WO2022250512A1 - 조직 특이적 조절지역의 무세포 dna 분포를 이용한 인공지능 기반 암 조기진단 방법 - Google Patents

조직 특이적 조절지역의 무세포 dna 분포를 이용한 인공지능 기반 암 조기진단 방법 Download PDF

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Definitions

  • Figure 5 shows the principle of generating an image to input the cfDNA distribution of the regulatory region obtained according to an embodiment of the present invention to an artificial intelligence model.
  • the tissue-specific regulatory region is a specific tissue, for example, cell-free DNA detected only in the liver and / or amount of cell-free DNA detected in other tissues, such as blood, brain, stomach and heart.
  • tissue-specific regulatory region is a specific tissue, for example, cell-free DNA detected only in the liver and / or amount of cell-free DNA detected in other tissues, such as blood, brain, stomach and heart.
  • different lengths and / or amounts, or different lengths and / or amounts of cell-free DNA detected in solid tissues (brain, liver, stomach, lungs and heart, etc.) and blood tissues (blood cells, bone marrow, etc.) can be used to produce various tissues.
  • the reference value of 0.5 is a value that can be changed at any time. For example, if you want to reduce false positives, you can strictly set the standard value higher than 0.5 to determine that you have cancer. You can take a little weaker standard that judges that there is.
  • a computer readable storage medium comprising instructions configured to be executed by a processor that provides information for a computer.
  • HMMRATAC Nucleosome Free Region
  • a total of 251 people with advanced liver cancer and healthy people were used for model learning, 150 people were trained for training, 49 people were trained for validation, and performance was confirmed with 52 people as a test.

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Abstract

본 발명은 인공지능 기반 암 조기진단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 조직 특이적 조절지역의 무세포 DNA 분포에 대한 정보를 암을 조기진단 하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하는 방법을 이용한 인공지능 기반의 암 조기진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암 조기진단 방법은 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)으로 수득한 조직 특이적 조절지역의 무세포 핵산 분포를 이용하여 인공지능 기반으로 암을 조기진단하여 정확도와 민감도가 높아 상업적 활용도를 높으므로, 본 발명의 방법은 암 조기 진단에 유용하다.

Description

조직 특이적 조절지역의 무세포 DNA 분포를 이용한 인공지능 기반 암 조기진단 방법
본 발명은 인공지능 기반 암 조기진단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 조직 특이적 조절지역의 무세포 DNA 분포에 대한 정보를 암을 조기진단 하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하는 방법을 이용한 인공지능 기반의 암 조기진단 방법에 관한 것이다.
액체생검(Liquid biopsy) 기술을 이용하여 세포의 괴사(necrosis), 세포자살(apoptosis), 분비(secretion)에 의해 혈장 내에 존재하는 무세포 DNA(cfDNA; cell-free DNA)를 이용하여 염색체이상을 검출하려는 연구들이 진행되고 있다. 특히 종양세포에서 유래된 혈중 무세포 DNA는 정상세포에서 나타나지 않는 종양 특이적인 염색체 이상 및 돌연변이를 포함하고 있으며, 반감기가 2시간 정도로 짧아서 종양의 현재상태를 반영한다는 장점이 있다. 또한 비침습적이고 반복적으로 채취가 가능하기 때문에 혈중 무세포 DNA는 암의 진단, 모니터링 및 예후 관측 등 암과 관련된 다양한 분야에서 종양 특이적인 생체 표지자로서 각광받고 있다.
단순한 혈액검사만으로 암을 진단할 수 있다는 장점을 이용해 액체 생검을 조기 진단에 이용하기위해 많은 연구자들이 노력하고 있다. 암은 DNA에 돌연변이가 점차 축적되어가며 생기는 질병이기 때문에 암 유래 cfDNA에는 정상인과 다른 돌연변이가 존재하고 이런 특징을 이용해 돌연변이가 포함된 DNA가 발견되면 암으로 진단할 수 있다. 하지만 30억개로 이루어진 사람 유전체에서 사람마다 암세포에서 공통적으로 발견되는 돌연변이는 굉장히 적고 심지어 그 돌연변이가 없어도 암에 걸리는 사람들이 많기 때문에 돌연변이를 이용해 암 조기 진단은 아직 좋은 성능을 보여주지 못하고 있다.
최근에는 cfDNA의 전장 유전체 데이터를 수득한 다음, transcription start site profile을 read depth 기반으로 도출하여, 각 유전자의 발현 여부를 SVM으로 학습하는 방법(Ulz, P., Thallinger, G., Auer, M. et al. Nat. Genet. Vol. 48, pp. 1273-1278, 2016) 이나, cfDNA fragmentation pattern에 기반한 transcription factor binding pattern을 분석하여 암을 조기 진단하거나, 암 종을 분류하는 기술(Ulz, P. et al., Nat. Commun. Vol. 10, 4666, 2019) 이 개발된 바 있으나, 그 신뢰도가 상대적으로 낮거나, 많은 양의 데이터가 필요하다는 단점이 있다.
