WO2023075402A1 - 메틸화된 무세포 핵산을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법 - Google Patents

메틸화된 무세포 핵산을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법 Download PDF

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WO2023075402A1
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cancer
nucleic acid
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vectorized data
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조은해
안진모
기창석
이준남
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주식회사 지씨지놈
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Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing cancer and predicting cancer types using methylated cell-free nucleic acids, and more specifically, by extracting nucleic acids from biological samples, obtaining sequence information including methylation information, and obtaining nucleic acids based on aligned reads. It relates to a method for diagnosing cancer and predicting cancer types using a method of generating fragment vectorized data and then inputting it into a learned artificial intelligence model to analyze the calculated value.
  • Cancer diagnosis in clinical practice is usually confirmed by performing a tissue biopsy after a medical history, physical examination, and clinical evaluation. Cancer diagnosis by clinical tests is possible only when the number of cancer cells is 1 billion or more and the diameter of the cancer is 1 cm or more. In this case, the cancer cells already have the ability to metastasize, and at least half of them have already metastasized.
  • tissue biopsy is invasive, it causes considerable inconvenience to patients, and there are problems in that tissue biopsy can often not be performed while treating cancer patients.
  • cancer screening tumor markers are used to monitor substances produced directly or indirectly from cancer, but even when cancer is present, more than half of the tumor marker screening results are normal, and often positive even when there is no cancer. Because it appears, there is a limit to its accuracy.
  • liquid biopsy using body fluids of patients as a recent cancer diagnosis and follow-up test (liquid biopsy) is widely used.
  • Liquid biopsy is a non-invasive diagnostic technique that is attracting attention as an alternative to conventional invasive diagnostic and examination methods.
  • an artificial neural network refers to a calculation model implemented in software or hardware that imitates the computational capability of a biological system by using a large number of artificial neurons connected by connection lines.
  • Artificial neural networks use artificial neurons that simplify the functions of biological neurons.
  • the human cognitive function or learning process is performed by interconnecting them through a connection line having a connection strength.
  • the connection strength is a specific value that a connection line has, and is also called a connection weight.
  • Learning of artificial neural networks can be divided into supervised learning and unsupervised learning.
  • Supervised learning is a method of putting input data and corresponding output data together into a neural network and updating the connection strength of connection lines so that output data corresponding to the input data is output.
  • Representative learning algorithms include Delta Rule and Back Propagation Learning.
  • Unsupervised learning is a method in which an artificial neural network learns connection strength by itself using only input data without a target value.
  • Unsupervised learning is a method of updating connection weights by correlation between input patterns.
  • the present inventors have made diligent efforts to solve the above problems and develop a highly sensitive and accurate AI-based cancer diagnosis method, and as a result, vectorized data is generated based on the distance or amount of methylated cell-free nucleic acid fragments, When this was analyzed with a learned artificial intelligence model, it was confirmed that cancer diagnosis and cancer type discrimination could be performed with high sensitivity and accuracy, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a method for diagnosing cancer and predicting cancer types using methylated cell-free nucleic acids.
  • Another object of the present invention is to provide an apparatus for diagnosing cancer and predicting cancer types using methylated cell-free nucleic acids.
  • Another object of the present invention is to provide a computer readable storage medium containing instructions configured to be executed by a processor for diagnosing cancer and predicting cancer types by the above method.
  • the present invention provides (a) obtaining sequence information including methylation information by extracting nucleic acids from a biological sample; (b) aligning the obtained sequence information (reads) with a standard chromosome sequence database (reference genome database); (c) generating vectorized data using nucleic acid fragments based on the aligned sequence reads; (d) determining the presence or absence of cancer by comparing an output result value analyzed by inputting the generated vectorized data into a learned artificial intelligence model and a cut-off value; and (e) estimating the type of cancer through comparison of the output result value.
  • the present invention also provides a decoding unit for extracting nucleic acids from a biological sample and decoding sequence information including methylation information; an alignment unit that aligns the translated sequence with a standard chromosomal sequence database; a data generator for generating vectorized data using the aligned sequence-based nucleic acid fragments; a cancer diagnosis unit that analyzes the generated vectorized data by inputting it to the learned artificial intelligence model and compares it with a reference value to determine whether or not there is cancer; and a cancer type prediction unit that analyzes the output result value and predicts the type of cancer.
  • the present invention also provides a computer-readable storage medium comprising instructions configured to be executed by a processor for diagnosing cancer and predicting cancer types, including (a) extracting nucleic acid from a biological sample to obtain sequence information including methylation information; obtaining; (b) aligning the obtained sequence information (reads) with a standard chromosome sequence database (reference genome database); (c) generating vectorized data using the nucleic acid fragments based on the aligned sequence information (reads); (d) inputting and analyzing the generated vectorized data into a learned artificial intelligence model, and comparing a cut-off value to determine the presence or absence of cancer; and (e) a computer-readable storage medium comprising instructions configured to be executed by a processor for predicting the presence of cancer and the type of cancer through the step of predicting the type of cancer through the comparison of the output values.
  • the present invention also includes (a) obtaining sequence information including methylation information by extracting nucleic acids from a biological sample; (b) aligning the obtained sequence information (reads) with a standard chromosome sequence database (reference genome database); (c) generating vectorized data using nucleic acid fragments based on the aligned sequence reads; (d) determining the presence or absence of cancer by comparing an output result value analyzed by inputting the generated vectorized data into a learned artificial intelligence model and a cut-off value; and (e) predicting the type of cancer through the comparison of the output result value.
  • FIG. 1 is an overall flowchart for determining artificial intelligence-based chromosomal abnormalities of the present invention.
  • FIG. 2 is an example of a GC plot generated based on methylated cfDNA according to an embodiment of the present invention, wherein the X-axis represents chromosomes for each segment, and the Y-axis represents the number of nucleic acid fragments corresponding to each segment.
  • 3 is a result of confirming the accuracy of neuroblastoma determination for a deep learning model that has learned GC plot image data generated based on the number of nucleic acid fragments using methylated cfDNA according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 4 is a probability distribution for each data set of neuroblastoma determination for a deep learning model that has learned GC plot image data generated based on the number of nucleic acid fragments using methylated cfDNA according to an embodiment of the present invention.
  • A means a training set
  • B a validation set
  • C a test set.
  • FIG. 5 is an example of a GC plot generated based on cfDNA according to an embodiment of the present invention, in which the X-axis indicates chromosomes for each section and the Y-axis indicates the number of nucleic acid fragments corresponding to each section.
  • FIG. 6 is a result of confirming the accuracy of neuroblastoma determination for a deep learning model that has learned GC plot image data generated based on the number of nucleic acid fragments using cfDNA according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 7 is a result showing the probability distribution for each data set of neuroblastoma determination for a deep learning model that has learned GC plot image data generated based on the number of nucleic acid fragments using cfDNA according to an embodiment of the present invention.
  • (A) means the training set
  • first, second, A, B, etc. may be used to describe various elements, but the elements are not limited by the above terms, and are merely used to distinguish one element from another. used only as For example, without departing from the scope of the technology described below, a first element may be referred to as a second element, and similarly, the second element may be referred to as a first element.
  • the terms and/or include any combination of a plurality of related recited items or any of a plurality of related recited items.
  • each component to be described below may be combined into one component, or one component may be divided into two or more for each more subdivided function.
  • each component to be described below may additionally perform some or all of the functions of other components in addition to its main function, and some of the main functions of each component may be performed by other components. Of course, it may be dedicated and performed by .
