FR3119460A1 - Signature transcriptomique pronostique du risque metastatique du cancer du sein triple negatif (cstn) - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une nouvelle signature ARN pronostique capable de prédire le risque de rechute métastatique d’un cancer du sein dans les 5 ans, en particulier d’un cancer du sein triple négatif (CSTN), avec une excellente sensibilité et spécificité. Figure de l’abrégé : Fig. 2

Description

SIGNATURE TRANSCRIPTOMIQUE PRONOSTIQUE DU RISQUE METASTATIQUE DU CANCER DU SEIN TRIPLE NEGATIF (CSTN)

Domaine technique de l’invention

La présente invention concerne une nouvelle signature ARN pronostique capable de prédire le risque de rechute métastatique d’un cancer du sein dans les 5 ans, en particulier d’un cancer du sein triple négatif (CSTN), avec une excellente sensibilité et spécificité. Une signature pronostique de 6 gènes est notamment capable de stratifier les patientes atteintes de CSTN en deux groupes, à faible et à haut risque métastatique, ouvrant ainsi la voie à l’optimisation de la stratégie thérapeutique et au développement de prises en charge personnalisées.

Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses( )renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.

État de la technique

Le cancer est une cause majeure de décès dans le monde, avec près de 10 millions par an. Le terme « cancer » englobe plus de 100 maladies différentes, toutes caractérisées par une prolifération incontrôlée de cellules et la propagation anarchique de cellules anormales dans l'organisme. La maladie évoluant le plus souvent rapidement, des outils efficaces, sensibles et robustes favorisant le dépistage, la détection précoce, le diagnostic, le pronostic et le traitement du cancer sont indispensables à une prise en charge optimale des patients. Le développement du cancer au sein d’un organisme ne se fait cependant pas de manière instantanée. Une combinaison d’évènements cellulaires incontrôlés induit un long processus conduisant à la transformation d’un tissu physiologique en un tissu cancéreux. Une exposition à des agents carcinogènes externes (chimiques, physiques, viraux, etc…), éventuellement combinée à une prédisposition héréditaire, constituent le point de départ du mécanisme de carcinogenèse. Des cellules normales vont alors acquérir des capacités distinctives et se transformer en cellules cancéreuses développant ainsi une tumeur. L’évolution de ces tumeurs peut les conduire à s’échapper de leur site primaire et à former des métastases dans différents organes de l’organisme.

Le cancer du sein (CS) est une tumeur maligne qui se développe au niveau du sein à partir des cellules mammaires. C’est une maladie durant laquelle des cellules anormales des canaux ou des lobules se multiplient de façon incontrôlée et forment une masse tumorale maligne. Ces cellules peuvent rester stables dans le sein ou se développer progressivement et se répandre dans le corps via les vaisseaux sanguins ou lymphatiques et former des tumeurs secondaires. Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme et est considérée comme la première cause de mortalité féminine dans le monde. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), qui qualifie ce cancer comme « un fardeau mondial », 2,1 millions de nouveaux cas et 627 000 décès ont été révélés en 2018 à travers le monde [1]. En France métropolitaine, selon le rapport de l’Institut National du Cancer (INCa), 58459 nouveaux cas de cancer du sein sont diagnostiqués pour 12146 décès en 2018. A ce titre, le cancer du sein, considéré comme une priorité mondiale, est la tumeur maligne la plus étudiée au monde. Le cancer du sein est guérissable chez environ 70 à 80% des patientes atteintes d’une maladie non métastatique à un stade précoce. Malgré les progrès du dépistage, du diagnostic et du traitement du cancer du sein, près de 12% des patientes diagnostiquées pour un cancer du sein développent finalement une maladie métastatique. Le cancer du sein avancé avec métastases d’organes distants est associé à un mauvais pronostic et est considéré comme incurable avec les thérapies actuellement disponibles. Ces métastases à distance, dues à la propagation de cellules du sein cancéreuses vers des sites distants, conduisent à une mortalité élevée avec un taux de survie à 5 ans de 26%.

Le cancer du sein est en réalité très hétérogène, et il englobe cinq grands sous-types moléculaires, de bons ou mauvais pronostics, dont les résultats cliniques et les réponses thérapeutiques sont variables [2]. A titre d’exemple, les tumeurs luminales expriment un niveau élevé de récepteurs hormonaux et présentent ainsi un bon taux de réponse à l’hormonothérapie. En revanche, le sous-type « triple négatif » (CSTN), qui représente 10-15 % de tous les cancers du sein, a été démontré comme étant corrélé avec le pire résultat de survie et la plus grande capacité de récurrence [3-6]. Les CSTN représentent un sous-type agressif caractérisé par l’absence d’expression des récepteurs aux oestrogènes (ER) et à la progestérone (PR) et l’absence de surexpression du récepteur au facteur de croissance épidermique humain-2 (HER2) [7]. Cette définition négative exclut donc tout recours à une thérapie ciblée. Il répond cependant bien au traitement par chimiothérapie mais son mauvais pronostic est lié à un risque élevé de récidive à distance [8-10]. Comme preuve d'hétérogénéité, au sein de ce sous-type, la moitié de ces cancers ne progresse pas en métastases et répond efficacement et durablement au traitement. Une stratification des patientes atteintes de CSTN parait donc capitale pour pouvoir prédire l’évolution tumorale et ainsi personnaliser et améliorer leur parcours de soins. Pour cette raison, des biomarqueurs prédisant la récurrence de métastases distantes restent essentiels pour obtenir un meilleur résultat clinique dans les CSTN. En effet, les métastases et les récidives tumorales sont des déterminants majeurs non seulement pour la sélection des stratégies de traitement mais aussi pour le pronostic global des patientes.

