WO2023080586A1 - 세포유리 핵산단편 위치별 서열 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법 - Google Patents

세포유리 핵산단편 위치별 서열 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2023080586A1
WO2023080586A1 PCT/KR2022/016868 KR2022016868W WO2023080586A1 WO 2023080586 A1 WO2023080586 A1 WO 2023080586A1 KR 2022016868 W KR2022016868 W KR 2022016868W WO 2023080586 A1 WO2023080586 A1 WO 2023080586A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
cancer
sequence
acid fragments
size
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/016868
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조은해
이태림
Original Assignee
주식회사 지씨지놈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 지씨지놈 filed Critical 주식회사 지씨지놈
Publication of WO2023080586A1 publication Critical patent/WO2023080586A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B35/00—ICT specially adapted for in silico combinatorial libraries of nucleic acids, proteins or peptides
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/20—Supervised data analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing cancer using the relative frequency and size of sequences for each position of cell-free nucleic acid fragments, and more specifically, to a method for diagnosing cancer by extracting nucleic acids from a biological sample, obtaining sequence information, and locating nucleic acid fragments based on aligned reads.
  • the present invention relates to a cancer diagnosis method using a method of deriving the relative frequency of a star sequence and the size of a nucleic acid fragment, and then analyzing the calculated value by inputting it into a learned artificial intelligence model.
  • Cancer diagnosis in clinical practice is usually confirmed by performing a tissue biopsy after a medical history, physical examination, and clinical evaluation. Cancer diagnosis by clinical tests is possible only when the number of cancer cells is 1 billion or more and the diameter of the cancer is 1 cm or more. In this case, the cancer cells already have the ability to metastasize, and at least half of them have already metastasized.
  • tissue biopsy is invasive, it causes considerable inconvenience to patients, and there are problems in that tissue biopsy can often not be performed while treating cancer patients.
  • cancer screening tumor markers are used to monitor substances produced directly or indirectly from cancer, but even when cancer is present, more than half of the tumor marker screening results are normal, and often positive even when there is no cancer. Because it appears, there is a limit to its accuracy.
  • liquid biopsy using a patient's body fluid as a recent cancer diagnosis and follow-up test (liquid biopsy) is widely used.
  • Liquid biopsy is a non-invasive diagnostic technique that is attracting attention as an alternative to conventional invasive diagnostic and examination methods.
  • Gradient Boosting Algorithm is a predictive model capable of performing regression or classification analysis, and is an algorithm that belongs to the boosting family of ensemble methodologies of predictive models.
  • the Gradient Boosting Algorithm shows tremendous performance in predicting tabular format data (data in X-Y Grid like Excel format), and is known to have the highest predictive performance among machine learning algorithms.
  • the present inventors have made diligent efforts to solve the above problems and develop a highly sensitive and accurate artificial intelligence-based cancer diagnosis method.
  • the present invention was completed by confirming that cancer diagnosis can be performed with high sensitivity and accuracy when the sequence relative frequency and size combination of is selected and analyzed with a learned artificial intelligence model.
  • An object of the present invention is to provide a method for diagnosing cancer using the relative frequency and size of sequence by position of cell-free nucleic acid fragments.
  • Another object of the present invention is to provide a device for diagnosing cancer using the relative frequency and size of sequences for each position of cell-free nucleic acid fragments.
  • Another object of the present invention is to provide a computer readable storage medium containing instructions configured to be executed by a processor for diagnosing cancer by the above method.
  • the present invention includes (a) obtaining sequence information by extracting nucleic acids from a biological sample; (b) aligning the obtained sequence information (reads) with a standard chromosome sequence database (reference genome database); (c) deriving a sequence relative frequency and size of nucleic acid fragments for each location of nucleic acid fragments using the aligned sequence reads; And (d) inputting the derived sequence relative frequency and size information into an artificial intelligence model learned to diagnose cancer and comparing the output result value analyzed with a cut-off value to determine the presence of cancer,
  • the artificial intelligence model is a method for providing information for cancer diagnosis using cell-free nucleic acid, characterized in that it is learned to distinguish between normal samples and cancer samples based on sequence relative frequency by position of nucleic acid fragments and size information of nucleic acid fragments. to provide.
  • the present invention also includes a decoding unit for extracting nucleic acids from a biological sample and decoding sequence information; an alignment unit that aligns the translated sequence with a standard chromosomal sequence database; a nucleic acid fragment analyzer for deriving a sequence relative frequency and a size of the nucleic acid fragments for each position of the nucleic acid fragments based on the aligned sequences; and a cancer diagnosis unit that inputs and analyzes the derived nucleic acid fragment sequence relative frequency by position and size information of the nucleic acid fragment into the learned artificial intelligence model, and compares the information with a reference value to determine the presence or absence of cancer. It provides a cancer diagnosis device comprising a.
  • the present invention also provides a computer-readable storage medium comprising instructions configured to be executed by a processor providing information for diagnosing cancer, including: (a) obtaining sequence information by extracting nucleic acids from a biological sample; (b) aligning the obtained sequence information (reads) with a standard chromosome sequence database (reference genome database); (c) deriving a sequence relative frequency and size of nucleic acid fragments for each location of nucleic acid fragments using the aligned sequence reads; And (d) inputting the derived sequence relative frequency and size information into an artificial intelligence model learned to diagnose cancer and comparing the output result value analyzed with a cut-off value to determine the presence of cancer,
  • the artificial intelligence model in step (d) is learned to distinguish between normal samples and cancer samples based on the sequence relative frequency of each position of the nucleic acid fragments and the size information of the nucleic acid fragments, wherein the information for diagnosing cancer It provides a computer readable storage medium comprising instructions configured to be executed by a processor that provides.
  • the present invention also includes (a) obtaining sequence information by extracting nucleic acids from a biological sample; (b) aligning the obtained sequence information (reads) with a standard chromosome sequence database (reference genome database); (c) deriving a sequence relative frequency and size of nucleic acid fragments for each location of nucleic acid fragments using the aligned sequence reads; And (d) inputting the derived sequence relative frequency and size information into an artificial intelligence model learned to diagnose cancer and comparing the output result value analyzed with a cut-off value to determine the presence of cancer,
  • the artificial intelligence model provides a method for diagnosing cancer using cell-free nucleic acid, characterized in that it is learned to distinguish between normal samples and cancer samples based on sequence relative frequency by position of nucleic acid fragments and size information of nucleic acid fragments.
  • 1 is an overall flowchart for performing the method for diagnosing cancer using the relative frequency and size of sequences for each position of cell-free nucleic acid fragments according to the present invention.
  • FIG. 2 is an example of a process of selecting a size of a nucleic acid fragment having a statistically significant difference in relative frequency by size between a healthy person and a cancer patient in one embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph confirming the statistical value of the relative frequency by size of nucleic acid fragments identified in an embodiment of the present invention and the size distribution of selected nucleic acid fragments.
  • FIG. 4 is a visualization of the FESS table produced in one embodiment of the present invention in a heatmap format.
  • the left panel of FIG. 5 is an enlarged view of the portion indicated by the dotted line in FIG. 4, and the two right panels are results of statistical analysis of relative frequencies of nucleotide sequences at each location.
  • 6 is a result of statistically confirming the similarity between each nucleotide sequence by calculating the relative frequency of each nucleotide sequence A, T, G, and C at the position of the selected nucleic acid fragment in one embodiment of the present invention.
  • (A) is the result of confirming the performance of the machine learning model constructed in one embodiment of the present invention with accuracy and AUC, and (B) is a confusion matrix.
  • FIG. 9 is a graph showing statistical values of relative frequency by size of nucleic acid fragments identified in an embodiment of the present invention and size distribution of selected nucleic acid fragments at different positions and bases.
  • the upper panel is Accuracy
  • the lower panel is AUC (Area Under Curve). )am.
  • first, second, A, B, etc. may be used to describe various elements, but the elements are not limited by the above terms, and are merely used to distinguish one element from another. used only as For example, without departing from the scope of the technology described below, a first element may be referred to as a second element, and similarly, the second element may be referred to as a first element.
  • the terms and/or include any combination of a plurality of related recited items or any of a plurality of related recited items.
  • each component to be described below may be combined into one component, or one component may be divided into two or more for each more subdivided function.
  • each component to be described below may additionally perform some or all of the functions of other components in addition to its main function, and some of the main functions of each component may be performed by other components. Of course, it may be dedicated and performed by .
  • each process constituting the method may occur in a different order from the specified order unless a specific order is clearly described in context. That is, each process may occur in the same order as specified, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the reverse order.
  • the sequence analysis data obtained from the sample is aligned with the reference genome, and then, based on the aligned sequence information, the sequence relative frequency and size of the nucleic acid fragment for each position of the nucleic acid fragment are derived, and the position of the derived nucleic acid fragment is derived. It was intended to confirm that cancer diagnosis can be performed with high sensitivity and accuracy when the relative frequency of star sequences and the size information of nucleic acid fragments are input to the learned artificial intelligence model and then the XPI value is calculated and analyzed.
  • the optimal nucleic acid fragment After deriving the sequence relative frequency and size combination of nucleic acid fragments for each position of , the XPI value was calculated by learning it with a deep learning model, and a method for performing cancer diagnosis was developed by comparing it with the reference value (FIG. 1).
  • It relates to a method for providing information for cancer diagnosis using cell-free nucleic acid comprising the following steps:
  • the artificial intelligence model is characterized in that it is learned to distinguish between normal samples and cancer samples based on sequence relative frequency by position of nucleic acid fragments and size information of nucleic acid fragments.
  • the nucleic acid fragment can be used without limitation as long as it is a fragment of nucleic acid extracted from a biological sample, and preferably may be a fragment of cell-free nucleic acid or intracellular nucleic acid, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid fragment can be obtained by any method known to those skilled in the art, and is preferably directly sequenced, sequenced through next-generation sequencing, or non-specific whole genome amplification. ), or obtained through sequencing or probe-based sequencing, but is not limited thereto.
  • the cancer may be solid cancer or hematological cancer, preferably non-Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, acute myeloid leukemia, or acute lymphocytic leukemia.
  • acute-lymphoid leukemia multiple myeloma, head and neck cancer, lung cancer, glioblastoma, colon/rectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, melanoma, prostate cancer
  • It may be selected from the group consisting of liver cancer, thyroid cancer, gastric cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, bladder cancer, small intestine cancer, cervical cancer, cancer of unknown primary site, kidney cancer, esophageal cancer, neuroblastoma, and mesothelioma, more preferably neuroblastoma. It may be a blastoma, but is not limited thereto.
  • the step (a) is
  • the step of obtaining sequence information of step (a) may be characterized in that the isolated cell-free DNA is obtained through whole genome sequencing at a depth of 1 million to 100 million reads, but is not limited thereto. .