이러한 기술배경하에, 본 발명자들은 인공지능 기반의 암 조기진단 방법 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 조직 특이적 조절지역의 무세포 핵산의 분포를 이미지화 하여, 암을 조기 진단하도록 학습된 인공지능 모델에 입력할 경우, 높은 민감도와 정확도로 암을 조기진단 할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 인공지능 기반의 암 조기진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인공지능 기반의 암 조기진단을 위한 정보의 제공 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 암 조기진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인공지능 기반의 암 조기진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인공지능 기반의 암 조기진단 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 암 조기진단을 수행하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계; (d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및 (e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)과 비교하여 암 유무를 판정하는 단계를 포함하는 인공지능 기반 암 조기진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열 기반의 핵산단편에서 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 핵산단편 선별부; 선별된 핵산 단편을 이미지 데이터로 생성하는 데이터 생성부; 및 생성된 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하고 분석하여, 암 조기 진단을 위한 정보를 제공하는 정보 제공부; 를 포함하는 인공지능 기반 암 조기진단을 위한 정보의 제공 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 조기진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계; (d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및 (e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)과 비교하여 암 유무를 판정하는 단계를 통하여, 암 조기진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계; (d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및 (e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)과 비교하여 기준값을 초과할 경우, 암이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 암 조기진단 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열 기반의 핵산단편에서 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 핵산단편 선별부; 선별된 핵산 단편을 이미지 데이터로 생성하는 데이터 생성부; 및 생성된 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 기준값을 초과할 경우, 암이 있는 것으로 판정하는 암 진단부; 를 포함하는 인공지능 기반 암 조기진단 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 조기진단을 수행하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계; (d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및 (e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)을 초과할 경우, 암이 있는 것으로 판정하는 단계를 통하여, 암 조기진단을 수행하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체를 제공한다.
도 1은 본 발명의 방법을 실시하기 위한 전체 흐름도이다.
도 2는 조절지역에서의 뉴클레오솜 위치 차이를 조직별로 나타낸 모식도와 실제 예시이다.
도 3은 다양한 조직에 대한 조절체 데이터의 모식도이다.
도 4는 조직 특이적 조절체를 발굴하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 수득한 조절지역의 cfDNA 분포를 인공지능 모델에 입력하기 위해 이미지로 생성하는 원리를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 구축한 인공지능 모델의 알고리즘을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 구축한 간암 예측 모델의 성능을 확인한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
제1, 제2, A, B 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않으며, 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 이하 설명하는 기술의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 해석되지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함한다" 등의 용어는 설시된 특징, 개수, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 의미하는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 개수, 단계 동작 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도면에 대한 상세한 설명을 하기에 앞서, 본 명세서에서의 구성부들에 대한 구분은 각 구성부가 담당하는 주기능 별로 구분한 것에 불과함을 명확히 하고자 한다. 즉, 이하에서 설명할 2개 이상의 구성부가 하나의 구성부로 합쳐지거나 또는 하나의 구성부가 보다 세분화된 기능별로 2개 이상으로 분화되어 구비될 수도 있다. 그리고 이하에서 설명할 구성부 각각은 자신이 담당하는 주기능 이외에도 다른 구성부가 담당하는 기능 중 일부 또는 전부의 기능을 추가적으로 수행할 수도 있으며, 구성부 각각이 담당하는 주기능 중 일부 기능이 다른 구성부에 의해 전담되어 수행될 수도 있음은 물론이다.
또, 방법 또는 동작 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 발명에서는, 샘플에서 획득한 서열 분석 데이터를 참조 유전체에 정렬한 다음, 정렬된 핵산단편에서 조절지역의 핵산단편을 선별하여 이미지 데이터를 생성하고, 생성된 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력할 경우, 높은 민감도와 정확도로 암을 조기진단 할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 정상인 187명, 초기 간암 환자 12명 및 후기 간암 환자 150명에서 수득한 액체생검에서 핵산을 추출한 다음, cfDNA 시퀀싱을 수득하여, 간 특이적 조절지역에 해당하는 핵산 단편을 선별한 다음, 이를 이미지 데이터로 생성하여 정상인 187명 및 후기 간암 환자 150명의 데이터를 이용하여 간암 조기진단을 위한 인공지능 학습 모델을 구축하였고, 초기 간암 환자 12명의 데이터를 이용하여 학습 모델의 성능을 확인한 결과, 높은 정확도로 구축한 학습 모델이 정상인과 간암 환자 및 초기 간암 환자 이미지를 구별할 수 있다는 것을 확인하였다(도 7 및 도 8).
