JP2019508016A - 早期乳癌における内分泌処置後の残留リスクの遺伝子シグネチャー - Google Patents

Abstract

乳癌を伴なう対象において内分泌単独処置の予後を判定する方法を本明細書に記載し、その方法は、ａ）乳癌の腫瘍試料を用意する；ｂ）腫瘍試料において表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現レベルを決定する；ｃ）その発現レベルを対象コホートからの対照試料からのその遺伝子グループの基準発現レベルと比較する；そしてｄ）乳癌に関連する残留リスクを決定することを含み、その際、基準発現レベルと比較した遺伝子グループの発現における統計学的に有意の差または類似性は乳癌に関連する残留リスクに対応する。
【選択図】図１−１

Description

[0001] 本出願は、U.S. Provisional Patent Application No. 62/263,805, 2015年12月7日出願に基づく優先権を主張し、それの全体を本明細書に援用する。
[0002] 本開示は、全般的に、乳癌を伴なう対象を予後判定または分類することに関する。より具体的には、本開示は、乳癌を伴なう対象を内分泌処置後にバイオマーカーを用いて予後判定または分類する方法およびデバイスに関する。

[0003] 早期エストロゲン受容体陽性(estrogen receptor positive)（ＥＲ＋）乳癌の処置における著しい改善にもかかわらず、臨床挑戦が行なわれている。抗−内分泌療法は過去３０〜４０年にわたる死亡率を低下させた^１，２が、乳癌の８０％を占めるＥＲ＋疾患はなお早期乳癌による死亡の大部分をもたらしている^３。臨床処置決定をガイドするためにマルチパラメトリック遺伝子アッセイを用いることが増えている^４。大部分の予後判定試験はＥＲ＋乳癌処置後の再発リスクを推定できるが、まだ新規標的治療選択肢についての予測的価値はない^２，４。ＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ（登録商標）（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｃ．）^５，６、Ｐｒｏｓｉｇｎａ（商標）（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）^７−９、Ｍａｍｍａｐｒｉｎｔ（登録商標）（Ａｇｅｎｄｉａ Ｉｎｃ．）^{１０，１１}、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｄｅｘ（ＢｉｏＴｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）^{１２，１３}、およびＥｎｄｏＰｒｅｄｉｃｔ（Ｓｉｖｉｄｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）^１４を含めて、これらのマルチパラメトリック検定はすべてほぼ類似の臨床有用性をもたらす^{１５，１６}。それぞれがＲＮＡ存在量試験に由来するが、意外にも異なるＲＮＡシグネチャー間にオーバーラップする遺伝子はほとんど無い^１７。Pratらは、組合わせシグネチャーがより正確に転帰を予測でき、より大きな臨床的有意性をもたらすことをイン・シリコで立証した^１８。それでもなお、１０年にわたる多重残留リスクシグネチャーの開発にもかかわらず、層別化または標的医療に向けた進歩はこれらの検定によって顕著に促進されてはいない。既存の検定はいずれも、層別化医療アプローチの基礎をなす可能性のある次世代の作動可能なターゲットを同定しなかった。

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[0004] ある側面において、乳癌を伴なう対象において内分泌単独処置(endocrine-only treatment)の予後を判定する方法を提供し、その方法は、ａ）乳癌の腫瘍試料を用意する；ｂ）腫瘍試料において表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現レベルを決定する；ｃ）その発現レベルを対象コホートからの対照試料からのその遺伝子グループの基準発現レベルと比較する；そしてｄ）乳癌に関連する残留リスクを決定することを含み、その際、基準発現レベルと比較した遺伝子グループの発現における統計学的に有意の差または類似性は乳癌に関連する残留リスクに対応する。

[0005] ある側面において、コンピューター実装した、乳癌を伴なう対象において内分泌単独処置の予後を判定する方法を提供し、その方法は、：ａ）少なくとも１つのプロセッサーにおいて、腫瘍試料における表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現レベルを反映するデータを受信する；ｂ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、その発現レベルに対応する発現プロファイルを構築する；ｃ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、その発現レベルを対象コホートからの対照試料からのその遺伝子グループの基準発現レベルと比較する；そしてｄ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、乳癌に関連する残留リスクを決定することを含み、その際、基準発現レベルと比較した遺伝子グループの発現における統計学的に有意の差または類似性は乳癌に関連する残留リスクに対応する。

[0006] ある側面において、プロセッサーおよびプロセッサーに接続したメモリーを有する汎用コンピューターと組み合わせて使用するためのコンピュータープログラムプロダクトを提供し、そのコンピュータープログラムプロダクトは、コンピューターメカニズムがエンコードされたコンピューター可読記憶媒体を含み、コンピュータープログラムメカニズムをコンピューターのメモリー内にローディングしてコンピューターに本明細書に記載する方法を実行させることができる。

[0007] ある側面において、本明細書に記載するコンピュータープログラムプロダクトを記憶させるためのデータ構造が記憶されたコンピューター可読媒体を提供する。
[0008] ある側面において、乳癌を伴ない、内分泌療法で処置された対象を、予後判定または分類するためのデバイスを提供し、そのデバイスは、少なくとも１つのプロセッサー；および少なくとも１つのプロセッサーと通信する電子メモリーを含み、その電子メモリーは、少なくとも１つのプロセッサーにおいて実行した際にその少なくとも１つのプロセッサーに下記を実行させる、プロセッサー実行可能なコードを記憶する：ａ）腫瘍試料における表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現レベルを反映するデータを受信する；ｂ）その発現レベルに対応する発現プロファイルを構築する；ｃ）その発現レベルを対象コホートからの対照試料からのその遺伝子グループの基準発現レベルと比較する；そしてｄ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、乳癌に関連する残留リスクを決定する；その際、基準発現レベルと比較した遺伝子グループの発現における統計学的に有意の差または類似性は乳癌に関連する残留リスクに対応する。

[0009] ある側面において、乳癌を伴なう対象を処置する方法であって：ａ）本明細書に記載する方法に従って対象の残留リスクを決定する；そしてｂ）その残留リスクに基づいて処置を選択し、好ましくは対象をその処置に従って処置することを含む方法を提供する。ある態様において、患者が基準コホートの集団中央値と対比して相対的に高い残留リスクを有するならば、内分泌療法と化学療法の併用を処置として選択する。

[0010] ある側面において、複数の単離した核酸配列を含む組成物であって、それぞれの単離した核酸配列は、（ａ）表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子に対応する遺伝子グループのｍＲＮＡ；および／または（ｂ）ａ）に対して相補的な核酸にハイブリダイズする、それらの遺伝子グループの発現レベルを測定するために使用される組成物を提供する。

[0011] ある側面において、表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現生成物に相補的およびハイブリダイズ可能である１以上のポリヌクレオチドプローブを含むアレイを提供する。

[0012] ある側面において、乳癌腫瘍の試料から表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬を含むキットを提供する。
[0013] 本開示の他の側面は以下の具体的態様のを添付の図面と合わせて考察すると当業者に明らかになるであろう。