  • each process constituting the method may occur in a different order from the specified order unless a specific order is clearly described in context. That is, each process may occur in the same order as specified, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the reverse order.
  • sequencing data obtained from methylated cell-free nucleic acids extracted from samples is aligned with a reference genome, vectorized data is generated based on the aligned nucleic acid fragments, and then DPI values are calculated from the learned artificial intelligence model. It was intended to confirm that cancer can be detected with high sensitivity and accuracy when cancer is detected by comparison with the reference value.
  • the deep learning model was trained to calculate the DPI value. If the DPI value is greater than the reference value, it is determined that there is cancer , developed a method for determining the cancer type showing the highest value among a plurality of DPI values as the actual cancer type (FIG. 1)
  • It relates to a method for providing information for diagnosing cancer and predicting cancer types, including (e) predicting cancer types through comparison of output result values.
  • the nucleic acid fragment may be used without limitation as long as it is a fragment of nucleic acid extracted from a biological sample, but preferably may be a fragment of cell-free nucleic acid or intracellular nucleic acid, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid fragment can be obtained by any method known to those skilled in the art, and is preferably directly sequenced, sequenced through next-generation sequencing, or non-specific whole genome amplification. ), or obtained through sequencing or probe-based sequencing, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid fragment may mean a lead when next-generation sequencing is used.
  • the cancer may be solid cancer or hematological cancer, preferably non-Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, acute myeloid leukemia, or acute lymphocytic leukemia.
  • acute-lymphoid leukemia multiple myeloma, head and neck cancer, lung cancer, glioblastoma, colon/rectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, melanoma, prostate cancer
  • It may be selected from the group consisting of liver cancer, thyroid cancer, gastric cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, bladder cancer, small intestine cancer, cervical cancer, cancer of unknown primary site, kidney cancer, esophageal cancer, neuroblastoma, and mesothelioma, more preferably neuroblastoma. It may be a neuroblastoma, but is not limited thereto.
  • the step (a) is
  • the step of obtaining sequence information of step (a) may be characterized in that the isolated cell-free DNA is obtained through whole genome sequencing at a depth of 1 million to 100 million reads, but is not limited thereto. .
  • the biological sample refers to any material, biological fluid, tissue or cell obtained from or derived from an individual, for example, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear peripheral blood mononuclear cells, leukocyte buffy coat, blood (including plasma and serum), sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirates, breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, pelvic fluids, cyst fluids ( cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchi Bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, cell extract, hair, oral cells, placenta cells, cerebrospinal fluid ( cerebrospinal fluid) and mixtures thereof, but is not limited thereto.
  • cyst fluids cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid,
  • the term "reference group” is a reference group that can be compared like a standard sequencing database, and refers to a group of people who do not currently have a specific disease or condition.
  • the standard nucleotide sequence in the standard chromosome sequence database of the reference group may be a reference chromosome registered with a public health institution such as NCBI.
  • the nucleic acid in step (a) may be cell-free DNA, more preferably circulating tumor DNA (ctDNA), but is not limited thereto.
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • the nucleic acid containing the methylation information can be obtained by various known methods, preferably by bisulfite conversion, enzymatic conversion or methylated DNA immunoprecipitation ( Methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) may be characterized as obtained, but is not limited thereto.
  • Methylated DNA Immunoprecipitation Methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) may be characterized as obtained, but is not limited thereto.
  • a method for detecting DNA methylation there is an additional restriction enzyme-based detection method, which uses a methylation restriction enzyme (MRE) to cleave unmethylated nucleic acid, or a specific sequence (recognition Site) is cut and analyzed by combining with hybridization method or PCR.
  • MRE methylation restriction enzyme
  • methods based on bisulfite substitution include Whole-Genome Bisulfite Sequencing (WGBS), Reduced-Representation Bisulfite Sequencing (RRBS), Methylated CpG Tandems Amplification and Sequencing (MCTA-seq), Targeted Bisulfite Sequencing, Methylation Array and Methylation- specific PCR (MSP), etc.
  • WGBS Whole-Genome Bisulfite Sequencing
  • RRBS Reduced-Representation Bisulfite Sequencing
  • MCTA-seq Methylated CpG Tandems Amplification and Sequencing
  • MSP Methylation-specific PCR
  • methods for enriching and analyzing methylated DNA include Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing (MeDIP-seq), Methyl-CpG Binding Domain Protein Capture Sequencing (MBD-seq), and the like.
  • Another method that can analyze methylated DNA in the present invention is 5-hydroxymethylation profiling, examples of which include 5hmC-Seal (hMe-Seal), hmC-CATCH, Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation Sequencing (hMeDIP-seq), Oxidative Bisulfite Conversion, etc.
  • next-generation sequencer can be used with any sequencing method known in the art. Sequencing of nucleic acids isolated by selection methods is typically performed using next-generation sequencing (NGS).
  • Next-generation sequencing includes any sequencing method that determines the nucleotide sequence of an individual nucleic acid molecule or one of clonally expanded proxies for individual nucleic acid molecules in a highly similar manner (e.g., 105 or more molecules are sequenced simultaneously). do).
  • the relative abundance of a nucleic acid species in a library can be estimated by counting the relative number of occurrences of its cognate sequence in data generated by sequencing experiments. Next-generation sequencing methods are known in the art and are described, for example, in Metzker, M. (2010) Nature Biotechnology Reviews 11:31-46, incorporated herein by reference.
  • next-generation sequencing is performed to determine the nucleotide sequence of individual nucleic acid molecules (e.g., the HeliScope Gene Sequencing system from Helicos BioSciences and the Pacific Biosciences' HeliScope Gene Sequencing system). PacBio RS system).
  • sequencing e.g., massively parallel short-read sequencing that yields more bases of sequence per sequencing unit than other sequencing methods that yield fewer but longer reads (e.g., San Diego, Calif.)
  • the Illumina Inc. Solexa sequencer method determines the nucleotide sequence of clonally expanded proxies for individual nucleic acid molecules (e.g., Illumina Inc., San Diego, CA).
  • Solexa sequencer 454 Life Sciences (Branford, Connecticut) and Ion Torrent).
  • Other methods or machines for next-generation sequencing include, but are not limited to, 454 Life Sciences (Branford, CT), Applied Biosystems (Foster City, CA; SOLiD sequencers), Helicos Provided by Bioscience Corporation (Cambridge, MA) and emulsion and microfluidic sequencing technology nanodroplets (eg, GnuBio droplets).
  • Genome Sequencer FLX system from Roche/454
  • Illumina/Solexa Genome Analyzer GA
  • Life/APG's Support Oligonucleotide Ligation Detection SOLiD
  • Polonator's G.007 Hcos BioSciences' HeliScope Gene Sequencing system , Oxford Nanopore Technologies' PromethION, GriION, MinION system and Pacific Biosciences' PacBio RS system.
  • the sequence alignment in step (b) is a computer algorithm that evaluates the similarity between most of the lead sequences in the genome (eg, short-lead sequences from next-generation sequencing) and the reference sequence. It includes computational methods or approaches used for identification from cases likely to be derived by A variety of algorithms can be applied to sequence alignment problems. Some algorithms are relatively slow, but allow relatively high specificity. These include, for example, dynamic programming-based algorithms. Dynamic programming is a way to solve complex problems by breaking them down into simpler steps. Other approaches are relatively more efficient, but are typically less thorough. This includes, for example, heuristic algorithms and probabilistic methods designed for bulk database searches.
  • candidate screening reduces the search space for sequence alignments from the whole genome to a shorter enumeration of possible alignment positions.