본 발명에서 용어 "리드(reads)"는, 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 서열정보를 분석한 하나의 핵산 단편을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “서열정보” 및 “리드”는 시퀀싱 과정을 통해 서열정보를 수득한 결과물이라는 점에서 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서 용어 “조절 지역(regulatory region)”은, 유전자의 발현을 조절할 수 있는 염색체 상의 모든 위치를 의미하며, RNA 합성을 위해 RNA 합성효소 및 전자 조절 단백질이 결합하는 영역을 의미한다. 바람직하게는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer), 인슐레이터(insulator)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 “NFR (Nucleosome Free Region)”은, 조절 지역과 같은 지역을 의미하나 조절 지역 내에서 nucleosome이 존재하지 않는 지역을 특히 한정하여 지칭한다. 예를 들어, 1 내지 147bp는 제1 뉴클레오솜, 148 내지 346bp는 뉴클레오솜 사이 핵산, 347 내지 493bp는 제2 뉴클레오솜, 494 내지 692는 뉴클레오솜 사이 핵산, 693 내지 839bp는 제3 뉴클레오솜, 840 내지 1039bp는 뉴클레오솜 사이 핵산으로 구성되는 인핸서 영역이 있다고 할 때, 전사가 시작되면, 제2 이 떨어져 나가 전사 조절 단백질이 결합하게 된다고 하면, NFR은 148 내지 692 bp 영역이 된다.
또한, 정상 샘플에서는 상기와 같은 방법으로 전사가 진행되나, 암 샘플에서는 NFR이 존재하지 않을 경우가 있을 수 있고, 또는 다른 영역의 뉴클레오솜이 떨어져 나가 다른 NFR이 발생할 수 있으며, 정상 샘플에서는 존재하지 않는 NFR이 암 샘플에서는 새롭게 생성될 수 있다.
뿐만 아니라, 혈액 세포에서는 상기와 같은 방법으로 전사가 진행되나, 다른 조직(예를 들어, 간)에서는 NFR이 존재하지 않을 경우가 있을 수 있고, 또는 다른 영역의 뉴클레오솜이 떨어져 나가 다른 NFR이 발생할 수 있으며, 혈액 세포에서는 존재하지 않는 NFR이 암 샘플에서는 새롭게 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서,
(a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
(b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
(c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계;
(d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및
(e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)과 비교하여 암 유무를 판정하는 단계를 포함하는 인공지능 기반 암 조기진단을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 바람직하게는 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 급성 골수성 백혈병 (acute-myeloid leukemia), 급성 림프구성 백혈병 (acute-lymphoid leukemia), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 경부암 (head and neck cancer), 폐암, 교모세포종 (glioblastoma), 대장/직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 흑색종 (melanoma), 전립선암, 간암, 갑상선암, 위암, 담낭암, 담도암, 방광암, 소장암, 자궁경부암, 원발부위불명암, 신장암, 식도암 및 중피종 (mesothelioma)으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 간암 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 서열정보를 획득하는 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다:
(a-i) 생체시료에서 핵산을 수득하는 단계;
(a-ii) 채취된 핵산에서 솔팅-아웃 방법(salting-out method), 컬럼 크로마토그래피 방법(column chromatography method) 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
(a-iii) 정제된 핵산 또는 효소적 절단, 분쇄, 수압 절단 방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)된 핵산에 대하여, 싱글 엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어 엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
(a-iv) 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
(a-v) 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 서열정보를 획득하는 단계는 분리된 무세포 DNA를 1백만 내지 1억 리드 깊이로 전장 유전체 시퀀싱을 통해 획득하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생체시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), (혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는) 혈액, 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract), 정액, 모발, 타액, 소변, 구강세포, 태반세포, 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 및 이의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, ”참조집단”은 표준 염기서열 데이터베이스와 같이 비교할 수 있는 기준(reference) 집단으로, 현재 특정 질환 또는 병증이 없는 사람의 집단을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에서 표준 염기서열은 NCBI 등의 공공보건기관에 등록되어 있는 참조 염색체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 핵산은 무세포 DNA 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 순환종양세포 DNA(circulating tumor DNA) 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)는 당업계에 공지된 임의의 시퀀싱 방법으로 사용될 수 있다. 선택 방법에 의해 분리된 핵산의 시퀀싱은 전형적으로는 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 수행된다. 차세대 시퀀싱은 개개의 핵산 분자 또는 고도로 유사한 방식으로 개개의 핵산 분자에 대해 클론으로 확장된 프록시 중 하나의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 임의의 시퀀싱 방법을 포함한다(예를 들어, 105개 이상의 분자가 동시에 시퀀싱된다). 일 실시형태에서, 라이브러리 내 핵산 종의 상대적 존재비는 시퀀싱 실험에 의해 만들어진 데이터에서 그것의 동족 서열의 상대적 발생 수를 계측함으로써 추정될 수 있다. 차세대 시퀀싱 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 본 명세서에 참조로서 포함된 문헌(Metzker, M. (2010) Nature Biotechnology Reviews 11:31-46)에 기재된다.