[0014] 添付の図面を参照して本開示の態様を以下に記載するが、それらは例示にすぎない。
[0015] 図１Ａ〜１Ｄは、ＴＥＡＭ病理コホートにおける９５−遺伝子 残留リスクシグネチャー(Residual Risk Signature)の、一組のカプラン・マイヤー生存プロット(Kaplan Meier Survival Plot)である。図１Ａ）内分泌療法のみを受けている患者の検証コホートに適用した、結節状態(nodal status)を含む予後判定モデルに基づく生存曲線。図１Ｂ）Ａに示したリスクスコア推定値を、各グループをＱ１に対比した分位数としてグループ分けしたもの。コックス比例ハザードモデル( Cox proportional hazards model)を用いてハザード比を推定し、ログランク検定(log-rank test)を用いて生存差の有意性を推定した。 図１Ｃ）ＴＥＡＭ検証コホートにおける患者リスクスコアの分布；推定５年再発確率（実線）および９５％ ＣＩ（影付き領域を囲む破線）を患者リスクスコアの関数として示す。垂直の黒い破線はトレーニングセット中央リスクスコアを示す。図１Ｄ）ＴＥＡＭ検証コホートにおける患者リスクスコアの分布；推定１０年再発確率（実線）および９５％ ＣＩ（影付き領域を囲む破線）を患者リスクスコアの関数として示す。垂直の黒い破線はトレーニングセット中央リスクスコアを示す。 [0016] 図２Ａおよび２Ｂは、検証コホートにおける９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーとマルチパラメトリック検定の比較を示す。Ａ）検証コホートにおいて、臨床共変量のほかに９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーおよび他の現在のマルチパラメトリック検定を用いて評価した患者のまとめ。患者試料を全体的な一致性(concordance)に従って順位付けし、すべての検定にわたってそれぞれヒートマップの下部および上部に組織化されたすべての患者を高リスクまたは低リスクと呼ぶ。標準的な臨床共変量、たとえばＨＥＲ２状態、年齢、グレード、結節状態、ステージを含む。ＰＡＭ５０／Ｐｒｏｓｉｇｎａ−ｌｉｋｅ検定に基づく分子サブタイプ分類も示す。 Ｂ）性能評価指標(performance indicator)として、各マルチパラメトリック検定についての受信者動作特性(receiver operating characteristic)曲線下面積（ＡＵＣ）も示す。提示したすべての患者が内分泌処置のみを受けた者である。 [0017] 図３Ａ〜３Ｇは、９５−遺伝子 残留リスクシグネチャー内のシグナル伝達モジュールを示す。図３Ａ）９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーの遺伝子間のＲＥＡＣＴＯＭＥ相互作用のまとめ。５２遺伝子を含む６つの主な相互作用モジュールを９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーから同定した。遺伝子間、モジュール間およびモジュール内の関係を結合線により示す。矢印付きの実線は既知の直接的な正の関係を示す。直角の線で終わる実線は既知の負の調節関係を指示する。点線は他の遺伝子によって関連づけられた関係を指示する。赤丸付きの遺伝子は、インテグリティー化合物検索ツール(Integrity compound search tool)（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒｅｕｔｅｒｓ）およびClinicalTrials.gov (https://clinicaltrials.gov/)に基づいて、既知の標的療法があるか、あるいはフェーズＩＩ／ＩＩＩ開発中である遺伝子ターゲットを示す。 図３Ｂ〜３Ｇ）各モジュールについての、検証コホートを表わすカプラン・マイヤー曲線生存曲線（左）を示す。それぞれのカプラン・マイヤー曲線の右側は、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたリスクスコア推定値である。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。提示したすべての患者が内分泌処置のみを受けた者である。 図３Ｂ〜３Ｇ）各モジュールについての、検証コホートを表わすカプラン・マイヤー曲線生存曲線（左）を示す。それぞれのカプラン・マイヤー曲線の右側は、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたリスクスコア推定値である。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。提示したすべての患者が内分泌処置のみを受けた者である。 図３Ｂ〜３Ｇ）各モジュールについての、検証コホートを表わすカプラン・マイヤー曲線生存曲線（左）を示す。それぞれのカプラン・マイヤー曲線の右側は、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたリスクスコア推定値である。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。提示したすべての患者が内分泌処置のみを受けた者である。 図３Ｂ〜３Ｇ）各モジュールについての、検証コホートを表わすカプラン・マイヤー曲線生存曲線（左）を示す。それぞれのカプラン・マイヤー曲線の右側は、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたリスクスコア推定値である。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。提示したすべての患者が内分泌処置のみを受けた者である。 図３Ｂ〜３Ｇ）各モジュールについての、検証コホートを表わすカプラン・マイヤー曲線生存曲線（左）を示す。それぞれのカプラン・マイヤー曲線の右側は、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたリスクスコア推定値である。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。提示したすべての患者が内分泌処置のみを受けた者である。 図３Ｂ〜３Ｇ）各モジュールについての、検証コホートを表わすカプラン・マイヤー曲線生存曲線（左）を示す。それぞれのカプラン・マイヤー曲線の右側は、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたリスクスコア推定値である。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。提示したすべての患者が内分泌処置のみを受けた者である。 [0018] 図４は、９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーを含む遺伝子の一変量結果を示す。ヒートマップは、内分泌処置患者のみのトレーニングコホートにおける最終残留リスクシグネチャーを含む９５遺伝子の正規化した計測ｍＲＮＡ存在量プロファイルを示す。ヒートマップに示した９５遺伝子は下記の順序で列記されている：ＢＵＢ１Ｂ、ＣＥＰ５５、ＭＹＢＬ２、ＡＮＬＮ、ＥＣＴ２、ＭＫＩ６７、ＭＣＭ１０、ＮＵＳＡＰ１、ＢＩＲＣ５、ＵＢＥ２Ｔ、ＲＲＭ２、ＣＥＮＰＦ、ＰＴＴＧ１、ＯＲＣ６Ｌ、ＣＥＮＰＡ、ＣＤＫ１、ＣＣＮＢ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＥＸＯ１、ＣＤＣ２０、ＳＴＫ１５、ＰＲＣ１、ＭＥＬＫ、ＳＴＭＮ１、ＮＥＫ２、ＣＤＣ６、ＣＣＮＢ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ２、ＥＳＰＬ１、ＰＩｋ１、ＫＰＮＡ２、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ７ＡＳ、ＫＮＴＣ２、ＧＮＡＺ、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、ＭＡＤ２、ＴＹＭＳ、ＵＢＥ２Ｃ、ＲＡＣＧＡＰ１、ＤＴＬ、ＣＸＸＣ５、ＣＤＣＡ７、ＲＦＣ４、ＤＩＡＰＨ３、ＣＤＣＡ１、Ｃ１６ｏｒｔ６１、ＥＳＭ１、ＣＫ８、ＭＭＰ９、ＧＭＰＳ、ＡＹＴＬ２、ＯＳＣＮ６Ｌ１、ＭＭＰ１１、ＬＩＮ９。 [0019] 図５Ａ〜５Ｆは、トレーニングコホートにおけるモデル比較のためのカプラン・マイヤー曲線を示す。Ａ）臨床共変量なしでモデリングした、内分泌療法のみを受けている患者を表わす、９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーについての予後判定モデリングに基づくカプラン・マイヤー生存曲線。Ｂ）Ａに示したリスクスコア推定値を、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたもの。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。 Ｃ）年齢、グレード、病理学的腫瘍サイズおよび結節状態を含む臨床共変量を用いてモデリングした、内分泌療法のみを受けている患者を表わす、９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーについての予後判定モデリングに基づくカプラン・マイヤー生存曲線。Ｄ）Ｃに示したリスクスコア推定値を、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたもの。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。 Ｅ）結節状態のみを唯一の臨床共変量としてモデリングした、内分泌療法のみを受けている患者における、９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーについての予後判定モデリングに基づくカプラン・マイヤー生存曲線。Ｆ）Ｅに示したリスクスコア推定値を、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたもの。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。 [0020] 図６Ａ〜６Ｄは、検証コホートにおけるモデル比較のためのカプラン・マイヤー曲線を示す。Ａ）臨床共変量なしでモデリングした、内分泌療法のみを受けている患者を表わす、９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーについての予後判定モデリングに基づくカプラン・マイヤー生存曲線。Ｂ）Ａに示したリスクスコア推定値を、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたもの。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。 Ｃ）年齢、グレード、病理学的腫瘍サイズおよび結節状態を含む臨床共変量を用いてモデリングした、内分泌療法のみを受けている患者を表わす、９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーについての予後判定モデリングに基づくカプラン・マイヤー生存曲線。Ｄ）Ｃに示したリスクスコア推定値を、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたもの。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。 [0021] 図７は、検証コホートの化学療法処置患者および非−化学療法処置患者における９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーの検証を示す。Ａ）化学療法のために調整されたアジュバント化学療法を受けた患者を含めた検証コホートにおける、結節状態を含む９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーの予後判定モデリングに基づくカプラン・マイヤー生存曲線。Ｂ）Ａに示したリスクスコア推定値を、各グループをＱ１と比較した分位数としてグループ分けしたもの。ハザード比はコックス比例ハザードモデルを用いて推定され、生存差の有意性はログランク検定を用いて推定された。Ｃ）Ａに示した生存曲線において、高リスクまたは低リスクと同定され、化学療法のために調整されたアジュバント化学療法による処置を受けた患者を区別したもの。 [0022] 図８は、検証コホートのＨＥＲ２陽性およびＨＥＲ２陰性患者における９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーの検証を示す。Ａ）ＨＥＲ２状態のために調整されたアジュバント化学療法を受けなかった患者の検証コホートにおける、結節状態を含む９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーの予後判定モデリングに基づくカプラン・マイヤー生存曲線。Ｂ）ＨＥＲ２陰性患者のために調整されたアジュバント化学療法を受けなかった患者の検証コホートにおける、結節状態を含む９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーの予後判定モデリングに基づくカプラン・マイヤー生存曲線。Ｃ）ＨＥＲ２陽性患者のために調整されたアジュバント化学療法を受けなかった患者の検証コホートにおける、結節状態を含む９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーの予後判定モデリングに基づくカプラン・マイヤー生存曲線。 [0023] 図９Ａ〜９Ｇは、現在の市販および学究的マルチパラメトリック検定のカプラン・マイヤー生存解析を示す。図示したのは、検証コホートにおける各種マルチパラメトリック検定のためにモデリングした遺伝子の発現に基づくカプラン・マイヤー生存曲線である。Ａ）検証コホートの患者のＰｒｏｓｉｇｎａ検定の結果。低リスクおよび中リスクと同定された患者は類似の生存率を示し、高リスク患者はより劣悪なＤＲＦＳを示す。Ｂ）マルチパラメトリックアルゴリズムに基づくｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ結果に従った患者のカプラン・マイヤー生存率。 Ｃ）リスクスコア（ＲＳ）カットオフ２５を用いて二分割した(dichotomized)ＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ−ｌｉｋｅ発現分析に基づく検証コホートのカプラン・マイヤー生存解析。Ｄ）ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ−ｌｉｋｅの発現分析に基づく検証コホートのカプラン・マイヤー生存解析。 Ｅ）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ−ｌｉｋｅの発現分析に基づく検証コホートのカプラン・マイヤー生存解析。Ｆ）ＩＨＣ４遺伝子（ＥＲ、ＰｇＲ、Ｋｉ６７およびＨＥＲ２）のＲＮＡ発現値に基づいて低リスクおよび高リスクと同定された検証コホート患者のカプラン・マイヤー生存解析。 Ｇ）ＩＨＣ４遺伝子（ＥＲ、ＰｇＲ、Ｋｉ６７およびＨＥＲ２）のタンパク質発現値に基づいて低リスクおよび高リスクと同定された検証コホート患者のカプラン・マイヤー生存解析。 [0024] 図１０は、９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーを用いる新薬への患者の推定層別化を示す。図示したのは、発現プロファイリングに基づいてイン・シリコ経路分析により同定した９５−遺伝子 標的療法シグネチャーに基づく推定臨床試験設計である。このスキームにおいて、シグネチャーによって低リスクと同定された患者は内分泌処置のみを受ける。高リスクと思われる者は、遺伝子変異状態およびコピー数など他のゲノムマーカーの統合と共に、次いでそれらの癌を駆動している経路を指向する標的治療にトリアージされる。 [0025] 図１１Ａ〜１１Ｂは、ＴＥＡＭ試験スキームおよび患者試料を示す。Ａ）タモキシフェン(Tamoxifen)およびエキセメスタン(Exemestan)アジュバント多国籍試験(Tamoxifen and Exemestane Adjuvant Multinational Trial)（ＴＥＡＭ）病態コホートについての試験スキーム。適格な患者は、タモキシフェンを２．５年間、続いてエキセメスタンを残りの２．５年間；またはエキセメスタンを５年間のいずれかを受けるようにランダム化された。 Ｂ）ＴＥＡＭコホートにおける統計学的検出力のまとめ。 Ｃ）この試験のために採集および処理した試料のまとめ。 [0026] 図１２は、正規化戦略の前処理方法順位付けを示す。前処理ＴＥＡＭコホート。ヒートマップは、ＨＥＲ２＋ｖｅとＨＥＲ２−ｖｅプロファイルの間の分子差を最大化し、一方でバッチエフェクト(batch effect)を最小限に抑える能力に基づく、前処理方法の順位付けを示す。２５２の組合わせの前処理方法について、上記の基準に従って２つの順位付けが確立され、続いてｒａｎｋ ｐｒｏｄｕｃｔを用いて集計された。このヒートマップは集計順位に基づいてソーティングされ、最も有効な前処理パラメーターが上部にある。

[0027] ホルモン受容体陽性の早期乳癌を伴なうある女性は内分泌療法のみで効果的に管理できるのに対し、他は追加の全身化学療法処置を必要とする。高リスク女性の管理における臨床上の難点は、既存および新規の薬物標的を同定すること、ならびにこれらの療法が有益であると思われる者を同定することである。

[0028] ３，８２５のホルモン受容体陽性（ＥＲ＋および／またはＰｇＲ＋）症例から構成され、４７７（１３％）のＨＥＲ２陽性症例を含むタモキシフェンおよびエキセメスタンアジュバント多国籍試験（ＴＥＡＭ）病態コホート^１９を用いてｍＲＮＡ存在量分析を実施して、残留リスクの遺伝子シグネチャー、たとえば９５−遺伝子シグネチャーを同定および検証した。この９５−遺伝子シグネチャーは、内分泌処置患者に関してリスク層別化を改善するのに有用である。さらに、この遺伝子シグネチャーを用いて潜在薬物標的を解明して、そのような高リスク患者に対する標的療法を開発するための層別化を改善することができる。

９５−遺伝子シグネチャーおよび処置
[0029] 学究的および市販のマルチパラメトリック検定から集めた遺伝子ならびに乳癌発病に対して重要な遺伝子のパネルを用いて、３，８２５人の患者をプロファイリングした。結節状態を含む９５−遺伝子シグネチャーを検証して、遠隔無再発生存(distant relapse-free survival)に基づいて内分泌処置患者を高リスクグループと低リスクグループに層別化した（ＤＲＦＳ；ＨＲ＝５．０５，９５％ＣＩ ３．５３〜７．２２，ｐ＝７．５１×１０^−２２）。このリスクシグネチャーは現在のマルチパラメトリック検定より良好に作動することも認められた。アジュバント化学療法を受けた検証コホートの患者を含むすべての患者に９５−遺伝子 予後判定シグネチャーを適用した場合にも、このシグネチャーはやはり予後判定能力があった（ＨＲ＝４．７６，９５％ＣＩ ３．５６〜６．２，ｐ＝８．８７×１０^−２８）。機能性遺伝子相互作用解析により、細胞周期制御、有糸分裂および受容体チロシンシグナル伝達に関与する経路を表わす６つの重要なモジュールが同定された；これには乳癌その他の悪性疾患に使用するための既存の標的療法に伴なう多数の遺伝子が含まれる。よって、この予後判定シグネチャーを用いた高リスク患者の同定は、これらの標的療法で処置するための患者を優先できる可能性も備えている。

[0030] 明らかになるように、本発明の一側面の好ましい特色および特徴は本発明の他のいずれかの側面に適用できる。本明細書中で用いる単数形“a”、“an”および“the”には、内容から明らかにそうではないことが要求されない限り、複数表記が含まれることを留意すべきである。

[0031] ある側面において、乳癌を伴なう対象において内分泌単独処置の予後を判定する方法を提供し、その方法は、ａ）乳癌の腫瘍試料を用意する；ｂ）腫瘍試料において表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現レベルを決定する；ｃ）その発現レベルを対象コホートからの対照試料からのその遺伝子グループの基準発現レベルと比較する；そしてｄ）乳癌に関連する残留リスクを決定することを含み、その際、基準発現レベルと比較した遺伝子グループの発現における統計学的に有意の差または類似性は乳癌に関連する残留リスクに対応する。

[0032] 本明細書中で用いる用語“対象”は、動物界のいずれかのメンバー、好ましくはヒト、最も好ましくは乳癌を伴なうかまたは乳癌を伴なう疑いのあるヒトを表わす。
[0033] 本明細書中で用いる用語“試料”は、対象からのいずれかの体液、細胞または組織試料であって、生検液中に差示的に存在するバイオマーカー発現生成物および／または基準発現プロファイル、たとえばペプチドについてアッセイできるものを表わす。

[0034] 本明細書中で用いる用語“予後”は、基準プロファイル、たとえばバイオマーカー基準発現プロファイルにより反映されるか、あるいは本明細書に開示する１５バイオマーカーの発現レベルにより反映される、疾患サブタイプに関連する臨床転帰グループ、たとえばより劣悪な生存グループまたはより良好な生存グループを表わす。予後は、疾患進行の指標を提供し、癌による死亡の可能性の指標を含む。一態様において、臨床転帰クラスにはより良好な生存グループおよびより劣悪な生存グループが含まれる。

[0035] 本明細書中で用いる用語“予後判定または分類する”は、予後と関連する基準プロファイルまたはバイオマーカー発現レベルに対する対象の類似性に従って、ある対象が属する臨床転帰グループを予測または同定することを意味する。たとえば、予後判定または分類は、乳癌を伴なうある個体がより良好またはより劣悪な生存転帰をもつかどうかを判定し、あるいは乳癌を伴なうある個体をより良好な生存グループまたはより劣悪な生存グループにグループ分けし、あるいは乳癌を伴なうある個体が療法に応答するか否かを予測する方法またはプロセスを含む。

