所述特征中基因的模块分析鉴别了适合在高风险患者中用于治疗性干预的一些基因和途径。需要显著改善适合于新疗法的患者的靶向选择，而不是在未来临床试验设计中对所有参与者的随机化。
激素-受体阳性癌症是分子异种的(heterogeneous)，因此需要新型治疗策略(参见图2A和表5，表11)。多参数基因特征是一种选择方式，但是改善的分层必须还包括基因突变和拷贝数状态的整合。因此，为了改善患有早期激素-受体阳性乳腺癌的妇女的临床管理，未来临床试验设计需要不但改善了高风险患者的鉴别，而且还改善了对于靶向所述特征潜在重要基因/途径的现有治疗的患者选择的多参数测试。
尽管已描述了本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员将理解在不背离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下，可以对其作出改变。本文所公开的所有文档，包括以下参考文献列表中的那些作为参考并入本文。
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Claims (32)

1.一种在具有乳腺癌的受试者中预后仅内分泌治疗的方法，所述方法包括：
a)提供所述乳腺癌的肿瘤样品；
b)确定所述肿瘤样品中表4所列基因中至少40个的表达水平；
c)将所述表达水平与来自受试者群组的对照样品的基因组群的参考表达水平相比；和
d)确定与所述乳腺癌有关的剩余风险；
其中，与所述参考表达水平相比，所述基因组群表达的统计学显著差异或相似性对应于与所述乳腺癌有关的剩余风险。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因组群为表4所列基因中的至少40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95个。
3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括从确定的所述基因组群的表达水平构建受试者基因表达谱。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中确定所述剩余风险包括确定模块失调得分(MDS)，所述模块失调得分(MDS)包括基因组群的权重乘以换算的mRNA丰度的总数。
5.根据权利要求4所述的方法，其中高MDS得分与较高的剩余风险和/或较差的存活有关，并且其中低MDS得分与较低的剩余风险和/或较好的存活有关。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，还包括使用至少一个对照，优选地多个对照归一化所述mRNA丰度。
7.根据权利要求6所述的方法，所述多个对照中的至少一个包括参考受试者或所述受试者的参考基因的mRNA丰度。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，还包括将所述受试者的临床指征与多个参考临床指征相比较，其中所述临床指征包括年龄、肿瘤等级、病理肿瘤尺寸或结节状态中的至少一种，优选地结节状态，并且将这些临床指征在MDS上拟合，优选地使用多变量Cox比例风险模型。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，还包括：如果相对于参考群组的群体中值，所述受试者具有相对高的剩余风险，则用组合的内分泌疗法和化学疗法治疗所述受试者。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是激素受体阳性(ER+)。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中使用确定所述表达水平。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述剩余风险代表无远处复发存活。
13.一种在具有乳腺癌的受试者中预后仅内分泌治疗的计算机-实施的方法，所述方法包括：
a)在至少一个处理器上接收反映肿瘤样品中表4所列基因中的至少40个的表达水平的数据；
b)在所述至少一个处理器上构建对应于所述表达水平的表达谱；
c)在所述至少一个处理器上将所述表达水平与来自受试者群组的对照样品的基因组群的参考表达水平相比较；
d)在所述至少一个处理器上确定与所述乳腺癌有关的剩余风险；
其中，与所述参考表达水平相比，所述基因组群的表达的统计学显著差异或相似性对应于与乳腺癌有关的剩余风险。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述基因组群为表4所列基因中的至少40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95个。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述处理器通过计算模块失调得分(MDS)确定所述剩余风险，所述模块失调得分(MDS)包含所述基因组群的权重乘以换算的mRNA丰度的总数。
16.根据权利要求14所述的方法，其中高MDS得分与较高的剩余风险和/或较差的存活有关，并且其中低MDS得分与较低的剩余风险和/或较好的存活有关。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述处理器还使用至少一个对照，优选地多个对照归一化所述mRNA丰度。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个对照中的至少一个包括参考受试者或所述受试者的参考基因的mRNA丰度。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述处理器还将所述受试者的临床指征与多个参考临床指征相比较，其中所述临床指征包括年龄、肿瘤等级、病理肿瘤尺寸或结节状态中的至少一种，优选地结节状态，并且将这些临床指征在MDS上拟合，优选地使用多变量Cox比例风险模型。
20.根据权利要求13-19中任一项所述的方法，如果相对于参考群组的群体中值，所述受试者具有相对高的剩余风险，则还输出使用组合的内分泌疗法和化学疗法治疗所述受试者的建议。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是激素受体阳性(ER+)。
22.根据权利要求13-21中任一项所述的方法，其中所述剩余风险代表无远处复发存活。
23.一种结合通用计算机使用的计算机程序产品，所述通用计算机具有处理器和连接至所述处理器的存储器，所述计算机程序产品包含具有在其上编码的计算机机构的计算机可读存储介质，其中计算机程序机构可载入所述计算机的存储器并使所述计算机实施权利要求1-12中任一项所述的方法。
24.一种用于存储根据权利要求23所述的计算机程序产品的在其上已存储数据结构的计算机可读介质。
25.一种用于预后或分类具有乳腺癌且用内分泌疗法治疗的受试者的装置，所述装置包含：
至少一个处理器；和
与所述至少一个处理器通信的电子存储器，所述电子存储器存储处理器-可执行代码，当所述处理器-可执行代码在所述至少一个处理器上执行时，导致所述至少一个处理器：
a)接收反映肿瘤样品中表4所列基因中的至少40个的表达水平的数据；
b)构建对应于所述表达水平的表达谱；
c)将所述表达水平与来自受试者群组的对照样品的基因组群的参考表达水平相比较；和
d)在所述至少一个处理器上确定与所述乳腺癌有关的剩余风险，
其中，与所述参考表达水平相比，所述基因组群的表达的统计学显著差异或相似性对应于与乳腺癌有关的剩余风险。
26.根据权利要求23所述的装置，其中所述基因组群为表4所列基因中的至少40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95个。
27.一种治疗具有乳腺癌的受试者的方法，包括：
a)根据权利要求1-12中任一项所述的方法确定受试者的剩余风险；和
b)基于所述剩余风险选择疗法，并且优选地根据所述疗法来治疗所述受试者。
28.根据权利要求27所述的方法，其中如果相对于参考群组的群体中值，所述患者具有相对高的剩余风险，则选择内分泌疗法和化学疗法的组合作为疗法。
29.一种包含多个分离的核酸序列的组合物，其中每个分离的核酸序列杂交至：
(a)对应于表4所列基因中的至少40个的基因组群的mRNA；和/或
(b)与a)互补的核酸，
其中所述组合物用于测量所述基因组群的表达水平。
30.一种阵列，包含与表4所列基因中的至少40个的表达产物互补和/或可杂交的一个或多个多核苷酸探针。
31.一种试剂盒，包含用于从乳腺癌肿瘤样品中检测至少一个表4所列基因中的至少40个的mRNA的试剂。
32.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述至少40个基因是具有与剩余风险统计学最相关的差异表达的至少40个基因。
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