일 실시형태에서, 차세대 시퀀싱은 개개의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 한다(예를 들어, 헬리코스 바이오사이언스(Helicos BioSciences)의 헬리스코프 유전자 시퀀싱 시스템(HeliScope Gene Sequencing system) 및 퍼시픽바이오사이언스의 팩바이오 알에스 시스템(PacBio RS system)). 다른 실시형태에서, 시퀀싱, 예를 들어, 더 적지만 더 긴 리드를 만들어내는 다른 시퀀싱 방법보다 시퀀싱 단위 당 서열의 더 많은 염기를 만들어내는 대량병렬의 짧은-리드 시퀀싱(예를 들어, 캘리포니아주 샌디에고에 소재한 일루미나 인코포레이티드(Illumina Inc.) 솔렉사 시퀀서(Solexa sequencer)) 방법은 개개의 핵산 분자에 대해 클론으로 확장된 프록시의 뉴클레오타이드 서열을 결정한다(예를 들어, 캘리포니아주 샌디에고에 소재한 일루미나 인코포레이티드(Illumina Inc.) 솔렉사 시퀀서(Solexa sequencer); 454 라이프 사이언스(Life Sciences)(코네티컷주 브랜포드에 소재) 및 아이온 토렌트(Ion Torrent)). 차세대 시퀀싱을 위한 다른 방법 또는 기계는, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 454 라이프 사이언스(Life Sciences)(코네티컷주 브랜포드에 소재), 어플라이드 바이오시스템스(캘리포니아주 포스터 시티에 소재; SOLiD 시퀀서), 헬리코스 바이오사이언스 코포레이션(매사추세츠주 캠브릿지에 소재) 및 에멀젼 및 마이크로 유동 시퀀싱 기법 나노 점적(예를 들어, 지누바이오(GnuBio) 점적)에 의해 제공된다.
차세대 시퀀싱을 위한 플랫폼은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 로슈(Roche)/454의 게놈 시퀀서(Genome Sequencer: GS) FLX 시스템, 일루미나(Illumina)/솔렉사(Solexa) 게놈 분석기(Genome Analyzer: GA), 라이프(Life)/APG의 서포트 올리고(Support Oligonucleotide Ligation Detection: SOLiD) 시스템, 폴로네이터(Polonator)의 G.007 시스템, 헬리코스 바이오사이언스의 헬리스코프 유전자 시퀀싱 시스템(Helicos BioSciences' HeliScope Gene Sequencing system) 및 퍼시픽 바이오사이언스(Pacific Biosciences)의 팩바이오알에스(PacBio RS) 시스템을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 정렬단계는 이에 제한되지는 않으나, BWA 알고리즘 및 Hg19 서열을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 BWA 알고리즘은 BWA-ALN, BWA-SW 또는 Bowtie2 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계를 수행하기에 앞서 정렬된 핵산 단편의 정렬 일치도 점수(mapping quality score)가 기준값 이상인 리드를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 기준값은 정렬된 핵산 단편의 퀄리티를 확인할 수 있는 값이면 제한없이 이용가능하여, 바람직하게는 50 내지 70점, 더욱 바람직하게는 60점인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 조절지역은 조직 특이적 조절지역인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조직 특이적 조절지역은 조직 별로 검출되는 무세포 DNA의 길이 및/또는 양이 상이한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 조직 특이적 조절지역은 특정 조직 예를 들어, 간에서만 검출되는 무세포 DNA의 길이 및/또는 양이 다른 조직 예를 들어, 혈액, 뇌, 위 및 심장 등에서 검출되는 무세포 DNA의 길이 및/또는 양이 상이하거나, 고형 조직(뇌, 간, 위, 폐 및 심장 등)과 혈액 조직(혈액 세포, 골수 등)에서 서로 검출되는 무세포 DNA의 길이 및/또는 양이 상이할 수 있다.