De nombreuses études visant à trouver des biomarqueurs de pronostic pour la prédiction du cancer du sein ont été réalisées ces dernières années dans le but de développer des outils cliniques efficaces et d'améliorer la compréhension biologique des cancers du sein [11-15]. Les signatures pronostiques basées sur l’expression de gènes ont été systématiquement évaluées dans plusieurs sous-types de cancers du sein (MammaPrint, EndoPredict) [16, 17]. Bien que certains obtiennent de bons résultats sur des sous-types spécifiques, aucun n'est efficace sur les CSTN. Dernièrement, des recherches intensives ont été menées sur les CSTN afin de caractériser leurs profils moléculaires et d'identifier les nouvelles voies impliquées et les cibles thérapeutiques [18, 19]. Des cibles moléculaires prometteuses ont été trouvées comme les inhibiteurs de PolyAdénosine Ribose Polymérase (PARPi) [20, 21], la voie des androgènes [22], et la voie de réparation de l'ADN [23, 24]. En outre, un certain nombre de biomarqueurs du CSTN de pronostic, de diagnostic et de survie ont été décrits [25-28]. Néanmoins, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la rechute du CSTN restent flous et les biomarqueurs uniques ne permettent pas à eux seuls de prédire efficacement la rechute métastatique. Il est maintenant bien établi qu’un ensemble de biomarqueurs multifactoriels est plus performant qu'un biomarqueur à gène unique.

En suivant cette voie, des signatures ont été rapportées pour prédire le sort des patientes. Pour plus de commodité, la plupart des études se concentrent sur un type d'ARN pour construire une signature. Cela conduit à des signatures qui ne se chevauchent pas. Par exemple, une signature de Zhong et al. qui a comparé les profils d’expression génétique de tumeurs CSTNvsdes tumeurs non-CSTN a identifié une signature à 2 gènes associée avec la survie globale des patientes CSTN [29]. Une autre étude a proposé un ensemble de 6 ARNm comme une signature capable de prédire la survie globale dans les CSTN [30]. En utilisant le séquençage du génome entier (WGS), une caractérisation des altérations génétiques entre les tumeurs primaires et leurs métastases pulmonaires sous-jacentes ont généré une signature de 4 gènes ayant une valeur pronostique pour la récurrence des tumeurs au niveau pulmonaire dans les CSTN [31]. Récemment, une signature épigénétique de 6 miARN a été décrite comme un modèle prédictif robuste pour les rechutes de patientes CSTN [32]. Une autre signature à 3 miARN a été décrite en corrélation avec le taux de survie des patientes CSTN [33]. Toutes les signatures décrites ci-dessus sont en corrélation avec la survie mais aucune ne vise à prédire la rechute métastatique chez les patientes CSTN. Cette prédiction est fortement requise pour les oncologistes afin de personnaliser les traitements des patientes CSTN.

Ainsi de nouveaux outils améliorant la capacité de pronostic des métastases et des résultats cliniques ainsi que la prédiction de la réponse au traitement des cancers du sein, en particulier des CSTN, tels que l’identification d’une signature moléculaire définissant en particulier le pronostic individuel des patientes CSTN en termes d’évolution métastatique, sont nécessaires de toute urgence. Cela pourrait faciliter le choix des stratégies thérapeutiques et améliorer leur efficacité.

Description de l’invention

La présente invention répond précisément à ce besoin en définissant une nouvelle signature pronostique ARN, capable de prédire le risque métastatique de patientes atteintes d’un cancer du sein basée sur l’expression génétique globale, en particulier de CSTN pour lequel aucun outil pronostique fiable n’est disponible actuellement.

Pour ce faire, les Inventeurs ont mené une étude rétrospective sur 64 tumeurs triple négatives identifiées et sélectionnées en s’appuyant exclusivement sur des données de suivi clinique complètes des patientes. Ces patientes ont été séparées en deux groupes selon qu’elles avaient développé des métastases dans les 5 ans suivant leur diagnostic ou pas. Cette collection de 64 échantillons est composée des données de 25 tumeurs issues du Centre Jean Perrin (CJP) assemblées à 39 profils d’expression génique disponibles grâce au projet TCGA (The Cancer Genome Atlas). Qu’elles aient été générées localement au Centre Jean Perrin ou par les équipes du Cancer Genome Atlas, toutes proviennent de RNA-Seq qui permet une analyse transcriptomique complète et sansa priori. Les 64 transcriptomes ont été intégrés dans un modèle de régression de Cox pénalisée par la méthode LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator). 100 itérations de validation croisée ont été réalisées afin de sélectionner les transcrits les plus pertinents. La construction d’un score a permis de déterminer un risque de rechute métastatique. Le seuil pronostique de la signature générée a été déterminé par analyse de courbe ROC (Receiver Operating Characteristic), calculée pour la survie spécifique à 5 ans post-diagnostic. Cette survie a été analysée grâce aux courbes de Kaplan-Meier.