  • Sequence alignment involves aligning sequences with sequences provided in the candidate screening step. This can be done using a global alignment (eg Needleman-Wunsch alignment) or a local alignment (eg Smith-Waterman alignment).
  • attribute sorting algorithms can be characterized as one of three types based indexing methods: hash tables (e.g. BLAST, ELAND, SOAP), suffix trees (e.g. Bowtie, BWA), and merge sort. (e.g. Slider) based algorithm. Short lead sequences are typically used for alignment.
  • hash tables e.g. BLAST, ELAND, SOAP
  • suffix trees e.g. Bowtie, BWA
  • merge sort. e.g. Slider
  • Short lead sequences are typically used for alignment.
  • the alignment step of step (b) is not limited thereto, but may be performed using the BWA algorithm and the Hg19 sequence.
  • the BWA algorithm may include BWA-ALN, BWA-SW or Bowtie2, but is not limited thereto.
  • the length of the sequence information (reads) in step b) is 5 to 5000 bp, and the number of sequence information used may be 5,000 to 5 million, but is not limited thereto.
  • the vectorized data in step (c) can be used without limitation as long as it can be generated based on the aligned nucleic acid fragments, preferably a Grand Canyon plot (GC plot) It may be characterized as, but is not limited thereto.
  • GC plot Grand Canyon plot
  • the vectorized data in the present invention may be characterized as preferably imaged, but not limited thereto.
  • An image is basically composed of pixels.
  • a 1-dimensional 2D vector black and white
  • 3-dimensional 2D vector color (RGB)
  • CMLK 4-dimensional 2D vector
  • the vectorized data of the present invention is not limited to images, and can be used, for example, as input data for an artificial intelligence model by stacking several n black-and-white images and using n-dimensional 2D vectors (Multi-dimensional Vector).
  • the GC plot is a plot in which a specific section (either bins of a certain size or bins of different sizes) is set as the X-axis and values that can be expressed as nucleic acid fragments, such as the distance or number between nucleic acid fragments, are created as the Y-axis.
  • step (c) prior to performing step (c), it may be characterized by further comprising the step of separately sorting nucleic acid fragments satisfying a mapping quality score of the aligned nucleic acid fragments.
  • the mapping quality score may vary depending on a desired criterion, but may be preferably 15 to 70 points, more preferably 50 to 70 points, and most preferably 60 points.
  • the GC plot in step (c) is characterized in that the distribution of the aligned nucleic acid fragments for each chromosome section is generated as vectorized data by calculating the number of nucleic acid fragments for each section or the distance between the nucleic acid fragments. there is.
  • any method of vectorizing the calculated number of nucleic acid fragments or the distance between nucleic acid fragments can be used without limitation as long as it is a known technique for vectorizing calculated values.
  • calculating the distribution of the aligned sequence information for each chromosome segment by the number of nucleic acid fragments may be characterized in that it is performed by including the following steps:
  • step iv) generating a GC plot with the order of each section as the X-axis value and the normalized value calculated in step iii) as the Y-axis value.
  • calculating the distribution of the aligned sequence information by chromosome section as the distance between nucleic acid fragments may be characterized in that it is performed by including the following steps:
  • step iv) normalizing by dividing the representative value calculated in step iii) by the representative value of all nucleic acid fragment distance values;
  • the GC plot can be used by aligning GC plots from chromosomes 1 to 22 on the Y axis to create one image, or by combining images created from chromosomes 1 to 22 on the z axis.
  • the representative value is the sum, difference, product, mean, median, quantile, minimum, maximum, variance, standard deviation, median absolute deviation, coefficient of variation, and reciprocal of the distances between nucleic acid fragments. And it may be characterized in that at least one selected from the group consisting of combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the bin may be characterized in that it is 1Kb to 3Gb, but is not limited thereto.
  • a step of grouping nucleic acid fragments may be additionally used, and in this case, the grouping criterion may be performed based on adapter sequences of the aligned nucleic acid fragments.
  • the distance between the nucleic acid fragments can be calculated for the selected sequence information by separately dividing it into forward-aligned nucleic acid fragments and reverse-aligned nucleic acid fragments.
  • the FD value is defined as the distance between the ith nucleic acid fragment and the reference value of one or more nucleic acid fragments selected from the i+1 to n nucleic acid fragments with respect to the obtained n nucleic acid fragments.
  • the FD value is calculated by calculating the distance from the reference value of one or more nucleic acid fragments selected from the group consisting of the first nucleic acid fragment and the second to n nucleic acid fragments with respect to the obtained n nucleic acid fragments.
  • a reciprocal value of , calculation results including weights, and statistics that are not limited thereto may be used as FD values, but are not limited thereto.
  • the "reference value of nucleic acid fragments" may be characterized in that a value obtained by adding or subtracting an arbitrary value from the median value of nucleic acid fragments.
  • the FD value can be defined as follows for the obtained n nucleic acid fragments.
  • the Dist function is the sum, difference, product, mean, log of the product, log of the sum, median, quantile, minimum value, maximum value, variance of the differences in alignment position values of all the nucleic acid fragments included between the two selected Ri and Rj nucleic acid fragments. Calculate one or more values selected from the group consisting of . , standard deviation, median absolute deviation, and coefficient of variation and/or one or more reciprocal values thereof, and calculation results including weights and statistical values that are not limited thereto.
  • FD value Frametic Distance Value
  • N the number of selection cases of nucleic acid fragments for distance calculation. That is, when i is 1, i+1 becomes 2, and the distance to one or more nucleic acid fragments selected from the 2nd to nth nucleic acid fragments can be defined.
  • the FD value may be characterized by calculating a distance between a specific position inside the i-th nucleic acid fragment and a specific position inside any one or more of the i+1 to n-th nucleic acid fragments.
  • nucleic acid fragment is 50 bp in length and is aligned at position 4,183 of chromosome 1
  • the genetic position values that can be used to calculate the distance of this nucleic acid fragment are 4,183 to 4,232 of chromosome 1.
  • the genetic position value that can be used for calculating the distance of this nucleic acid fragment is 4,232 to 4,281 of chromosome 1
  • the FD between the two nucleic acid fragments Values can be from 1 to 99.
  • the genetic position values that can be used to calculate the distance of this nucleic acid fragment are 4,123 to 4,172 of chromosome 1
  • the FD value between the two nucleic acid fragments is 61 to 159
  • the FD value with the first example nucleic acid fragment is 12 to 110, the sum, difference, product, average, log of the product, log of the sum, median, quantile, minimum,
  • One or more values selected from the group consisting of the maximum value, variance, standard deviation, median absolute deviation, and coefficient of variation, and/or one or more reciprocal values thereof, and calculation results including weights, and statistics, including but not limited to, can be used as FD values. It may be, preferably, characterized in that it is a reciprocal value of one of the two FD value ranges, but is not limited thereto
  • the FD value may be a value obtained by adding or subtracting an arbitrary value from the median value of nucleic acid fragments.
  • the median value of FD means a value located at the most center when the calculated FD values are arranged in order of size. For example, when there are three values, such as 1, 2, and 100, 2 is the median because 2 is the most central. If there are an even number of FD values, the median is determined as the average of the two values in the middle. For example, if there are FD values of 1, 10, 90, and 200, the median is 50, which is the average of 10 and 90.
  • the arbitrary value can be used without limitation as long as it can indicate the position of the nucleic acid fragment, but is preferably 0 to 5 kbp or 0 to 300% of the length of the nucleic acid fragment, 0 to 3 kbp or the length of the nucleic acid fragment. 0 to 200%, 0 to 1 kbp or 0 to 100% of the length of the nucleic acid fragment, more preferably 0 to 500 bp or 0 to 50% of the length of the nucleic acid fragment, but is not limited thereto.