본 발명에서 상기 조직 특이적 조절지역은 보다 구체적으로 조절 지역 내에서 nucleosome이 존재하지 않는 지역, 즉 NFR (Nucleosome Free Region)을 의미할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조직 특이적 조절지역은 인공지능 모델에 입력할 이미지 데이터를 생성할 수 있는 개수이면 제한없이 이용가능하며, 바람직하게는 10개, 100개, 1,000개, 10,000개, 20,000개 내지 50,000개 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 이미지는, 인공지능 모델이 학습에 사용할 수 있는 이미지이면 제한없이 이용가능하며, 바람직하게는 x 축이 선별된 핵산단편의 정렬 위치 별 리드 개수로 구성되는 1차원 이미지인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 (d) 단계의 이미지는 각각의 base pair마다 cfDNA read가 쌓인 값을 나열한 것으로 예를 들어, [0.91, 0.93, ~~ , 0.73, 0.86]와 같은 형태의 구조를 나타낼 수 있으며, 조직 특이적 조절지역으로 선별된 위치를 중심으로 ±1000bp, 총 2000bp를 사용할 경우에는 [ ] 안의 숫자가 2000개가 되는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 인공지능 모델은 정상 이미지와 암 이미지를 구별할 수 있도록 학습하는 학습 모델이면 제한없이 이용가능하며, 바람직하게는 인공신경망일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 합성곱 신경망(convolutional neural network, CNN) 또는 재귀 신경망(recurrent neural network, RNN)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 기준값은 암을 조기진단 할 수 있는 값이면 제한없이 이용가능하고, 바람직하게는 0.5일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 만약 기준값이 0.5일 경우, 0.5 이상일 경우에 암인 것으로 판정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 인공지능 모델은 학습할 때, 암이 있으면 output 결과가 1에 가깝게 학습하고, 암이 없으면 output 결과가 0에 가깝게 학습을 시켜서, 0.5를 기준으로 0.5 이상이면 암이 있다고 판단하고, 0.5 이하이면 암이 없다고 판단하여 performance 측정을 수행하였다(Training, validation, test accuracy).
여기서, 0.5의 기준값은 언제든지 바뀔 수 있는 값이라는 것은 통상의 기술자에게 자명한 것이다. 예를 들어서 False positive(위양성)를 줄이고자 하면, 0.5보다 높은 기준값을 설정하여 암이 있다고 판단되는 기준을 엄격하게 가져 갈 수 있고, False Negative(위음성)를 줄이고자 하면 기준값을 더 낮게 측정하여 암이 있다고 판단되는 기준을 조금 더 약하게 가져갈 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인공지능 모델이 CNN일 경우, 손실함수는 하기 수식 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
Figure PCTKR2022007648-appb-img-000001
여기서, N=학습 데이터 수, y는 실제 label 값, p(y)는 모델을 통해 예측된 확률값을 의미한다.
본 발명에서, 상기 인공지능 모델이 CNN일 경우, 학습은 하기 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다:
i) 생산된 이미지 데이터를 training(학습), validation(검증), test(성능평가) 데이터로 분류하는 단계;
이 때, Training 데이터는 CNN 모델을 학습할 때 사용되고, Validation 데이터는 hyper-parameter tuning 검증에 사용되며, Test 데이터는 최적의 모델 생산 후, 성능 평가로 사용되는 것을 특징으로 함.
ii) Hyper-parameter tuning 및 학습 과정을 통해서 최적의 CNN 모델을 구축하는 단계;
iii) Hyper-parameter tuning을 통해서 얻어진 여러 모델의 성능을 validation data를 이용하여 비교하여, validation data 성능이 가장 좋은 모델을 최적의 모델로 결정하는 단계;
본 발명에서, 상기 Hyper-parameter tuning 과정은 CNN 모델을 이루는 여러 parameter(convolution layer 수, dense layer 수, convolution filter 수 등) 값을 최적화 하는 과정으로 Hyper-parameter tuning 과정으로는 Hyperband optimization, Bayesian optimization 및 grid search 기법을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 학습 과정은 정해진 hyper-parameter들을 이용하여 CNN 모델의 내부 parameter(weights)들을 최적화 시켜, Training loss 대비 validation loss가 증가하기 시작하면 모델이 과적합(Overfitting) 되었다 판단하고, 그전에 model 학습을 중단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 e) 단계에서 인공지능 모델이 입력된 이미지 데이터로부터 분석한 결과값은 특정 score 또는 실수이면 제한없이 이용가능하며, 바람직하게는 실수 값인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 실수 값은 인공지능 model의 마지막 layer에 sigmoid function 또는 softmax function을 사용하여 인공지능 모델의 output을 0 ~ 1 scale로 조정하여 확률값으로 표현한 값을 의미한다.
본 발명은 다른 관점에서,
생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 해독하는 해독부;
해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부;
정렬된 서열 기반의 핵산단편에서 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 핵산단편 선별부;
선별된 핵산 단편을 이미지 데이터로 생성하는 데이터 생성부; 및
생성된 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 암 조기 진단을 위한 정보를 제공하는 정보 제공부;
를 포함하는 인공지능 기반 암 조기진단을 위한 정보의 제공 장치에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 해독부는 독립된 장치에서 추출된 핵산을 주입하는 핵산 주입부; 및 주입된 핵산의 서열정보를 분석하는 서열정보 분석부를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 NGS 분석 장치일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 해독부는 독립된 장치에서 생성된 서열정보 데이터를 수신하여 해독하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 조기진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되,
(a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
(b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
(c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계;
(d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및
(e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)과 비교하여 암 유무를 판정하는 단계를 통하여, 암 조기진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체에 관한 것이다.
