KR20190085667A

KR20190085667A - 무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR20190085667A
Application number: KR1020180003804A
Authority: KR
Inventors: 조은해; 이준남; 장자현; 전영주
Original assignee: 주식회사 녹십자지놈
Priority date: 2018-01-11
Filing date: 2018-01-11
Publication date: 2019-07-19
Also published as: WO2019139363A1; KR102029393B1

Abstract

본 발명은 무세포 DNA에서 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 순환 종양 DNA 검출 방법은 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용하여 순환 종양 DNA 검출의 정확도를 높일 뿐만 아니라 검출하기 어려웠던 매우 낮은 농도의 순환 종양 DNA에 대한 검출 정확도를 높여서 상업적 활용도를 높일 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 순환 종양 DNA의 존재 여부를 조기에 판단할 수 있어, 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단에 유용하다.

Description

무세포 DNA를 포함하는 샘플에서 순환 종양 DNA를 검출하는 방법 및 그 용도{Circulating Tumor DNA Detection Method Using Sample comprising Cell free DNA and Uses thereof}

본 발명은 순환 종양 DNA를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체시료에서 무세포 DNA(cell free DNA)를 추출하여, 서열정보를 획득한 다음, 염색체 영역의 정규화 교정 및 회귀분석을 이용한 무세포 DNA에서 순환 종양 DNA의 검출방법 및 그 용도에 관한 것이다.

세포의 괴사(necrosis), 세포자살(apoptosis), 분비(secretion)에 의해 혈액, 림프액, 소변 등에서 세포의 존재 여부와 관계없이 검출되는 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA)가 존재한다. 그 중 종양세포로부터 유래되어 혈액을 떠다니는 작은 크기의 genomic DNA를 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)라고 일컫는다(Wan JCM et al., Nat Rev Cancer. Vol. 4 pp. 223-238, 2017).

일반적으로 건강한 사람의 혈액 속 cfDNA는 1-10ng/ml 정도의 매우 낮은 농도로 존재하지만 암 환자에게선 5-10배 이상 높게 나타나며 만성 염증을 비롯한 다른 요인에 의해서도 증가할 수 있다고 알려져 있다(Wan JCM et al., Nat Rev Cancer. Vol. 4 pp. 223-238, 2017). 때문에 cfDNA 안에서 암 세포의 유전정보를 가지고 있는 ctDNA를 검출해 내는 것이 중요하다. ctDNA의 농도는 종양의 크기 또는 병기와 상관관계를 가지는 것으로 알려져 있는데, 640명의 환자를 대상으로 한 조사에 따르면 1병기의 환자에 비해 4병기의 환자에게서 ctDNA 농도가 평균 100배 높게 나타났다( Bettegowda C et al., Sci. Transl Med. Vol. 6, pp. 224ra24, 2014). 차세대염기서열분석법(NGS)과 디지털 PCR(dPCR) 기술의 발전으로 미량의 DNA분석이 가능해지면서 ctDNA의 분석연구가 가속화되고 있다.

또한, ctDNA는 종양 특유의 돌연변이 및 유전적 변화를 포함하고 있으며, 반감기가 2시간 정도로 짧기 때문에 종양의 현재상태를 반영하고, 비침습적이고 반복적 채취가 가능하다는 특징을 가지고 있다(Diehl F et al., Nat Med Vol. 14, pp. 985-990, 2008). 이러한 특징으로 ctDNA는 종양 특이적 생체표지자로써 암 진단, 모니터링 및 예후 관측의 지표로써 각광받고 있으며 다양한 분야에 적용하기 위한 연구가 진행되고 있다.

혈액 속에 존재하는 cfDNA의 존재는 1948년에 알려졌지만 혈액에 미량 존재하기 때문에 초기 시퀀싱(sequencing) 기술로는 분석이 어려웠고, cfDNA를 종양의 생체지표로 이용하기에 분석의 일관성이나 신뢰성이 부족하였다. 하지만 최근 분자진단기술이 발전함에 따라 BEAMing 기법이나 PAP, Digital PCR, TAM-Seq 등의 고감도 분석 기법들이 개발되어 미량의 ctDNA를 검출, 정량화가 가능하게 되면서 임상적으로 적용하기 위한 연구가 진행되고 있다.

ctDNA 분석의 임상적 적용 분야는 조기검진, 진단, 동반진단 및 예후추적 등으로 나누어지는데, 현재 동반진단과 치료의 예후 분석 분야가 가장 진전되어 있다. 초기 단계의 치료가 중요한 암의 특성 상 조기 진단을 위한 연구도 활발히 이루어지고 있으나 초기에 생성되는 ctDNA의 정도가 개인마다 다르며 아직 연구된 암의 종류가 다양하지 않다는 문제점이 있다.