  • the FD value may be derived based on positional values of forward and reverse sequence information (reads).
  • nucleic acid fragment distances are 4183 to 4349.
  • the position value of this nucleic acid fragment is 4349 to 4515.
  • the distance between the two nucleic acid fragments may be 0 to 333, and most preferably 166, which is the distance of the median value of each nucleic acid fragment.
  • sequence information when sequence information is obtained by the paired-end sequencing, in the case of a nucleic acid fragment whose alignment score of sequence information (reads) is less than the reference value, it may be characterized in that it further comprises the step of excluding from the calculation process. there is.
  • the FD value may be derived based on one type of positional value of forward or reverse sequence information (read).
  • the arbitrary value in the case of the single-end sequencing, when a position value is derived based on sequence information aligned in the forward direction, an arbitrary value is added, and when a position value is derived based on sequence information aligned in the reverse direction It can be characterized in that an arbitrary value is subtracted, and the arbitrary value can be used without limitation as long as the FD value clearly indicates the location of the nucleic acid fragment, but is preferably 0 to 5 kbp or the length of the nucleic acid fragment 0 to 300%, 0 to 3 kbp or 0 to 200% of the nucleic acid fragment length, 0 to 1 kbp or 0 to 100% of the nucleic acid fragment length, more preferably 0 to 500 bp or 0 to 50% of the nucleic acid fragment length. , but is not limited thereto.
  • Nucleic acids to be analyzed in the present invention may be sequenced and expressed in units called reads.
  • This read can be divided into single end sequencing read (SE) and paired end sequencing read (PE) according to the sequencing method.
  • SE-type read means that one of the 5' and 3' parts of the nucleic acid molecule is sequenced for a certain length in a random direction
  • PE-type read means that both 5' and 3' are sequenced for a certain length. Because of this difference, it is well known to those skilled in the art that one lead is generated from one nucleic acid fragment when sequencing in SE mode, and two reads are generated in pairs from one nucleic acid fragment in PE mode.
  • the most ideal way to calculate the exact distance between nucleic acid fragments is to sequence the nucleic acid molecules from start to finish, align the grids, and use the median (center) of the aligned values.
  • the above method has limitations due to limitations of sequencing technology and cost aspects. Therefore, sequencing is performed in the same way as SE and PE.
  • SE sequencing technology
  • the exact position (median value) of the nucleic acid fragment can be identified through the combination of these values, but the SE
  • the method since information on only one end of a nucleic acid fragment can be used, there is a limit to calculating the exact position (median value).
  • the 5' end of the forward read has a position value smaller than the central position of the nucleic acid molecule, and the 3' end of the reverse read has a large value.
  • a value close to the central position of a nucleic acid molecule can be estimated by adding an arbitrary value (Extended bp) to a forward read and subtracting a reverse read.
  • the arbitrary value may vary depending on the sample used, and in the case of cell-free nucleic acids, since the average length of the nucleic acids is known to be about 166 bp, it can be set to about 80 bp. If the experiment is conducted through fragmentation equipment (eg, sonication), about half of the target length set in the fragmentation process can be set as extended bp.
  • fragmentation equipment eg, sonication
  • the representative value is one or more selected from the group consisting of the sum, difference, product, mean, median, quantile, minimum, maximum, variance, standard deviation, median absolute deviation, and coefficient of variation of FD values value and/or one or more reciprocal values thereof, preferably a median value, an average value, or an inverse value thereof of FD values, but is not limited thereto.
  • the artificial intelligence model in step (d) can be used without limitation as long as it is a model capable of learning to distinguish a normal image from a cancerous image, and is preferably a deep learning model.
  • the artificial intelligence model can be used without limitation as long as it is an artificial neural network algorithm capable of analyzing vectorized data based on an artificial neural network, but preferably a convolutional neural network (CNN) or a deep neural network (Deep Neural Network). It may be characterized in that it is selected from the group consisting of Neural Network (DNN), Recurrent Neural Network (RNN), and Autoencoder, but is not limited thereto.
  • CNN convolutional neural network
  • RNN Recurrent Neural Network
  • Autoencoder but is not limited thereto.
  • the recurrent neural network is a group consisting of a long-short term memory (LSTM) neural network, a gated recurrent unit (GRU) neural network, a vanilla recurrent neural network, and an attentive recurrent neural network. It can be characterized as being selected.
  • the loss function for performing binary classification may be characterized in that it is represented by Equation 1 below, and the loss function for performing multi-class classification is represented by Equation 2 below. can be characterized as being
  • the binary classification means that the artificial intelligence model learns to determine whether or not there is cancer
  • the multi-class classification means that the artificial intelligence model learns to determine the type of cancer
  • learning when the artificial intelligence model is a CNN, learning may be performed including the following steps:
  • the training data is used when learning the CNN model
  • the validation data is used for hyper-parameter tuning verification
  • the test data is used for performance evaluation after producing the optimal model.
  • the hyper-parameter tuning process is a process of optimizing the values of various parameters (the number of convolution layers, the number of dense layers, the number of convolution filters, etc.) constituting the CNN model, and the hyper-parameter tuning process includes Bayesian optimization and grid search techniques. It can be characterized by using.
  • the learning process optimizes the internal parameters (weights) of the CNN model using predetermined hyper-parameters, and when the validation loss compared to the training loss starts to increase, it is determined that the model is overfitting, and before that, the model It may be characterized as stopping learning.
  • the result value analyzed from the vectorized data input by the artificial intelligence model in step (d) can be used without limitation as long as it is a specific score or real number, and is preferably a DPI (Deep Probability Index) value. It can, but is not limited to this.
  • DPI Deep Probability Index
  • the Deep Probability Index uses a sigmoid function in the case of binary classification in the last layer of the artificial intelligence model and a softmax function in the case of multi-class classification to adjust the output of artificial intelligence to a scale of 0 to 1 to obtain a value expressed as a probability value. it means.
  • the sigmoid function is used to learn so that the DPI value becomes 1 in case of cancer. For example, if a neuroblastoma sample and a normal sample are input, the DPI value of the neuroblastoma sample is learned to be close to 1.
  • the softmax function is used to select as many DPI values as the number of classes.
  • the sum of the DPI values as many as the number of classes is 1, and learning is performed so that the DPI value of the actual cancer type is 1. For example, if there are three classes of neuroblastoma, liver cancer, and normal, and a neuroblastoma sample is received, the breast cancer class will be learned close to 1.
  • the output result value of step (d) may be characterized in that it is derived for each type of cancer.
  • the artificial intelligence model learns, if there is cancer, the output result learns close to 1, and if there is no cancer, the output result learns close to 0. , 0.5 or less, it was judged that there was no cancer and performance measurement was performed (training, validation, test accuracy).
  • the reference value of 0.5 is a value that can be changed at any time. For example, if you want to reduce false positives, you can strictly set the standard value higher than 0.5 to determine that you have cancer. You can take a little weaker standard that judges that there is.
  • the standard value can be determined by checking the probability of the DPI value by applying unseen data (data for which the answer is not trained for learning) using the learned artificial intelligence model.
  • the step of predicting the cancer type through the comparison of the output result value of step (e) is performed by a method comprising determining the cancer type showing the highest value among the output result values as the cancer of the sample. It can be characterized by doing.