다른 양태에서 본원에 따른 방법은 컴퓨터를 이용하여 구현될 수 있다. 일 구현예에서, 컴퓨터는 칩 세트에 연결된 하나 이상의 프로세서를 포함한다. 또한 칩 세트에는 메모리, 저장 장치, 키보드, 그래픽 어댑터(Graphics Adapter), 포인팅 장치(Pointing Device) 및 네트워크 어댑터(Network Adapter) 등이 연결되어 있다. 일 구현예에서, 상기 칩 세트의 성능은 메모리 컨트롤러 허브(Memory Controller Hub) 및 I/O 컨트롤러 허브에 의하여 가능하다. 다른 구현예에서, 상기 메모리는 칩 세트 대신에 프로세서에 직접 연결되어 사용될 수 있다. 저장 장치는 하드 드라이브, CD-ROM(Compact Disk Read-Only Memory), DVD 또는 기타 메모리 장치를 포함하는 데이터를 유지할 수 있는 임의의 장치이다. 메모리는 프로세서에 의하여 사용된 데이터 및 명령에 관여한다. 상기 포인팅 디바이스는 마우스, 트랙볼 (Track Ball) 또는 다른 유형의 포인팅 디바이스일 수 있고, 키보드와 조합하여 입력 데이터를 컴퓨터 시스템으로 전송하는데 사용된다. 상기 그래픽 어댑터는 디스플레이 상에서 이미지 및 다른 정보를 나타낸다. 상기 네트워크 어댑터는 근거리 또는 장거리 통신망으로 컴퓨터 시스템과 연결된다. 본원에 사용되는 컴퓨터는 하지만 위와 같은 구성으로 제한되는 것은 아니고, 일부 구성이 없거나, 추가의 구성을 포함 할 수 있으며, 또한 저장장치영역네트워크(Storage Area Network, SAN)의 일부일 수 있으며, 본원의 컴퓨터는 본원에 따른 방법의 수행을 위한 프로그램에 모듈의 실행에 적합하도록 구성될 수 있다.
본원에서 모듈이라 함은, 본원에 따른 기술적 사상을 수행하기 위한 하드웨어 및 상기 하드웨어를 구동하기 위한 소프트웨어의 기능적, 구조적 결합을 의미할 수 있다. 예컨대, 상기 모듈은 소정의 코드와 상기 소정의 코드가 수행되기 위한 하드웨어 리소스(Resource)의 논리적인 단위를 의미할 수 있으며, 반드시 물리적으로 연결된 코드를 의미하거나, 한 종류의 하드웨어를 의미하는 것은 아님은 본원 기술분야의 당업자에게 자명한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
(b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
(c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계;
(d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및
(e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)과 비교하여 기준값을 초과할 경우, 암이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 암 조기진단 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 방법으로 조절지역의 핵산단편 이미지를 데이터를 인공지능 모델에 입력하여 분석하는 단계; (b) 인공지능 모델이 출력한 값이 기준값을 초과할 경우, 암이 있는 것으로 판정하는 단계; 및 (c) 암이 있는 것으로 판정된 환자를 치료하는 단계를 포함하는 암 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 암 치료제는 암 또는 미세잔존암을 치료할 수 있는 방법이면 제한없이 사용가능하며, 바람직하게는 수술, 보조 화학 요법(adjuvant chemotherapy), 선행 화학 요법(neoadjuvant chemotherapy), 방사선 요법(radiation therapy), 호르몬 요법(hormone therapy), 세포독성 요법(cytotoxic therapy), 면역 요법(immunotherapy), 이식 T 세포 요법(adoptive T cell therapy), 타겟 요법(targeted therapy) 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는 암 치료제를 투여하여 치료하는 것을 특징으로 할 수 있고, 가장 바람직하게는 화학 항암제, 표적항암제 및 면역항암제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 항암제를 투여하여 치료하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열 기반의 핵산단편에서 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 핵산단편 선별부; 선별된 핵산 단편을 이미지 데이터로 생성하는 데이터 생성부; 및 생성된 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 기준값을 초과할 경우, 암이 있는 것으로 판정하는 암 진단부; 를 포함하는 인공지능 기반 암 조기진단 장치에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 조기진단을 수행하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계; (d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및 (e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)을 초과할 경우, 암이 있는 것으로 판정하는 단계를 통하여, 암 조기진단을 수행하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 조절지역 확보
조절지역은 ATAC-seq, DNase-seq, FAIRE-seq과 같은 next generation sequencing(NGS) 기술로 확인할 수 있는데, 본 발명자들은 23가지 암 종에 대한 400명이 넘는 환자들에 대해 조절지역데이터를 생산한 TCGA 데이터와 16개의 혈액세포에 대한 조절지역에 대해 프로파일한 데이터를 사용하였다. (DOI: 10.1126/science.aav1898, DOI:https://doi.org/10.1038/ng.3646)
해당 조절체 데이터를 이용해서 Nucleosome Free Region(NFR)을 찾기 위해서 HMMRATAC이라는 툴을 사용했고, 조절지역을 찾기 위해서 MACS2 툴을 사용했다. HMMRATAC은 default 옵션을 이용해 유전체 상의 NFR을 찾았고 MACS2 툴은 “--shift -75 --extsize 150 --nomodel --nolambda --call-summits -q 0.05 -B --SPMR” 옵션을 이용해 조절지역을 찾았다.