[0036] 本明細書中で用いる用語“遺伝子”は、ポリヌクレオチドを意味し、それにはコード配列、介在配列、ならびに転写および／または翻訳を制御する調節エレメントを含めることができる。遺伝子には、多型をコードする遺伝子の正常な対立遺伝子が含まれ、それにはその遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないサイレント対立遺伝子、およびコードするポリペプチドの機能に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸配列バリアントをもたらす対立遺伝子が含まれる。これらの用語は、場合により、コードするポリペプチドの機能に影響を及ぼす１以上の変異をもつ対立遺伝子も含むことができる。

[0037] 本明細書中で用いる“バイオマーカーの発現を決定する”という句は、それらのバイオマーカーにより発現するＲＮＡまたはタンパク質もしくはタンパク質活性もしくはタンパク質関連代謝産物を決定または定量することを表わす。用語“ＲＮＡ”は、ｍＲＮＡ転写体、および／またはｍＲＮＡの特定のスプライスバリアントもしくは選択的バリアントを含み、それにはアンチセンス生成物が含まれる。本明細書中で用いる用語“バイオマーカーのＲＮＡ生成物”は、バイオマーカーおよび／または特定のスプライスバリアントもしくは選択的バリアントから転写されたＲＮＡ転写体を表わす。“タンパク質”の場合、それはバイオマーカーから転写されたＲＮＡ転写体から翻訳されたタンパク質を表わす。用語“バイオマーカーのタンパク質生成物”は、バイオマーカーのＲＮＡ生成物から翻訳されたタンパク質を表わす。

[0038] 本明細書中で用いる用語“発現のレベル”または“発現レベル”は、バイオマーカーの生成物の測定可能な発現のレベルを表わす；たとえば、限定ではなく、マイクロＲＮＡ、発現したメッセンジャーＲＮＡ転写体、または転写体の特定のエキソンもしくは他の部分のレベル、バイオマーカーの発現したタンパク質またはその一部のレベル、バイオマーカーのＤＮＡ多型の数または存在、バイオマーカーの酵素活性または他の活性、および特定の代謝産物のレベル。

[0039] 本明細書中で用いる用語“差示的発現した”または“差示的発現”は、バイオマーカーの生成物の発現レベルを測定することによりアッセイできるバイオマーカーの発現レベルの差、たとえば発現したｍＲＮＡまたはその一部のレベルの差を表わす。好ましい態様において、その差は統計学的に有意である。用語“発現のレベルの差”は、たとえば対照における特定のバイオマーカーの測定可能な発現レベルと比較したｍＲＮＡの量により測定した、特定のバイオマーカーの測定可能な発現レベルの増大または低減を表わす。

[0040] 特定の態様において、遺伝子のグループは表４に挙げた遺伝子のうち少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５である。

[0041] ある態様において、本方法はさらに、測定した遺伝子グループの発現レベルから対象の遺伝子発現プロファイルを構築することを含む。
[0042] ある態様において、残留リスクの判定は、遺伝子グループの荷重和を計測ｍＲＮＡ存在量に掛けることを含む、モジュール調節異常スコア(module dysregulation score)（ＭＤＳ）を決定することを含む。ある態様において、高いＭＤＳスコアはより高い残留リスクおよび／またはより劣悪な生存と関連し、低いＭＤＳスコアはより低い残留リスクおよび／またはより良好な生存と関連する。

[0043] 本明細書中で用いる“全生存率(overall survival)”は、被験または処置グループの人々が癌などの疾患の診断日または処置開始日のいずれかの後からなお生存しているパーセントまたは時間の長さを表わす。臨床試験において、全生存率の測定は新規処置がいかに良好に作動するかを知るための１方法である。

[0044] 本明細書中で用いる“無再発生存率”は、癌の場合には被験または処置グループの人々がその癌の一次処置後に何らその癌の徴候または症状なしに生存しているパーセントまたは時間の長さを表わす。臨床試験において、無再発生存率を測定することは新規処置がいかに良好に作動するかを知るための１方法である。それは何らかの疾患再発（局所、限局、または遠隔）として定義される。

[0045] 本明細書中で用いる用語“生存良好”または“より良好な生存”は、“低生存”グループの患者と比較して生存の機会が高いことを表わす。たとえば、本出願のバイオマーカーは、患者を“生存良好グループ”に予後判定または分類することができる。これらの患者は外科処置後の死亡リスクがより低い。

[0046] 本明細書中で用いる用語“生存不良”または“より劣悪な生存”は、“生存良好”グループの患者と比較して死亡リスクが高いことを表わす。たとえば、本出願のバイオマーカーまたは遺伝子は、患者を“生存不良グループ”に予後判定または分類することができる。これらの患者は、疾患による、または疾患のための外科処置、処置その他の原因による、死亡または有害反応のリスクがより高い。

[0047] ある態様において、本方法はさらに、少なくとも１つの対照、好ましくは複数の対照を用いて、そのｍＲＮＡ存在量を正規化することを含む。
[0048] ある態様において、複数の対照のうち少なくとも１つは基準対象またはその対象の基準遺伝子のｍＲＮＡ存在量を含む。

[0049] “対照集団”は、特定の個体グループまたは癌を伴なう個体もしくは伴わない個体のグループを表わし、場合によってはさらに地理、人種、系統、性、１以上の他の条件もしくは疾患、および／または文化指数（ただし、限定ではない）により同定できる。大部分の場合、対照集団は少なくとも１０、５０、１００、１０００、またはそれ以上の個体を含むことができる。

[0050] “陽性対照データ”は、本発明の癌を伴なう１以上の対象のそれぞれにおいて本発明の標的遺伝子がコードするＲＮＡのレベルを表わすデータを含み、本発明の癌を伴なう複数の対象において本発明の標的遺伝子がコードするＲＮＡの平均レベルを表わす単一データ点を含む。

[0051] “陰性対照データ”は、本発明の癌を伴わない１以上の対象のそれぞれにおいて本発明の標的遺伝子がコードするＲＮＡのレベルを表わすデータを含み、本発明の癌を伴なう複数の対象において本発明の標的遺伝子がコードするＲＮＡの平均レベルを表わす単一データ点を含む。

[0052] 試験データが陽性対照データまたは陰性対照データと“一致する”確率は、試験データが、それぞれ、乳癌を伴わない対象より乳癌を伴なう対象において得られたデータの方に特徴的である可能性があるか、あるいは処理に対する乳癌応答を伴なう対象より処理に対する乳癌応答を伴わない対象において得られたデータの方に特徴的である可能性がある確率を表わす。

[0053] ある態様において、本方法はさらに、対象の臨床指標を複数の基準臨床指標と比較し、その際、臨床指標は年齢、腫瘍グレード、病理学的腫瘍サイズまたは結節状態のうち少なくとも１つ、好ましくは 結節状態を含み、そして好ましくは多変量コックス比例ハザードモデルを用いてこれらの臨床指標をＭＤＳに当てはめることを含む。

[0054] したがって、高リスク予後を伴なう患者には、ホルモン療法に加えてより攻撃的な療法、たとえばアジュバント療法が有益な可能性がある。アジュバント療法は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的療法、または生物学的療法を含むことができる。

[0055] ある態様において、本方法はさらに、対象が基準コホートの集団中央値に対比して相対的に高い残留リスクをもつならば対象を内分泌療法と化学療法の併用で処置することを含む。

[0056] ある態様において、乳癌はホルモン受容体陽性（ＥＲ＋）である。
[0057] ある態様において、発現レベルはＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）を用いて決定される。

[0058] ある態様において、残留リスクは遠隔無再発生存を表わす。
[0059] ある側面において、乳癌を伴なう対象を処置する方法であって：ａ）本明細書に記載する方法に従って対象の残留リスクを決定する；そしてｂ）その残留リスクに基づいて処置を選択し、好ましくは対象をその処置に従って処置することを含む方法を提供する。ある態様において、患者が基準コホートの集団中央値と対比して相対的に高い残留リスクを有するならば、内分泌療法と化学療法の併用を処置として選択する。

デバイスおよびシステム
[0060] ある側面において、コンピューター実装した、乳癌を伴なう対象において内分泌単独処置の予後を判定する方法であって：ａ）少なくとも１つのプロセッサーにおいて、腫瘍試料における表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現レベルを反映するデータを受信する；ｂ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、その発現レベルに対応する発現プロファイルを構築する；ｃ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、その発現レベルを対象コホートからの対照試料からのその遺伝子グループの基準発現レベルと比較する；そしてｄ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、乳癌に関連する残留リスクを決定することを含む方法を提供し、その際、基準発現レベルと比較した遺伝子グループの発現における統計学的に有意の差または類似性は乳癌に関連する残留リスクに対応する。

[0061] 本明細書中で用いる“プロセッサー”はいずれかのタイプのプロセッサー、たとえばいずれかのタイプの汎用マイクロプロセッサーまたはマイクロコントローラー（たとえば、Ｉｎｔｅｌ（商標）ｘ８６、ＰｏｗｅｒＰＣ（商標）、ＡＲＭ（商標）プロセッサーなど）、デジタル信号処理(digital signal processing)（ＤＳＰ）プロセッサー、集積回路、フィールドプログラマブルゲートアレイ(field programmable gate array)（ＦＰＧＡ）、またはそのいずれかの組合わせであってもよい。

[0062] 本明細書中で用いる“メモリー”は、内部または外部のいずれかに配置されたいずれかのタイプのコンピューターメモリーの適切な組合わせを含むことができる；たとえば、ランダムアクセスメモリー(random-access memory)（ＲＡＭ）、読取り専用メモリー(read-only memory)（ＲＯＭ）、コンパクトディスク読取り専用メモリー（ＣＤＲＯＭ）、電気光学メモリー、光磁気メモリー、消去可能プログラマブル読取り専用メモリー(erasable programmable read-only memory)（ＥＰＲＯＭ）、および電気的消去可能読取り専用メモリー(electrically-erasable programmable read-only memory)（ＥＥＰＲＯＭ）など。慣用ファイルシステムを用いてメモリー１０２の部分を組織化し、制御し、そしてデバイスの全操作を支配するオペレーティングシステムにより制御および管理することができる。

[0063] 本明細書中で用いる“コンピューター可読記憶媒体”（機械可読媒体、プロセッサー−可読媒体、またはコンピューター−可読プログラムコードが内蔵されたコンピューター使用可能媒体とも呼ばれる）は、コンピューターまたは機械により読み取ることができるフォーマットでデータを記憶できる媒体である。機械可読媒体はいずれか適切な有形の(tangible)非一過性媒体(non-transitory medium)であってもよく、これには下記を含む磁気、光学または電気記憶媒体が含まれる：フロッピーディスク、コンパクトディスク読取り専用メモリー（ＣＤ−ＲＯＭ）、メモリーデバイス（揮発性または不揮発性）、または類似の記憶メカニズム。コンピューター可読記憶媒体は、実行した際にプロセッサーに本開示の態様に従った方法における工程を実施させる指示、コードシーケンス、コンフィギュレーション情報、または他のデータの各種セットを収容することができる。記載した実施事項を実施するために必要な他の指示および操作もコンピューター可読記憶媒体に記憶できることは当業者に認識されるであろう。コンピューター可読記憶媒体に記憶された指示をプロセッサーまたは他の適切な情報処理デバイスにより実行でき、記載したタスクを実施するための回路とインターフェース接続することができる。

[0064] 本明細書中で用いる“データ構造”は、データを効率的に使用できるようにコンピューターにおいて組織化する特定の方法である。データ構造は、データ構造で実施できる操作およびそれらの操作の計算複雑性を特定する、１以上の特定の抽象データ型(abstract data types)（ＡＤＴ）を実行できる。これと比較して、データ構造はＡＤＴが提供する指定の具体的実行である。

[0065] 本開示の態様は、機械可読媒体（コンピューター−可読媒体、プロセッサー−可読媒体、またはコンピューター−可読プログラムコードが内蔵されたコンピューター使用可能媒体と呼ぶこともできる）に記憶されたコンピュータープログラムプロダクトとして表わすことができる。機械可読媒体はいずれか適切な有形の非一過性媒体であってもよく、これには下記を含む磁気、光学または電気記憶媒体が含まれる：フロッピーディスク、コンパクトディスク読取り専用メモリー（ＣＤ−ＲＯＭ）、メモリーデバイス（揮発性または不揮発性）、または類似の記憶メカニズム。機械可読記憶媒体は、実行した際にプロセッサーに本開示の態様に従った方法における工程を実施させる指示、コードシーケンス、コンフィギュレーション情報、または他のデータの各種セットを収容することができる。記載した実施事項を実施するために必要な他の指示および操作も機械可読記憶媒体に記憶できることは当業者に認識されるであろう。機械可読媒体に記憶された指示をプロセッサーまたは他の適切な情報処理デバイスにより実行でき、記載したタスクを実施するための回路とインターフェース接続することができる。