Dans cette étude, une signature pronostique ARN a été développée, prédictive de la progression métastatique chez les patientes CSTN, et basée sur une expression génétique globale. L'ensemble des données a rassemblé des données transcriptomiques générées localement (CJP) avec des données accessibles au public (TCGA). Des méthodes statistiques adaptées à la grande dimension des données transcriptomiques ont été utilisées. Dans une première étape de présélection, une régression PLS-DA a été réalisée avec l'objectif de prioriser les gènes en fonction de leur potentiel de discrimination. Ainsi en utilisant la version régularisée de la méthode de régression logistique et le modèle de régression à risques proportionnels de Cox, une combinaison d’un nombre limité de gènes (en particulier 6 gènes sur une liste de 16 gènes) a permis de reclasser correctement les tumeurs dans les deux groupes d’origine. Les 16 gènes identifiés, dont le rôle dans le cancer du sein n’est pas forcément connu, sont les suivants : IVL, AC006539.2, AC010096.1, CCL28, RHOV, AC092106.1, CA15P1, ANKRD26P3, GKN2, FOXJ1, LAMP3, AC104772.1, HES2, HOXD1, ALG5 et TAX1BP3. De préférence, il s’agit des 10 gènes suivants : IVL, AC006539.2, AC010096.1, CCL28, RHOV, AC092106.1, CA15P1, ANKRD26P3, GKN2, FOXJ1. En particulier, la détection systématique de l’expression de 6 gènes, trois pseudogènes (AC006539.2, AC010096.1, AC092106.1) et trois gènes (CCL28, IVL et RHOV), dans les tumeurs du sein triple négatives, et le calcul de leur score de risque a permis de fournir une signature présentant une corrélation significative avec le taux de survie sans métastases (MFS) et la survie globale (OS) des patientes. RHOV (Ras HOmolog family member V) est connue comme une GTPase Rho atypique principalement étudiée dans le cancer du poumon. Une étude de Shepelev & Korobko a montré que RHOV est surexprimée dans le cancer du poumon à petites cellules [34]. De même, le RHOV a été suggérée comme biomarqueur du cancer par une signature pronostique dans l'adénocarcinome pulmonaire [35]. Cependant, il n'y a pas de recherche sur RHOV dans le cancer du sein,a fortioridans le CSTN. CCL28 (chimiokine éptihéliale associée à la muqueuse) est une chimiokine de la sous-famille CC connue pour être surexprimée dans les cellules tumorales métastatiques ainsi que comme un biomarqueur potentiel prédisant les cancers tels que le cancer colorectal [36, 37] son rôle dans le cancer du sein reste un sujet controversé [38]. Même si CCL28 a été défini comme un bon biomarqueur de pronostic dans le cancer du sein luminal, il a été décrit comme un biomarqueur potentiellement dangereux dans le CSTN [38]. De plus, la CCL28 a été suggérée comme cible thérapeutique potentielle en raison de son rôle dans la promotion de la croissance et des métastases du CSTN par l'activation de la voie de signalisation pro-métastase et anti-apoptotique ERK/MAPK [39]. De plus, bien qu’il ait été montré que l'Involucrine IVL, une protéine impliquée dans la différenciation terminale des kératinocytes, était surexprimée dans les cancers du sein métaplasiques, les carcinomes invasifs avec zones acellulaires centrales [40] et le carcinome micropapillaire invasif [41], il n’existe aucune étude spécifique sur l'IVL dans le CSTN. La signature de la présente invention a également révélé un certain nombre de pseudogènes comme biomarqueurs potentiels pour la métastase des CSTN, même si le rôle des pseudogènes n'est pas encore totalement compris. La fonction des pseudogènes, principalement impliqués dans le réseau de régulation des gènes, a été étudiée récemment. Il a été démontré que les pseudogènes peuvent agir comme des ARN endogènes compétitifs (ARNce) par rapport à leurs gènes codant correspondants, et modifier ainsi la régulation des gènes [42-44]. De plus, les pseudogènes, en tant que membres de la famille des ARN longs non-codants, peuvent assurer la régulation des gènes par méthylation de l'ARN [45], [46]. L'expression aberrante d'un ensemble de pseudogènes a été révélée dans de multiples types de cancer, y compris le cancer du sein, suggérant un rôle potentiel dans la tumorigenèse [47]. En fait, les pseudogènes ont été étudiés dans plusieurs types de cancer où ils agissent comme oncogènes ou suppresseurs de tumeurs [48-51]. Ces études font état du rôle des pseudogènes dans le développement du cancer et soulignent en définitive le fait que les pseudogènes représentent des biomarqueurs et des cibles thérapeutiques potentiels pour le cancer. Ces résultats mettent en lumière l'importance des pseudogènes identifiés dans la régulation des gènes des cellules qui affectent la progression des CSTN. Une caractérisation plus poussée de ces pseudogènes permettrait de souligner leur mécanisme de régulation et leur fonction spécifiques afin de mieux comprendre leur impact sur la progression des CSTN et des métastases.

Le sens de la variation d’expression, ainsi que le poids accordé à chacun de ces 6 ARN a permis de déterminer un score prédictif fiable de la rechute métastatique des patientes atteintes de CSTN dans les 5 ans avec une sensibilité de 100%, une spécificité de 89,7% et une précision de 93,8%. La valeur de SSC de la signature à 6 gènes atteint 0,969 (IC à 95% : 0,935-1). Les courbes de Kaplan-Meier classent les patientes à haut risque associées à une faible survie globale et survie sans métastases (p<0,0001). Cette signature devrait ouvrir la voie à une prise en charge personnalisée des patientes atteintes d’un cancer du sein, en particulier de CSTN, afin soit d’alléger le traitement des patientes répondeuses, soit de compléter le traitement des patientes non répondeuses.

La présente invention a donc pour objet un procédéin vitropour le pronostic de rechute métastatique du cancer du sein à partir d’un échantillon biologique d’une patiente comprenant :
a) mesurein vitrodans ledit échantillon du niveau d’expression d’au moins un gène choisi parmi IVL, AC006539.2, AC010096.1, CCL28, RHOV, AC092106.1, CA15P1, ANKRD26P3, GKN2, FOXJ1, LAMP3, AC104772.1, HES2, HOXD1, ALG5 et TAX1BP3.
b) calcul d’un score de risque correspondant à la moyenne géométrique de la somme des niveaux d’expression mesurés à l’étape a) pondérés par des coefficients de régression ;
c) détermination que ladite patiente est à risque faible ou élevé de rechute métastatique lorsque la valeur du score de risque obtenue à l’étape (b) est inférieure ou supérieure, respectivement, à une valeur seuil ;
où lesdits coefficients de régression sont déterminés par régression de Cox ; et
où ladite valeur seuil est déterminée en réalisant une analyse de la courbe ROC des scores d’au moins 10, 20, 30, 40, 50, ou 60 autres échantillons de patientes atteintes d’un cancer du sein dont le statut de rechute métastatique est connu, et en calculant l’ensemble des valeurs seuils possibles pour distinguer entre ces autres patientes à risque faible de rechute métastatique et ces autres patientes à risque élevé de rechute métastatique, où ladite valeur seuil présente une spécificité d’au moins 70, 75, 80 ou 89% et une sensibilité de 100%

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, l’étape de mesure a) mesure le niveau d’expression d’au moins, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 gènes.