현재 ctDNA를 검출하기 위한 노력이 다방면에서 진행되고 있지만, 아직 기술적인 한계로 인해 ctDNA의 임상적 적용에는 제약이 있으며 꾸준한 기술 개발과 연구가 진행 중인 실정이다. 최근 FDA에서 ctDNA를 통한 유전자검사로 비소세포폐암(NSCLC)을 진단하는 방법이 승인됨에 따라 ctDNA 분석의 임상적 상용화가 시작되었다(http://www.investor.jnj.com/releaseDetail.cfm?releaseid=296494).

암은 세포의 유전자에 돌연변이가 누적되면서 세포분열이 정상적으로 조절되지 않아 발생한다. 때문에 암세포의 염색체는 결실이나 중복, 전좌와 같은 염색체 이상(chromosomal abnormality)이 빈번하게 나타나는 특징이 있다. 염색체 이상으로 인해 나타나는 암의 발생 기작에 관한 연구들이 이루어지면서 융합 유전자(Fusion gene)와 같은 염색체이상을 암의 진단 및 예후관측의 지표로 활용하려는 노력이 계속되고 있다(Parker BC and Zhang W, Chin J Cancer. Vol. 11, pp. 594-603, 2013).

더 나아가 종양세포로부터 유래된 ctDNA는 정상세포에서는 나타나지 않는 염색체이상을 반영한다는 접근에서, cfDNA를 통한 염색체 이상 검출을 임상적으로 활용하려는 연구가 이루어지고 있다. 최근 분자진단기술의 발전으로 cfDNA에서 염색체 이상 검출이 가능해짐에 따라, Digital Karyotyping, PARE 분석을 통해서 암 환자의 cfDNA에서 종양 특이적인 염색체이상을 검출이 가능하다는 연구와 함께 이를 임상적으로 확인한 연구결과들이 보고되고 있다(Leary RJ et al., Sci Transl Med. Vol. 4, Issue 162. 2012).

난소암 환자 10명을 대상으로 한 Faye R. Harris의 연구에 따르면, 환자의 암 조직 DNA에서 확인한 미세결실을 수술 전후에 얻은 ctDNA에서 분석한 결과, 수술 전 8명의 환자, 수술 후 8명 중 3명의 재발환자 모두에게서 미세결실을 검출 하였다. 이를 통해 ctDNA의 미세결실 검출이 임상적으로 유의미하며, 종양 특이적인 염색체 이상이 ctDNA에 반영되는 것을 확인하였다(Harris FR et al., Sci Rep. Vol. 6 pp.29831, 2016).

이러한 기술배경하에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, 높은 민감도와 위양성 및 위음성 결과가 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 검출방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 염색체 영역의 정규화 교정 및 회귀분석을 수행할 경우, 높은 민감도와 낮은 위양성/위음성의 분석결과를 얻을 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 순환 종양 DNA의 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 순환 종양 DNA를 검출하는 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 방법으로 순환 종양 DNA를 검출하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 방법을 포함하는 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계; b) 상기 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계 d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화 하는 단계; e) 참조집단에서 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수를 계산하는 단계; f) 상기 Z 점수(z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수(I score)를 계산하는 단계; 및 g) 상기 I 점수(I score)가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정하는 단계를 포함하는, 생체시료 내 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 기준값(cut-off value) 이상인 샘플의 서열정보만 선별하는 품질관리부; 및 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 참조집단 샘플과 비교하여 Z 점수(Z score)를 계산한 다음, 이를 바탕으로 I 점수(I score)를 도출하여, I 점수(I score)가 기준값 이상일 경우, 순환 종양 DNA 존재 여부를 판정하는 결정부를 포함하는 순환 종양 DNA 검출 장치를 제공한다.