  • the biological sample refers to any material, biological fluid, tissue or cell obtained from or derived from an individual, for example, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear peripheral blood mononuclear cells, leukocyte buffy coat, blood (including plasma and serum), sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirates, breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, pelvic fluids, cyst fluids ( cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchi Bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, cell extract, hair, oral cells, placenta cells, cerebrospinal fluid ( cerebrospinal fluid) and mixtures thereof, but is not limited thereto.
  • cyst fluids cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid,
  • the term "reference group” is a reference group that can be compared like a standard sequencing database, and refers to a group of people who do not currently have a specific disease or condition.
  • the standard nucleotide sequence in the standard chromosome sequence database of the reference group may be a reference chromosome registered with a public health institution such as NCBI.
  • the nucleic acid in step (a) may be cell-free DNA, more preferably circulating tumor DNA, but is not limited thereto.
  • next-generation sequencer can be used with any sequencing method known in the art. Sequencing of nucleic acids isolated by selection methods is typically performed using next-generation sequencing (NGS).
  • Next-generation sequencing includes any sequencing method that determines the nucleotide sequence of an individual nucleic acid molecule or one of clonally expanded proxies for individual nucleic acid molecules in a highly similar manner (e.g., 105 or more molecules are sequenced simultaneously). do).
  • the relative abundance of a nucleic acid species in a library can be estimated by counting the relative number of occurrences of its cognate sequence in data generated by sequencing experiments. Next-generation sequencing methods are known in the art and are described, for example, in Metzker, M. (2010) Nature Biotechnology Reviews 11:31-46, incorporated herein by reference.
  • next-generation sequencing is performed to determine the nucleotide sequence of individual nucleic acid molecules (e.g., the HeliScope Gene Sequencing system from Helicos BioSciences and the Pacific Biosciences' HeliScope Gene Sequencing system). PacBio RS system).
  • sequencing e.g., massively parallel short-read sequencing that yields more bases of sequence per sequencing unit than other sequencing methods that yield fewer but longer reads (e.g., San Diego, Calif.)
  • the Illumina Inc. Solexa sequencer method determines the nucleotide sequence of clonally expanded proxies for individual nucleic acid molecules (e.g., Illumina Inc., San Diego, CA).
  • Solexa sequencer 454 Life Sciences (Branford, Connecticut) and Ion Torrent).
  • Other methods or machines for next-generation sequencing include, but are not limited to, 454 Life Sciences (Branford, CT), Applied Biosystems (Foster City, CA; SOLiD sequencers), Helicos Provided by Bioscience Corporation (Cambridge, MA) and emulsion and microfluidic sequencing technology nanodroplets (eg, GnuBio droplets).
  • Genome Sequencer FLX system from Roche/454
  • Illumina/Solexa Genome Analyzer GA
  • Life/APG's Support Oligonucleotide Ligation Detection SOLiD
  • Polonator's G.007 Hcos BioSciences' HeliScope Gene Sequencing system , Oxford Nanopore Technologies' PromethION, GriION, MinION system and Pacific Biosciences' PacBio RS system.
  • the sequence alignment in step (b) is a computer algorithm that evaluates the similarity between most of the lead sequences in the genome (eg, short-lead sequences from next-generation sequencing) and the reference sequence. It includes computational methods or approaches used for identification from cases likely to be derived by A variety of algorithms can be applied to sequence alignment problems. Some algorithms are relatively slow, but allow relatively high specificity. These include, for example, dynamic programming-based algorithms. Dynamic programming is a way to solve complex problems by breaking them down into simpler steps. Other approaches are relatively more efficient, but are typically less thorough. This includes, for example, heuristic algorithms and probabilistic methods designed for bulk database searches.
  • candidate screening reduces the search space for sequence alignments from the whole genome to a shorter enumeration of possible alignment positions.
  • Sequence alignment involves aligning sequences with sequences provided in the candidate screening step. This can be done using a global alignment (eg Needleman-Wunsch alignment) or a local alignment (eg Smith-Waterman alignment).
  • attribute sorting algorithms can be characterized as one of three types based indexing methods: hash tables (e.g. BLAST, ELAND, SOAP), suffix trees (e.g. Bowtie, BWA), and merge sort. (e.g. Slider) based algorithm. Short lead sequences are typically used for alignment.
  • hash tables e.g. BLAST, ELAND, SOAP
  • suffix trees e.g. Bowtie, BWA
  • merge sort. e.g. Slider
  • Short lead sequences are typically used for alignment.
  • the alignment step of step (b) is not limited thereto, but may be performed using the BWA algorithm and the Hg19 sequence.
  • the BWA algorithm may include BWA-ALN, BWA-SW or Bowtie2, but is not limited thereto.
  • the length of the sequence information (reads) in step (b) is 5 to 5000 bp, and the number of sequence information used may be 5,000 to 5 million, but is not limited thereto.
  • step (c) prior to performing step (c), it may be characterized in that it further comprises the step of selecting reads having a mapping quality score of the aligned nucleic acid fragments equal to or greater than a reference value, wherein the reference value is a value capable of confirming the quality of the aligned nucleic acid fragments without limitation, and is preferably 50 to 70 points, more preferably 60 points, but is not limited thereto.
  • the size of the nucleic acid fragment in step (c) is the number of bases from the 5' end to the 3' end of the nucleic acid fragment.
  • the size of the nucleic acid fragment in step (c) can be used without limitation as long as it can distinguish between healthy people and cancer patients, preferably 90 to 250 bp, more preferably 127-129 bp. , 137-139bp, 148-150bp, 156-158bp and 181-183bp, but may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • Reverse strand 3 ⁇ -ATGACTGAAACCTTA-5 ⁇ (SEQ ID NO: 2)
  • the sequence relative frequency by position of the nucleic acid fragments in step (c) is the total number of nucleic acid fragments having A, T, G, and C bases detected at each position in nucleic acid fragments of the same size. It may be characterized as a value normalized by the number of fragments.
  • the position of the nucleic acid fragment in step (c) may be characterized in that it is 1 to 10 bases from the 5' end of the nucleic acid fragment.
  • the sequence relative frequency by position of the nucleic acid fragment in step (c) is the frequency of A, T, G, and C bases at 1 to 5 positions from the 5' end of the nucleic acid fragment, Positions 6 to 10 can be characterized by the frequency of A bases.
  • the sequence relative frequency and size of the nucleic acid fragments for each position of the nucleic acid fragments in step (c) may be characterized in that one or more selected from those shown in Table 3, preferably Table 7 It may be the sequence relative frequency and nucleic acid fragment size by position of nucleic acid fragments from those listed to Top 1 to Top 5, more preferably sequence relative frequency and nucleic acid fragment size by position of nucleic acid fragments from those listed in Table 7 to Top 50. It may be the size of, and most preferably, the sequence relative frequency and size of the nucleic acid fragments for each position of the nucleic acid fragments up to Top 375.
  • the position of the nucleic acid fragment is defined based on the 5' end of the nucleic acid fragment.
  • the positions of the nucleic acid fragments from the 5' end of the forward strand of SEQ ID NO: 1 are For1, For2, ... It can have a value of For 15, and so does the reverse strand.
  • the For1 value of SEQ ID NO: 1 is T
  • the Rev1 value of the reverse strand is A.
  • the frequency of nucleotide sequences for each position of a nucleic acid fragment can be calculated in the following process.
  • the artificial intelligence model in step (d) can be used without limitation as long as it is a model capable of learning to distinguish between a healthy person and a cancer patient, and is preferably a machine learning model. .
  • the artificial intelligence model may be selected from the group consisting of AdaBoost, Random forest, Catboost, Light Gradient Boosting Model, and XGBoost, but is not limited thereto.
  • the loss function may be expressed by Equation 1 below.
  • the binary classification means that an artificial intelligence model learns to determine the presence or absence of cancer.
  • learning when the artificial intelligence model is XGBoost, learning may be performed including the following steps:
  • the training data is used when learning the XGBoost model
  • the validation data is used for hyper-parameter tuning verification
  • the test data is used for performance evaluation after producing the optimal model.
  • the hyper-parameter tuning process is a process of optimizing the values of various parameters (maximum depth of learner tree, number of learner trees, learning rate, etc.) constituting the XGBoost model.
  • Hyper-parameter tuning process includes Bayesian optimization and grid It may be characterized by using a search technique.
  • the learning process optimizes the internal parameters (weights) of the XGBoost model using predetermined hyper-parameters, and when the validation loss compared to the training loss starts to increase, it is determined that the model is overfitting, and before that, the model It may be characterized as stopping learning.
  • the result value analyzed from the sequence relative frequency and size information for each position of the nucleic acid fragment inputted by the artificial intelligence model in step d) can be used without limitation as long as it is a specific score or real number, preferably XPI (XGBoost Probability Index) value, but is not limited thereto.
  • the XGBoost Probability Index means a value expressed as a probability value by adjusting the output of the artificial intelligence model to a scale of 0 to 1.
  • learning is performed so that the XPI value becomes 1 in the case of cancer by using the sigmoid function. For example, if a neuroblastoma sample and a normal sample are input, the XPI value of the neuroblastoma sample is learned to be close to 1 and the normal sample to be close to 0.
  • the artificial intelligence model learns, if there is cancer, the output result learns close to 1, and if there is no cancer, the output result learns close to 0. , 0.5 or less, it was judged that there was no cancer and performance measurement was performed (training, validation, test accuracy).
  • the reference value of 0.5 is a value that can be changed at any time. For example, if you want to reduce false positives, you can strictly set the standard value higher than 0.5 to determine that you have cancer. You can take a little weaker standard that judges that there is.
  • a standard value can be determined by checking the probability of the XPI value by applying unseen data (data that knows the answer that has not been trained for learning) using the learned artificial intelligence model.
  • the present invention includes a decoding unit for decoding sequence information by extracting nucleic acids from a biological sample
  • an alignment unit that aligns the translated sequence with a standard chromosomal sequence database
  • nucleic acid fragment analyzer for deriving a sequence relative frequency and a size of the nucleic acid fragments for each position of the nucleic acid fragments based on the aligned sequences
  • a cancer diagnostic unit that inputs and analyzes the derived sequence relative frequency and nucleic acid fragment size information for each position of the nucleic acid fragments into the learned artificial intelligence model and compares them with reference values to determine whether or not there is cancer;
  • It relates to a cancer diagnosis device comprising a.
  • the decoding unit nucleic acid injection unit for injecting the extracted nucleic acid in an independent device; And it may include a sequence information analyzer for analyzing the sequence information of the injected nucleic acid, preferably an NGS analysis device, but is not limited thereto.