En particulier, la présente invention a pour objet un procédéin vitropour le pronostic de rechute métastatique du cancer du sein à partir d’un échantillon biologique d’une patiente atteinte d’un cancer du sein comprenant :
a) mesurein vitrodans ledit échantillon des niveaux d’expression des gènes suivants : AC006539.2, AC010096.1, AC092106.1, CCL28, IVL et RHOV,
b) calcul d’un score de risque à partir de la somme des niveaux d’expression mesurés à l’étape a) pondérés par des coefficients de régression selon la formule suivante :

c) détermination que ladite patiente est à risque faible ou élevé de rechute métastatique lorsque la valeur du score de risque obtenue à l’étape (b) est inférieure ou supérieure à la valeur seuil de 1,341, respectivement.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, ledit procédé concerne le pronostic de rechute métastatique dans les 5 ans post-diagnostic.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, le cancer du sein est le cancer du sein triple négatif (CSTN).

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, le niveau d’expression des gènes est déterminé en mesurant le niveau d’ARN.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, l’échantillon comprend des tissus ou du sang, de préférence du tissu tumoral.

Brève description des figures

La représente la conception de l'étude via un diagramme montrant les étapes de sélection des patientes incluses dans la cohorte de l’étude.

La représente le plan de travail de l'étude identifiant une signature pronostique transcriptomique prédisant une rechute à cinq ans chez les patientes CSTNs. (A) Construction de la signature basée sur la pénalisation Lasso en utilisant deux modèles différents : la régression de Cox et la régression logistique. Une combinaison de six gènes a été identifiée avec la meilleure valeur pronostique pour la prédiction des métastases à distance à cinq ans. (B) Évaluation de la performance de la signature à six gènes. L'analyse de survie et la courbe ROC confirment la capacité prédictive métastatique de la signature identifiée via la stratification des patients TNBC en groupes à faible et à haut risque.

La représente l'analyse discriminante partielle des moindres carrés (PLS-DA) regroupe l'ensemble de données générées pour les CSTN selon 2 axes. Les 2 groupes correspondant à CSTN métastatique (mTNBC) et TNBC non métastatique (non-mTNBC) sont parfaitement distincts.

La représente Diagnostic des valeurs aberrantes à partir de l'analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA). L'échantillon 44 a été retiré de l'analyse en fonction du score et des distances orthogonales pour détecter les valeurs aberrantes (Hubert, Rousseeuw et Vanden Branden 2005).

et Les figures 5a et 5b représentent la sélection des gènes les plus représentatifs impliqués dans la rechute métastatique de CSTN par pénalisation LASSO. (a, b) Box plot démontrant le nombre optimal de gènes discriminant m-TNBC de non-mTNBC, déterminé par LASSO en utilisant respectivement Cox (a) ou régression logistique (b). La meilleure description de mTNBC vs non-mTNBC est obtenue avec 6 gènes par la régression Cox et 10 gènes pour la régression logistique.

, , et Les figures 6a, 6b, 6c et 6d représentent l’évaluation de la performance de la signature pronostique à six gènes. (a) Courbe ROC pour les métastases à cinq ans déterminée par la signature pronostique à six ARNm entre mTNBC et non-mTNBC. (b, c) Les courbes de Kaplan–Meier montrent une excellente corrélation des groupes à haut et faible risque avec la survie sans métastase (b) et la survie globale (c). (d) Carte présentant les niveaux d'expression des six gènes de la signature pronostique chez les patients CSTN. La sous-expression est notée par une étoile.

La représente la courbe ROC pour les métastases à cinq ans déterminée par l’algorithme de régression logistique entre mTNBC et non-mTNBC.

EXEMPLES

EXEMPLE 1 : MATERIEL ET METHODES

1. Sélection des échantillons

L’étude a compris deux cohortes cliniques principales avec un total de 7424 patientes atteintes de CSTN. Les critères d’inclusion pour cette étude ont été comme suit :

1. Confirmation du caractère triple négatif (TN) par des outils immunohistochimiques par un seul pathologiste, ou par classification basale selon le profil d’expression.
2. Disponibilité d'un suivi de cinq ans après le diagnostic
3. Disponibilités d’échantillons de tumeurs.
4. Succès du séquençage transcriptomique des données.
5. État sans métastases au moment du diagnostic.
6. Disponibilités des caractéristiques clinicopathologiques.

Selon ces critères d’inclusion, 6340 patientes traitées entre 2001 et 2014 au Centre Jean Perrin (CJP) ont été filtrées en 26 patientes CSTN comme décrit dans la . 1082 profils transcriptomiques de cancer du sein ont été téléchargés à partir de la cohorte en ligne de TCGA. Les échantillons triple négatifs ont été définis comme précédemment décrits [52] et 39 cas ont été conservés pour être utilisés dans l’étude ( ).

Cette combinaison de cohortes de patientes n’est de ce fait pas limitée à une seule population géographique mais inclut une diversification ethnique qui augmente les chances que la signature soit robuste pour une large partie de la population.

2. Préparation des données des échantillons du CJP

a Préparation de l’ARN et séquençage

Le séquençage de l’ensemble du transcriptome a été réalisé sur les 25 échantillons du CJP. Les tumeurs fixées au formol et enrobées de paraffine (FFPE) des patients CSTN ont été utilisées dans l’étude. Les régions spécifiques avec un pourcentage élevé de cellules cancéreuses ont été sélectionnées par un pathologiste. L’ARN total a été isolé à partir de ces régions en utilisant le kit AllPrep DNA/RNA Micro (Qiagen), conformément aux instructions du fournisseur, comprenant un traitement DNase sur colonne. La qualité et la quantité d’ARN total ont été évaluées par le biais du Bioanalyseur 2100, avec le kit RNA 6000 pico (Agilent Technologies). Les librairies ADNc ont été préparées en utilisant le kit KAPA RNA HyperPrep avec la RiboErase (Roche Diagnostics). Ce kit élimine la plupart des ARN ribosomiques mais conserve tous les autres types d’ARN. La procédure a suivi les recommandations du fournisseur, avec 25 ng d’apport d’ARN total. Le séquençage ultérieur de l'ARN indexé des bibliothèques d'ADNc avec des lectures à une seule extrémité (1 x 75 lectures bps) a ensuite été effectué selon le protocole Illumina standard en utilisant le kit NextSeq 550 High Output v2 (Illumina). 15 millions de lectures au minimum ont été générées par échantillon (en moyenne 42,8 millions).

b Analyses bioinformatiques

Les lectures démultipexées ont été alignées sur le génome humain de référence (GRCh37/hg19) en utilisant le logiciel Star (v2.7) avec les paramètres par défaut. HTSeq (v0.11.2) a été utilisé pour quantifier l’expression brute des gènes. Le logiciel R package DESeq2 v1.26.0 a été utilisé pour réaliser la normalisation des données pour les analyses d’expression différentielle et de différences de profondeur de séquençage.