  • the present invention extracts nucleic acids from a biological sample and decodes sequence information including methylation information
  • an alignment unit that aligns the translated sequence with a standard chromosomal sequence database
  • a data generator for generating vectorized data using the aligned sequence-based nucleic acid fragments
  • a cancer diagnosis unit that analyzes the generated vectorized data by inputting it to the learned artificial intelligence model and compares it with a reference value to determine whether or not there is cancer
  • the present invention relates to a cancer diagnosis and cancer prediction device including a cancer diagnosis and cancer prediction unit including a cancer type prediction unit that analyzes an output result value and predicts a cancer type.
  • the decoding unit may be performed in an independent device.
  • the decoding unit of the present invention can produce sequence information including methylation information, ie read, in the NGS device.
  • the present invention is a computer readable storage medium comprising instructions configured to be executed by a processor for diagnosing cancer and predicting cancer types,
  • It relates to a computer-readable storage medium including instructions configured to be executed by a processor for predicting the presence of cancer and the type of cancer through the step of (e) predicting the type of cancer through the comparison of output result values.
  • sequence information including methylation information by extracting nucleic acids from a biological sample
  • It relates to a method for diagnosing cancer and predicting cancer types, including the step of predicting cancer types through the comparison of the output result values.
  • a method according to the present disclosure may be implemented using a computer.
  • a computer includes one or more processors coupled to a chip set.
  • a memory, a storage device, a keyboard, a graphics adapter, a pointing device, and a network adapter are connected to the chipset.
  • the performance of the chipset is enabled by a memory controller hub and an I/O controller hub.
  • the memory may be used directly coupled to the processor instead of a chip set.
  • a storage device is any device capable of holding data, including a hard drive, compact disk read-only memory (CD-ROM), DVD, or other memory device. Memory is concerned with data and instructions used by the processor.
  • the pointing device may be a mouse, track ball or other type of pointing device, and is used in combination with a keyboard to transmit input data to a computer system.
  • the graphics adapter presents images and other information on a display.
  • the network adapter is connected to the computer system through a local area network or a long distance communication network.
  • the computer used herein is not limited to the above configuration, may not have some configurations, may include additional configurations, and may also be part of a storage area network (SAN), and the computer of the present application May be configured to be suitable for the execution of modules in the program for the execution of the method according to the present invention.
  • SAN storage area network
  • a module herein may mean a functional and structural combination of hardware for implementing the technical idea according to the present application and software for driving the hardware.
  • the module may mean a logical unit of a predetermined code and a hardware resource for executing the predetermined code, and does not necessarily mean a physically connected code or one type of hardware. is apparent to those skilled in the art.
  • the storage medium includes any medium that stores or transmits data in a form readable by a device such as a computer.
  • a computer readable medium may include Read Only Memory (ROM); random access memory (RAM); magnetic disk storage media; optical storage media; It includes flash memory devices and other electrical, optical or acoustic signal transmission media.
  • Example 1 Next-generation sequencing analysis performed by extracting methylated cfDNA from blood
  • the prepared library produced about 30 million reads per sample by sequencing with Novaseq 6000 (Illumina) in 150 paired-end mode.
  • Example 1 The reads obtained in Example 1 were aligned with the reference genome using the bwa (version 0.7.17-r1188) alignment tool, and then PCR duplicate nucleic acid fragments were generated using the biobambam2 bammarkduplicates (version 2.0.87) tool. and nucleic acid fragments having a mapping quality of 60 or less were removed using sambaamba (version 0.6.6).
  • the GC plot expresses the alignment of NGS reads from the beginning to the end of the chromosome. All chromosomes except sex chromosomes were divided into non-overlapping 100 kilobase bins, and the number of reads assigned to each bin was counted (read count value ). Normalization was performed by dividing the read count value assigned to each bin by the total number of reads in the sample. A GC plot was produced for each chromosome by setting the normalized bin read count value as Y value and the order of each bin as X value, and aligning the produced GC plot from chromosome 1 to chromosome 22 to produce one image (Fig. 2 ).
  • the GC plot produced in Example 2 is divided into training (learning), validation (validation), and test (performance evaluation) data.
  • Training data is used when learning a CNN model
  • Validation data is used for hyper-parameter tuning verification and the test data was used for performance evaluation after production of the optimal model.
  • Tensorflow (version 2.4.1) was used to build and train the CNN model.
  • the structure of the CNN model is in the order of convolution layer -> pooling layer -> fully connected layer, and a pooling layer is always inserted after the convolution layer. there is.
  • the number of convolution layers and the number of fully connected layers were determined through a hyper-parameter tuning process.
  • learning the model learning proceeded in the direction of minimizing the loss function, and the loss function is as shown in Equations 1 and 2.
  • hyper-parameter tuning was performed using the scikit-optimize (version 0.7.4) python package.
  • the hyper-parameter tuning process is a process of optimizing the values of various parameters (number of convolution layers, number of dense layers, number of convolution filters, etc.) constituting the CNN model. After specifying the number of hidden nodes, activation function, dropout presence, and learning rate as hyper-parameters, an optimal model was built using Bayesian optimization technique. After comparing the performance of several models obtained in the hyper-parameter tuning process using validation data, the model with the best performance is judged to be the best model, and the test Performance evaluation was conducted using the data.
  • the sigmoid function was used for the output layer of the model.
  • the sigmoid function is as shown in Equation 3 below.
  • DPI One probability value
  • the softmax function was used for the output layer of the model, as shown in Equation 4.
  • Equation 4 Since the probability value (DPI) output in Equation 4 is output as many as the number of classes, it was used to classify the type of cancer.
  • Example 4 Construction of neuroblastoma deep learning model of GC plot based on the number of nucleic acid fragments using methylated cfDNA and confirmation of performance
  • ROC Receiver Operating Characteristic
  • Figure 4 shows the probability of having cancer (DPI values calculated in the artificial intelligence model of the present invention as a boxplot in the normal sample and neuroblastoma sample groups, and the red line represents the DPI cutoff of 0.5.
  • Example 5 Construction of neuroblastoma deep learning model of GC plot based on the number of nucleic acid fragments using cfDNA and confirmation of performance
  • the method for diagnosing cancer and predicting cancer types using methylated cell-free nucleic acid is a method using a step of determining a chromosome amount based on an existing read count or a concept of distance between aligned reads Compared to using values related to reads as individual standardized values in a detection method using , since vectorized data is generated and analyzed using an AI algorithm, a similar effect can be exerted even if the read coverage is low, which is useful.

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Abstract

본 발명은 메틸화된 무세포 핵산을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체시료에서 메틸화된 핵산을 추출하여, 서열정보를 획득하여 정렬한 리드를 기반으로 핵산단편의 벡터화된 데이터를 생성한 다음, 이를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 계산된 값을 분석하는 방법을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메틸화된 무세포 핵산을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법은, 기존의 리드 개수(read count) 기반으로 염색체 양을 결정하는 단계를 이용하는 방식 또는 정렬된 리드(reads) 사이의 거리 개념을 이용하는 검출 방법 등에서 리드와 관련된 값을 하나하나의 정형화된 값으로 활용하는 데 비하여 벡터화된 데이터를 생성하여 AI 알고리즘을 이용하여 분석하기 때문에, 리드 커버리지가 낮더라도 유사한 효과를 발휘할 수 있어 유용하다.

Description

메틸화된 무세포 핵산을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법
본 발명은 메틸화된 무세포 핵산을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체시료에서 핵산을 추출하여, 메틸화 정보가 포함된 서열정보를 획득하여 정렬한 리드를 기반으로 핵산단편의 벡터화된 데이터를 생성한 다음, 이를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 계산된 값을 분석하는 방법을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법에 관한 것이다.