본 발명은 또한, 컴퓨터 판독 가능한 매체로서, 순환 종양 DNA를 검출하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계; b) 획득한 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; c) 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계; d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화 하는 단계; e) 참조집단에서 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계; f) 상기 Z 점수(Z score)를 기반으로 염색체 영역을 구분하여, I 점수(I score)를 계산하는 단계; 및 g) I 점수(I score)가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정하는 단계를 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 방법을 포함하는 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 순환 종양 DNA 검출 방법은 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용하여 순환 종양 DNA 검출의 정확도를 높일 뿐만 아니라 검출하기 어려웠던 매우 낮은 농도의 순환 종양 DNA에 대한 검출 정확도를 높여서 상업적 활용도를 높일 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 순환 종양 DNA의 존재 여부를 조기에 판단할 수 있어, 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단에 유용하다.

도 1은 본 발명의 순환 종양 DNA를 검출하기 위한 전체 흐름도이다.
도 2는 read data의 QC(퀄리티 관리, quality control) 과정 중, LOESS 알고리즘에 의한 GC 교정 전과 후의 시퀀싱 리드 수의 보정결과를 도식화 한 것이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 순환 종양 DNA의 혼성화 비율에 따른 분석 민감도를 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따라 정상인 샘플 및 암 환자 샘플 혈액에서 실제로 순환 종양 DNA를 검출한 다음, 양성일치도(Positive Percent Agreement)를 평가한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는, 샘플에서 획득한 서열 분석 데이터를 정규화하고, 기준값을 바탕으로 정리한 뒤, 일정 구간(bin)으로 나누어 각 구간(bin) 별 리드 양을 정규화 한 다음, 참조집단 샘플과의 Z 점수(Z score)를 계산하고, 도출된 Z 점수(Z score)를 기반으로 염색체를 다시 나눈 뒤(segmentation), 이를 바탕으로 I 점수(I score)를 계산하여, I 점수(I score)가 기준값 이상일 때 이를 순환종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정할 경우, 높은 민감도와 낮은 위양성/위음성을 가지고 순환 종양 DNA를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 정상인과 암 환자혈액에서 추출한 DNA를 시퀀싱 한 뒤, LOESS 알고리즘을 이용하여 품질을 관리하고, 염색체를 일정 구간(bin)으로 구분하여 각 구간 별 매칭되는 리드 양을 GC 비율로 정규화한 다음, 정상인 샘플에서 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한다음, 상기 정규화한 값과의 Z 점수(Z score)를 계산하고 이를 기반으로 Z 점수(Z score)가 급변하는 염색체 영역을 다시 나눈 뒤(segmentation), 이를 이용하여 I 점수(I score)를 계산하여, I 점수(I score)가 기준값 이상일 경우, 순환종양 DNA가 있다고 판정하는 방법을 개발하였다(도 1)

본 명세서에서 용어 "리드(read)"는, 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 서열정보를 분석한 하나의 핵산 단편을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “서열정보” 및 “리드”는 시퀀싱 과정을 통해 서열정보를 수득한 결과물이라는 점에서 동일한 의미를 가진다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서,

a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계;

b) 상기 획득한 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;

c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계;

d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화 하는 단계;

e) 참조집단에서 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계;

f) 상기 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수(I score)를 계산하는 단계; 및

g) 상기 I 점수(I score)가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 상기 생체시료 내에 순환 종양 DNA가 존재하는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서,

상기 a) 단계는

(a-i) 채취된 무세포 DNA에서 염석 방법(salting-out method), 컬럼크로마토그래피 방법(column chromatography method), 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;

(a-ⅱ) 상기 정제된 핵산에 대하여, 싱글-엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어-엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;