3. Construction de la signature (Figure 2A)

Les expressions des gènes des ensembles de données du CJP et du TCGA ont été mises à l'échelle de manière indépendante. L'annotation des données de séquençage des patients du TCGA téléchargés a été convertie de Ensembl à refGene sur la base du fichier GTF humain afin de correspondre à la formule des données du CJP. Les expressions des gènes des 26 échantillons du CJP et 39 échantillons du TCGA ont été combinées ensemble et les gènes sans expression dans les 65 échantillons ont été retirés. Au total, le niveau d’expression des gènes pour tous les échantillons a été disponible pour 27887 gènes. Les 65 patientes CSTN ont été composées de (i) 25 CSTN métastatiques en 5 ans (mCSTN) et (ii) 40 CSTN non-métastatiques (non-mCSTN) à titre de contrôle, au lieu de tissus normaux afin d'éliminer le biais lié à l'utilisation du profilage global du transcriptome des populations cellulaires et de réduire ainsi le rapport signal/bruit de fond. La signature a été construite en différentes étapes : (a) une présélection de gènes avec l’utilisation de la PLS-DA (analyse discriminante partielle des moindres carrés), (b) régression de Cox, (c) régression logistique avec une sélection de gènes basée sur la régularisation des coefficients, et (d) l’obtention d’une signature robuste en regroupant ces résultats.

a PLS-DA pour la présélection des gènes

Pour construire la signature, une présélection des gènes a tout d’abord été réalisée afin de réduire la taille des données avec une analyse PLS-DA afin de sélectionner par la suite les meilleurs gènes prédictifs. La PLS-DA (roplsR paskage [53]) a été utilisée pour identifier les gènes qui établissent une discrimination entre les patients mCSTN et non-mCSTN. La Variable d’Importance dans la Projection (VIP) a été calculée par la suite [54]. La VIP est un paramètre établi reflétant la variabilité de la réponse expliquée par chaque gène dans la ségrégation de nos deux groupes sur le modèle PLS-DA. La moyenne carrée de VIP étant égale à 1, les gènes avec un VIP>1 ont été sélectionnés pour le reste de l’étude comme les meilleurs représentants de la discrimination entre les patientes CSTN métastatiques et non-métastatiques.

b Régression de Cox pour prédire le risque de métastases

Les analyses par le modèle de régression à risques proportionnels de Cox multivarié ont été utilisées pour évaluer les gènes candidats qui ont été associés avec la survie sans métastases (MFS). Pour sélectionner les gènes, une régularisation LASSO a également été utilisée, comme décrit par Simon et al. [55]. Comme dans l’analyse de régression logistique, une sélection similaire de gènes robustes par validation croisée répétée a été réalisée afin d’obtenir une liste de biomarqueurs associée avec des risques instantanés de métastases.

c Régression logistique pour prédire la probabilité de développement de métastases durant 5 ans

Afin de développer la signature, un modèle de régression logistique a été appliqué en combinaison avec la méthode LASSO (glmnetR package), une méthode de régularisation L.1 de sélection automatique des variables [56]. Le paramètre de pénalité a été estimé par validation croisée de 7 fois (CV). Cette validation croisée a été répétée 100 fois pour éviter les incertitudes dues à un effet d’échantillonnage. A chacune des 100 répétitions de validation croisée, les gènes sélectionnés ont été comptés et la fréquence d’apparition des gènes a permis d’identifier une première liste de biomarqueurs permettant de prédire le développement de métastases dans 5 ans.

d Signature de gènes de pronostic du risque de métastases

Les gènes obtenus avec la régression logistique et ceux obtenus en utilisant la régression de Cox ont été combinés ensemble afin de sélectionner une liste finale de gènes robustes constituant la signature. Sur la base du niveau d’expression et du coefficient du modèle de chaque gène robuste calculé par l’analyse de régression à risques proportionnels de Cox multivarié, une nouvelle signature de gènes pronostique fiable a été établie. Afin d’éviter les biais statistiques tels que le surajustement, la multicollinéarité et la non-convergence du modèle, des régressions régularisées par crêtes ont été utilisées pour déduire les coefficients de pondération du modèle et les scores prédictifs du risque métastatique.

4. Analyse de la signature (Figure 2B)

Les rapports de risque (HR) ont été calculés à partir du coefficient de pondération de la signature avec l'équation HR=exp(coefficient), et ont été utilisés pour identifier les gènes protecteurs (HR>1) et à risques (HR>1). Une analyse de la courbe ROC en fonction du temps, utilisant le R packagepROC[57], a été construite pour évaluer l'exactitude prédictive de la signature génétique pour les résultats cliniques. Les échantillons de patientes CSTN ont ensuite été divisés en groupes à risque faible ou élevé sur la base du point de coupure optimal de la courbe ROC (critère du topleft le plus proche). Les courbes de Kaplan-Meier ont été utilisées pour évaluer la valeur pronostique de ces deux groupes à risque en utilisant le R packagesurvival[58]. Les hypothèses proportionnelles pour le modèle à risques proportionnels de Cox ont été examinées par l’analyse de Kaplan-Meier pour aplanir toute variabilité génétique due à un effet géographique,

EXEMPLE 2 : RESULTATS

Pour aplanir toute variabilité génétique due à un effet géographique, les profils RNA-Seq normalisés de deux jeux de données ont été combinés, 26 patientes CSTN du CJP et 39 patientes du TCGA, en un unique jeu de données de 65 échantillons. Le niveau d’expression pour tous les échantillons a été disponible pour 27887 gènes. Le déroulement de l’étude est présenté dans la et les caractéristiques clinicopathologiques de l'ensemble des patientes CSTN (échantillons du CJP et TCGA) sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous.