  • the decryption unit may be characterized in that it receives and decodes sequence information data generated in an independent device.
  • the present invention is a computer readable storage medium comprising instructions configured to be executed by a processor providing information for diagnosing cancer
  • the artificial intelligence model in step (d) is learned to distinguish between normal samples and cancer samples based on the sequence relative frequency of each position of the nucleic acid fragments and the size information of the nucleic acid fragments, wherein the information for diagnosing cancer It relates to a computer readable storage medium comprising instructions configured to be executed by a processor that provides.
  • the present invention relates to a method for diagnosing cancer using cell-free nucleic acid comprising the following steps:
  • the artificial intelligence model is characterized in that it is learned to distinguish between normal samples and cancer samples based on sequence relative frequency by position of nucleic acid fragments and size information of nucleic acid fragments.
  • a method according to the present disclosure may be implemented using a computer.
  • a computer includes one or more processors coupled to a chip set.
  • a memory, a storage device, a keyboard, a graphics adapter, a pointing device, and a network adapter are connected to the chipset.
  • the performance of the chipset is enabled by a memory controller hub and an I/O controller hub.
  • the memory may be used directly coupled to the processor instead of a chip set.
  • a storage device is any device capable of holding data, including a hard drive, compact disk read-only memory (CD-ROM), DVD, or other memory device. Memory is concerned with data and instructions used by the processor.
  • the pointing device may be a mouse, track ball or other type of pointing device, and is used in combination with a keyboard to transmit input data to a computer system.
  • the graphics adapter presents images and other information on a display.
  • the network adapter is connected to the computer system through a local area network or a long distance communication network.
  • the computer used herein is not limited to the above configuration, may not have some configurations, may include additional configurations, and may also be part of a storage area network (SAN), and the computer of the present application May be configured to be suitable for the execution of modules in the program for the execution of the method according to the present invention.
  • SAN storage area network
  • a module herein may mean a functional and structural combination of hardware for implementing the technical idea according to the present application and software for driving the hardware.
  • the module may mean a logical unit of a predetermined code and a hardware resource for executing the predetermined code, and does not necessarily mean a physically connected code or one type of hardware. is apparent to those skilled in the art.
  • the storage medium includes any medium that stores or transmits data in a form readable by a device such as a computer.
  • a computer readable medium may include Read Only Memory (ROM); random access memory (RAM); magnetic disk storage media; optical storage media; It includes flash memory devices and other electrical, optical or acoustic signal transmission media.
  • the position of the nucleic acid fragment was defined based on the 5' end of the nucleic acid fragment.
  • Example 1 Since the read obtained in Example 1 is a paired-end sequencing read and is 100 bp in length, the forward strand is For1, For2, ... from the 5' end. , the position up to For 100 was set, and in the reverse strand, from the 5' end, Rev1, Rev2, ... , the position up to Rev 100 was set.
  • the assembly of nucleic acid fragments was performed using the bamtobed -bedpe option of the bedtools program.
  • the entire nucleic acid fragment was divided into groups of nucleic acid fragments having the same size. For example, a group with a nucleic acid fragment size of 101, a group with a nucleic acid fragment size of 150, ... Groups of 200, etc.
  • the number of A, T, G, and C bases for each nucleic acid fragment position in each group was counted. For example, counting the number of bases for each position of a nucleic acid fragment in a population in which the size of the nucleic acid fragment is 120 can be summarized as shown in Table 1 below.
  • the position and nucleotide sequence of the nucleic acid fragment to be analyzed was fixed as (For1_A), and the following analysis was performed.
  • the X-axis of FIG. 3 represents the size of the nucleic acid fragment
  • the Y-axis represents the -log10(p) value.
  • the larger the Y-axis value the greater the difference between the healthy person and the neuroblastoma patient.
  • the (For1_A) frequency difference between healthy individuals and neuroblastomas widened significantly ( ⁇ log10(p) value peaked and went down) at a nucleic acid fragment size of about 10 cycles.
  • a total of 15 nucleic acid fragment sizes were selected by selecting nucleic acid fragment sizes that showed a common -log10 (p) peak in both datasets (127-129, 137-139, 148-150, 156-158, 181-183). selected.
  • Example 1 Since the data obtained in Example 1 is 100 PE data, a total of 200 nucleic acid fragment positions available for analysis are For1 to 100 and Rev1 to 100.
  • Figure 4 is a visualization of FESS_Table_120 in Table 2 in a heatmap format, and the relative frequency difference of A, T, G, and C base sequences according to position was observed only in some of the ends (For1 to 10, Rev1 to 10) indicated by dotted lines. It can be seen that the relative frequency of A, T, G, and C base sequences is repeated toward the end of the read ( ⁇ 100).
  • the relative frequency of sequences A, T, G, and C in For1 shows a significant difference from the relative frequencies of sequences A, T, G, and C in For2, but the relative frequencies of sequences A, T, G, and C in For11 and For99 It can be seen that the relative frequencies of the A, T, G, and C base sequences of and the relative frequencies of the A, T, G, and C base sequences of For100 are almost similar without significant differences.
  • (For1_A and Rev1_A), (For1_T and Rev1_T), (For1_G and Rev1_G), and (For1_C and Rev1_C) have similar relative frequency values, and in the same way (For2_A and Rev2_A), (For2_T and Rev2_T ), (For2_G and Rev2_G), and (For2_C and Rev2_C) have similar relative frequency values.
  • the relative frequency of four types of base sequences A, T, G, and C can be calculated.
  • relative frequencies of For1_A, For1_T, For1_G, and For1_C can be calculated at the location of For1.
  • additional selection was performed by confirming the similarity between nucleotide sequences at the same position. Base sequence selection by location was performed in the healthy population in the following manner.
  • nucleotide sequences A, T, G, and C were selected at For1-5 positions, and only A nucleotide sequences were selected as representative values among A, T, C, and G at For6-10 positions.
  • Nucleic acid fragment sizes 127, 128, 129, 137, 138, 139, 148, 149, 150, 156, 157, 158, 181, 182, 183. A total of 15 fragments.
  • Example 2 Using the relative frequency values of the 375 features selected in Example 2 as inputs, a machine learning model for classifying healthy people and patients with neuroblastoma was learned.
  • the machine learning algorithm used XGBoost.
  • the entire sample was divided into training, validation, and test data sets, and the training data set was used for model learning, the validation data set for hyper-parameter tuning, and the test data set for final model performance evaluation.
  • the number of samples for each set is as follows.
  • the hyper-parameter tuning process is a process of optimizing the values of various parameters (maximum depth of the learner tree, number of learner trees, learning rate, etc.) that make up the XGBoost model.
  • Bayesian optimization and grid search techniques were used in the hyper-parameter tuning process, and when the validation loss compared to the training loss started to increase, it was judged that the model was overfitting and model learning was stopped.
  • the performance of several models obtained through hyper-parameter tuning was compared using the validation data set, and among them, the model with the best validation data set performance was determined to be the best model, and the final performance evaluation was performed with the test data set. .
  • the relative frequency value vector of 375 features calculated from a random sample is input to the XGBoost model created through the above process, the probability of the sample being a healthy person or a patient with neuroblastoma is calculated, and these probability values are converted into XGBoost It was defined as the Probability Index (XPI).
  • the XPI value calculated from any sample was greater than 0.5, it was determined as a neuroblastoma patient, and if it was less than 0.5, it was determined as a healthy person.
  • Example 3 The performance of the XPI value output from the machine learning model built in Example 3 was tested. All samples were divided into Train, Validation, and Test groups, and models were built using the Train sample, and then the performance of the model created using the Train sample was verified using samples from the Validation and Test groups.
  • the X axis of FIG. 8 represents group (True label) information of actual samples
  • the Y axis represents the XPI values of a healthy person (Normal) and a neuroblastoma patient (NBT) day calculated by the machine learning model in order from the left.
  • the XPI distribution confirmed that healthy samples had the highest probability of being healthy in all of the Train, Validation, and Test data sets, and neuroblastoma patient samples had the highest probability of being liver cancer patients. confirmed to appear.
  • Example 3 A learning model was built in Example 3 using the features selected in Example 2, and when the XGB model was learned using each feature, the importance values of each feature are shown in Table 6 below.
  • the top 3 rows of Table 7 are the results of measuring performance by the Accuracy (ACC) method, and the bottom 3 rows are the results of measuring performance by the AUC method.
  • the composition of the train, valid, and test sets that measure ACC and AUC performance is the same.
  • the method for diagnosing cancer using the relative frequency and size of sequences for each position of cell-free nucleic acid fragments obtains information on the relative frequency and size of optimal sequences for each position of nucleic acid fragments and analyzes them using an AI algorithm, so even if the read coverage is low, the read coverage is high. It is useful to indicate sensitivity and accuracy.

Abstract

본 발명은 세포유리 핵산단편 말단 서열 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체시료에서 핵산을 추출하여, 서열정보를 획득하여 정렬한 리드를 기반으로 핵산단편의 말단 서열 빈도와 핵산단편의 크기를 도출한 다음, 이를 벡터화된 데이터로 생성한 후, 학습된 인공지능 모델에 입력하여 계산된 값을 분석하는 방법을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포유리 핵산단편 말단 서열 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법은 벡터화된 데이터를 생성하여 AI 알고리즘을 이용하여 분석하기 때문에 리드 커버리지가 낮더라도 높은 민감도와 정확도를 나타내어 유용하다.

Description

세포유리 핵산단편 위치별 서열 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법
본 발명은 세포유리 핵산단편 위치별 서열 상대 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체시료에서 핵산을 추출하여, 서열정보를 획득하여 정렬한 리드를 기반으로 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도와 핵산단편의 크기를 도출한 다음, 이를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 계산된 값을 분석하는 방법을 이용한 암 진단 방법에 관한 것이다.
임상에서의 암 진단은 통상적으로 병력 조사, 물리적 검사 및 임상적 평가 후 조직 생검(tissue biopsy)을 수행 하여 확인하고 있다. 임상 실험에 의한 암 진단은 암 세포의 수가 10억 개 이상이고 암의 직경이 1cm 이상일 경우에만 가능하다. 이 경우, 암 세포는 이미 전이능력을 가지고 있으며, 적어도 이들 중 반은 이미 전이된 상태이다. 또한, 조직생검은 침습적이어서 환자에게 상당한 불편함을 주고, 암 환자를 치료하다 보면 조직생검을 수행할 수 없는 경우도 자주 있다는 문제점이 있다. 이외에, 암 스크리닝에 있어서 암으로부터 직접 또는 간접적으로 생산되는 물질을 모니터링하기 위한 종양 마커가 사용되고 있지만, 암이 존재하는 경우에도 종양 마커 스크리닝 결과 반 이상이 정상으로 나타나고, 암이 없는 경우에도 자주 양성으로 나타나기 때문에, 그 정확성에 한계가 있다.