우선, Blood 관련한 세포타입으로 HMMRATAC을 이용해 Bcell은 39604개, CD4Tcell은 40795개, CD8Tcell은 44687개, Monocyte는 36342개, NKcell은 42458개의 NFR을 찾았다. 이 중 NFR 수가 가장 많았던 CD8Tcell을 blood 세포타입 대표로 사용했고 CD8Tcell로부터 찾은 NFR지역과 17명의 간암 환자들의 조절지역이 겹치는지 Bedtools의 intersectBed를 이용해 계산했다. 이때 intersectBed의 기본 옵션으로 진행했기 때문에 두 지역 사이에 절반 이상이 겹칠 경우, 겹친다고 계산을 했다.
마찬가지로 간암 환자들 총 17명의 ATAC-seq 데이터를 이용해 HMMRATAC 프로그램으로 NFR 지역을 찾았고 각 샘플당 최소 13712개부터 62344개의 NFR 지역을 확보했다. 이 중 가장 많은 62344개의 NFR을 확보한 샘플을 간암 대표로 사용했고 blood 세포타입 총 5개와 위와 같은 방식으로 중복되어 값을 계산했다. 그리고 blood 대표 세포 타입인 CD8Tcell의 NFR을 간암 조절지역들과 오버랩 했을 때 아무것도 오버랩이 안되는 지역을 혈액 특이적 NFR이라고 명명했고, 간암 조절지역들과 모두 오버랩이 되는 NFR을 혈액 공통적 NFR이라고 명명했다. 또한 반대로 간암 대포 샘플의 NFR과 혈액 세포의 조절지역들과 오버랩을 진행했을 때 아무것도 오버랩이 안되는 지역을 간암 특이적 NFR이라고 명명했고, 혈액 특이적 NFR과 모두 오버랩 되는 지역을 간암 공통적 NFR이라고 명명했다.
이러한 방식을 이용해 혈액 세포 특이적 NFRs은 8,806개, 혈액 공통적 NFRs은 17508개, 간암 특이적 NFRs은 24,642개, 간암 공통적 NFRs은 19134개를 선별했고 이 지역들에 쌓여있는 cfDNA reads들의 분포로 딥러닝 이미지를 구축했다(도 4).
실시예 2. 인공지능 모델 구축
조절지역 위치에 cfDNA의 분포를 이용해 딥러닝 모델의 인풋으로 사용하기 위해 cfDNA의 분포를 도 5와 같이 제작하였다.
즉, NGS를 통해 혈액 속에 떠돌아다니는 수 백만 개의 cfDNA 조각들에 대한 정보를 얻을 수 있고, 조절지역에 위치한 각 cfDNA 조각들을 이용해 이미지처럼 만들기 위해 x 축에 cfDNA 조각들의 유전체내 위치에 대한 정보를 쌓아 1D 이미지를 만들었다(도 5).
조직 특이적인 조절지역들에 대해 딥러닝의 인풋 이미지로 만들고 해당 모델에서는 정상인과 간암을 구분하는 모델이기 때문에 혈액 세포 특이적인 조절지역과 간암 특이적인 조절지역 두 가지로 인풋 이미지를 만들고 둘을 합쳐 최종적인 인풋 이미지로 제작하였다.
x축에 해당하는 cfDNA의 위치는 HMMRATAC으로 콜링한 NFR의 중심으로부터 ±1000bp, 총 2000bp를 사용했다. 즉, 각각의 bp마다 cfDNA 리드가 쌓인 값을 1D 이미지로 구축한 것이다.
따라서 최종 인풋 이미지는 2000(x축, cfDNA의 위치) x 4(혈액 세포 특이적, 공통적 조절지역, 간암 특이적, 공통적 조절지역)으로 이루어져 있다.
Convolutional neural network (CNN)모델은 kernel을 통해 국소적인 특징을 잘 잡기 때문에 이미지 분류에 좋은 성능을 나타내는 모델이므로, 상기 cfDNA 분포를 이미지 데이터로 생성하여, CNN 모델로 패턴을 학습했고 이 학습된 패턴으로 암인지 정상인지 판별하는 모델을 제작하였다.
실험예 1. 간암 조기진단 모델 구축
본 모델이 간암 진단에 사용할 수 있는지 확인하기 위해 건강한 사람(healthy) 187명, 간암환자 64명의 혈액을 채취 후 streck tube에 보관했다. 원심분리 후 혈액의 상부에 있는 plasma를 분리 후 tiangen kit를 이용해 cfDNA를 추출하고 MGI DNB-seq을 이용해 시퀀싱을 진행했다.