(a-ⅲ) 상기 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및

(a-ⅳ) 상기 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 (a-i) 및 상기 (a-ⅱ) 단계 사이에, 상기 (a-i) 단계에서 정제된 핵산을, 효소적 절단, 분쇄 또는 하이드로쉐어방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)하여 싱글-엔드 시퀀싱 또는 페어-엔드 시퀀싱 라이브러리를 제작하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 ”참조집단”은 표준 염기서열 데이터베이스와 같이 비교할 수 있는 기준(reference) 집단으로, 현재 특정 질환 또는 병증이 없는 사람의 집단을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에서 표준 염기서열은 NCBI 등의 공공보건기관에 등록되어 있는 참조 염색체일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 차세대 유전자서열 검사기(next-generation sequencer)는 이에 제한되지는 않으나, 일루미나 컴파니의 하이섹(Hiseq) 시스템, 일루미나 컴파니의 마이섹(Miseq) 시스템, 일루미나 컴파니의 게놈 분석기(GA) 시스템, 로슈 컴파니(Roche Company)의 454 FLX, 어플라이드 바이오시스템즈 컴파니의 SOLiD 시스템, 라이프 테크놀러지 컴파니의 이온토렌트 시스템일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 정렬단계는 이에 제한되지는 않으나, BWA 알고리즘 및 Hg19 서열을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 BWA 알고리즘은 BWA-ALN, BWA-SW 또는 Bowtie2 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 c) 단계에서 상기 정렬된 서열정보에 대하여 퀄리티를 확인하는 것은, 정렬 일치도 점수(Mapping Quality Score) 지표를 이용하여 실제 시퀀싱 리드가 참조 염색체 서열과 얼마나 일치하는지를 확인하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 c) 단계는

(c-i) 각 정렬된 핵산서열의 영역을 특정하는 단계; 및

(c-ii) 상기 영역 내에서 정렬 일치도 점수(mapping quality score)와 GC 비율의 기준값을 만족하는 서열을 선별하는 단계;를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c-i) 단계의 핵산서열의 영역을 특정하는 단계에서, 핵산서열의 영역은 이에 제한되는 않으나, 20kb~1MB일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c-ii) 단계에서, 상기 기준값은 상기 정렬 일치도 점수(mapping quality score)가 원하는 기준에 따라 달라질 수 있으나, 구체적으로는 15 내지 70, 보다 구체적으로는 60일 수 있다. 상기 (c-ii) 단계에서, 상기 GC 비율이 원하는 기준에 따라 비율이 달라질 수 있으나, 구체적으로는 20 내지 70%, 보다 구체적으로는 30 내지 60% 인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 c) 단계는 염색체의 중심체 또는 말단체의 데이터를 제외하고 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서 용어 “중심체”는 각 염색체 장완(q arm)의 시작점으로부터 1Mb 내외인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 용어 “말단체”는 각 염색체 단완(p arm)의 시작점으로부터 1 Mb 내외 이내 또는 장완(q arm)의 종료점으로부터 1 Mb 이내인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는

(d-i) 표준 염색체를 일정구간(bin)으로 나누는 단계;

(d-ii) 상기 구간별 정렬된 리드 개수 및 리드들의 GC양을 산출하는 단계;

(d-iii) 상기 리드 개수 및 GC양을 바탕으로 회귀분석을 실시하여 회귀계수를 산출하는 단계; 및

(d-iv) 상기 회귀계수를 이용하여 리드 개수를 정규화하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, (d-i)에서의 일정구간(bin)은, 구체적으로는 50 kb내지 1000 kb일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (d-i) 단계의 핵산서열의 영역을 특정하는 단계에서, 일정구간(bin)은 이에 제한되는 않으나, 100 kb 내지 2MB, 구체적으로 500kb 내지 1500 kb, 보다 구체적으로는 600kb 내지 1600 kb, 보다 더 구체적으로 800kb 내지 1200 kb, 가장 구체적으로 900 kb 내지 1100 kb 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (iii) 단계의 회귀분석은 회귀계수를 산출할 수 있는 회귀분석 방법이면 모두 이용가능하나, 구체적으로는 LOESS 분석인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계는 특정 영역(bin)별 시퀀싱 리드 값을 표준화하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로는 하기의 수식 1로 계산하는 것을 특징으로 할 수 있다.