이와 같은 통상적인 암 진단 방법의 문제점을 보완할 만한 비교적 간편하고 비침습적이며 높은 민감도 및 특이도를 가진 암 진단 방법의 요구에 따라, 최근 암의 진단, 추적 검사로 환자의 체액을 활용하는 액상생검(liquid biopsy)이 많이 이용되고 있다. 액상생검은 비침습적(non-invasive)인 방법으로, 기존의 침습적인 진단 및 검사방법의 대안으로 주목 받고 있는 진단기술이다.
최근에는 액상생검에서 획득한 세포 유리 DNA (cell free DNA)을 이용하여 암 진단 및 암 종 감별을 수행하는 방법이 개발되고 있으며(US 10975431, Zhou, Xionghui et al., bioRxiv, 2020.07.16.201350), 특히, 세포 유리 핵산 말단 서열의 모티프 빈도 정보를 분석하여 암 진단, 산전진단 또는 장기이식 모니터링에 이용하는 방법이 알려져 있다(WO 2020-125709, Peiyong Jiang et al., cancer discovery, Vol. 10, 2020, pp. 664-673).
한편, Gradient Boosting Algorithm (GBM)은 회귀분석 또는 분류 분석을 수행할 수 있는 예측모형이며 예측모형의 앙상블 방법론 중 부스팅 계열에 속하는 알고리즘이다. Gradient Boosting Algorithm은 Tabular format 데이터 (엑셀형태와 같이 X-Y Grid로 되어있는 데이터)에 대한 예측에서 엄청난 성능을 보여주고, 머신러닝 알고리즘 중에서도 가장 예측 성능이 높다고 알려진 알고리즘이다.
이러한 Gradient Boosting Algorithm을 이용하여 바이오 분야에 활용하는 다양한 문헌(Daping Yu et al., Thoracic Cancer Vol. 11, pp. 95-102. 2020, KR 10-2061800, KR 10- 2108050, KR 10-2021-0081547)이 존재하고 있으나, 혈액 내 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA)의 서열분석 정보를 기반으로 GBM을 통해 암을 진단하는 방법에 대해서는 연구가 부족한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, 높은 민감도와 정확도의인공지능 기반 암 진단방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 무세포 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도와 핵산단편의 크기 정보를 기반으로 최적의 서열 상대 빈도 및 크기 조합을 선별하고, 이를 학습된 인공지능 모델로 분석할 경우, 높은 민감도와 정확도로 암 진단을 수행할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 세포유리 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 크기를 이용한 암 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포유리 핵산단편 위치별 서열 상대 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 암 진단을 수행하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)를 이용하여 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 단계; 및 (d) 도출된 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 암을 진단하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계에 있어서, 상기 인공지능 모델은 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 기반으로 정상 샘플과 암 샘플을 구별하도록 학습된 것을 특징으로 하는 무세포 핵산을 이용한 암 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열 기반의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 핵산단편 분석부; 및 도출된 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값과 비교하여 암 유무를 판정하는 암 진단부; 를 포함하는 암 진단 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)를 이용하여 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 단계; 및 (d) 도출된 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 암을 진단하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계에 있어서, 상기 (d) 단계의 인공지능 모델은 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 기반으로 정상 샘플과 암 샘플을 구별하도록 학습된 것을 특징으로 하는 단계를 통하여, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)를 이용하여 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 단계; 및 (d) 도출된 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 암을 진단하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계에 있어서, 상기 인공지능 모델은 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 기반으로 정상 샘플과 암 샘플을 구별하도록 학습된 것을 특징으로 하는 무세포 핵산을 이용한 암 진단방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 세포유리 핵산단편 위치별 서열 상대 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법을 수행하기 위한 전체 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 건강인과 암 환자 사이에서 크기별로 상대 빈도가 통계적으로 유의미하게 차이가 있는 핵산단편 크기를 선별하는 과정의 예시이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 확인한 핵산단편들의 크기별 상대 빈도의 통계값과 선별한 핵산단편들의 크기 분포를 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 제작한 FESS table을 heatmap 형식으로 시각화한 것이다.
도 5의 왼쪽 패널은 도 4의 점선으로 표시된 부분을 확대한 것이고, 오른쪽 두 패널은 위치별 염기 서열의 상대 빈도를 통계적으로 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 선별한 핵산단편의 위치에서 A, T, G, C 각 염기 서열의 상대 빈도를 계산하여 각각의 염기 서열 사이의 유사성을 통계적으로 확인한 결과이다.
도 7의 (A)는 본 발명의 일 실시예에서 구축한 머신러닝 모델의 성능을 Accuracy와 AUC로 확인한 결과이며, (B)는 혼동행렬(confusion matrix)이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 구축한 머신러닝 모델에서 예측한 건강인 및 신경모세포종 환자의 확률값이 실제 환자와 얼마나 일치하는 지를 머신러닝 모델이 출력한 XPI 값의 분포를 통해 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 확인한 핵산단편들의 크기별 상대 빈도의 통계값과 선별한 핵산단편들의 크기 분포를 서로 다른 위치와 염기에서 확인한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 선별한 feature의 중요도에 따라 소수의 feature로 구축한 머신러닝 모델의 성능을 확인한 결과로서, 윗 패널은 정확도(Accuracy)이고, 아래 패널은 AUC(Area Under Curve)이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
제1, 제2, A, B 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않으며, 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 이하 설명하는 기술의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 해석되지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함한다" 등의 용어는 설시된 특징, 개수, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 의미하는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 개수, 단계 동작 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도면에 대한 상세한 설명을 하기에 앞서, 본 명세서에서의 구성부들에 대한 구분은 각 구성부가 담당하는 주기능 별로 구분한 것에 불과함을 명확히 하고자 한다. 즉, 이하에서 설명할 2개 이상의 구성부가 하나의 구성부로 합쳐지거나 또는 하나의 구성부가 보다 세분화된 기능별로 2개 이상으로 분화되어 구비될 수도 있다. 그리고 이하에서 설명할 구성부 각각은 자신이 담당하는 주기능 이외에도 다른 구성부가 담당하는 기능 중 일부 또는 전부의 기능을 추가적으로 수행할 수도 있으며, 구성부 각각이 담당하는 주기능 중 일부 기능이 다른 구성부에 의해 전담되어 수행될 수도 있음은 물론이다.
또, 방법 또는 동작 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 발명에서는, 샘플에서 획득한 서열 분석 데이터를 참조 유전체에 정렬한 다음, 정렬된 서열정보를 기반으로 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하고, 상기 도출된 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 학습된 인공지능 모델 입력한 다음, XPI값을 계산하여 분석할 경우, 높은 민감도와 정확도로 암 진단을 수행할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 혈액에서 추출한 DNA를 시퀀싱 한 뒤, 참조 염색체에 정렬한 다음, 이를 이용하여 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하고, 최적의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 조합을 도출한 다음, 이를 딥러닝 모델에 학습시켜 XPI 값을 계산하였으며, 이를 기준값과 비교하여 암 진단을 수행하는 방법을 개발하였다(도 1)
따라서, 본 발명은 일관점에서,
다음의 단계를 포함하는 무세포 핵산을 이용한 암 진단을 위한 정보의제공방법에 관한 것이다:
(a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
(b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
(c) 상기 정렬된 서열정보(reads)를 이용하여 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 단계; 및
(d) 도출된 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 암을 진단하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계에 있어서,
상기 인공지능 모델은 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 기반으로 정상 샘플과 암 샘플을 구별하도록 학습된 것을 특징으로 함.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 단편은 생체시료에서 추출한 핵산의 조각이면 제한없이 이용할 수 있으며, 바람직하게는 세포 유리 핵산 또는 세포 내 핵산의 조각일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 단편은 통상의 기술자에게 알려진 모든 방법으로 얻을 수 있으며, 바람직하게는 직접 서열분석하거나, 차세대 염기서열 분석을 통해 서열분석하거나 또는 비특이적 전장 유전체 증폭(non-specific whole genome amplification)을 통해 서열분석하여 얻거나, 프로브 기반 서열분석을 통해 얻을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 바람직하게는 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 급성 골수성 백혈병 (acute-myeloid leukemia), 급성 림프구성 백혈병 (acute-lymphoid leukemia), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 경부암 (head and neck cancer), 폐암, 교모세포종 (glioblastoma), 대장/직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 흑색종 (melanoma), 전립선암, 간암, 갑상선암, 위암, 담낭암, 담도암, 방광암, 소장암, 자궁경부암, 원발부위불명암, 신장암, 식도암, 신경모세포종 및 중피종 (mesothelioma)으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 신경모세포종일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서,
상기 (a) 단계는
(a-i) 생체시료에서 핵산을 수득하는 단계;
(a-ii) 채취된 핵산에서 솔팅-아웃 방법(salting-out method), 컬럼 크로마토그래피 방법(column chromatography method) 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
(a-iii) 정제된 핵산 또는 효소적 절단, 분쇄, 수압 절단 방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)된 핵산에 대하여, 싱글 엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어 엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
(a-iv) 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
(a-v) 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 (a) 단계의 서열정보를 획득하는 단계는 분리된 무세포 DNA를 1백만 내지 1억 리드 깊이로 전장 유전체 시퀀싱을 통해 획득하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생체시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), (혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는) 혈액, 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract), 모발, 구강세포, 태반세포, 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 및 이의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, ”참조집단”은 표준 염기서열 데이터베이스와 같이 비교할 수 있는 기준(reference) 집단으로, 현재 특정 질환 또는 병증이 없는 사람의 집단을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에서 표준 염기서열은 NCBI 등의 공공보건기관에 등록되어 있는 참조 염색체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 핵산은 무세포 DNA 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 순환종양세포 DNA(circulating tumor DNA) 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)는 당업계에 공지된 임의의 시퀀싱 방법으로 사용될 수 있다. 선택 방법에 의해 분리된 핵산의 시퀀싱은 전형적으로는 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 수행된다. 차세대 시퀀싱은 개개의 핵산 분자 또는 고도로 유사한 방식으로 개개의 핵산 분자에 대해 클론으로 확장된 프록시 중 하나의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 임의의 시퀀싱 방법을 포함한다(예를 들어, 105개 이상의 분자가 동시에 시퀀싱된다). 일 실시형태에서, 라이브러리 내 핵산 종의 상대적 존재비는 시퀀싱 실험에 의해 만들어진 데이터에서 그것의 동족 서열의 상대적 발생 수를 계측함으로써 추정될 수 있다. 차세대 시퀀싱 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 본 명세서에 참조로서 포함된 문헌(Metzker, M. (2010) Nature Biotechnology Reviews 11:31-46)에 기재된다.