임상에서의 암 진단은 통상적으로 병력 조사, 물리적 검사 및 임상적 평가 후 조직 생검(tissue biopsy)을 수행 하여 확인하고 있다. 임상 실험에 의한 암 진단은 암 세포의 수가 10억 개 이상이고 암의 직경이 1cm 이상일 경우에만 가능하다. 이 경우, 암 세포는 이미 전이능력을 가지고 있으며, 적어도 이들 중 반은 이미 전이된 상태이다. 또한, 조직생검은 침습적이어서 환자에게 상당한 불편함을 주고, 암 환자를 치료하다 보면 조직생검을 수행할 수 없는 경우도 자주 있다는 문제점이 있다. 이외에, 암 스크리닝에 있어서 암으로부터 직접 또는 간접적으로 생산되는 물질을 모니터링하기 위한 종양 마커가 사용되고 있지만, 암이 존재하는 경우에도 종양 마커 스크리닝 결과 반 이상이 정상으로 나타나고, 암이 없는 경우에도 자주 양성으로 나타나기 때문에, 그 정확성에 한계가 있다.
이와 같은 통상적인 암 진단 방법의 문제점을 보완할 만한 비교적 간편하고 비침습적이며 높은 민감도 및 특이도를 가진 암 진단 방법의 요구에 따라, 최근 암의 진단, 추적 검사로 환자의 체액을 활용하는 액체생검(liquid biopsy)이 많이 이용되고 있다. 액체생검은 비침습적(non-invasive)인 방법으로, 기존의 침습적인 진단 및 검사방법의 대안으로 주목 받고 있는 진단기술이다.
최근에는 액체생검에서 획득한 세포 유리 DNA (cell free DNA)을 이용하여 암 진단 및 암 종 감별을 수행하는 방법이 개발되고 있으며(US 10975431, Zhou, Xionghui et al., bioRxiv, 2020.07.16.201350), 특히, 세포 유리 핵산의 메틸화 패턴을 이용하여 암 진단/종류를 결정하는 방법이 알려져 있다(Li, Jiaqi et al., bioRxiv, 2021.01.12.426440, US 2020-0131582, KR 10-2148547).
한편, 인공 신경망이란 연결선으로 연결된 많은 수의 인공 뉴런들을 이용하여 생물학적인 시스템의 계산 능력을 모방하는 소프트웨어나 하드웨어로 구현된 연산모델을 나타낸다. 인공 신경망에서는 생물학적인 뉴런의 기능을 단순화시킨 인공 뉴런을 사용하게 된다. 그리고 연결강도를 갖는 연결선을 통해 상호 연결시켜 인간의 인지작용이나 학습과정을 수행하게 된다. 연결강도는 연결선이 갖는 특정 값으로, 연결가중치라고도 한다. 인공신경망의 학습은 지도 학습과 비지도 학습으로 나눌 수 있다. 지도 학습이란 입력 데이터와 그에 대응하는 출력 데이터를 함께 신경망에 넣고, 입력 데이터에 대응하는 출력 데이터가 출력되도록 연결선들의 연결강도를 갱신시키는 방법이다. 대표적인 학습 알고리즘으로는 델타규칙(Delta Rule)과 오류 역전파 학습(Back propagation Learning)이 있다. 비지도 학습이란 목표 값 없이 입력 데이터만을 사용하여 인공신경망이 스스로 연결강도를 학습시키는 방법이다. 비지도 학습은 입력 패턴들 사이의 상관관계에 의해 연결가중치들을 갱신시켜 나가는 방법이다.
기계학습에서 적용되는 많은 데이터는 복잡해지고 차원이 늘어남에 따라 차원의 저주(curse of dimensionality)의 문제가 발생한다. 즉 이는, 필요한 데이터의 차원이 무한으로 갈수록 임의의 두 점간의 거리가 무한대로 발산하며 데이터의 존재량, 즉 밀도가 고차원의 공간에서는 다소 낮아져 데이터의 특성(Feature)을 제대로 반영하지 못하게 되는 것이다(Richard Bellman, Dynamic Programming, 2003, chapter 1). 최근 심층신경망(deep learning)의 발달은 입력층(input layer)과 출력층(output layer) 사이에 숨겨진 층(hidden layer)이 있는 구조로, 입력층으로부터 전달되는 변수 값의 선형 결합(linear combination)을 비선형 함수로 처리하면서 이미지, 영상, 신호데이터 등의 고차원의 데이터에서의 분류기(classifier)의 성능을 크게 향상시켰다고 보고되었다(Hinton, Geoffrey, et al., IEEESignal Processing Magazine Vol. 29.6, pp. 82-97, 2012).
이러한 인공신경망을 이용하여 바이오 분야에 활용하는 다양한 특허(KR 10-2018-124550, KR 10-2019-7038076, KR 10-2019-0003676, KR 10-2019-0001741)가 존재하고 있으며, 본 발명자들은 혈액 내 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA)의 서열분석 정보를 기반으로 인공신경망 분석을 통해 염색체 이상을 검출하는 방법에 대해 특허를 출원한 바 있다(KR 10-2021-0067931).
하지만, 메틸화된 세포 유리 핵산의 정보를 이미지화하여 분석한 사례는 없으며, 또한 전장 유전체 단위의 메틸화된 패턴을 표현하는 사례는 없었다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, 높은 민감도와 정확도의인공지능 기반 암 진단방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 메틸화된 무세포 핵산단편의 거리 또는 양에 기반하여 벡터화된 데이터를 생성하고, 이를 학습된 인공지능 모델로 분석할 경우, 높은 민감도와 정확도로 암 진단 및 암 종 판별을 수행할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 메틸화된 무세포 핵산을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 메틸화된 무세포 핵산을 이용한 암 진단 및 암 종 예측장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 암 진단 및 암 종을 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보가 포함된 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads) 기반의 핵산단편(fragments)을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는단계; (d) 생성된 상기 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계; 및 (e) 상기 출력 결과값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계를 포함하는 암 진단 및 암 종 예측을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보가 포함된 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열 기반의 핵산단편을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는 데이터 생성부; 생성된 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값과 비교하여 암 유무를 판정하는 암 진단부; 및 출력된 결과값을 분석하여 암 종을 예측하는 암 종 예측부를 포함하는 암 진단 및 암 종 예측 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 진단 및 암 종을 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보가 포함된 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads) 기반의 핵산단편을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는단계; (d) 생성된 상기 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계; 및 (e) 상기 출력값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계를 통하여, 암 유무 및 암 종을 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보를 포함하는 서열정보를 획득하는 단계; (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; (c) 상기 정렬된 서열정보(reads) 기반의 핵산단편(fragments)을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는단계; (d) 생성된 상기 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계; 및 (e) 상기 출력 결과값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계를 포함하는 암 진단 및 암 종 예측방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 인공지능 기반 염색체 이상을 판정하기 위한 전체 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 메틸화된 cfDNA를 기반으로 생성한 GC plot의 예시로서, X축은 구간별 염색체이며, Y축은 각 구간에 해당되는 핵산단편 사이의 수를 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 메틸화된 cfDNA를 이용한 핵산단편 사이의 수를 기반으로 생성한 GC plot 이미지 데이터를 학습한 딥러닝 모델에 대하여 neuroblastoma 판정의 정확도를 확인한 결과이며,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, 메틸화된 cfDNA를 이용한 핵산단편 사이의 수를 기반으로 생성한 GC plot 이미지 데이터를 학습한 딥러닝 모델에 대하여 neuroblastoma 판정의 각 데이터 세트별 확률분포를 나타낸 결과로서, (A)는 Training set, (B)는 Validation set, (C)는 Test set을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 cfDNA를 기반으로 생성한 GC plot의 예시로서, X축은 구간별 염색체이며, Y축은 각 구간에 해당되는 핵산단편 사이의 수를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, cfDNA를 이용한 핵산단편 사이의 수를 기반으로 생성한 GC plot 이미지 데이터를 학습한 딥러닝 모델에 대하여 neuroblastoma 판정의 정확도를 확인한 결과이며,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, cfDNA를 이용한 핵산단편 사이의 수를 기반으로 생성한 GC plot 이미지 데이터를 학습한 딥러닝 모델에 대하여 neuroblastoma 판정의 각 데이터 세트별 확률분포를 나타낸 결과로서, (A)는 Training set, (B)는 Validation set, (C)는 Test set을 의미한다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
제1, 제2, A, B 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않으며, 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 이하 설명하는 기술의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 해석되지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함한다" 등의 용어는 설시된 특징, 개수, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 의미하는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 개수, 단계 동작 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도면에 대한 상세한 설명을 하기에 앞서, 본 명세서에서의 구성부들에 대한 구분은 각 구성부가 담당하는 주기능 별로 구분한 것에 불과함을 명확히 하고자 한다. 즉, 이하에서 설명할 2개 이상의 구성부가 하나의 구성부로 합쳐지거나 또는 하나의 구성부가 보다 세분화된 기능별로 2개 이상으로 분화되어 구비될 수도 있다. 그리고 이하에서 설명할 구성부 각각은 자신이 담당하는 주기능 이외에도 다른 구성부가 담당하는 기능 중 일부 또는 전부의 기능을 추가적으로 수행할 수도 있으며, 구성부 각각이 담당하는 주기능 중 일부 기능이 다른 구성부에 의해 전담되어 수행될 수도 있음은 물론이다.