수식 1: Z 점수

본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계는

(f-i) 각 구간별 Z 점수(Z score)를 기반으로 CBS 방법(Circular Binary segmentation method)으로 염색체 영역을 구분하는 단계;

(f-ii) 상기 구분된 구역의 Z 점수(Z score)의 평균 절대값이 기준값 이상인 지역의 염색체 길이(size)를 구하는 단계; 및

(f-iii) 하기 수식 2로 I 점수(I score)를 계산하는 단계:

수식 2

:

본 발명에 있어서, 상기 Z 점수(Z score)의 평균 절대값의 기준값은 1-2이고, 보다 구체적으로는 2인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (g) 단계의 I 점수(I score)의 기준값은 50-150이고, 보다 구체적으로는 70-130, 보다 더 구체적으로 80-120, 가장 구체적으로 90-110인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 기준값(cut-off value) 이상인 샘플의 서열정보만 선별하는 품질관리부; 및 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 참조집단 샘플과 비교하여 Z 점수(Z score)를 계산한 다음, 이를 바탕으로 I 점수(I score)를 도출하여 I 점수(I score)가 기준값 이상일 경우, 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정하는 결정부를 포함하는 순환 종양 DNA 검출 장치에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 컴퓨터 판독 가능한 매체로서, 순환 종양 DNA를 검출하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계; b) 획득한 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; c) 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계; d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화 하는 단계; e) 참조집단에서 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계; f) 계산된 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체 영역을 구분하여, I 점수(I score)를 계산하는 단계; 및 g) I 점수(I socre)가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정하는 단계를 포함하는, 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 방법을 포함하는 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

본 발명의 용어 “암”은 고형 종양, 예로서, 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 눈, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선의 암 및 그의 원위 전이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 용어는 또한 림프종, 육종, 및 백혈병을 포함한다.

유방암의 일례로는 침윤성 관 암종, 침윤성 소엽성 암종, 관상피내 암종, 및 소엽상피내 암종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

기도암의 일례로는 소세포 폐 암종 및 비-소세포 폐 암종 뿐만 아니라, 기관지 선종 및 흉막폐장 모세포종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

뇌암의 일례로는 뇌간 및 시상하부 신경아교종, 소뇌 및 대뇌 성상세포종, 수모세포종, 뇌실막세포종 뿐만 아니라, 신경외배엽 또는 송과체 종양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

남성 생식 기관의 종양으로는 전립선암 및 고환암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여성 생식 기관의 종양으로는 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 질암, 및 외음부암 뿐만 아니라, 자궁의 육종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

소화관의 종양으로는 항문암, 결장암, 직장결장암, 식도암, 담낭암, 위암, 췌장암, 직장암, 소장암 및 타액선암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

요로의 종양으로는 방광암, 음경암, 신장암, 신우암 (예컨대, 신 세포 암종), 요관암 및 요도암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

안구암으로는 안내 흑색종 및 망막모세포종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

간암의 예로는 간세포 암종 (섬유층판성 변형이 있거나 없는 간 세포 암종), 담관암종 (간내 쓸개관 암종) 및 혼합 간세포 담관암종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

피부암으로는 편평세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈 세포 피부암 및 비-흑색종 피부암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

두경부암으로는 후두/하인두/비인두/구인두 암, 및 구순 및 구강 암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

림프종으로는 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨병 및 중추신경계의 림프종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

육종으로는 연조직의 육종, 골육종, 악성 섬유 조직구종, 림프육종 및 횡문근육종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

백혈병으로는 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 모발 상세포 백혈병을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “진단(diagnosis)”은 의료적 또는 병리적 상태(state), 질병 또는 상태(condition)의 확인 또는 분류를 의미한다. 예를 들면, “진단”은 암의 발병, 암의 재발, 암의 진행 또는 암의 전이를 의미할 수 있다. “진단”은 또한 암의 발병, 암의 재발, 암의 진행 또는 암의 전이의 중증도(severity)의 분류를 의미할 수 있다. 암의 발명, 암의 재발, 암의 진행 또는 암의 전이의 진단은 당업자(예를 들면 의사)가 사용할 수 있는 임의의 프로톨에 따라 수행될 수 있다.

본 발명의 용어 “예후(prognosis)”는 암의 발명, 암의 재발, 암의 진행 및/또는 암의 전이의 가능성의 예측을 의미한다. 본 발명의 상기 예측 방법은 임의의 특정환자에 대한 가장 적절한 치료 양식을 선택하는 것으로 임상적으로 치료 결정을 내리기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 예측 방법은 환자의 암의 발명, 암의 재발, 암의 진행 및/또는 암의 전이가 발생할 가능성이 높은지를 판단하는 것에 대한 진단 및/또는 진단을 보조하는 가치있는 도구이다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. I score의 분석 민감도 확인 시험

HG29 암 세포주의 DNA를 정상인 DNA에 다양한 비율(0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 100%)로 희석시킨 샘플을 사용해 라이브러리로 만들어 NextSeq 장비에서 염기서열 분석을 수행 하였으며 샘플 당 평균 10 million read의 서열정보 데이터를 생산하였다.