일 실시형태에서, 차세대 시퀀싱은 개개의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 한다(예를 들어, 헬리코스 바이오사이언스(Helicos BioSciences)의 헬리스코프 유전자 시퀀싱 시스템(HeliScope Gene Sequencing system) 및 퍼시픽바이오사이언스의 팩바이오 알에스 시스템(PacBio RS system)). 다른 실시형태에서, 시퀀싱, 예를 들어, 더 적지만 더 긴 리드를 만들어내는 다른 시퀀싱 방법보다 시퀀싱 단위 당 서열의 더 많은 염기를 만들어내는 대량병렬의 짧은-리드 시퀀싱(예를 들어, 캘리포니아주 샌디에고에 소재한 일루미나 인코포레이티드(Illumina Inc.) 솔렉사 시퀀서(Solexa sequencer)) 방법은 개개의 핵산 분자에 대해 클론으로 확장된 프록시의 뉴클레오타이드 서열을 결정한다(예를 들어, 캘리포니아주 샌디에고에 소재한 일루미나 인코포레이티드(Illumina Inc.) 솔렉사 시퀀서(Solexa sequencer); 454 라이프 사이언스(Life Sciences)(코네티컷주 브랜포드에 소재) 및 아이온 토렌트(Ion Torrent)). 차세대 시퀀싱을 위한 다른 방법 또는 기계는, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 454 라이프 사이언스(Life Sciences)(코네티컷주 브랜포드에 소재), 어플라이드 바이오시스템스(캘리포니아주 포스터 시티에 소재; SOLiD 시퀀서), 헬리코스 바이오사이언스 코포레이션(매사추세츠주 캠브릿지에 소재) 및 에멀젼 및 마이크로 유동 시퀀싱 기법 나노 점적(예를 들어, 지누바이오(GnuBio) 점적)에 의해 제공된다.
차세대 시퀀싱을 위한 플랫폼은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 로슈(Roche)/454의 게놈 시퀀서(Genome Sequencer: GS) FLX 시스템, 일루미나(Illumina)/솔렉사(Solexa) 게놈 분석기(Genome Analyzer: GA), 라이프(Life)/APG의 서포트 올리고(Support Oligonucleotide Ligation Detection: SOLiD) 시스템, 폴로네이터(Polonator)의 G.007 시스템, 헬리코스 바이오사이언스의 헬리스코프 유전자 시퀀싱 시스템(Helicos BioSciences' HeliScope Gene Sequencing system), 옥스포드 나노포어 테크놀로지스(Oxford Nanopore Technologies)의 PromethION, GriION, MinION 시스템 및 퍼시픽 바이오사이언스(Pacific Biosciences)의 팩바이오알에스(PacBio RS) 시스템을 포함한다.
본 발명에서, 상기 (b) 단계의 서열 정렬은 컴퓨터 알고리즘으로서 게놈에서 리드 서열(예를 들어, 차세대 시퀀싱으로부터의, 예를 들어 짧은-리드 서열)이 대부분 리드 서열과 기준 서열 사이의 유사성을 평가함으로써 유래될 가능성이 있는 경우로부터 동일성에 대해 사용되는 컴퓨터적 방법 또는 접근을 포함한다. 서열 정렬 문제에 다양한 알고리즘이 적용될 수 있다. 일부 알고리즘은 상대적으로 느리지만, 상대적으로 높은 특이성을 허용한다. 이들은, 예를 들어 역동적 프로그래밍-기반 알고리즘을 포함한다. 역동적 프로그래밍은 그것들이 더 간단한 단계로 나누어짐으로써 복잡한 문제를 해결하는 방법이다. 다른 접근은 상대적으로 더 효율적이지만, 전형적으로 철저하지 않다. 이는, 예를 들어 대량 데이터베이스 검색을 위해 설계된 휴리스틱(heuristic) 알고리즘 및 확률적(probabilistic) 방법을 포함한다.
전형적으로, 정렬 과정에 두 단계가 있을 수 있다: 후보자 검사 및 서열 정렬. 후보자 검사는 가능한 정렬 위치의 더 짧은 열거에 대해 전체 게놈으로부터 서열 정렬을 위한 검색 공간을 감소시킨다. 용어가 시사하는 바와 같이 서열 정렬은 후보자 검사 단계에 제공된 서열을 갖는 서열을 정렬시키는 단계를 포함한다. 이는 광역 정렬(예를 들어, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 정렬) 또는 국소 정렬(예를 들어, 스미스-워터만 정렬)을 사용하여 수행될 수 있다.
대부분의 속성 정렬 알고리즘은 색인 방법에 기반한 3가지 유형 중 하나를 특징으로 할 수 있다: 해쉬 테이블(예를 들어, BLAST, ELAND, SOAP), 접미사트리(예를 들어, Bowtie, BWA) 및 병합 정렬(예를 들어, 슬라이더(Slider))에 기반한 알고리즘. 짧은 리드 서열은 정렬을 위해 전형적으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 정렬단계는 이에 제한되지는 않으나, BWA 알고리즘 및 Hg19 서열을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 BWA 알고리즘은 BWA-ALN, BWA-SW 또는 Bowtie2 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 서열정보(reads)의 길이는, 5 내지 5000 bp이고, 사용하는 서열정보의 수는 5천 내지 500만개가 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계를 수행하기에 앞서 정렬된 핵산 단편의 정렬 일치도 점수(mapping quality score)가 기준값 이상인 리드를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 기준값은 정렬된 핵산 단편의 퀄리티를 확인할 수 있는 값이면 제한없이 이용가능하여, 바람직하게는 50 내지 70점, 더욱 바람직하게는 60점인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 (c) 단계의 핵산단편의 크기는 핵산단편의 5’ 말단에서 3’ 말단까지의 염기 개수이다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산단편의 크기는 건강인과 암 환자를 구분할 수 있는 크기이면 제한없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 90 내지 250bp일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 127-129bp, 137-139bp, 148-150bp, 156-158bp 및 181-183bp로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 하기와 같이 페어드-엔드 시퀀싱에 의해 서열 분석된 핵산단편이 있을 시,
Forward strand: 5`-TACAGACTTTGGAAT-3` (서열번호 1)
Reverse strand: 3`-ATGACTGAAACCTTA-5` (서열번호 2)
Forward strand 5` 말단에서부터 3’ 말단까지의 염기 개수인 15가 상기 핵산단편의 크기 값이 된다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도는 동일한 크기의 핵산단편에서, 각각의 위치에서 검출되는 A, T, G, C 염기를 가지는 핵산단편의 수를 전체 핵산 단편 수로 정규화한 값인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산단편의 위치는 핵산단편의 5’ 말단에서 1 내지 10개 염기인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도는 핵산단편의 위치는 핵산단편의 5’ 말단에서 1 내지 5개 위치에서는 A, T, G 및 C 염기의 빈도이며, 6 내지 10개 위치에서는 A 염기의 빈도인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기는 표 3에 기재된 것에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 표 7에 기재된 것에서 Top 1 내지 Top 5까지의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 표 7에 기재된 것에서 Top 50까지의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기일 수 있고, 가장 바람직하게는 Top 375까지의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기일 수 있다.
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000001
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000002
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000003
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000004
본 발명에서, 핵산단편의 위치는 핵산단편의 5’ 말단을 기준으로 정의된다.
예를 들어, 상기 서열번호 1의 forward strand의 5’ 말단에서부터 핵산단편의 위치는 For1, For2, … For 15의 값을 가질 수 있고, reverse strand도 마찬가지이다. 상기 서열번호 1의 For1 값은 T이고, reverse strand의 Rev1 값은 A이다.
본 발명에서, 핵산단편의 위치별 염기서열의 빈도는 하기와 같은 과정으로 계산할 수 있다.
a) 전체 핵산 단편을 동일한 크기를 갖는 핵산 단편 집단으로 구분하는 단계;
b) 각 그룹 내에서 핵산 단편 위치 별 A, T, G, C 염기의 개수를 계수하는 단계; 및
c) 수식 2를 이용하여 핵산 단편 위치 별 염기의 개수를 정규화하는 단계.
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000005
본 발명에 있어서, 상기 수식 2의 size와 position 및 염기는 정규화하고자 하는 크기, 위치 및 염기에 따라 달라진 다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 인공지능 모델은 건강인과 암 환자를 구별할 수 있도록 학습할 수 있는 모델이면 제한없이 사용가능하며, 바람직하게는 머신러닝 모델인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인공지능 모델은 AdaBoost, Random forest, Catboost, Light Gradient Boosting Model 및 XGBoost로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 인공지능 모델이 XGBoost이고, binary classification 을 학습할 경우, 손실함수는 하기 수식 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000006
본 발명에서, 상기 binary classification은 인공지능 모델이 암 유무를 판별하도록 학습하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 인공지능 모델이 XGBoost일 경우, 학습은 하기 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다:
i) 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 training(학습), validation(검증), test(성능평가) 데이터로 분류하는 단계;
이 때, Training 데이터는 XGBoost 모델을 학습할 때 사용되고, Validation 데이터는 hyper-parameter tuning 검증에 사용되며, Test 데이터는 최적의 모델 생산 후, 성능 평가로 사용되는 것을 특징으로 함.
ii) Hyper-parameter tuning 및 학습 과정을 통해서 최적의 XGBoost 모델을 구축하는 단계;
iii) Hyper-parameter tuning을 통해서 얻어진 여러 모델의 성능을 validation data를 이용하여 비교하여, validation data 성능이 가장 좋은 모델을 최적의 모델로 결정하는 단계;
본 발명에서, 상기 Hyper-parameter tuning 과정은 XGBoost 모델을 이루는 여러 parameter(learner tree의 최대 깊이, learner tree의 개수, learning rate 등) 값을 최적화 하는 과정으로 Hyper-parameter tuning 과정으로는 Bayesian optimization 및 grid search 기법을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 학습 과정은 정해진 hyper-parameter들을 이용하여 XGBoost 모델의 내부 parameter(weights)들을 최적화 시켜, Training loss 대비 validation loss가 증가하기 시작하면 모델이 과적합(Overfitting) 되었다 판단하고, 그전에 model 학습을 중단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 d) 단계에서 인공지능 모델이 입력된 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 크기 정보로부터 분석한 결과값은 특정 score 또는 실수이면 제한없이 이용가능하며, 바람직하게는 XPI(XGBoost Probability Index) 값인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, XGBoost Probability Index는 인공지능 모델의 output을 0 ~ 1 scale로 조정하여 확률값으로 표현한 값을 의미한다.