[0066] ある態様において、プロセッサーは遺伝子グループの荷重和を計測ｍＲＮＡ存在量に掛けたものを含むモジュール調節異常スコア（ＭＤＳ）を計算することにより残留リスクを決定する。

[0067] ある態様において、高いＭＤＳスコアはより高い残留リスクおよび／またはより劣悪な生存と関連し、低いＭＤＳスコアはより低い残留リスクおよび／またはより良好な生存と関連する。

[0068] ある態様において、プロセッサーはさらに少なくとも１つの対照、好ましくは複数の対照を用いてｍＲＮＡ存在量を正規化する。
[0069] ある態様において、複数の対照のうち少なくとも１つは基準対象またはその対象の基準遺伝子のｍＲＮＡ存在量を含む。

[0070] ある態様において、プロセッサーはさらに対象の臨床指標を複数の基準臨床指標と比較し、その際、臨床指標は年齢、腫瘍グレード、病理学的腫瘍サイズまたは結節状態のうち少なくとも１つ、好ましくは 結節状態を含み、そして好ましくは多変量コックス比例ハザードモデルを用いてこれらの臨床指標をＭＤＳに当てはめることを含む。

[0071] ある態様において、本方法はさらに、対象が基準コホートの集団中央値と対比して相対的に高い残留リスクを有するならば、内分泌療法と化学療法の併用で処置するための指示を出力することを含む。

[0072] ある態様において、乳癌はホルモン受容体陽性（ＥＲ＋）である。
[0073] ある態様において、残留リスクは遠隔無再発生存を表わす。
[0074] ある側面において、プロセッサーおよびプロセッサーに接続したメモリーを有する汎用コンピューターと組み合わせて使用するためのコンピュータープログラムプロダクトを提供し、そのコンピュータープログラムプロダクトは、コンピューターメカニズムがエンコードされたコンピューター可読記憶媒体を含み、コンピュータープログラムメカニズムをコンピューターのメモリー内にローディングしてコンピューターに本明細書に記載する方法を実行させることができる。

[0075] ある側面において、本明細書に記載するコンピュータープログラムプロダクトを記憶させるためのデータ構造が記憶されたコンピューター可読媒体を提供する。
[0076] ある側面において、乳癌を伴ない、内分泌療法で処置された対象を、予後判定または分類するためのデバイスを提供し、そのデバイスは、少なくとも１つのプロセッサー；および少なくとも１つのプロセッサーと通信する電子メモリーを含み、その電子メモリーは、少なくとも１つのプロセッサーにおいて実行した際にその少なくとも１つのプロセッサーに下記を実行させる、プロセッサー実行可能なコードを記憶する：ａ）腫瘍試料における表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現レベルを反映するデータを受信する；ｂ）その発現レベルに対応する発現プロファイルを構築する；ｃ）その発現レベルを対象コホートからの対照試料からのその遺伝子グループの基準発現レベルと比較する；そしてｄ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、乳癌に関連する残留リスクを決定する；その際、基準発現レベルと比較した遺伝子グループの発現における統計学的に有意の差または類似性は乳癌に関連する残留リスクに対応する。

診断試薬
[0077] ある側面において、複数の単離した核酸配列を含む組成物であって、それぞれの単離した核酸配列は、（ａ）表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子に対応する遺伝子グループのｍＲＮＡ；および／または（ｂ）ａ）に対して相補的な核酸にハイブリダイズする、それらの遺伝子グループの発現レベルを測定するために使用される組成物を提供する。

[0078] ある側面において、表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現生成物に相補的およびハイブリダイズ可能である１以上のポリヌクレオチドプローブを含むアレイを提供する。

[0079] ある側面において、乳癌腫瘍の試料から表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬を含むキットを提供する。
[0080] プライマーの例には、ポリヌクレオチドに対して相補的なプライマー伸長生成物の合成を触媒する条件下に置かれた際に相補鎖に沿ったポリヌクレオチド合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような条件には、４種類の異なるヌクレオチド三リン酸またはヌクレオシドアナログ、ならびに重合のための１種類以上の試薬、たとえばＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素の存在、適切な緩衝剤（“緩衝剤”には、補因子であるか、またはｐＨ、イオン濃度などに影響を及ぼす物質が含まれる）、ならびに適切な温度が含まれる。プライマーは、ポリメラーゼに対する試薬の存在下で伸長生成物の合成を刺激するのに十分な長さでなければならない。代表的プライマーは、標的配列に対して実質的に相補的な少なくとも約５ヌクレオチド長さの配列を含むが、これより若干長いプライマーが好ましい。プライマーは常に、標的配列（すなわち増幅されるべき特異的配列）に対し実質的に相補的な配列を含み、それにアニールできる。

[0081] 本明細書中で用いる用語“相補的”または“その相補体”は、他の特定のポリヌクレオチドと相補的領域全体にわたってワトソン・クリック塩基対合を形成できるポリヌクレオチドの配列を表わす。この用語はポリヌクレオチド対にそれらの配列のみに基づいて適用され、それら２つのポリヌクレオチドが実際に結合するであろういずれか特定の条件を表わすものではない。

[0082] 用語“プローブ”は、構造の異なる標的分子、たとえば対立遺伝子バリアントを、検出可能な状態で区別できる分子を表わす。検出は多種多様な方法で達成できるが、好ましくは特異的結合の検出に基づく。そのような特異的結合の例には、抗体結合および核酸プローブハイブリダイゼーションが含まれる。

[0083] 用語“ハイブリダイズする”または“ハイブリダイズ可能”は、相補的核酸との配列特異的な非共有結合相互作用を表わす。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェンシー条件下におけるものである。ハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は当業者に既知であるか、あるいはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6中に見出すことができる。たとえば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０℃での２．０×ＳＳＣ洗浄を採用できる。

[0084] ポリヌクレオチド組成物は、当業者に容易に認識されるように、プライマーであってもよく、ｃＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、標的ｃＤＮＡまたはその一部に対して相補的なＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、スプライシングされていないＲＮＡ、スプライシングされたＲＮＡ、オルタニティブスプライシングされたＲＮＡ、合成形態のもの、および混合ポリマー（センス鎖およびアンチセンス鎖の両方）であってもよく、化学的または生化学的に修飾されていてもよく、あるいは非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。

[0085] 核酸がＲＮＡを含む場合、示した配列という表記はＴをＵで置き換えたＲＮＡ均等物を表わすと解釈すべきである。
[0086] 核酸の単離、増幅および分析の方法は当業者にルーティンであり、プロトコルの例を、たとえばMolecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set) Ed. Joseph Sambrook, David W. Russel, and Joe Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition (Jan. 15, 2001), ISBN: 0879695773中に見出すことができる。ＰＣＲ増幅に用いる方法に特に有用なプロトコル源は、PCR(Basics: From Background to Bench) by M. J. McPherson, S. G. Moller, R. Beynon, C. Howe, Springer Verlag; 1st edition (Oct. 15, 2000), ISBN: 0387916008である。

[0087] 増幅法の例には以下のものが含まれる：鎖置換増幅(strand displacement amplification），U.S. Pat. No. 5,744,311に開示; 無転写等温増幅(transcription-free isothermal amplification），U.S. Pat. No. 6,033,881に開示; 修復連鎖反応増幅(repair chain reaction amplification），WO 90/01069に開示; リガーゼ連鎖反応増幅(ligase chain reaction amplification），European Patent Appl. 320 308に開示; ギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅(gap filling ligase chain reaction amplification），U.S. Pat. No. 5,427,930に開示; およびＲＮＡ無転写増幅(RNA transcription-free amplification），U.S. Pat. No. 6,025,134に開示。

[0088] “キット”は、物理的構成要素、たとえばプローブ（これには限定ではなく、特異的プライマー、標識した核酸プローブ、抗体、タンパク質捕獲剤（単数または複数）が含まれる）、試薬（単数または複数）、指示シート（単数または複数）、および本発明を実施するのに有用な、特に試料中の特定のＲＮＡ分子のレベルを同定するのに有用な他の構成要素の組合わせを表わす。これらの物理的構成要素を、本発明を実施するのに適したいずれかの様式で配置することができる。たとえば、プローブおよび／またはプライマーを１以上の容器内に、またはアレイもしくはマイクロアレイデバイス状で提供することができる。

[0089] 一態様において、 標的遺伝子がコードするＲＮＡのレベルを１回の分析で決定できる。組合わせキットは、そのために、異なる標的遺伝子によりコードされるＲＮＡからｃＤＮＡを増幅することができるプライマー類を含むことができる。たとえば、異なる標的遺伝子に由来するＲＮＡが識別されるように、異なる蛍光標識を用いてプライマー類を差示標識することができる。

[0090] マルチプレックス（たとえばデュプレックス）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、同一反応において２つの標的を同時に定量することができ、それによって時間が節約され、コストが低減し、かつ試料が節約される。マルチプレックスリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのこれらの利点は、この手法をハイスループット遺伝子発現分析に好適なものにする。リアルタイムフォーマットでのマルチプレックスｑＰＣＲアッセイは定量測定を促進し、偽陰性結果のリスクを最小限に抑える。すべての試料のアンプリコンがＰＣＲのサブプラトー相(sub-plateau phase)で比較されるように、マルチプレックスＰＣＲを最適化することが必須である。Yun, Z., I. Lewensohn-Fuchs, P. Ljungman, L. Ringholm, J. Jonsson, and J. Albert. 2003. A real-time TaqMan PCR for routine quantitation of cytomegalovirus DNA in crude leukocyte lysates from stem cell transplant patients. J. Virol. Methods 110:73-79. [PubMed]. Yun, Z., I. Lewensohn-Fuchs, P. Ljungman, and A. Vahlne. 2000. Real-time monitoring of cytomegalovirus infections after stem cell transplantation using the TaqMan polymerase chain reaction assays. Transplantation 69:1733-1736. [PubMed]。最大２、３、４、５、６、７、および８またはそれ以上の標的の同時定量が有用であろう。

[0091] たとえば、キットに収容されるプライマーおよびプローブには、本明細書に記載する９５−遺伝子シグネチャーのいずれかを認識できるものを含めることができる。
[0092] 標的ポリヌクレオチドに“選択的にハイブリダイズする”プライマーは、もっぱらまたは大部分が、試料中のＲＮＡからなるかまたは試料中のＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡからなるポリヌクレオチド混合物中の単一の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズできるプライマーである。

[0093] 試料にみられる、本明細書に記載する９５遺伝子のいずれかを含む（ただし、これらに限定されない）乳癌についての１以上の遺伝子のＲＮＡレベルでの遺伝子発現プロファイルは、多数の手法を用いて同定または確認することができ、これには下記のものが含まれるが、好ましくはそれらに限定されない：ＰＣＲ法、たとえば本明細書において実施例中でさらに考察するもの、ノーザン分析およびマイクロアレイ手法、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）および定量シーケンシング。この遺伝子発現プロファイルは、試料において、たとえばマイクロアレイ手法を含む種々の手法を用いて測定できる。この方法の態様において、試料から抽出したＲＮＡの逆転写により蛍光ヌクレオチドを取込ませることによって、蛍光標識ｃＤＮＡプローブを作製することができる。チップに適用した標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに特異的にハイブリダイズする。各アレイ状エレメントのハイブリダイゼーションの定量により、対応するｍＲＮＡ存在量の評価が可能になる。たとえば、二色蛍光を用いると、２つのＲＮＡ源から作製された個別標識したｃＤＮＡプローブが対でアレイにハイブリダイズする。それぞれ特定した遺伝子に対応する２つの供給源からの転写体の相対存在量が、こうして同時に決定される。そのような方法は、細胞当たり少ないコピー数で発現する稀な転写体を検出するのに必要な感度、および少なくともおおよそ２倍の発現レベル差で再現性をもって検出するのに必要な感度をもつことが示された(Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2):106-149 (1996))。マイクロアレイ分析は市販の装置により、製造業者のプロトコルに従って、たとえばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎＣｈｉｐ技術またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いて実施できる。

[0094] 本明細書には本発明の態様が十分に理解されるために説明の目的で多数の詳細事項を述べる。しかし、これらの具体的な詳細事項が必須ではないことは当業者に明らかであろう。たとえば、本明細書に記載する態様がソフトウェアルーティン、ハードウェア回路、ファームウェア、またはその組合わせとして実装されるかどうかについて具体的な詳細事項を提示していない。

[0095] 当業者に認識されるように、前記に挙げた側面および／または態様を多様な組合わせで組み合わせることができる。本開示の利点を以下の実施例によってさらに説明する。本明細書に述べる実施例およびそれらの具体的な詳細事項は説明のために提示されるにすぎず、それらを本発明の特許請求の範囲に対する限定と解釈すべきではない。