또, 방법 또는 동작 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 발명에서는, 샘플에서 추출한 메틸화된 무세포 핵산에서 획득한 서열 분석 데이터를 참조 유전체에 정렬한 다음, 정렬된 핵산단편을 기반으로 벡터화된 데이터를 생성한 다음, 학습된 인공지능 모델에서 DPI값을 계산하여 기준값과 비교하여 암을 검출할 경우, 높은 민감도와 정확도로 암을 검출할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 혈액에서 추출한 DNA를 메틸화 정보가 포함되도록 시퀀싱 한 뒤, 참조 염색체에 정렬한 다음, 핵산단편 사이의 거리 또는 양을 일정한 염색체 구간 별로 계산하고, 각 유전영역을 X축으로 하고, 핵산단편 사이의 거리 또는 양을 Y축으로 하는 벡터화된 데이터를 생성한 다음, 이를 딥러닝 모델에 학습시켜 DPI 값을 계산하였으며, DPI 값이 기준값 이상일 경우, 암이 있다고 결정하고, 다수의 DPI 값 중, 가장 높은 값을 나타내는 암 종을 실제 암 종으로 결정하는 방법을 개발하였다(도 1)
따라서, 본 발명은 일관점에서,
(a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보가 포함된 서열정보를 획득하는 단계;
(b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
(c) 상기 정렬된 서열정보(reads) 기반의 핵산단편(fragments)을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는단계;
(d) 생성된 상기 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계; 및
(e) 상기 출력 결과값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계를 포함하는 암 진단 및 암 종 예측을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 단편은 생체시료에서 추출한 핵산의 조각이면 제한없이 이용할 수 있으나, 바람직하게는 세포 유리 핵산 또는 세포 내 핵산의 조각일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 단편은 통상의 기술자에게 알려진 모든 방법으로 얻을 수 있으며, 바람직하게는 직접 서열분석하거나, 차세대 염기서열 분석을 통해 서열분석하거나 또는 비특이적 전장 유전체 증폭(non-specific whole genome amplification)을 통해 서열분석하여 얻거나, 프로브 기반 서열분석을 통해 얻을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 핵산 단편은 차세대 염기서열 분석을 이용할 경우에는 리드를 의미할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 바람직하게는 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 급성 골수성 백혈병 (acute-myeloid leukemia), 급성 림프구성 백혈병 (acute-lymphoid leukemia), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 경부암 (head and neck cancer), 폐암, 교모세포종 (glioblastoma), 대장/직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 흑색종 (melanoma), 전립선암, 간암, 갑상선암, 위암, 담낭암, 담도암, 방광암, 소장암, 자궁경부암, 원발부위불명암, 신장암, 식도암, 신경모세포종 및 중피종 (mesothelioma)으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 신경모세포종(neuroblastoma)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서,
상기 (a) 단계는
(a-i) 생체시료에서 메틸화 정보가 포함된 핵산을 수득하는 단계;
(a-ii) 채취된 핵산에서 솔팅-아웃 방법(salting-out method), 컬럼 크로마토그래피 방법(column chromatography method) 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
(a-iii) 정제된 핵산 또는 효소적 절단, 분쇄, 수압 절단 방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)된 핵산에 대하여, 싱글 엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어 엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
(a-iv) 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
(a-v) 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 (a) 단계의 서열정보를 획득하는 단계는 분리된 무세포 DNA를 1백만 내지 1억 리드 깊이로 전장 유전체 시퀀싱을 통해 획득하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생체시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), (혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는) 혈액, 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract), 모발, 구강세포, 태반세포, 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 및 이의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, ”참조집단”은 표준 염기서열 데이터베이스와 같이 비교할 수 있는 기준(reference) 집단으로, 현재 특정 질환 또는 병증이 없는 사람의 집단을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에서 표준 염기서열은 NCBI 등의 공공보건기관에 등록되어 있는 참조 염색체일 수 있다.
본 발명에서, 상기 (a) 단계의 핵산은 무세포 DNA 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 순환종양세포 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 메틸화 정보가 포함된 핵산은 공지의 다양한 방법으로 수득할 수 있으며, 바람직하게는 바이설파이트 전환법(bisulfite conversion), 효소전환법 (Enzymatic conversion) 또는 메틸화 DNA 면역침강법(Methylated DNA Immunoprecipitation, MeDIP)으로 수득한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, DNA 메틸화를 검출할 수 있는 방법은 제한효소 기반 검출 방법이 추가로 있는데, 이는 methylation restriction enzyme(MRE)를 이용하여 메틸화 되지 않은 핵산을 절단하거나, 메틸화 여부에 상관없이 특정 서열(recognition site)를 절단하여 hybridization 방법 또는 PCR과 결합해 분석하는 방법이다.
본 발명에서 바이설파이트 치환에 기반한 방법은 Whole-Genome Bisulfite Sequencing(WGBS), Reduced-Representation Bisulfite Sequencing (RRBS), Methylated CpG Tandems Amplification and Sequencing (MCTA-seq), Targeted Bisulfite Sequencing, Methylation Array 및 Methylation-specific PCR (MSP) 등이 있다.
본 발명에서, 메틸화 DNA를 풍부화(enrichment)하여 분석하는 방법은 Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing (MeDIP-seq), Methyl-CpG Binding Domain Protein Capture Sequencing (MBD-seq) 등이 있다.
본 발명에서 메틸화 DNA를 분석할 수 있는 또 다른 방법은 5-hydroxymethylation profiling이 있으며, 그 예시로는 5hmC-Seal (hMe-Seal), hmC-CATCH, Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation Sequencing (hMeDIP-seq), Oxidative Bisulfite Conversion 등이 있다.