Binary classification일 경우에는 sigmoid function을 이용하여 암 일 경우 XPI 값이 1이 되게끔 학습을 하게 된다. 예를 들어, 신경모세포종 샘플과 정상 샘플이 입력되면, 신경모세포종 샘플의 XPI 값이 1에 가깝도록, 그리고 정상 샘플은 0에 가깝도록 학습하는 것이다.
본 발명에서, 상기 인공지능 모델은 학습할 때, 암이 있으면 output 결과가 1에 가깝게 학습하고, 암이 없으면 output 결과가 0에 가깝게 학습을 시켜서, 0.5를 기준으로 0.5 이상이면 암이 있다고 판단하고, 0.5 이하이면 암이 없다고 판단하여 performance 측정을 수행하였다(Training, validation, test accuracy).
여기서, 0.5의 기준값은 언제든지 바뀔 수 있는 값이라는 것은 통상의 기술자에게 자명한 것이다. 예를 들어서 False positive(위양성)를 줄이고자 하면, 0.5보다 높은 기준값을 설정하여 암이 있다고 판단되는 기준을 엄격하게 가져 갈 수 있고, False Negative(위음성)를 줄이고자 하면 기준값을 더 낮게 측정하여 암이 있다고 판단되는 기준을 조금 더 약하게 가져 갈 수 있다.
가장 바람직하게는 학습된 인공지능 모델을 이용하여 unseen data(학습에 training하지 않은 답을 알고 있는 data)를 적용시켜서, XPI값의 probability를 확인하여 기준값을 정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 해독하는 해독부;
해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부;
정렬된 서열 기반의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 핵산단편 분석부; 및
도출된 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값과 비교하여 암 유무를 판정하는 암 진단부;
를 포함하는 암 진단 장치에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 해독부는 독립된 장치에서 추출된 핵산을 주입하는 핵산 주입부; 및 주입된 핵산의 서열정보를 분석하는 서열정보 분석부를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 NGS 분석 장치일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 해독부는 독립된 장치에서 생성된 서열정보 데이터를 수신하여 해독하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되,
(a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
(b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
(c) 상기 정렬된 서열정보(reads)를 이용하여 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 단계; 및
(d) 도출된 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 암을 진단하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계에 있어서,
상기 (d) 단계의 인공지능 모델은 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 기반으로 정상 샘플과 암 샘플을 구별하도록 학습된 것을 특징으로 하는 단계를 통하여, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 무세포 핵산을 이용한 암 진단방법에 관한 것이다:
(a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
(b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
(c) 상기 정렬된 서열정보(reads)를 이용하여 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 단계; 및
(d) 도출된 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 암을 진단하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계에 있어서,
상기 인공지능 모델은 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 기반으로 정상 샘플과 암 샘플을 구별하도록 학습된 것을 특징으로 함.
다른 양태에서 본원에 따른 방법은 컴퓨터를 이용하여 구현될 수 있다. 일 구현예에서, 컴퓨터는 칩 세트에 연결된 하나 이상의 프로세서를 포함한다. 또한 칩 세트에는 메모리, 저장 장치, 키보드, 그래픽 어댑터(Graphics Adapter), 포인팅 장치(Pointing Device) 및 네트워크 어댑터(Network Adapter) 등이 연결되어 있다. 일 구현예에서, 상기 칩 세트의 성능은 메모리 컨트롤러 허브(Memory Controller Hub) 및 I/O 컨트롤러 허브에 의하여 가능하다. 다른 구현예에서, 상기 메모리는 칩 세트 대신에 프로세서에 직접 연결되어 사용될 수 있다. 저장 장치는 하드 드라이브, CD-ROM(Compact Disk Read-Only Memory), DVD 또는 기타 메모리 장치를 포함하는 데이터를 유지할 수 있는 임의의 장치이다. 메모리는 프로세서에 의하여 사용된 데이터 및 명령에 관여한다. 상기 포인팅 디바이스는 마우스, 트랙볼 (Track Ball) 또는 다른 유형의 포인팅 디바이스일 수 있고, 키보드와 조합하여 입력 데이터를 컴퓨터 시스템으로 전송하는데 사용된다. 상기 그래픽 어댑터는 디스플레이 상에서 이미지 및 다른 정보를 나타낸다. 상기 네트워크 어댑터는 근거리 또는 장거리 통신망으로 컴퓨터 시스템과 연결된다. 본원에 사용되는 컴퓨터는 하지만 위와 같은 구성으로 제한되는 것은 아니고, 일부 구성이 없거나, 추가의 구성을 포함 할 수 있으며, 또한 저장장치영역네트워크(Storage Area Network, SAN)의 일부일 수 있으며, 본원의 컴퓨터는 본원에 따른 방법의 수행을 위한 프로그램에 모듈의 실행에 적합하도록 구성될 수 있다.
본원에서 모듈이라 함은, 본원에 따른 기술적 사상을 수행하기 위한 하드웨어 및 상기 하드웨어를 구동하기 위한 소프트웨어의 기능적, 구조적 결합을 의미할 수 있다. 예컨대, 상기 모듈은 소정의 코드와 상기 소정의 코드가 수행되기 위한 하드웨어 리소스(Resource)의 논리적인 단위를 의미할 수 있으며, 반드시 물리적으로 연결된 코드를 의미하거나, 한 종류의 하드웨어를 의미하는 것은 아님은 본원 기술분야의 당업자에게 자명한 것이다.
본원에 따른 방법은 하드웨어, 펌웨어, 또는 소프트웨어 또는 이들의 조합으로 구현될 수 있다. 소트프웨어로 구현되는 경우 저장매체는 컴퓨터와 같은 장치에 의해 판독가능한 형태의 저장 또는 전달하는 임의의 매체를 포함한다. 예를 들면 컴퓨터 판독가능한 매체는 ROM(Read Only Memory); RAM(Random Access Memory); 자기디스크 저장 매체; 광저장 매체; 플래쉬 메모리 장치 및 기타 전기적, 광학적 또는 음향적 신호 전달 매체 등을 포함한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 혈액에서 DNA를 추출하여, 차세대 염기서열 분석 수행
건강인 202명 및 신경모세포종 환자 61명의 혈액을 10mL씩 채취하여 EDTA Tube에 보관하였으며, 채취 후 2시간 이내에 1200g, 4℃, 15분의 조건으로 혈장 부분만 1차 원심분리한 다음, 1차 원심분리된 혈장을 16000g, 4℃, 10분의 조건으로 2차 원심분리하여 침전물을 제외한 혈장 상층액을 분리하였다. 분리된 혈장에 대해, Chemagic ccfNA 2K Kit (chemagen)을 사용하여 cell-free DNA를 추출하고, MGIEasy cell-free DNA library prep set kit 를 사용하여 library preparation 과정을 수행 한 다음, DNBseq G400 장비 (MGI) 를 100 base Paired end 모드로 sequencing 하였다. 그 결과, 샘플 당 약 170 million 개의 reads가 생산되는 것을 확인 하였다.
실시예 2. 최적의 핵산단편 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편 크기 선별
2-1. 핵산단편 위치와 염기서열의 상대 빈도 정의 및 측정
핵산단편의 위치는 핵산단편의 5’ 말단을 기준으로 정의하였다.
실시예 1에서 수득한 리드는 paired-end sequencing read이고, 100bp 길이이므로, forward strand는 5’ 말단에서부터 For1, For2, …, For 100까지의 위치를 설정하였고, Reverser strand에서도 5’ 말단에서부터 Rev1, Rev2, …, Rev 100까지의 위치를 설정하였다. 핵산단편의 조립은 bedtools 프로그램의 bamtobed -bedpe 옵션을 사용하였다.
핵산단편의 위치별 염기서열의 상대 빈도를 구하는 과정을 간략히 설명하자면 먼저, 실시예 1에서 생산한 약 170M read 정도의 시퀀싱 데이터에서, 임의로 17M read를 선별하여 downsampling 한 다음, QC filtering를 수행하고, Size, position, base (ex, Size120_For1_A) 조합을 만족하는 fragment 수 계수한 뒤, 위의 3 QC filtering 후에 남아 있는 전체 시퀀싱 read 수로 나누어 normalization을 수행한 것이다.
보다 구체적으로는 하기의 방법으로 수행하였다.
1. 전체 핵산 단편을 동일한 크기를 갖는 핵산 단편 집단으로 구분하였다. 예를 들어, 핵산 단편 크기가 101인 그룹, 150인 그룹, … 200인 그룹 등.
2. 각 그룹 내에서 핵산 단편 위치 별 A, T, G, C 염기의 개수를 계수하였다. 예를 들어, 핵산 단편의 크기가 120인 집단에서의 핵산 단편 위치 별 염기의 수를 계수하면 아래 표 1과 같이 정리할 수 있다.
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000007
위의 표를 해석해 보면, 크기가 120이었던 핵산 단편은 총 23,135 개가 있었고, 그 중 For1 위치에 A, T, G, C 염기를 갖고 있던 핵산 단편이 각각 5,683개, 4,680개, 4,194개, 8,566개 있다는 것을 의미한다.
3. 위의 과정으로 핵산 단편 위치 별 염기의 개수를 계수한 후, 시퀀싱 된 전체 리드 수 (핵산 단편 크기 구분 없이, 생산된 분석 대상의 모든 리드 수. 실시예 1에서는 15,063,130 개)로 나누어 수식 2로 정규화(Normalization) 하여, 아래 표 2(FESS_Table_120)와 같이 상대 빈도를 계산한 FESS(Fragment End Seuqnece frequency and Size) table을 제작하였다.
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000008
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000009
4. N (시퀀싱 에러, 낮은 퀄리티 등의 이유로 염기 서열 측정 불가했던 경우) 값의 상대 빈도는 계산하지 않았다.
2-2. 최적의 핵산단편 크기 선별
분석 대상 핵산 단편의 위치와 염기 서열을 (For1_A)로 고정하고 아래 분석을 진행하였다.
1. 핵산 단편 크기를 1씩 변화시켜가면서 건강인과 신경모세포종 환자군 사이에서 (For1_A)의 상대 빈도 분포 차이가 있는지를 Kruskal-Wallis Test를 이용하여 통계적으로 확인하였다. 즉, 도 2에 기재된 바와 같이, 크기가 118인 핵산 단편 집단에서는 (For1_A)의 상대 빈도가 건강인보다 신경포세포종 환자군에서 통계적으로 유의미한 수준으로 높게 분포하는 것을 확인할 수 있다. 같은 방법으로, 크기가 168인 핵산 단편 집단에서는 (For1_A)의 상대 빈도가 두 집단에서 큰 차이 없이 분포하는 것을 확인할 수 있으며, 크기가 185인 핵산 단편 집단에서는 (For1_A)의 상대 빈도가 건강인 에서 신경모세포종 환자군보다 통계적으로 유의미한 수준으로 낮게 분포하는 것을 확인할 수 있다.