차세대염기서열분석기(NGS) 장비에서 생성된 Bcl 파일(염기서열정보 포함)을 fastq 형식으로 변환한 다음, fastq 파일을 BWA-mem 알고리즘을 사용하여 참조염색체 Hg19 서열을 기준으로 라이브러리 서열을 정렬하였다. 라이브러리 서열의 정렬 시 오류가 발생할 확률이 있어 오류를 교정하는 과정을 수행하였다.

GC 양에 따라 reads의 분포가 편향되는 것을 확인했고(도 2), LOESS 알고리즘을 사용하여 염색체별 GC 비율에 따라 정렬된 라이브러리 서열의 숫자를 교정하였다(도 2).

이후 하기 수식 1로 Z 점수(Z score)를 계산하였다:

수식 1: Z 점수

I score를 계산하기 위해, 계산된 bin별 Z score를 데이터로 사용해, CBS 알고리즘으로, 염색체를 분할(Segmentation)하는 과정이 선행되었다.

평균 Z score 값이 절대값 2 이상인 분할 지역의 평균 Z score 와 염색체 길이를 곱한 뒤, 이 값들의 합으로 각 샘플의 I score를 구하였고 I score 값이 100을 넘어가는 샘플은 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판단하였다. I score는 하기의 식으로 계산하였다.

수식 2

:

HG29 암 세포주의 DNA를 정상인 DNA에 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 100%로 희석시킨 샘플들의 I score 값은 표 1과 같다.

HG29 암 세포주 농도별 I score

Sample	I score
HT29-0	0
HT29-5	141.48
HT29-10	443.181
HT29-15	1678.762
HT29-20	2710.05
HT29-25	3635.193
HT29-50	7672.867
HT29-100	13760.21

도 3은 순환 종양 DNA의 혼성화 비율에 따른 분석 민감도를 평가한 결과를 나타낸 것으로, I score 임계값 100을 사용시, 분석민감도는 종양 DNA가 5% 혼성화된 샘플까지 검출 가능한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. I score의 양성일치도, 음성일치도 평가

19명의 정상인과 7명의 암 환자 혈액을 10mL씩 각각 채취하여 EDTA Tube에 보관하였으며, 채취 후 2시간 이내에 1200g, 4℃, 15분의 조건으로 혈장 부분만 1차 원심분리한 다음, 1차 원심분리된 혈장을 16000g, 4℃, 10분의 조건으로 2차 원심분리하여 침전물을 제외한 혈장 상층액을 분리하였다. 분리된 혈장에 대해 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit을 사용하여 cell-free DNA를 추출하고 2-4ng의 DNA를 라이브러리로 만들어 NextSeq 장비 염기서열 분석을 수행 하였으며 샘플당 평균 10 million read의 서열정보 데이터를 생산하였다.

실시예 1의 방법으로, 서열정보 데이터를 분석한 결과 19명의 정상 샘플에서 I score 값은 모두 0으로 확인된 반면, 7명의 암 환자 샘플 I score 값은 모두 7,500이상의 수치가 나타났으며, 평균 11,121의 I score 값을 확인할 수 있었다. 암 환자 샘플의 I score 값은 표 2와 같다.

임상 샘플(암 양성)의 I score 측정치

Sample	I score	Type
CRPC1	8775.53	Tumor
CRPC2	14743.24	Tumor
CRPC3	14071.436	Tumor
CSPC1	7839.972	Tumor
CSPC2	15081.961	Tumor
CSPC3	9784.259	Tumor
CSPC4	7553.028	Tumor

순환 종양 DNA의 존재 여부를 판단하는 임계값을 I score 100으로 기준하였을 때 표 3 및 도 4에 개시된 바와 같이 PPA(Positive Percent Agreement, 양성 일치도)와 NPA(Negative Percent Agreement, 음성 일치도) 모두 100%임을 확인 할 수 있었다.