Variables	Groupe CJP (N=26)	Groupe TCGA (N=39)
Age (moyenne ±SD)	53,0 ± 12,4	53,2 ± 11,8
Statut métastatique
Positif Négatif	38,40% 61,60%	38,46% 61,54%
Etape T
T1 T2 T3 T4	53,84% 26,92% 11,53% 7,69%	17,95% 64,10% 12,82% 5,12%
Etape N
N0 N1 N2 N3	53,84% 26,92% 7,69% 11,53%	58,97% 23,07% 7,69% 10,25%
Grade histologique
1 2 3 4	0% 42,30% 57,69% 0,00%	23,07% 48,71% 25,64% 2,56%
Localisation
Carcinome infiltrant Carcinome in situ Autres	92,30% 7,70% 0%	84,62% 0% 15,38%

Les échantillons ont été répartis en 26 CSTN métastatiques (mCSTN) et 40 CSTN non-métastatiques (non-mCSTN). L'ensemble des données, telles que les deux populations, se répartissent en 40% de m-CSTN et 60% de non-mCSTN, ce qui est très similaire aux observations cliniques pour cette pathologie.

1. L’analyse discriminante partielle des moindres carrés (PLS-DA) distingue les CSTN métastatiques des non-métastatiques

La PLS-DA est bien adaptée pour la visualisation de données de haute dimension et la description des caractéristiques qui décrit le mieux les différences entre les groupes expérimentaux. La courbe de PLS-DA regroupe clairement la cohorte de patientes en 2 groupes distincts, suggérant que les variations de l’expression de l'ARN total dans la tumeur primaire pourraient être utilisées comme biomarqueurs de rechute métastatique ( ). Le calcul de la Variable d’Importance dans la Projection (VIP) permet de résumer l’importance de chaque gène individuel dans le modèle PLS-DA. Dans une étape préliminaire basée sur le seuil des scores VIP, 10428 gènes impliqués dans la discrimination entre les patientes CSTN métastatiques et non-métastatiques ont été identifiés avec ce modèle. Ces 10428 gènes seront utilisés pour une analyse plus approfondie. Cette analyse a également mis en évidence un échantillon atypique, qui a été supprimé pour construire la signature ( ).

2. La régression de Cox et la régression logistique pénalisée par la méthode LASSO des données RNA-Seq dévoile une liste de gènes candidats communs

Pour affiner la liste de gènes impliqués significativement dans la rechute métastatique des CSTN, un modèle de régression de Cox pénalisée par la méthode LASSO a été construit et appliqué aux échantillons des cohortes CJP et TCGA combinées. Le modèle vise à générer la meilleure combinaison d’expression génétique à partir des 10428 gènes, en classant les échantillons en fonction de leur état métastatique. Après avoir effectué 100 itérations de validation croisée (CV), les meilleurs modèles pronostiques d’apparition de métastases comprennent entre 6 et 9 gènes ( ). Les cinq gènes les plus cités font partie de plus de 90 % des modèles qui distinguent les mCSTN des non-mCSTN. Le 6^èmegène est représenté dans 71% du modèle Cox. Cependant, les gènes suivants dans la liste sont moins consensuels car ils ont été invoqués dans moins de 59% des modèles. Le nombre de fois où chaque gène a été inclus dans le meilleur modèle est indiqué dans le tableau 2 ci-dessous.

Top 10 des gènes montrant le meilleur pourcentage de récidive dans les 100 itérations de Cox. En gras les gènes sélectionnés pour la signature
Gène	Récurrence
AC006539.2 AC010096.1 IVL CCL28 RHOV AC092106.1 RNU6.1054P TAX1BP3 KRTDAP ARL4D	100% 100% 100% 90% 90% 71% 59% 59% 41% 22%

Ainsi, les six meilleurs gènes candidats nouvellement identifiés ont été utilisés pour construire la signature pronostique. Ces gènes couvrent BCL2/Adenovirus E1B Interacting Protein 3 (BNIP3) pseudogène (AC006539.2), Lnc-OSR1-2 (AC010096.1), Facteur d’épissage, arginine/sérine-rich 3 (SRSF3) pseudogène 4 (AC092106.1), C-C Motif Chemokine Ligand 28 (CCL28), Involucrine (IVL), et Ras HOmolog family member V (RHOV).

En parallèle, l'analyse de régression logistique avec pénalisation LASSO des profils d'expression génétique assemblés a montré que les combinaisons de 8 à 12 gènes avaient la valeur pronostique la plus significative avec une efficacité très similaire ( ). Le pourcentage d’inclusion dans le meilleur modèle logistique de chaque gène est mentionné dans le tableau 3 ci-dessous.

Top 10 des gènes montrant le meilleur pourcentage de récidive dans les 100 itérations de régression logistique. En gras les gènes sélectionnés pour la signature
Gène	Récurrence
AC006539.2 AC010096.1 AC092106.1 CCL28 IVL ANKRD26P3 CA15P1 RHOV FOXJ1 GKN2	100% 100% 100% 100% 100% 98% 98% 98% 58% 58%

Il est intéressant de noter que les six gènes les plus cités du modèle de régression de Cox (AC006539.2, AC010096.1, AC092106.1, CCL28, IVL et RHOV) sont tous inclus dans la liste des huit premiers gènes identifiés par la régression logistique mentionnée dans ≥98% du modèle logistique. Ces résultats convergents ont renforcé la suggestion d'utiliser ces 6 gènes prédictifs, communs aux deux approches statistiques et les plus utilisés dans les validations croisées, afin de construire une signature restreinte. Sur la base de ces résultats, les 6 ARNm identifiés sont utilisés pour construire une signature pronostique transcriptomique prédisant une rechute métastatique sur cinq ans.