모델 학습에는 후기 간암과 건강한 사람들 총 251명을 이용했고 training에는 150명, validation에는 49명 학습을 진행하고 test로 52명으로 성능을 확인했다.
딥러닝은 학습하는 데이터 수가 많을수록 학습이 잘되기 때문에 학습할 수 있는 샘플 수를 늘리기 위해 한 샘플 당 down-sampling을 진행했고 1.7×10^7개의 reads를 랜덤하게 10번을 뽑아서 샘플 수를 늘려 학습을 진행했다.
Figure PCTKR2022007648-appb-img-000002
실험예 2. 간암 조기진단 모델 성능 확인
2020개의 training set와 670개의 validation set, 680개의 test set을 이용해 hyperband를 이용해 다양한 hyperparameter를 tuning하고 최종적으로 training에서는 auc가 0.98, validation에서는 auc가 0.94, test에서는 auc가 0.86로 높은 성능을 확인하였다(도 7).
또한 위에 선별된 조직 특이적 NFR이 아니라 랜덤하게 선택된 지역을 이용했을 때에는 training에서는 auc가 0.83, validation에서는 0.79, test에서는 0.70로 나오는 것으로 확인해 선별된 조직 특이적 NFR이 정상인과 간암을 가르는데 중요하고, 선별된 지역들을 통해 정확히 간암 환자들을 선별하는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 암 조기진단 방법은 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)으로 수득한 조직 특이적 조절지역의 무세포 핵산 분포를 이용하여 인공지능 기반으로 암을 조기진단하여 정확도와 민감도가 높아 상업적 활용도를 높으므로, 본 발명의 방법은 암 조기 진단에 유용하다.

Claims (15)

  1. (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
    (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계;
    (d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및
    (e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)과 비교하여 암 유무를 판정하는 단계를 포함하는 인공지능 기반 암 조기진단을 위한 정보의 제공방법.
  2. (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
    (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계;
    (d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및
    (e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)과 비교하여 기준값을 초과할 경우, 암이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 암 조기진단 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계의 서열정보를 획득하는 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a-i) 생체시료에서 핵산을 수득하는 단계;
    (a-ii) 채취된 핵산에서 솔팅-아웃 방법(salting-out method), 컬럼 크로마토그래피 방법(column chromatography method) 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
    (a-iii) 정제된 핵산 또는 효소적 절단, 분쇄, 수압 절단 방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)된 핵산에 대하여, 싱글 엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어 엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
    (a-iv) 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
    (a-v) 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계의 핵산은 무세포 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c) 단계를 수행하기에 앞서 정렬된 핵산 단편의 정렬 일치도 점수(mapping quality score)가 기준값 이상인 리드를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 기준값은 50 내지 70점인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c) 단계의 조절지역은 조직 특이적 조절지역인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조직 특이적 조절지역은 조직 별로 검출되는 무세포 DNA의 길이 및/또는 양이 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (d) 단계의 이미지는 x 축이 선별된 핵산단편의 정렬 위치 별 리드 개수로 구성되는 1차원 이미지인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (e) 단계의 인공지능 모델은 인공신경망인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 인공신경망은 합성곱 신경망(convolutional neural network, CNN) 또는 재귀 신경망(recurrent neural network, RNN)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 해독하는 해독부;
    해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부;
    정렬된 서열 기반의 핵산단편에서 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 핵산단편 선별부;
    선별된 핵산 단편을 이미지 데이터로 생성하는 데이터 생성부; 및
    생성된 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하고 분석하여 암 조기 진단을 위한 정보를 제공하는 정보 제공부;
    를 포함하는 인공지능 기반 암 조기진단을 위한 정보의 제공 장치.
  13. 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 조기진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되,
    (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
    (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계;
    (d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및
    (e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)과 비교하여 암 유무를 판정하는 단계를 통하여, 암 조기진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  14. 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 해독하는 해독부;
    해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부;
    정렬된 서열 기반의 핵산단편에서 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 핵산단편 선별부;
    선별된 핵산 단편을 이미지 데이터로 생성하는 데이터 생성부; 및
    생성된 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 기준값을 초과할 경우, 암이 있는 것으로 판정하는 암 진단부;
    를 포함하는 인공지능 기반 암 조기진단 장치.
  15. 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 조기진단을 수행하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되,
    (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
    (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 기반하여 조절 지역의 핵산단편(fragments)을 선별하는 단계;
    (d) 선별된 핵산단편을 이미지 데이터로 생성하는 단계; 및
    (e) 생성된 상기 이미지 데이터를 정상 이미지와 암 이미지를 구별하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)을 초과할 경우, 암이 있는 것으로 판정하는 단계를 통하여, 암 조기진단을 수행하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
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