材料および方法
[0096] ＴＥＡＭ試験は多国籍オープンラベル フェーズＩＩＩ試験であり、ホルモン受容体陽性^１９の早期乳癌を伴なう閉経後の女性を、エキセメスタン（２５ｍｇ）１日１回またはタモキシフェン（２０ｍｇ）１日１回を最初の２．５〜３年間；続いてエキセメスタン（２５ｍｇ）を投与する（合計５年間の処置）ようにランダムに割りつけた（参照：図１１Ａ）。ホルモン受容体（ＥＲおよびＰｇＲ）およびＨＥＲ２状態を免疫組織化学により試験参加のために地域で評価し、次いで中央で確認し^２８、ＨＥＲ２状態を免疫組織化学および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(fluorescence in situ hybridization)（ＦＩＳＨ）^２９により確認した。すべての評価をＡＳＣＯ／ＣＡＰガイドライン^{３０−３２}に従って実施した。どの患者も抗ＨＥＲ２療法を受けなかった。遠隔無再発生存(distant relapse-free survival)（ＤＲＦＳ）をランダム化から遠隔再発または乳癌による死亡までの時間と定めた^１９。

[0097] ＴＥＡＭ試験は、５カ国からの４，７３６人の患者からなる、平均臨床追跡６．８６年間の病態研究試験を含んでいた。検出力解析を実施して、この試験サイズがトレーニングコホートと検証コホートにおいてそれぞれ少なくとも３．０のＨＲを検出する８８．６％および１００％の検出力をもつことを確認した（参照：図１１Ｂ）。３，８２５の試料からＲＮＡが得られ、アッセイに成功した。英国コホートからの患者をトレーニングコホートとして割当て（ｎ＝７９０）；一方、ドイツ、ベルギー、オランダおよびギリシャからの残りの患者は完全に独立した検証コホートを構成した（ｎ＝３，０３５）。すべての患者をｍＲＮＡ存在量について評価した（参照：図１１Ｃ）。内分泌単独処置後の残留リスクのシグネチャーを同定するために、主解析はネオアジュバントおよびアジュバント化学療法を受けた患者を除外した。

ＴＥＡＭコホート検出力計算
[0098] この試験で予後判定マーカーを開発するのに十分な検出力があるかどうかを評価するために、内分泌単独コホートと内分泌＋アジュバント化学療法コホートの両方について検出力計算を実施した；全ＴＥＡＭコホート（ｎ＝２５４９および事象数＝３２０；ｎ＝３，８２５および事象数＝５０７）；ならびにトレーニング（ｎ＝５７６および事象数＝６７；ｎ＝７９０および事象数＝１０６）および検証（ｎ＝１９７３および事象数＝２５３；ｎ＝３，０３５および事象数＝４３１）それぞれのサブセットについて別個に。等サイズの患者グループと仮定して、前記の事象数に対する特定のＨＲを観察する尤度を表わす検出力推定値を下記の式（１）から導いた^３７：

式中のＥは総事象数（ＤＲＦＳ）を表わし、αは多重検定調整を表わすために１０^−３に設定された有意水準を表わす。１から３までの範囲のＨＲについて０．０１のステップでｚ_{ｐｏｗｅｒ}を計算した^３８(Haider et al. 提出済み)。

ＲＮＡ抽出および発現プロファイリング
[0099] 症例当たり５つの４μｍホルマリン固定パラフィン包埋(formalin-fixed paraffin-embedded)（ＦＦＰＥ）切片を脱パラフィン処理し、腫瘍領域をマクロ切除し、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標） Ｒｅｃｏｖｅｒａｌｌ（商標）総核酸単離キット−ＲＮＡ抽出ブロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標），カナダ，オンタリオ）を用いてＲＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ−８０００分光光度計（米国デラウェア州）を用いてＲＮＡアリコートを定量した。ＴＥＡＭ病態コホートから抽出した３８２５のＲＮＡすべてのアッセイに成功した。各遺伝子についてプローブを設計し、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ワシントン州シアトル）で合成し；ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムを用い、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓプロトコルに従って、各試料につき２５０ｎｇのＲＮＡをハイブリダイゼーション、処理および分析した。

ｍＲＮＡ存在量分析および生存モデリング
[00100] 未処理のｍＲＮＡ存在量カウントデータを、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＮｏｒｍ Ｒパッケージ^{３３，３９}（ｖ１．１．１９）により、発現上位７５遺伝子の幾何平均から導いた正規化係数を用いて前処理した。ＲＮＡカウント｜ｚ−スコア｜＞６をもつ試料に目印をつけ、外れ値として除外した。このコホートにおける選択した正規化方法の性能を評価するために、合計２５２の組合わせの前処理方法を評価した：６つの陽性対照、８つの陰性対照および８つのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬＰ０、ＴＦＲＣ、ＭＲＰＬ１９、ＳＦ３Ａ１、ＧＡＰＤＨ、ＰＳＭＣ４、ＡＣＴＢ、およびＧＵＳ）を利用する正規化方法、続いて包括的正規化に及ぶ（参照：図１２）。最適な前処理パラメーターを同定するために、２つの基準を評価した。第１に、それぞれの前処理方法を、それらがＨＥＲ２陽性試料とＨＥＲ２陰性試料の間のＥＲＢＢ２ ｍＲＮＡ存在量のユークリッド距離(Euclidean distance)を最大化する能力に基づいて順位付けした。このプロセスをそれぞれの前処理スキームにつき１００万のランダムサブセットのＨＥＲ２陽性およびＨＥＲ２陰性試料について繰り返した。第２に、それぞれの前処理方法を、それらがバッチ間変動を最小限に抑える能力に基づいて、５つのランダム選択した匿名ＦＦＰＥ乳癌試料から抽出したＲＮＡの１５回複製プールを用いて評価および順位付けした。混合効果線形モデルを実行し、残差推定値(residual estimate)をバッチ間変動の推定値として用いた（Ｒ ｐａｃｋａｇｅ：ｎｌｍｅ ｖ３．１−１１７）。最後に、２つのマトリックスのＲａｎｋＰｒｏｄｕｃｔ^４０に基づいて、これら２つの基準に基づく累積順位を推定した。未処理カウントを上位７５の発現遺伝子から誘導した幾何平均に対して正規化するｒａｎｋ ｐｒｏｄｕｃｔに基づいて、最適な前処理方法の最終選択肢を選択した。１４の試料を潜在外れ値として排除した（ＲＮＡカウント｜ｚ−スコア｜＞５または低いアレイ間相関性をもつ）。１４の試料を二重に試験し、それらの未処理カウントを平均し、その後、単一試料として処理した後に正規化した。選択した方法はｒａｎｋ ｐｒｏｄｕｃｔ中の上位１０の前処理方法に含まれていた（参照：図１２）。

[00101] 患者を高発現グループと低発現グループに中央二分割(median-dichotomizing)することにより、前処理したｍＲＮＡ存在量データの一変量生存解析を実施した。臨床変動年齢を二値としてモデリングし（５５歳付近で二分割した）、一方、グレードおよび結節状態を順位変数(ordinal variable)としてモデリングし、病理学的サイズを連続変数としてモデリングした。

ネットワークベースのシグネチャー誘導およびモジュール調節異常スコア
[00102] 一変量コックス比例ハザードモデリングに基づき、内分泌処置のみのトレーニングコホートにおいてまず遺伝子のフィーチャー選択を実施した；ｐ＜０．２５のものを残した。これらの残した遺伝子を用いて“モジュール調節異常スコア”を計算した。

[00103] 下記の方法を用いてモジュール調節異常スコア（ＭＤＳ）を計算した(Haider et al., 提出済み)：１）トレーニングコホートのみに基づく一変量コックス比例ハザードモデルを当てはめることにより、評価した遺伝子すべての重み（β）を計算した；そして２）次いでこれらの重みを計測ｍＲＮＡ存在量レベルに掛けて、式（２）により表わされる患者当たりのモジュール調節異常スコアを推定した：

ここで、ｎは特定のモジュールにおける遺伝子の数を表わし、Ｘ_ｉは遺伝子ｉの計測（ｚ−スコア）存在量を表わす。トレーニングコホートにより推定したパラメーターを用いて検証コホートの患者についてのＭＤＳを作成した。

[00104] 次いで多変量コックス比例ハザードモデルを臨床共変量（年齢、グレード、病理学的サイズおよび結節状態）と共にＭＤＳに当てはめた；ＡＩＣを用いた段階的後退選択法(stepwise backward selection approach)を実施して、多変量モデルを改良した。最終選択したモデルをトレーニングコホートにおいてトレーニングし、そして完全独立した検証コホートにおいて検証した（参照：表１）。１０年に切断した(truncated)ＤＲＦＳをエンドポイントとして用いた。下記に従って再発確率を推定した。すべての生存モデリングを、ＤＲＦＳについて、生存率パッケージ(survival package)（ｖ２．３７−４）を備えたＲ統計学的環境(R statistical environment)において実施した。受信者動作特性(receiver operating characteristic)（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）によりモデル性能を評価した。

再発確率
[00105] 予測リスクスコアを２５の等しいビン(bin)に分割することにより、５年目および１０年目の再発確率を推定した。各ビンについて、再発確率Ｒ（ｔ）を１−Ｓ（ｔ）として計算した；ここで、Ｓ（ｔ）は５年目または１０年目のカプラン・マイヤー生存率推定値である。これら２５のビンのＲ（ｔ）推定値を平滑化するために局所多項式回帰(local polynomial regression)を用いた。次いでこれらの予測推定値を、最初と最後のグループを除いた各グループの中央リスクスコアに対してプロットした；その際、それぞれ最低リスクスコアおよび９９パーセンタイルを用いた。すべての生存モデリングをＲ統計学的環境（Ｒパッケージ：生存率ｖ ２．３８−３）で実施した。

モデル評価
[00106] 受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を用いて生存モデルの性能を評価した。異なるモデルにわたるＡＵＣ差の有意性を評価するために並べ替え解析(permutation analysis)を実施した（生存オブジェクトの順序を維持したままスコアを１０，０００回シャッフルした）。

商業ベースおよび学究ベースのリスク層別化スコアの誘導
[00107] 下記のマルチパラメトリック検定を含む、遺伝子を用いる類似のリスク分類の誘導：ＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ（登録商標）（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｃ．）^５，６、Ｐｒｏｓｉｇｎａ（商標）（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）^７−９、Ｍａｍｍａｐｒｉｎｔ（登録商標）（Ａｇｅｎｄｉａ Ｉｎｃ．）^{１０，１１}。

[00108] ｍＲＮＡ−ＩＨＣ４リスクスコア：記載^{４１，４２}に従ってＩＨＣ４−タンパク質モデルリスクスコアを計算し、臨床共変量について調整した。ＥＲヒストスコア(histoscore)を３０で割ることによりＥＲ１０スコアを計算し、ＰｇＲ染色パーセントを１０で割ることによりＰｇＲ１０スコアを計算した。１０倍交差検証法を用いてモデルをトレーニングし、ＩＨＣ４ ＲＮＡリスクスコアを作成した。ｍＲＮＡ−ＩＨＣ４モデルを、トレーニングコホートにおけるＥＳＲ１、ＰＧＲ、ＥＲＢＢ２およびＭＫＩ６７のｍＲＮＡ存在量プロファイル上で、多変量コックス比例ハザードモデリングを用いてトレーニングした（表２）。モデル予測値（連続リスクスコア）を分位数にグループ分けし、カプラン・マイヤー解析、および前記に従って臨床変量について調整した多変量コックス比例ハザードモデルを用いて解析した。

[00109] ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ−ｌｉｋｅ再発スコア：前記^４３に従って１６の被験遺伝子からのデータを正規化し、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ強度値をｌｏｇ２変換して元の刊行物からの０−１５測定範囲に当てはめた。次いで下記に基づいて未基準化(unscaled)再発スコアを計算した：ＲＳ_Ｕ＋０．４７×ＧＲＢ７グループスコア−０．３４×ＥＲグループスコア＋１．０４×増殖グループスコア＋０．１０×浸潤グループスコア＋０．０５×ＣＤ６８−０．０８×ＧＳＴＭ１−０．０７×ＢＡＧ１；最後にこれらのスコアを前記^４３に従って基準化した。次いで患者をそれぞれ２５より大またはそれ未満の再発スコアに基づいて高転帰および低転帰グループに分類し、ＤＲＦＳについてモデリングした。