I score의 양성 일치도, 음성 일치도 평가

	Cancer (-)	Cancer (+)
I score < 100	19	0
I score ≥≥ 100	0	7

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 생체시료 내 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)의 검출 방법:
a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA 의 서열정보를 획득하는 단계;
b) 상기 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계;
d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화하는 단계;
e) 참조집단의 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수를 계산하는 단계;
f) 상기 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수를 계산하는 단계; 및
g) 상기 I 점수(I score)가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 상기 생체시료 내에 순환 종양 DNA가 존재하는 것으로 판정하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법:
(a-i) 채취된 무세포 DNA에서 염석 방법(salting-out method), 컬럼크로마토그래피 방법(column chromatography method), 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
(a-ii) 상기 정제된 핵산에 대하여, 싱글-엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어-엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
(a-ⅲ) 상기 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
(a-ⅳ) 상기 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계.
제2항에 있어서,
상기 (a-ⅰ) 및 상기 (a-ⅱ) 단계 사이에, 상기 (a-ⅰ) 단계에서 정제된 핵산을, 효소적 절단, 분쇄 또는 하이드로쉐어방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)하여 싱글-엔드 시퀀싱 또는 페어-엔드 시퀀싱 라이브러리를 제작하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 c) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법:
(c-i) 각 정렬된 핵산서열의 영역을 특정하는 단계; 및
(c-ii) 상기 영역 내에서 정렬 일치도 점수(mapping quality score)와 GC 비율의 기준값을 만족하는 서열을 선별하는 단계.
제4항에 있어서, 상기 기준값은, 상기 정렬 일치도 점수(mapping quality score)가 15 내지 70이고, GC 비율은 30 내지 60%인 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법.
제4항에 있어서, c) 단계는, 염색체의 중심체 또는 말단체의 데이터를 제외하고 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법:
(d-i) 표준 염색체를 일정구간(bin)으로 나누는 단계;
(d-ii) 상기 구간별 정렬된 리드 개수 및 리드들의 GC양을 산출하는 단계
(d-iii) 상기 리드 개수 및 GC양을 바탕으로 회귀분석을 실시하여 회귀계수를 산출하는 단계; 및
(d-iv) 상기 회귀계수를 이용하여 리드 개수를 정규화하는 단계.
제7항에 있어서, (d-i)에서의 일정구간(bin)은 100 kb 내지 2 Mb인 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 e) 단계는, 하기의 수식 1로 계산하는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법:
수식 1: Z 점수
제1항에 있어서, 상기 (f) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법:
(f-i) 각 구간별 Z 점수를 기반으로 CBS(Circular Binary Segmentation) 방법로 염색체 영역을 구분하는 단계;
(f-ii) 상기 구분된 구역의 Z 점수의 평균 절대값이 기준값 이상인 지역의 염색체길이(size)를 구하는 단계; 및
(f-iii) 하기 수식 2로 I 점수를 계산하는 단계.
수식 2
:
제10항에 있어서, 상기 Z 점수의 평균 절대값의 기준값은 1-2인 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 I 점수의 기준값은 50-150인 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법으로 순환 종양 DNA를 검출 하는 단계를 포함하는 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법.
생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 해독하는 해독부;
해독된 서열을 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부;
정렬된 서열정보(reads)에 대하여 기준값(cut-off value) 이상인 샘플의 서열정보만 선별하는 품질관리부; 및
선별된 서열정보(reads)에 대하여, 참조집단 샘플과 비교하여 Z 점수(Z score)를 계산한 다음, 이를 바탕으로 I 점수(I score)를 도출하여, I 점수가 기준값 이상일 경우, 순환 종양 DNA 존재 여부를 판정하는 결정부를 포함하는 순환 종양 DNA 검출 장치.
컴퓨터 판독 가능한 매체로서, 순환 종양 DNA를 검출하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되,
a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계;
b) 획득한 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
c) 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계;
d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화 하는 단계;
e) 참조집단에서 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계;
f) 계산된 Z 점수를 기반으로 염색체 영역을 구분하여, I 점수(I score)를 계산하는 단계; 및
g) I 점수가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정하는 단계;
를 포함하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체.