3. Construction de la signature à 6 gènes

Le but a été de développer une nouvelle signature pronostique métastatique afin d’améliorer la répartition du risque métastatique des patientes CSTN. En utilisant le coefficient à partir du modèle à risques proportionnels de Cox multivarié, une signature pronostique uniquement d’ARNm a été dérivée sur la base des niveaux d’expression des 6 ARNm déterminés par RNA-Seq dans le jeu combiné des 64 CSTN. Un score de risque de métastases instantané a été calculé pour la signature. Le score de risque pour chaque gène a été pondéré par les coefficients de régression. Il a été calculé sur la base de l’équation

Σ Coefficient(ARNm) x Expression(ARNm)

décrite par la somme des coefficients de chaque ARNm multipliée par l’expression correspondante. La formule du score de risque a été établie comme suit :

Comme le montre le modèle, le coefficient de AC006539.2 et AC092106.1 sont négatifs, ce qui indique un rôle protecteur pour la survie des patientes (HR=0,45 et 0,69, respectivement) tandis que les coefficients de AC010096.1, CCL28, IVL et RHOV sont négatifs, ce qui indique qu'il s'agit de facteurs de risque de métastases de CSTN (HR=1,32 ; 1,08 ; 1,13 et 1,41, respectivement) (Tableau 4 ci-dessous).

Coefficients LASSO des six gènes pronostiques utilisant le modèle de régression de Cox.
	Coefficients	Rapports de risques
IVL	0.121	1.129
AC006539.2	-0.792	0.453
AC010096.1	0.274	1.316
CCL28	0.077	1.08
RHOV	0.346	1.414
AC092106.1	-0.371	0.69

4. Performance de la signature

Selon les formules, un score a été attribué à chaque patiente CSTN en répartissant les patientes en groupes à risque faible ou élevé (n=39 et n=25, respectivement) sur la base du seuil de 1,341 obtenu à partir de l'analyse des courbes ROC. Les scores de risque dans le groupe à risque faible ont varié de 0,021 à 1,339 et ceux dans le groupe à risque élevé ont varié de 1,343 à 12,82 (Figures 6a à 6d). Les patientes CSTN avec des scores de risque élevé ont un risque plus élevé de métastases distantes que celles avec un score de risque faible.

Pour tester la performance prédictive de la signature pronostique développée pour les résultats cliniques, des analyses ROC en fonction du temps ont été réalisées et les valeurs d’aire sous la courbe (ASC) ont été calculées. L’analyse ROC de survie a démontré que le score de risque de la signature à 6 ARNm pourrait prédire efficacement la récurrence métastatique sur cinq ans des patientes présentant une sensibilité (100%), une spécificité (89,7%), et une précision (93,8%) élevées ( ). La valeur d’ASC de la signature à 6 gènes a été de 0,969 (95% CI : 0,935-1) démontrant la grande performance de la signature à 6 gènes pour prédire les métastases des CSTN. Ces résultats confirment que l’association de la signature à 6 ARNm améliore significativement la valeur pronostique des patientes CSTN. Des résultats similaires ont été obtenus par l’algorithme de régression logistique à partir duquel un indice de probabilité permettant de prédire l'évolution des métastases à distance dans un délai de cinq ans a été calculé. Les coefficients correspondants ont été calculés à l'aide du modèle logistique. Pondéré par leurs coefficients de régression, l’indice de probabilité de métastases pour chaque patient a été calculé comme suit :

Coefficient de pondération
(Interception)	-1.226
IVL	0,661
AC006539.2	-1,450
AC010096.1	0,837
CCL28	0,898
RHOV	0,987
AC092106.1	-1,103

Le score de probabilité permet de prédire l'issue métastatique pour les patients atteints de CBTN afin d'adapter les stratégies thérapeutiques. Comme le montre le modèle, les coefficients sont conformes à ceux résultant de la régression de Cox. AC006539.2 et AC092106.1 étaient négatifs et considérés comme des facteurs de protection alors que les coefficients de AC010096.1, CCL28, IVL et RHOV étaient positifs et considérés comme des facteurs de risque.

Les courbes ROC ont également été calculées et la SSC = 0,982 (IC 95% : 0,957-1) avec une sensibilité (100%) et une spécificité (92,3%) élevées ( ). Cet indice permet également de classer les patients atteints de CSTN en groupes à faible risque (0,000 - 0,239) et à haut risque (0,542 - 0,999), ce qui permet de prédire la récidive métastatique du CSTN.

Par ailleurs, l'association entre le score de risque de la signature de la présente invention avec la survie globale OS et la survie sans métastases MFS des patientes CSTN a été mesurée en utilisant l’analyse de survie de Kaplan-Meier. Comme vu dans la et la , les courbes de survie de Kaplan-Meier ont révélé une aggravation du taux de mortalité et une augmentation des rechutes de métastases dans les 5 ans chez les patientes avec un score de risque élevé de la signature à 6 gènes que dans le groupe à risque faible (p<0,0001 les deux). Cette analyse a montré que la signature a défini les deux populations avec une sensibilité élevée.

De plus, le profil d’expression de la signature pronostique à 6 gènes distinguant les mCSTN des non-mCSTN est présenté dans une carte thermique ( ). Les niveaux d’expression de AC010096.1, CCL28, IVL et RHOV ont été revus à la hausse, et les niveaux d’expression de AC006539.2 et AC092106.1 ont été revus à la baisse révélant que les différences étaient statistiquement significatives dans la cohorte combinée. Cette visualisation des données a permis de constater que ces 6 ARNm candidats étaient très différents entre les deux groupes de patientes. Dans l'ensemble, ces résultats renforcent l'importance de cette signature à 6 gènes pour identifier les patientes CSTN des groupes à haut risque métastatique qui nécessitent des soins améliorés et un traitement actif personnalisé afin d'augmenter leur taux de survie.

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[48]. Breyer, J.P.; Dorset, D.C.; Clark, T.A.; Bradley, K.M.; Wahlfors, T.A.; McReynolds, K.M.; Maynard, W.H.; Chang, S.S.; Cookson, M.S.; Smith, J.A.; et al. An Expressed Retrogene of the Master Embryonic Stem Cell Gene POU5F1 Is Associated with Prostate Cancer Susceptibility.Am. J. Hum. Genet. 2014,94, 395–404, doi:10.1016/j.ajhg.2014.01.019.