[00110] Ｐｒｏｓｉｇｎａ−ｌｉｋｅサブタイプ分類および再発リスクスコア：Parker et al.^４４が概説した方法に基づいて試料をスコアリングし、ＰＡＭ５０遺伝子リストの５０遺伝子^{４５−４７}を用いてＥＲ陽性に関してトレーニングした。“ｎｏｒｍａｌ−ｌｉｋｅ”サブグループを最終サブタイプ分類から除外した。補足ファイル^４４からＲスクリプト(R script)を求め、スコアを作成し、それらを次いでＤＲＦＳに対してモデリングした。

[00111] ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ−ｌｉｋｅリスクスコア：ｇｅｎｅｆｕ Ｒパッケージ（ｖ１．１４．０）のｇｅｎｅ７０関数に基づいて試料をスコアリングした。van de Vijver et al. ^４８およびＤＲＦＳに基づく転帰に従って低リスクおよび高リスクカテゴリーの誘導をモデリングした。

[00112] Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ−ｌｉｋｅリスクモデリング:Toussaint et al.^４９に概説された方法に基づき、ＭＹＢＬ２、ＫＰＮＡ２、ＣＤＣ２およびＣＤＣ２０を用いて試料をスコアリングした。発現データを用いて平均発現ハウスキーピング遺伝子（ＧＵＳ、ＴＢＰ、ＲＰＬＰＯおよびＴＦＲＣ）を計算し、それを用いて４遺伝子の発現を正規化して、ＧＧＩスコアの決定に用いた。患者を低リスクまたは高リスクグループに分類し、ＤＲＦＳについてモデリングした。Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ^３４はＩＨＣ４^{３５，３６}のほかに先にPrat et al., ^１８が記載し、それらを表２に記載する。

Ｒｅａｃｔｏｍｅを用いたパスウェイ解析
[00113] 最終遺伝子リストをＣｙｔｏｓｃａｐｅ（ｖ３．０．２）のＣｙｔｏｓｃａｐｅ Ｒｅａｃｔｏｍｅ機能性相互作用(Functional Interaction)（ＦＩ）プラグインにローディングした。２０１３バージョンのＦＩネットワークで記号を遺伝子セットとしてローディングした。ＦＩネットワークをＦＩアノテーションでリンカー遺伝子なしに構築した。ＦＩプラグイン関数を用いて、各モジュールについてスペクトルクラスタリング(Spectral clustering)およびパスウェイエンリッチメント(Pathway Enrichment)を計算した。

結果
[00114] すべての遺伝子のＲＮＡ存在量プロファイルを３，８２５人の患者について作成した。完全な療法情報があった患者のうち２，５４９人を内分泌療法のみで処置し、一方、１，２７５人はアジュバント化学療法も受けた。内分泌処置のみの患者を５７６人のトレーニングコホート（ｎ＝６７の事象）と１，９７３人の検証コホート（ｎ＝２５３の事象）に分け、それをそれぞれシグネチャー発見と検証に用いた。内分泌処置患者においてトレーニングおよび検証したシグネチャーの、アジュバント化学療法で処置した患者に対する予後判定能力を調べるために、次いで、そのシグネチャーを検証コホートの全患者に対してモデリングし、アジュバント化学療法のために調整した（ｎ＝３，０３５）。各コホートにおける中央追跡はそれぞれ７．５１年および６．２１年であった。内分泌処置のトレーニングコホートおよび検証コホートの臨床特徴を表１に記載する。３，８２５人の患者の全コホートの臨床特徴を表３にまとめる。高い腫瘍グレード、結節状態、病理学的サイズおよびＨＥＲ２ ＩＨＣ状態は、トレーニングコホートと検証コホートの両方において一変量で予後判定能力があった（参照：表１および表３）。

内分泌処置後の残留リスクシグネチャーの同定および検証
[00115] 元の１６５遺伝子の遺伝子リストの一変量評価により、内分泌単独処置した患者において予後判定有意である９５の遺伝子が同定された（表４，参照：図４）。これら９５の遺伝子を機能モジュール(functional module)に集計し、残留リスクモデルをトレーニングするために用いた。これら９５の遺伝子から、臨床共変量を用いて、および用いずに作成したＭＤＳのモデリングにより、結節状態を唯一の臨床共変量として含む最終改良型シグネチャーが得られた（参照：図１）。このリスクモデルは、９５−遺伝子シグネチャーを用いた場合、トレーニングコホートにおいて同等であることが認められた：臨床共変量を用いない場合（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝４．０５，９５％ ＣＩ ２．２５−７．３，ｐ＝３．２８×１０^−６；１０倍交差検証）、ならびに臨床共変量、たとえば腫瘍グレード、病理学的腫瘍サイズおよび結節状態を含めた場合（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝２．７４，９５％ ＣＩ １．６１〜４．６５，ｐ＝２．０６×１０^−４；１０倍交差検証）（参照：図５）。中央値周囲で二分割し、検証セットに適用した場合、得られた９５−遺伝子シグネチャーは内分泌処置後のＤＦＲＳの頑健な予測子であった（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝５．０５，９５％ ＣＩ ３．５３〜７．２２，ｐ＝７．５１×１０^−１９，参照：図１Ａ）。トレーニングセットと同様に、すべての臨床共変量を検証コホートのモデルに含めた場合、類似の結果が得られた（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝５．５６，９５％ ＣＩ ３．８５〜８．０３，ｐ＝５．７５×１０^−２０，参照：図６）。試料を分位数に分けた場合（参照：図１Ｂ）、このシグネチャーはきわめて低いリスクの患者（１０年目に＜５％のＤＲＦＳ）を同定した。このシグネチャーからの連続リスクスコアは５年目（参照：図１Ｃ）および１０年目（参照：図１Ｄ）の再発の尤度と直接相関し、より高いリスクスコアは顕著に、より高い転移事象の尤度と相関していた。

アジュバント化学療法の存在下における９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーの性能
[00116] アジュバント化学療法も受けた患者において９５−遺伝子 残留シグネチャーが予後判定能力を維持するかどうかを判定するために、このモデルを検証コホートのすべての患者（化学療法を受けた者および受けていない者）に、ただし化学療法に層別化して適用した（参照：図７Ａおよび７Ｂ）。結果は、このサブセットの患者において９５−遺伝子シグネチャーが依然として予後判定能力をもつことを示した（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝４．７，９５％ ＣＩ ３．５６〜６．２，ｐ＝８．８７×１０^−２８）。アジュバント化学療法に従った層別化は、このシグネチャーによって低リスクまたは高リスクとして定められる患者間でＤＲＦＳにおいて差を示さなかった（参照：図７Ｃ）。

ＨＥＲ２状態について調整した場合の９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーの性能
[00117] ＨＥＲ２陽性およびＨＥＲ２陰性患者の両方において９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーが予後判定能力を維持するかどうかを判定するために、このモデルを追加のアジュバント化学療法を受けなかった検証コホートの患者に適用し、ＨＥＲ２状態により結果を層別化した（参照：図８）。このモデルをすべての患者に適用し、ＨＥＲ２状態により結果を層別化した場合（参照：図８Ａ）、９５−遺伝子シグネチャーによって低リスクと同定された患者はＨＥＲ２陽性またはＨＥＲ２陰性の患者間でＤＲＦＳに有意差を示さなかった（ｐ＝０．７８）。同様に、高リスクと同定された患者について、ＨＥＲ２陽性またはＨＥＲ２陰性の患者間でＤＲＦＳに統計学的有意差はみられなかった（ｐ＝０．０９）が、ＨＥＲ２陽性患者はより劣悪な転帰の傾向を示すことが観察された。全体として、このシグネチャーは、ＨＥＲ２陽性（ＨＲ＝５．１７；９５％ ＣＩ：１．２５〜２１．３８；ｐ＝０．０２３）またはＨＥＲ２陰性（ＨＲ＝４．７５；９５％ ＣＩ：３．２３〜６．９７；ｐ＝２．０１×１０^−１５）のいずれの患者サブセット内でも（参照：図８Ｂ）、高リスクを低リスクから鑑別することができる。

マルチパラメトリック検定に対する９５−遺伝子シグネチャーの性能
[00118] ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＲＮＡ存在量データを用いて、現在のマルチパラメトリック検定からリスクスコアを作成し、図２Ａおよび表５に既知の予後判定臨床因子と共に示す。分子ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ結果も示す（参照：図２Ａ）。全検定にわたって高リスクおよび低リスク患者の共通グループがあるが、不一致(discordant)結果を伴なう患者が多数ある（参照：図２Ａ、表６）。市販検定に基づいて作成したリスクスコア（参照：図２Ｂ、表７）と比較した場合、９５−遺伝子シグネチャーはこの試験において０．７６のＡＵＣでこれらのマルチパラメトリック検定より良好な性能を示した。市販検定と９５−遺伝子リスクスコアとのＡＵＣにおける差は統計学的に有意であることが認められた（表８）。検定間の全体的一致性のほかに、検証コホート全体にわたるｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ−ｌｉｋｅリスクスコアのまとめを表５および６に示し、市販または学究的リスク層別化検定それぞれについてのカプラン・マイヤー生存プロットを図９に示し、補足データ中にさらに記載する。全体として、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＲＮＡ存在量データを用いて総括した各検定は再発に対する低リスクまたは高リスクの患者を統計学的に有意に鑑別できた（参照：図９）。

９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーおよびマルチパラメトリック検定の性能：
[00119] この遺伝子リストの組成物により、多数の市販および学究的な残留リスク層別化検定のものと類似するリスク分類の誘導が可能であった（参照：図２）。検証コホートにわたるそれぞれの市販および学究的検定についてのカプラン・マイヤー生存プロットは、それらのマルチパラメトリック検定の性能と一致する統計学的に有意の結果を示した（参照：図９，表５および６）。直接比較すると、９５−遺伝子 残留リスク分類器(classifier)は、他のマルチパラメトリック検定結果より有意に良好な性能をもつ０．７６の曲線下面積（ＡＵＣ）を生じた（表７および８）。その次に良好な性能をもつ分類器は、ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ−ｌｉｋｅの結果（ＡＵＣ＝０．７２）、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ−ｌｉｋｅ（ＡＵＣ＝０．７１）、ｍＲＮＡ−ＩＨＣ４（ＡＵＣ＝０．７２）、Ｐｒｏｓｉｇｎａ−ｌｉｋｅ（ＡＵＣ＝０．７０）、タンパク質−ＩＨＣ４（ＡＵＣ＝０．６８）、およびＧｅｎｏｍｉｃ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ−ｌｉｋｅ（ＡＵＣ＝０．６７）の結果であった。９５−遺伝子シグネチャーは、この試験においてＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ発現データにより作成されたＧｅｎｏｍｉｃ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ−ｌｉｋｅ（２．８３×１０^−９）およびＰｒｏｓｉｇｎａ−ｌｉｋｅ（ｐ＝３．０２×１０^−８）の結果より有意に良好な性能を示し；一方で、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ−ｌｉｋｅ（ｐ＝５．１０×１０^−３）およびＭａｍｍａＰｒｉｎｔ−ｌｉｋｅ（ｐ＝２．９８×１０^−３）検定結果より良好な性能も示した。検定間の一致性を表９に示す；９５−遺伝子シグネチャーは、ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ−ｌｉｋｅおよびＰｒｏｓｉｇｎａ−ｌｉｋｅの結果と、より大きな一致性を示す。

[00120] Ｐｒｏｓｉｇｎａ−ｌｉｋｅ再発リスクスコアおよび分子サブタイプ分類： Ｐｒｏｓｉｇｎａ検定を含む遺伝子を用いて、内分泌単独処置した検証コホート１９７１人の患者のうち、ｎ＝１９４は低リスクであると同定され；ｎ＝７４４は中リスクをもつと同定され；ｎ＝１０３３は高リスクであると同定された（参照：表５、図９）。検証コホートのＤＲＦＳ所見によって先の試験が確認され、低リスクおよび中リスクと同定された者は高リスク患者より長いＤＲＦＳを示した（ｐ＝１．６５×１０^−１７）（参照：図９）。低リスクと中リスクの患者を合わせると、ＨＲ_ｈｉｇｈ ３．４９，９５％ ＣＩ ２．５９〜４．７，ｐ＝１．７５×１０^−１６となった（参照：図９）。分子サブタイプ分類は７７７人（３９．３％）の患者をルミナル(Luminal)Ａ、５０２人の患者をルミナルＢ（２５．４％）、３５２人（１７．８％）の患者をＢａｓａｌ−ｌｉｋｅ（基底−様）の分子シグネチャーをもつと同定し；３４２人（１７．５％）の患者をＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ−ｌｉｋｅ（ＨＥＲ２豊富−様）の分子シグネチャーをもつと同定した（表５）。ＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ−ｌｉｋｅであると同定され、それらについてＨＥＲ２状態の情報が得られた患者のうち、１１３／３３４人（３３．８％）はＨＥＲ２が増幅されているかまたはＨＥＲ２過剰発現について陽性であることがＩＨＣにより認められ、一方、残りの２２１人（６６．２％）は遺伝子によるタンパク質発現増幅について陰性であった。分子サブタイプにわたるＤＲＦＳ間の差は、ルミナルＡと分類された患者が過剰ルミナルＢと分類された患者より長いＤＲＦＳをもつことを示した（参照：図９）；同様に、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅの患者は８年目にＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ−ｌｉｋｅの症例と類似のＤＲＦＳを示し、同様に、より短いＤＲＦＳを示した（ｐ＝８．８８×１０^−２３）（参照：図９）。