2. 이러한 방법으로 으로 핵산 단편 크기를 101에서 200까지 변화시켜가면서 건강인과 신경모세포종 사이의 (For1_A) 상대 빈도 차이를 통계적으로(p-value) 확인하였다.
그 결과, 도 3의 X축은 핵산 단편의 크기를, Y 축은 -log10(p) 값을 나타내는데, Y 축 값이 클수록 건강인과 신경포세포종 환자 사이에서 차이가 크다는 것을 의미한다. 도 3에 기재된 바와 같이, 10 정도의 핵산 단편 크기를 주기로 하여 건강인과 신경모세포종 사이에 (For1_A) 빈도 차이가 크게 벌어지는 (-log10(p) 값이 peak를 찍고 내려가는) 것을 확인하였다.
또한, 이러한 패턴이 Training Dataset 뿐만 아니라, 독립된 Validation Dataset에서도 동일하게 반복되는 것으로 보아, 초록색으로 표시한 핵산 단편 크기들이 Training Dataset에 overfitting 된 우연한 패턴이 아닌 것을 확인할 수 있습니다.
두 Dataset에서 공통적으로 -log10(p) 값이 peak를 보이는 핵산 단편 크기를 선택하여(127~129, 137~139, 148~150, 156~158, 181~183), 총 15개의 핵산 단편 크기를 선별하였다.
아울러, 다른 위치의 다른 염기에서도 유사한 패턴이 나타나는 것을 확인하였다(도 9).
2-3. 최적의 핵산단편 위치 선별
실시예 1에서 수득한 데이터는 100 PE 데이터이므로, 분석에 사용 가능한 핵산 단편 위치는 For1~100, 그리고 Rev1~100까지 총 200 가지이다.
도 4는 표 2의 FESS_Table_120을 Heatmap 형식으로 시각화한 것으로, 점선으로 표시된 양 끝 쪽 (For1~10, Rev1~10) 일부에서만 위치에 따른 A, T, G, C 염기 서열의 상대 빈도 차이가 관찰되고, read의 뒷부분(~100)으로 갈수록 거의 비슷한 A, T, G, C 염기 서열의 상대 빈도가 반복되는 것을 확인할 수 있다.
예를 들어, For1의 A, T, G, C 염기 서열 상대 빈도는 For2의 A, T, G, C 상대 빈도와 상당한 차이를 보이지만, For11의 A, T, G, C 염기 서열 상대 빈도와 For99의 A, T, G, C 염기 서열 상대 빈도, 그리고 For100의 A, T, G, C 염기 서열 상대 빈도는 큰 차이 없이 거의 유사한 것을 확인할 수 있다.
따라서, 학습 모델의 성능향상을 위해 read 뒷부분 위치를 제외한 For1~10, Rev1~10 위치만 모델 학습 대상 feature로 선별하였다.
추가적으로, 도 4의 점선으로 표시된 영역을 확대하면 도 5와 같은데(Rev1~10은 Rev10~1 순으로 역으로 정렬하였다), 가장 왼쪽 패널을 보면, Forward와 Reverse의 같은 위치에 있는 같은 서열의 상대 빈도가 서로 상당히 유사한 것을 확인할 수 있다.
예를 들어, (For1_A와 Rev1_A), (For1_T와 Rev1_T), (For1_G와 Rev1_G), 그리고 (For1_C와 Rev1_C)가 서로 유사한 상대 빈도 값을 갖고, 같은 방법으로 (For2_A와 Rev2_A), (For2_T와 Rev2_T), (For2_G와 Rev2_G), 그리고 (For2_C와 Rev2_C)가 서로 유사한 상대 빈도 값을 갖는다.
이러한 유사성을 건강인 집단에서의 Pearson's correlation coefficient로 측정해보면 도 5의 오른쪽 두 패널과 같다. 건강인 집단에서 측정된 For1_A의 상대 빈도 값들과 Rev1_A의 상대 빈도 값들 사이의 유사성, For1_T의 상대 빈도 값들과 Rev1_T의 상대 빈도 값들 사이의 유사성, For1_G의 상대 빈도 값들과 Rev1_G의 상대 빈도 값들 사이의 유사성, 및 For1_C의 상대 빈도 값들과 Rev1_C의 상대 빈도 값들 사이의 유사성은 모두 1인 것을 확인하였다.
이러한 분석을 통해 핵산 단편의 Forward strand쪽 5` 말단 염기 서열의 상대 빈도와 Reverse strand쪽 5` 말단 염기 서열의 상대 빈도가 유사하다는 것을 확인할 수 있었고, 따라서, Rev1~10 위치를 제외한 For1~10 위치만 모델 학습 대상 feature로 선별하였다.
2-4. 최적의 핵산단편 위치별 염기 서열 선별
실시예 2-3에서 선별한 10 곳의 위치에서는 각각 A, T, G, C 네 종류 염기 서열의 상대 빈도를 계산할 수 있다. 예를 들어, For1 위치에서는 For1_A, For1_T, For1_G, For1_C의 상대 빈도를 계산할 수 있다. 모델 학습 대상 변수를 줄이기 위해, 같은 위치에 있는 염기 서열들 사이의 유사성을 확인하여 추가적인 선별을 진행하였다. 위치 별 염기 서열 선별은 건강인 집단에서 하기 방법으로 진행하였다.
1. For1~10 각 위치에서 A, T, G, C 염기 서열의 상대 빈도를 계산하고,
2. (For1_A와 For1_T), (For1_A와 For1_G), (For1_A와 For1_C), (For1_T와 For1_G), (For1_T와 For1_C), 그리고 (For1_G와 For1_C) 사이의 유사성을 Pearson's correlation coefficient로 측정하였다.
그 결과, 도 6에 기재된 바와 같이, For1~5 위치에서는 A, T, G, C 네 종류 염기 서열의 상대 빈도 사이의 유사성이 낮은 것을 확인하였으며, For6~10 위치에서는 A, T, G, C 네 종류 염기 서열의 상대 빈도 사이의 유사성이 상당히 높은 것을 확인하였다.
따라서, For1~5 위치에서는 A, T, G, C 네 종류의 염기 서열을 모두 선별하고, For6~10 위치에서는 A, T, C, G 중 대표 값으로 A 염기 서열만 선별하였다.
결론적으로 최적의 핵산단편 크기 및 위치별 서열 상대 빈도는 하기와 같다:
1) 핵산 단편 크기: 127, 128, 129, 137, 138, 139, 148, 149, 150, 156, 157, 158, 181, 182, 183. 총 15개.
2) 핵산 단편 위치: For1~10. 총 10개.
3) 핵산 단편 위치 별 염기 서열 조합
For1~5: A, T, G, C For6~10: A
15개 크기 * 25개 위치_염기서열 = 375개 Features
375개의 Feature 조합은 표 3에 기재하였다.
실시예 3. 머신러닝 모델 구축 및 학습 과정
실시예 2에서 선별한 375개 Feature들의 상대 빈도 값을 인풋으로 하여 건강인, 신경모세포종 환자를 구분하는 머신러닝 모델을 학습하였다. 머신러닝 알고리즘은 XGBoost를 사용하였다.
전체 샘플을 Training, Validation, Test 데이터 세트로 나누어 Training 데이터 세트는 모델 학습에, Validation 데이터 세트는 hyper-parameter tuning에, Test 데이터 세트는 최종 모델 성능 평가에 사용하였다. 각 세트 별 샘플 수는 아래와 같다.
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000010
Hyper-parameter tuning 과정은 XGBoost 모델을 이루는 여러 parameter(learner tree의 최대 깊이, learner tree의 개수, learning rate 등) 값을 최적화 하는 과정이다.
Hyper-parameter tuning 과정에는 Bayesian optimization 및 grid search 기법을 사용하였고, Training loss 대비 validation loss가 증가하기 시작하면 모델이 과적합(Overfitting) 되었다고 판단하여 model 학습을 중단하였다.
Hyper-parameter tuning을 통해서 수득한 여러 모델의 성능을 Validation 데이터 세트를 이용하여 비교하고, 이 중 Validation 데이터 세트 성능이 가장 좋은 모델을 최적의 모델이라 판단하고, Test 데이터 세트로 최종 성능 평가를 수행하였다.
상기 과정을 거쳐서 만들어진 XGBoost 모델에 임의의 샘플에서 계산된 375개 feature의 상대 빈도 값 벡터를 인풋으로 넣어 주면, 해당 샘플의 건강인일 확률, 신경모세포종 환자일 확률이 계산되고, 이 확률 값을 XGBoost Probability Index (XPI)라 정의하였다.
임의의 샘플에서 계산된 XPI 값이 0.5 초과이면 신경모세포종 환자로, 0.5 이하이면 건강인으로 판단하였다.
실시예 4. 구축한 모델의 성능 확인
4-1 성능 확인
실시예 3에서 구축한 머신러닝 모델에서 출력한 XPI 값의 성능을 테스트 하였다. 모든 샘플은 Train, Validation, Test 그룹으로 나눠 진행했고, Train 샘플을 이용하여 model을 구축한 다음 Validation 그룹 및 Test 그룹의 샘플을 이용해서, Train 샘플을 이용해 만든 모델의 성능을 확인하였다.
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000011
그 결과, 표 5 및 도 7에 기재된 바와 같이, Accuracy 는 Train, Valid, Test 그룹에서 각각 1.000, 0.945, 0.937인 것을 확인하였고, ROC 분석 결과인 AUC 값은 Train, Valid, Test 그룹에서 각각 1.000, 0.952, 0.987인 것을 확인하였다
4-2. XPI 분포 확인
실시예 3에서 구축한 머신러닝 모델의 출력값인 XPI 값이 실제 환자와 얼마나 일치하는 지를 확인하였다. 도 8의 X 축은 실제 샘플의 그룹 (True label) 정보를 나타내고, Y 축은 왼쪽에서부터 순서대로 머신러닝 모델에서 계산한 건강인(Normal), 신경모세포종 환자(NBT)일 XPI 값을 나타낸다.
그 결과, 도 8에 기재된 바와 같이 XPI 분포는 Train, Validation, Test 데이터 세트 모두에서 건강인 샘플들은 건강인일 확률이 가장 높게 분포하는 것을 확인하였으며, 신경모세포종 환자 샘플들은 간암 환자일 확률이 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 5. Feature 별 모델 성능 확인
5-1 Feature 별 중요도 도출
실시예 2에서 선별한 feature를 이용하여 실시예 3에서 학습모델을 구축하였고, 각각의 feature를 사용하여 XGB 모델을 학습했을 때, 각 feature들의 importance 값은 하기 표 6과 같다.