[49]. Hayashi, H.; Arao, T.; Togashi, Y.; Kato, H.; Fujita, Y.; De Velasco, M.A.; Kimura, H.; Matsumoto, K.; Tanaka, K.; Okamoto, I.; et al. The OCT4 Pseudogene POU5F1B Is Amplified and Promotes an Aggressive Phenotype in Gastric Cancer.Oncogene 2015,34, 199–208, doi:10.1038/onc.2013.547.

[50]. Lian, Y.; Xiao, C.; Yan, C.; Chen, D.; Huang, Q.; Fan, Y.; Li, Z.; Xu, H. Knockdown of Pseudogene Derived from LncRNA DUXAP10 Inhibits Cell Proliferation, Migration, Invasion, and Promotes Apoptosis in Pancreatic Cancer.J. Cell. Biochem. 2018,119, 3671–3682, doi:10.1002/jcb.26578.

[51]. Yang, W.; Du, W.W.; Li, X.; Yee, A.J.; Yang, B.B. Foxo3 Activity Promoted by Non-Coding Effects of Circular RNA and Foxo3 Pseudogene in the Inhibition of Tumor Growth and Angiogenesis.Oncogene 2016,35, 3919–3931, doi:10.1038/onc.2015.460.

[52]. Lehmann, B.D.; Bauer, J.A.; Chen, X.; Sanders, M.E.; Chakravarthy, A.B.; Shyr, Y.; Pietenpol, J.A. Identification of Human Triple-Negative Breast Cancer Subtypes and Preclinical Models for Selection of Targeted Therapies.J. Clin. Invest.2011,121, 2750–2767, doi:10.1172/JCI45014.

[53]. Thévenot, E.A.; Roux, A.; Xu, Y.; Ezan, E.; Junot, C. Analysis of the Human Adult Urinary Metabolome Variations with Age, Body Mass Index, and Gender by Implementing a Comprehensive Workflow for Univariate and OPLS Statistical Analyses.J Proteome Res2015,14, 3322–3335, doi:10.1021/acs.jproteome.5b00354.

[54]. Galindo-Prieto, B.; Eriksson, L.; Trygg, J. Variable Influence on Projection (VIP) for Orthogonal Projections to Latent Structures (OPLS).Journal of Chemometrics2014,28, 623–632, doi:10.1002/cem.2627.

[55]. Simon, N.; Friedman, J.H.; Hastie, T.; Tibshirani, R. Regularization Paths for Cox’s Proportional Hazards Model via Coordinate Descent.Journal of Statistical Software2011,39, 1–13, doi:10.18637/jss.v039.i05.

[56]. Friedman, J.; Hastie, T.; Tibshirani, R. Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent.J Stat Softw2010,33, 1–22.

[57]. Robin, X.; Turck, N.; Hainard, A.; Tiberti, N.; Lisacek, F.; Sanchez, J.-C.; Müller, M. PROC: An Open-Source Package for R and S+ to Analyze and Compare ROC Curves.BMC Bioinformatics2011,12, 77, doi:10.1186/1471-2105-12-77.

[58]. Therneau, T.M.; Grambsch, P.M.Modeling Survival Data: Extending the Cox Model; Statistics for Biology and Health; Springer-Verlag: New York, 2000; ISBN 978-0-387-98784-2.

Claims (8)

1. Procédéin vitropour le pronostic de rechute métastatique du cancer du sein à partir d’un échantillon biologique d’une patiente comprenant :
   a) mesurein vitrodans ledit échantillon du niveau d’expression d’au moins un gène choisi parmi IVL, AC006539.2, AC010096.1, CCL28, RHOV, AC092106.1, CA15P1, ANKRD26P3, GKN2, FOXJ1, LAMP3, AC104772.1, HES2, HOXD1, ALG5 et TAX1BP3.
   b) calcul d’un score de risque correspondant à la moyenne géométrique de la somme des niveaux d’expression mesurés à l’étape a) pondérés par des coefficients de régression ;
   c) détermination que ladite patiente est à risque faible ou élevé de rechute métastatique lorsque la valeur du score de risque obtenue à l’étape (b) est inférieure ou supérieure, respectivement, à une valeur seuil ;
   où lesdits coefficients de régression sont déterminés par régression de Cox ; et
   où ladite valeur seuil est déterminée en réalisant une analyse de la courbe ROC des scores d’au moins 10 autres échantillons de patientes atteintes d’un cancer du sein dont le statut de rechute métastatique est connu, et en calculant l’ensemble des valeurs seuils possibles pour distinguer entre ces autres patientes à risque faible de rechute métastatique et ces autres patientes à risque élevé de rechute métastatique, où ladite valeur seuil présente une spécificité d’au moins 89% et une sensibilité de 100%
2. Procédé selon la revendication 1, où l’étape de mesure a) mesure le niveau d’expression d’au moins, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 gènes.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, pour le pronostic de rechute métastatique du cancer du sein à partir d’un échantillon biologique d’une patiente atteinte d’un cancer du sein comprenant :
   a) mesurein vitrodans ledit échantillon des niveaux d’expression des gènes suivants : AC006539.2, AC010096.1, AC092106.1, CCL28, IVL et RHOV,
   b) calcul d’un score de risque à partir de la somme des niveaux d’expression mesurés à l’étape a) pondérés par des coefficients de régression selon la formule suivante :
   
   c) détermination que ladite patiente est à risque faible ou élevé de rechute métastatique lorsque la valeur du score de risque obtenue à l’étape (b) est inférieure ou supérieure à la valeur seuil de 1,341, respectivement.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, pour le pronostic de rechute métastatique dans les 5 ans post-diagnostic.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, où le cancer du sein est le cancer du sein triple négatif (CSTN).
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, où le niveau d’expression des gènes est déterminé en mesurant le niveau d’ARN.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, où l’échantillon comprend des tissus ou du sang.
8. Procédé selon la revendication 7 où le tissu est du tissu tumoral.