[00121] ＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ−ｌｉｋｅリスクスコア： ＯｎｃｏｔｙｐｅＤｘ−ｌｉｋｅリスクスコアをPaik et al. ^４３に従って作成した。ＴＡＩＬＯＲｘ試験^{５０，５１}に用いられたカットオフに合わせてリスクスコア２５をカットオフとして用いることにより、患者を低リスクまたは高リスクグループに二分割して（参照：図９）、９３６人（４７．４％）を低リスクとみなし、１０３７人の患者（５２．６ ％）を高リスクとみなして同定した。２５を超えるリスクスコアをもつ患者について、より低いリスクスコアをもつ患者より短いＤＲＦＳがみられた（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝２．９７，９５％ ＣＩ ２．２３〜３．９５，ｐ＝７．３７×１０^−１４）。

[00122] ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ−ｌｉｋｅリスク評価： ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ−ｌｉｋｅリスク評価は、内分泌単独処置したコホート全体のうち１１２５人（５７．０％）の患者を低リスクと同定し；８４８人（４３％）を高リスクと同定した。ＤＲＦＳは、低リスク患者についてはより長く、ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ−ｌｉｋｅ高リスク患者についてはより短かった（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝３．６３，９５％ ＣＩ ２．７７〜４．７７，ｐ＝１．６６×１０^−２０，参照：図９）。

[00123] Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ−ｌｉｋｅリスクモデリング：Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘの使用に従って患者を層別化した場合、９９５人の患者（５０．４％）が低リスクと同定され、残り１０１８人の患者（４９．６％）は高リスクとみなされた（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝３．１２，９５％ ＣＩ ２．３４〜４．１５，ｐ＝７．５１×１０^−１５）参照：図９）。

[00124] ＩＨＣ４−ｍＲＮＡリスク評価：タンパク質ベースの残留リスク分類器に転換すると、コードセット内のＥＲ、ＰｇＲ、Ｋｉ６７およびＨＥＲ２の発現値を用いるＩＨＣ４は、内分泌単独処置した患者内の５６９人（２８．８％）の患者を低リスクと同定し、１４０４人（７１．２％）の患者を高リスクと同定する結果になった。ＩＨＣ４−ｍＲＮＡによって低リスクとみなされた内分泌単独処置患者についてのＤＦＲＳは、高リスクとみなされた者より長かった（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝３．４８，９５％ ＣＩ ２．３５〜５．１５，ｐ＝５．１１×１０^−１０，参照：図９）。実際に、ｍＲＮＡの使用は、ＨＲにおいて元の報文に従った免疫組織化学的結果を用いるＩＨＣ４に匹敵した（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝２．４，９５％ ＣＩ １．８５〜３．１１，ｐ＝３．７２×１０^−１１，参照：図９）。

９５−遺伝子シグネチャーにおける薬物標的の同定および層別化プレシジョンメディシンの指示
[00125] シグネチャーにおける９５遺伝子のうち５２を含む機能性相互作用（ＦＩ）ツールを用いて、６つの重要なネットワークモジュールを同定した（参照：図３Ａ，表１０）。モジュール１、３および４は、有糸分裂（ＦＤＲ＜５．０×１０^−４）、細胞周期（ＦＤＲ＜３．３３×１０^−４）、および細胞周期チェックポイント関連の経路（ＦＤＲ＝０．０００１）に関与する遺伝子を含んでいた。モジュール２は、下記を含めた受容体−チロシンシグナル伝達に関与する遺伝子および経路を含んでいた：ＥＲＢＢ経路シグナル伝達（ＦＤＲ＜６．６６×１０^−５）、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達（ＦＤＲ＜８．３３×１０^−５）、ｐ５３シグナル伝達（ＦＤＲ＜５．００×１０^−４）、およびアポトーシス（ＦＤＲ＝０．００４７９）。これらのモジュール内の個々の遺伝子について正規化した発現（表９）は、モジュール１、３および４内のすべての遺伝子が高リスクと分類された患者間で高度に発現していることを示した（表９；ウィルコクソンの順位和検定(Wilcoxon rank-sum test))。

[00126] これらの差は統計学的に有意であることが認められた（表９）。個別モジュールとして、それらは統計学的に有意の転帰予測子であった（参照：図３Ｂ）。統計学的に有意ではないが、９５遺伝子すべてを一緒に残留リスクシグネチャーセットとして用いた場合、より高いＡＵＣがみられ、よって最終リストとして持ち越された（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝５．０５，９５％ ＣＩ ３．５３〜７．２２，ｐ＝７．５１×１０^−１９）。有糸分裂および細胞周期調節に大きく関連する遺伝子、たとえばＢＩＲＣ５、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＣＮＢ１およびＰＴＴＧ１からなるモジュール１（表１０）は、検証コホートの患者を低リスクまたは高リスクとして分類することができた（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝３．０１，９５％ ＣＩ，ｐ＝１．８１×１０^−１８）。同様に、ＡＵＲＫＡ、ＣＤＫ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ２、ＣＤＣ６およびＰＬＫ１を含むモジュール３および４からの遺伝子も、患者を低リスクと高リスクのカテゴリーに分類した：それぞれ、ＨＲ_ｈｉｇｈ＝３．３，９５％ ＣＩ ２．４７〜４．４２，ｐ＝９．８２×１０^−１６、およびＨＲ_ｈｉｇｈ＝３．８４，９５％ ＣＩ ２．８３〜５．２１，ｐ＝５．１２ｘ１０^−１８（参照：図３Ｂ）。モジュール２内の正規化したＲＮＡ存在量（表９）は混合しており、あるものは高リスク患者間で発現低下を示し（すなわち、ＴＰ５３およびＢＣＬ２）、他のものは発現増大を示した（すなわち、ＣＣＮＥ１およびＲＲＭ２）；しかし、グループとしてモデリングした場合、モジュール２もより劣悪な予後を伴なう患者を同定することができた（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝４．０３，９５％ ＣＩ ２．９８〜５．４５，ｐ＝１．０３×１０^−１９）。最後に、ＣＤＨ３およびＭＭＰ９からなるモジュール５（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝１．３３，９５％ ＣＩ １．０４〜１．７１，ｐ＝０．０２２）も、２つの遺伝子ＫＰＮＡ２およびＫＲＴ８を含むモジュール６（ＨＲ_ｈｉｇｈ＝２．６５，９５％ ＣＩ ２．０１〜３．４９，ｐ＝５．４３×１０^−１２）と同様に、ＤＲＦＳの有意の予測子であった。

偽発見率(False Discovery Rate)（ＦＤＲ）ｐ＜０．００１で選択された経路
^＊ Thomson Reuters Integrity(サービスマーク)およびClinicalTrials.gov (https://clinicaltrials.gov/)を用いて検索した化合物
[00127] これらのモジュール内の遺伝子についてＩｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｓｅａｒｃｈ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｒｅｕｔｅｒｓ）を用いて、臨床で乳癌または他の新生物の処置のために現在用いられている多数の標的化合物；あるいはフェーズＩＩおよび／またはフェーズＩＩＩ開発中のもの(https://clinicaltrials.gov/)を同定した（参照：図３，表１１）。これらの化合物のうち多数が、この試験で用いた分類器によって高リスクとみなされた者について、早期ルミナル乳癌(luminal breast cancer)セッティングにおいて層別化使用できる可能性をもつ（表１０）。したがって、これらの化合物は標的療法薬を早期ルミナル乳癌のために再利用できる可能性をもつ（参照：図１０）。

[00128] ＥＲ＋疾患の処置後に死亡する女性が他のいずれの乳癌サブタイプより多いので^３、内分泌処置後の再発は依然として臨床上の問題である。したがって、内分泌療法後に再発するリスクをもつ女性を同定するというニーズが現在ある。より重要なことに、同時に将来の療法介入のための標的および女性をそのような標的療法に効果的に層別化する手段を同定することにより、これらの患者の臨床管理が改善され、それらの過剰処置を低減でき、あるいは逆に現在は過少処置の可能性がある患者を同定できる。ＴＥＡＭ病態コホートからの３８２５人の患者を用いて、リスク層別化を有意に改善する、かつそれらに対して他の悪性疾患において現在使用中であるかまたは評価中である薬物がある遺伝子(https://clinicaltrials.gov/)を同定する、シグネチャーを誘導した。これらの患者はこの９５−遺伝子シグネチャー内の特定の機能モジュールに一致する可能性がある（表１０，表１１）。個々のモジュールの予後判定能力により暗示されるように（参照：図３）、このアプローチは、患者をそれらの癌の分子ドライバーに基づく既存の標的療法に、および／またはインビトロ検証試験のための新規／推定標的に、より良好に層別化できる可能性をもつ（参照：図１０）。市販のリスクスコアおよびサブタイプ分類はＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＲＮＡ存在量プロファイリングに基づいて誘導されたという事実にもかかわらず、この試験により、大部分の現在の乳癌マルチパラメトリックリスク検定はＥＲ＋乳癌を伴なう女性集団についておおまかに同等なリスク情報を提供する（参照：図９）が、個々の患者レベルでの検定間では不一致を示す可能性がある（参照：図２，表５および６）という最近のＵＫ−ＯＰＴＩＭＡ ｐｒｅｌｉｍ試験^１７の所見が確認された。現在の標準細胞毒化学療法に対して感受性である可能性がある患者を同定するほかに、このシグネチャー中の遺伝子によって明らかになったこれらの高リスク患者の分子ドライバーに対する標的療法を考慮および同定すべきである。

[00129] 現在のマルチパラメトリック検定は現在のアジュバント化学療法計画が有益な可能性がある者を同定できるが、これらの検定はいずれも薬物特異的化学療法に対する応答を予測しない。この問題は、包括的および個別の両方の化学療法応答の複雑さのほかに、ドライバー経路の同定によって妨げられている。このデータにより作成された情報を用いると、９５−遺伝子シグネチャーを含む遺伝子モジュールをターゲティングする候補薬物を試験および検証するためのモデル（参照：図１０，表１１）を開発することができる。

[00130] この方法で、モジュール１において同定したＧ２／Ｍチェックポイントに関連する遺伝子、たとえばＢＩＲＣ５（サバイビン(Survivin)）をターゲティングすることができた。ＹＭ１５５、すなわちサバイビン抑制薬が、転移乳癌セッティングでドセタキセル(docetaxel)と組み合わせて、フェーズＩＩ、多施設、オープンラベル、２アーム試験において評価された^２０。しかし、この試験において、ＹＭ１５５有益性について先立って患者層別化がなかったことは、それをドセタキセルに追加することに有意の有益性がないという所見に関与した可能性があり、よってこの経路をターゲティングすることの潜在有益性が不明瞭になる。乳癌において過剰発現することが知られてはいたが、高リスク患者にみられた相対的に高いＢＩＲＣ５発現（ｐ＝７．２３×１０^−１８０）（表９）は、高リスクをもたらすｍＲＮＡ存在量の転換点があることを示唆する。モジュール１、３および４内のすべての遺伝子が統計学的に有意に再発のリスクがより高い患者においてより高い発現を示すことが観察され（表９）、これは乳癌発病における細胞周期および増殖の顕著な役割を反映している。