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000012
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000013
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000014
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000015
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000016
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000017
5-2. TopN feature 성능 확인
실시예 3의 방법으로 상위 1번 feature 만을 사용하여 구축한 XGB 모델, 2번까지 사용한 모델, 3번, 4번, 5번, 6번, 7번, 8번, 9번, 15번, 20번, 25번, 30번, 35번, 40번, 45번 및 50번까지를 사용하여 구축한 XGB 모델의 성능을 실시예 4의 방법으로 확인한 결과, 표 7 및 도 10에 기재된 바와 같이 5개의 상위 Feature를 사용하더라도 충분한 성능이 발휘되는 것을 확인을 하였다.
Figure PCTKR2022016868-appb-img-000018
즉, 표 7의 위 3행은 Accuracy (ACC) 방법으로 성능을 측정한 결과이고, 아래 3 행은 AUC 방법으로 성능을 측정한 결과이다. ACC와 AUC 성능을 측정한 Train, valid, test set의 구성은 동일하다. Accuracy (ACC) 는 모델에서 예측된 확률 값이 정해진 cutoff 값 (cutoff = 0.5) 보다 높은지 낮은지를 판단해 측정하는 성능 지표이며, AUC는 ACC와 다르게 특정한 cutoff를 설정하지 않고, 예측된 확률 값의 분포가 정상인 집단과 암 환자 집단에서 얼마만큼 분명하게 차이나는지를 측정하는 성능 지표이다.
ACC 의 경우 cutoff 값을 어떻게 설정하는지에 따라 결과가 달라질 수 있기 때문에, AUC 값을 기준으로 해석하는 것이 맞다. Test set의 AUC 값을 기준으로 표 7의 결과는
i) 375 개의 모든 Feature를 사용했을 때 AUC=0.987로, feature들의 일부 부분집합을 사용했을 때와 비교했을 때 가장 높은 성능을 보이고 있다.
ii) 375 개 feqture를 사용했을 때와 비슷한 Test AUC 성능을 확보할 수 있는 가장 적은 feature의 개수를 찾아보면 TopN = 5 인 것을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 세포유리 핵산단편 위치별 서열 상대 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법은 최적의 핵산단편 위치별 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 수득하여 AI 알고리즘을 이용하여 분석하기 때문에 리드 커버리지가 낮더라도 높은 민감도와 정확도를 나타내어 유용하다.

Claims (14)

  1. 다음의 단계를 포함하는 무세포 핵산을 이용한 암 진단을 위한 정보의 제공방법:
    (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
    (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)를 이용하여 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 단계; 및
    (d) 도출된 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 암을 진단하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계에 있어서,
    상기 인공지능 모델은 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 기반으로 정상 샘플과 암 샘플을 구별하도록 학습된 것을 특징으로 함.
  2. 다음의 단계를 포함하는 무세포 핵산을 이용한 암 진단방법:
    (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
    (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)를 이용하여 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 단계; 및
    (d) 도출된 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 암을 진단하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계에 있어서,
    상기 인공지능 모델은 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 기반으로 정상 샘플과 암 샘플을 구별하도록 학습된 것을 특징으로 함.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a-i) 생체시료에서 핵산을 수득하는 단계;
    (a-ii) 채취된 핵산에서 솔팅-아웃 방법(salting-out method), 컬럼 크로마토그래피 방법(column chromatography method) 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
    (a-iii) 정제된 핵산 또는 효소적 절단, 분쇄, 수압 절단 방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)된 핵산에 대하여, 싱글 엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어 엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
    (a-iv) 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
    (a-v) 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산단편의 크기는 127-129bp, 137-139bp, 148-150bp, 156-158bp 및 181-183bp로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도는 동일한 크기의 핵산단편에서, 각각의 위치에서 검출되는 A, T, G, C 염기를 가지는 핵산단편의 수를 전체 핵산 단편 수로 정규화한 값인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산단편의 위치는 핵산단편의 5’ 말단에서 1 내지 10개 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도는 핵산단편의 위치는 핵산단편의 5’ 말단에서 1 내지 5개 위치에서는 A, T, G 및 C 염기의 빈도이며, 6 내지 10개 위치에서는 A 염기의 빈도인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기는 표 3에 기재된 것에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 인공지능 모델은 AdaBoost, Random forest, Catboost, Light Gradient Boosting Model 및 XGBoost로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인공지능 모델이 XGBoost이고, binary classification 을 학습할 경우, 손실함수는 하기 수식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure PCTKR2022016868-appb-img-000019
  11. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 인공지능 모델이 입력된 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 분석하여 출력하는 결과값은 XPI(XGBoost Probability Index)값인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 기준값은 0.5이며, 0.5 이상일 경우, 암 인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 해독하는 해독부;
    해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부;
    정렬된 서열 기반의 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 핵산단편 분석부; 및
    도출된 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값과 비교하여 암 유무를 판정하는 암 진단부;
    를 포함하는 암 진단 장치.
  14. 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 진단을 위한 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되,
    (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 서열정보를 획득하는 단계;
    (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    (c) 상기 정렬된 서열정보(reads)를 이용하여 핵산단편(fragments)의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기를 도출하는 단계; 및
    (d) 도출된 서열 상대 빈도 및 크기 정보를 암을 진단하도록 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계에 있어서,
    상기 (d) 단계의 인공지능 모델은 핵산단편의 위치별 서열 상대 빈도 및 핵산단편의 크기 정보를 기반으로 정상 샘플과 암 샘플을 구별하도록 학습된 것을 특징으로 하는 단계를 통하여, 암 진단을 위한 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
PCT/KR2022/016868 2021-11-03 2022-11-01 세포유리 핵산단편 위치별 서열 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법 WO2023080586A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0149466 2021-11-03
KR1020210149466A KR20230064172A (ko) 2021-11-03 2021-11-03 세포유리 핵산단편 위치별 서열 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023080586A1 true WO2023080586A1 (ko) 2023-05-11

Family

ID=86241775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/016868 WO2023080586A1 (ko) 2021-11-03 2022-11-01 세포유리 핵산단편 위치별 서열 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20230064172A (ko)
WO (1) WO2023080586A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190036494A (ko) * 2017-09-27 2019-04-04 이화여자대학교 산학협력단 Dna 복제수 변이 기반의 암 종 예측 방법
KR20190085667A (ko) * 2018-01-11 2019-07-19 주식회사 녹십자지놈 무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도
KR20210113237A (ko) * 2018-12-19 2021-09-15 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 무 세포 dna 말단 특성

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190036494A (ko) * 2017-09-27 2019-04-04 이화여자대학교 산학협력단 Dna 복제수 변이 기반의 암 종 예측 방법
KR20190085667A (ko) * 2018-01-11 2019-07-19 주식회사 녹십자지놈 무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도
KR20210113237A (ko) * 2018-12-19 2021-09-15 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 무 세포 dna 말단 특성

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CRISTIANO STEPHEN; LEAL ALESSANDRO; PHALLEN JILLIAN; FIKSEL JACOB; ADLEFF VILMOS; BRUHM DANIEL C.; JENSEN SARAH ØSTRUP; MEDIN: "Genome-wide cell-free DNA fragmentation in patients with cancer", NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP UK, LONDON, vol. 570, no. 7761, 29 May 2019 (2019-05-29), London, pages 385 - 389, XP036814426, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/s41586-019-1272-6 *
WAN NATHAN, DAVID WEINBERG, TZU-YU LIU, KATHERINE NIEHAUS, ERIC A. ARIAZI, DANIEL DELUBAC, AJAY KANNAN, BRANDON WHITE, MITCH BAILE: "Machine learning enables detection of early-stage colorectal cancer by whole-genome sequencing of plasma cell-free DNA", BMC CANCER, vol. 19, 23 August 2019 (2019-08-23), pages 832, XP093062357 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230064172A (ko) 2023-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021154060A1 (en) Method of predicting disease, gene or protein related to queried entity and prediction system built by using the same
WO2021107676A1 (ko) 인공지능 기반 염색체 이상 검출 방법
WO2018143540A1 (ko) 인공신경망을 이용한 위암의 예후 예측 방법, 장치 및 프로그램
WO2023033329A1 (ko) 질환 연관 유전자 변이 분석을 통한 질환별 위험 유전자 변이 정보 생성 장치 및 그 방법
WO2017135496A1 (ko) 약물과 단백질 간 관계 분석 방법 및 장치
WO2022114631A1 (ko) 인공지능 기반 암 진단 및 암 종 예측방법
WO2017116135A1 (ko) 개인 유전체의 유전변이정보를 이용한 유전형 분석 시스템 및 방법
WO2021125744A1 (en) Method and system for providing interpretation information on pathomics data
WO2023172025A1 (ko) 시계열적 정보를 인코딩하는 모델을 사용하여 개체-쌍 사이의 연관성 관련 정보를 예측하는 방법 및 이를 이용하여 생성되는 예측 시스템
WO2020022733A1 (ko) 전장유전체 시퀀싱 기반의 염색체 이상 검출 방법 및 그 용도
WO2017086675A1 (ko) 대사 이상 질환 진단 장치 및 그 방법
WO2022097844A1 (ko) 유전자 복제수 변이 정보를 이용하여 췌장암 환자의 생존 예후를 예측하는 방법
WO2023080586A1 (ko) 세포유리 핵산단편 위치별 서열 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법
WO2022250513A1 (ko) 세포유리 핵산단편 말단 서열 모티프 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법
WO2017116139A1 (ko) 개인 유전체의 유전변이정보를 이용한 생리활성변이 분석 시스템
Giacomelli et al. Relationship between human oral lichen planus and oral squamous cell carcinoma at a genomic level: a datamining study
WO2023075402A1 (ko) 메틸화된 무세포 핵산을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법
WO2022250514A1 (ko) 세포유리 핵산과 이미지 분석기술 기반의 암 진단 및 암 종 예측 방법
WO2022250512A1 (ko) 조직 특이적 조절지역의 무세포 dna 분포를 이용한 인공지능 기반 암 조기진단 방법
WO2022203437A1 (ko) 인공지능 기반 무세포 dna의 종양 유래 변이 검출 방법 및 이를 이용한 암 조기 진단 방법
WO2023244046A1 (en) Method for diagnosing cancer and predicting type of cancer based on single nucleotide variant in cell-free dna
Lomsadze et al. GeneMark-HM: improving gene prediction in DNA sequences of human microbiome
WO2021034034A1 (ko) 핵산 단편간 거리 정보를 이용한 염색체 이상 검출 방법
WO2020050627A1 (ko) 시료 미생물의 동정 및 분류 방법
WO2018021636A1 (ko) 휴먼 하플로타이핑 시스템 및 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22890317

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1