[00131] モジュール３は後期有糸分裂事象を伴なう経路を特徴とする。ＣＤＫ１の過剰発現はセラノスティクス標的(theranostic target)を提供し、現在、ディナシリブ(Dinacilib)または類似の分子を用いてフェーズＩＩＩ試験で評価中である（表１１）。細胞周期および有糸分裂チェックポイント制御の回復は指向型療法(directed therapy)のためのもうひとつの魅力的機序であり、セラノスティクス標的、たとえばＰＬＫ１（参照：図３）について前臨床および臨床セッティングにおいて阻害薬で処置が行なわれている^{２１，２２}。ＣＣＮＤ１を含むモジュール４のＳ期およびＤＮＡ複製経路の調節は、患者をパルボシクリブ(Palbociclib)または他のＣＤＫ阻害薬に層別化できる可能性を支持する（表１１）。ＰＡＬＯＭＡ−１試験^２８についての所見により、転移性乳癌セッティングにおけるレトロゾール(Letrozole)との併用でパルボシクリブ（ＣＤＫ４／６阻害薬）について承認が得られた；これは、ＰＥＮＥＬＯＰＥ−Ｂ試験において、ＥＲ＋／ＨＥＲ２癌および残留疾患を伴なう高リスク患者のランダム化のための道を敷いた。ＣＤＫ阻害薬の使用は後期および転移性セッティングにおいては有望であるが、早期乳癌セッティングにおいてはまだ適切に評価されておらず、この処置が最も有益であると思われる患者を層別化するための検証された方法も無い。興味深いことに、最近のパルボシクリブとタモキシフェンの相乗作用のインビトロ証拠は、ＥＲ耐性細胞株におけるタモキシフェンに対する再感受性化を示し^２４、これはＥＲ耐性の可能性がある者の同定には内分泌療法とＣＤＫ阻害薬の併用がより大きな有益性を示す可能性があることを示唆する。モジュール２の遺伝子は、受容体型チロシンキナーゼシグナル伝達、アポトーシスおよび細胞周期の制御を特徴とし、ＥＲＢＢファミリーの遺伝子のメンバー中に薬物標的をもつ。抗ＨＥＲ療法はＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２陽性患者に効果的であるが、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢファミリーの他のメンバー間の相互干渉は、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２とは別のメンバーの異常発現がＨＥＲ２増幅の存在しない状態で抗ＨＥＲ療法を使用することを正当化できることを示唆する。ＥＧＦＲ阻害薬、たとえばゲフィチニブ(Gefitinib)およびラプチニブ(Laptinib)は他の悪性疾患において有効性を示したが、乳癌においては中等度の成功を示したにすぎず、これは最も有益性を受けるであろう者を同定するためには改良された患者選択方法が必要であることを示唆する。興味深いことに、２９６／３４２人（８６．５％）のＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ−ｌｉｋｅの患者が、この試験に用いた分類器によって高リスクと同定された。

[00132] しかし、確認されたＨＥＲ２遺伝子増幅またはタンパク質過剰発現をもつＨＥＲ２ ｅｎｒｉｃｈｅｄ−ｌｉｋｅの患者の３３．８％について、これらの結果はある患者にはＥＲＢＢファミリーおよび関連経路をターゲティングする療法が有益である可能性があることを示唆する。事実、抗−ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２療法の使用に先立つ９５−遺伝子シグネチャーは、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２状態に関係なくこの患者集団においてなお予後判定能力がある（参照：図８）。さらに、ＥＲＢＢ３およびＥＲＢＢ４は一変量で予後判定能力をもち最終シグネチャーの一部であることが認められたが、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２発現はそうではなかった（表４）。このデータは、現在の臨床実施において多数のＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２陽性、低リスク患者が抗−ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２療法を受けており、その結果、ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２陰性患者より良好ではない転帰を生じている可能性があることを示唆するであろう。同様にＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２陽性である高リスク患者に関して抗−ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２処置はこのグループのサブセットに対して若干の有益性をもつであろうが、この高リスク集団に再発の他の分子ドライバーがあることは明らかである。ＥＲＢＢの下流経路、たとえば本発明の解析によって有意経路として同定されたＰＩＫ３／ＡＫＴ／ｍＴＯＲは、高リスクと同定された患者におけるエベロリムス(Everolimus)使用の可能性を支持する^{２５，２６}。興味深いことに、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅと同定された２７８／３５２人（７８．９％）の患者が、ＥＲ＋と臨床分類されているにもかかわらず遺伝子シグネチャーによって高リスクとして分類された；これにより、ホルモン受容体陽性癌における分子不均質性の重要さを認識する必要性、および新規処置の意義が強調された。

[00133] 結節状態を統合する９５−遺伝子 残留リスクシグネチャーは、早期再発について現在利用されているマルチパラメトリック検定より有意に良好な臨床有用性をもつことが立証された。このシグネチャーは後期再発について予後判定能力を維持すると思われる。これらのマルチパラメトリック検定とは異なり、このシグネチャー中の遺伝子のモジュール解析は高リスク患者における療法介入に適した幾つかの遺伝子および経路を同定した。将来の臨床試験設計には希望参加者全員のランダム化より、むしろ新規療法に適した患者のターゲティッド選択における著しい改善が必要である。

[00134] ホルモン受容体陽性癌は分子的に不均質であり、よって新たな処置戦略が要求される（参照：図２Ａおよび表５，表１１）。マルチパラメトリック遺伝子シグネチャーは選択の一手段ではあるが、改良された層別化は遺伝子の変異状態とコピー数状態の統合も含まなければならない。したがって、早期のホルモン受容体陽性乳癌を伴なう女性の臨床管理を改善するためには、将来の臨床試験設計は、高リスク患者の同定を改善するだけでなく、そのシグネチャーの根底にある鍵となる遺伝子／経路をターゲティングする既存の療法薬への患者の選択をも改善するマルチパラメトリック検定を必要とする。

[00135] 本発明の好ましい態様を本明細書に記載したが、本発明の精神および特許請求の範囲の範囲から逸脱することなくそれらを変更できることは当業者に理解されるであろう。後記の参考文献リストを含めて本明細書に開示するすべての文献を援用する。

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42. Cuzick,J., Dowsett,M., Pineda,S., Wale,C., Salter,J., Quinn,E. et al. Prognostic value of a combined estrogen receptor, progesterone receptor, Ki-67, and human epidermal growth factor receptor 2 immunohistochemical score and comparison with the Genomic Health recurrence score in early breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 4273-4278 (2011).
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49. Toussaint,J., Sieuwerts,A.M., Haibe-Kains,B., Desmedt,C., Rouas,G., Harris,A.L. et al. Improvement of the clinical applicability of the Genomic Grade Index through a qRT-PCR test performed on frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissues. BMC. Genomics 10, 424 (2009).
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Claims (32)

1. 乳癌を伴なう対象において内分泌単独処置の予後を判定する方法であって：
   ａ）乳癌の腫瘍試料を用意する；
   ｂ）腫瘍試料において表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現レベルを決定する；
   ｃ）その発現レベルを対象コホートからの対照試料からのその遺伝子グループの基準発現レベルと比較する；そして
   ｄ）乳癌に関連する残留リスクを決定する
   ことを含み、その際、基準発現レベルと比較した遺伝子グループの発現における統計学的に有意の差または類似性は乳癌に関連する残留リスクに対応する、前記方法。
2. 遺伝子のグループが表４に挙げる遺伝子のうち少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５である、請求項１に記載の方法。
3. さらに、決定した遺伝子グループの発現レベルから対象の遺伝子発現プロファイルを構築する、請求項１または２に記載の方法。
4. 残留リスクの決定が、遺伝子グループの荷重和を計測ｍＲＮＡ存在量に掛けたものを含むモジュール調節異常スコア（ＭＤＳ）を決定することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 高いＭＤＳスコアはより高い残留リスクおよび／またはより劣悪な生存に関連し、低いＭＤＳスコアはより低い残留リスクおよび／またはより良好な生存に関連する、請求項４に記載の方法。
6. さらに、少なくとも１つの対照、好ましくは複数の対照を用いてｍＲＮＡ存在量を正規化することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 複数の対照のうち少なくとも１つが、基準対象または対象の基準遺伝子のｍＲＮＡ存在量を含む、請求項６に記載の方法。
8. さらに、対象の臨床指標を複数の基準臨床指標と比較し、その際、臨床指標は年齢、腫瘍グレード、病理学的腫瘍サイズまたは結節状態のうち少なくとも１つ、好ましくは 結節状態を含み、そして好ましくは多変量コックス比例ハザードモデルを用いてこれらの臨床指標をＭＤＳに当てはめることを含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 基準コホートの集団中央値と対比して対象が相対的に高い残留リスクを有するならば、さらに対象を内分泌療法と化学療法の併用で処置することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 乳癌がホルモン受容体陽性（ＥＲ＋）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）を用いて発現レベルを決定する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 残留リスクが遠隔無再発生存である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. コンピューター実装した、乳癌を伴なう対象において内分泌単独処置の予後を判定する方法であって：
    ａ）少なくとも１つのプロセッサーにおいて、腫瘍試料における表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現レベルを反映するデータを受信する；
    ｂ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、その発現レベルに対応する発現プロファイルを構築する；
    ｃ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、その発現レベルを対象コホートからの対照試料からのその遺伝子グループの基準発現レベルと比較する；そして
    ｄ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、乳癌に関連する残留リスクを決定する
    ことを含み、その際、基準発現レベルと比較した遺伝子グループの発現における統計学的に有意の差または類似性は乳癌に関連する残留リスクに対応する、前記方法。
14. 遺伝子のグループが表４に挙げる遺伝子のうち少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５である、請求項１３に記載の方法。
15. プロセッサーが、遺伝子グループの荷重和を計測ｍＲＮＡ存在量に掛けたものを含むモジュール調節異常スコア（ＭＤＳ）を計算することにより残留リスクを決定する、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 高いＭＤＳスコアはより高い残留リスクおよび／またはより劣悪な生存に関連し、低いＭＤＳスコアはより低い残留リスクおよび／またはより良好な生存に関連する、請求項１４に記載の方法。
17. プロセッサーがさらに、少なくとも１つの対照、好ましくは複数の対照を用いてｍＲＮＡ存在量を正規化する、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 複数の対照のうち少なくとも１つが、基準対象または対象の基準遺伝子のｍＲＮＡ存在量を含む、請求項１７に記載の方法。
19. プロセッサーがさらに、対象の臨床指標を複数の基準臨床指標と比較し、その際、臨床指標は年齢、腫瘍グレード、病理学的腫瘍サイズまたは結節状態のうち少なくとも１つ、好ましくは 結節状態を含み、そして好ましくは多変量コックス比例ハザードモデルを用いてこれらの臨床指標をＭＤＳに当てはめる、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 基準コホートの集団中央値と対比して対象が相対的に高い残留リスクを有するならば、さらに対象を内分泌療法と化学療法の併用で処置するための指示を出力する、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 乳癌がホルモン受容体陽性（ＥＲ＋）である、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 残留リスクが遠隔無再発生存である、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. プロセッサーおよびプロセッサーに接続したメモリーを有する汎用コンピューターと組み合わせて使用するためのコンピュータープログラムプロダクトであって、コンピューターメカニズムがエンコードされたコンピューター可読記憶媒体を含み、コンピュータープログラムメカニズムをコンピューターのメモリー内にローディングしてコンピューターに請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を実行させることができる、前記コンピュータープログラムプロダクト。
24. 請求項２３に記載のコンピュータープログラムプロダクトを記憶させるためのデータ構造が記憶されたコンピューター可読媒体。
25. 乳癌を伴ない、内分泌療法で処置された対象を、予後判定または分類するためのデバイスであって：
    少なくとも１つのプロセッサー；および
    少なくとも１つのプロセッサーと通信する電子メモリーであって、少なくとも１つのプロセッサーにおいて実行した際にその少なくとも１つのプロセッサーに下記を実行させる、プロセッサー実行可能なコードを記憶する電子メモリー：
    ａ）腫瘍試料における表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現レベルを反映するデータを受信する；
    ｂ）その発現レベルに対応する発現プロファイルを構築する；
    ｃ）その発現レベルを対象コホートからの対照試料からのその遺伝子グループの基準発現レベルと比較する；そして
    ｄ）その少なくとも１つのプロセッサーにおいて、乳癌に関連する残留リスクを決定する；
    を含み、その際、基準発現レベルと比較した遺伝子グループの発現における統計学的に有意の差または類似性は乳癌に関連する残留リスクに対応する、前記デバイス。
26. 遺伝子のグループが表４に挙げる遺伝子のうち少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５である、請求項２３に記載のデバイス。
27. 乳癌を伴なう対象を処置する方法であって：
    ａ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法に従って対象の残留リスクを決定する；そして
    ｂ）その残留リスクに基づいて処置を選択し、好ましくは対象をその処置に従って処置する
    ことを含む方法。
28. 患者が基準コホートの集団中央値と対比して相対的に高い残留リスクを有するならば、内分泌療法と化学療法の併用を処置として選択する、請求項２７に記載の方法。
29. 複数の単離した核酸配列を含む組成物であって、それぞれの単離した核酸配列は
    （ａ）表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子に対応する遺伝子グループのｍＲＮＡ；および／または
    （ｂ）ａ）に対して相補的な核酸
    にハイブリダイズする、それらの遺伝子グループの発現レベルを測定するために使用される組成物。
30. 表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子の発現生成物に相補的および／またはハイブリダイズ可能である１以上のポリヌクレオチドプローブを含むアレイ。
31. 乳癌腫瘍の試料から表４に挙げる少なくとも４０の遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬を含むキット。
32. 少なくとも４０の遺伝子が、統計学的に残留リスクと最も相関する差示的発現を有する少なくとも４０の遺伝子である、請求項３９に記載のキット。