본 발명에서, 상기 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)는 당업계에 공지된 임의의 시퀀싱 방법으로 사용될 수 있다. 선택 방법에 의해 분리된 핵산의 시퀀싱은 전형적으로는 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 수행된다. 차세대 시퀀싱은 개개의 핵산 분자 또는 고도로 유사한 방식으로 개개의 핵산 분자에 대해 클론으로 확장된 프록시 중 하나의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 임의의 시퀀싱 방법을 포함한다(예를 들어, 105개 이상의 분자가 동시에 시퀀싱된다). 일 실시형태에서, 라이브러리 내 핵산 종의 상대적 존재비는 시퀀싱 실험에 의해 만들어진 데이터에서 그것의 동족 서열의 상대적 발생 수를 계측함으로써 추정될 수 있다. 차세대 시퀀싱 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 본 명세서에 참조로서 포함된 문헌(Metzker, M. (2010) Nature Biotechnology Reviews 11:31-46)에 기재된다.
일 실시형태에서, 차세대 시퀀싱은 개개의 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 한다(예를 들어, 헬리코스 바이오사이언스(Helicos BioSciences)의 헬리스코프 유전자 시퀀싱 시스템(HeliScope Gene Sequencing system) 및 퍼시픽바이오사이언스의 팩바이오 알에스 시스템(PacBio RS system)). 다른 실시형태에서, 시퀀싱, 예를 들어, 더 적지만 더 긴 리드를 만들어내는 다른 시퀀싱 방법보다 시퀀싱 단위 당 서열의 더 많은 염기를 만들어내는 대량병렬의 짧은-리드 시퀀싱(예를 들어, 캘리포니아주 샌디에고에 소재한 일루미나 인코포레이티드(Illumina Inc.) 솔렉사 시퀀서(Solexa sequencer)) 방법은 개개의 핵산 분자에 대해 클론으로 확장된 프록시의 뉴클레오타이드 서열을 결정한다(예를 들어, 캘리포니아주 샌디에고에 소재한 일루미나 인코포레이티드(Illumina Inc.) 솔렉사 시퀀서(Solexa sequencer); 454 라이프 사이언스(Life Sciences)(코네티컷주 브랜포드에 소재) 및 아이온 토렌트(Ion Torrent)). 차세대 시퀀싱을 위한 다른 방법 또는 기계는, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 454 라이프 사이언스(Life Sciences)(코네티컷주 브랜포드에 소재), 어플라이드 바이오시스템스(캘리포니아주 포스터 시티에 소재; SOLiD 시퀀서), 헬리코스 바이오사이언스 코포레이션(매사추세츠주 캠브릿지에 소재) 및 에멀젼 및 마이크로 유동 시퀀싱 기법 나노 점적(예를 들어, 지누바이오(GnuBio) 점적)에 의해 제공된다.
차세대 시퀀싱을 위한 플랫폼은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 로슈(Roche)/454의 게놈 시퀀서(Genome Sequencer: GS) FLX 시스템, 일루미나(Illumina)/솔렉사(Solexa) 게놈 분석기(Genome Analyzer: GA), 라이프(Life)/APG의 서포트 올리고(Support Oligonucleotide Ligation Detection: SOLiD) 시스템, 폴로네이터(Polonator)의 G.007 시스템, 헬리코스 바이오사이언스의 헬리스코프 유전자 시퀀싱 시스템(Helicos BioSciences' HeliScope Gene Sequencing system), 옥스포드 나노포어 테크놀로지스(Oxford Nanopore Technologies)의 PromethION, GriION, MinION 시스템 및 퍼시픽 바이오사이언스(Pacific Biosciences)의 팩바이오알에스(PacBio RS) 시스템을 포함한다.
본 발명에서, 상기 (b) 단계의 서열 정렬은 컴퓨터 알고리즘으로서 게놈에서 리드 서열(예를 들어, 차세대 시퀀싱으로부터의, 예를 들어 짧은-리드 서열)이 대부분 리드 서열과 기준 서열 사이의 유사성을 평가함으로써 유래될 가능성이 있는 경우로부터 동일성에 대해 사용되는 컴퓨터적 방법 또는 접근을 포함한다. 서열 정렬 문제에 다양한 알고리즘이 적용될 수 있다. 일부 알고리즘은 상대적으로 느리지만, 상대적으로 높은 특이성을 허용한다. 이들은, 예를 들어 역동적 프로그래밍-기반 알고리즘을 포함한다. 역동적 프로그래밍은 그것들이 더 간단한 단계로 나누어짐으로써 복잡한 문제를 해결하는 방법이다. 다른 접근은 상대적으로 더 효율적이지만, 전형적으로 철저하지 않다. 이는, 예를 들어 대량 데이터베이스 검색을 위해 설계된 휴리스틱(heuristic) 알고리즘 및 확률적(probabilistic) 방법을 포함한다.
전형적으로, 정렬 과정에 두 단계가 있을 수 있다: 후보자 검사 및 서열 정렬. 후보자 검사는 가능한 정렬 위치의 더 짧은 열거에 대해 전체 게놈으로부터 서열 정렬을 위한 검색 공간을 감소시킨다. 용어가 시사하는 바와 같이 서열 정렬은 후보자 검사 단계에 제공된 서열을 갖는 서열을 정렬시키는 단계를 포함한다. 이는 광역 정렬(예를 들어, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 정렬) 또는 국소 정렬(예를 들어, 스미스-워터만 정렬)을 사용하여 수행될 수 있다.
대부분의 속성 정렬 알고리즘은 색인 방법에 기반한 3가지 유형 중 하나를 특징으로 할 수 있다: 해쉬 테이블(예를 들어, BLAST, ELAND, SOAP), 접미사트리(예를 들어, Bowtie, BWA) 및 병합 정렬(예를 들어, 슬라이더(Slider))에 기반한 알고리즘. 짧은 리드 서열은 정렬을 위해 전형적으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 정렬단계는 이에 제한되지는 않으나, BWA 알고리즘 및 Hg19 서열을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 BWA 알고리즘은 BWA-ALN, BWA-SW 또는 Bowtie2 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계의 서열정보(reads)의 길이는, 5 내지 5000 bp이고, 사용하는 서열정보의 수는 5천 내지 500만개가 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 벡터화된 데이터는 정렬된 핵산단편을 기반으로 생성할 수 있는 벡터화된 데이터이면 제한없이 이용가능하며, 바람직하게는 그랜드 캐년 플롯(Grand Canyon plot, GC plot)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 벡터화된 데이터는 이에 한정되지는 않으나 바람직하게는 이미지화된 것을 특징으로 할 수 있다. 이미지는 기본적으로 픽셀로 구성되는데, 픽셀로 구성된 이미지를 벡터화 시키면, 이미지의 종류에 따라서 1차원 2D 벡터(흑백), 3차원 2D 벡터(color(RGB)) 또는 4차원 2D 벡터(color(CMYK))로 표현될 수 있다.
본 발명의 벡터화된 데이터는 이미지에 한정되지 않고, 예를 들어 n개의 흑백 이미지 여러 장으로 쌓아서 n차원의 2D 벡터(Multi-dimensional Vector)를 이용하여 인공지능 모델의 입력 데이터로 사용할 수 있다.
본 발명에서 GC plot은 특정 구간을 (일정한 bin 또는 크기가 다른 bin) X축으로 두고 핵산단편 사이의 거리 또는 수와 같은 핵산단편으로 표현 할 수 있는 수치를 Y축으로 생성한 plot이다.
본 발명에서, 상기 (c) 단계를 수행하기에 앞서 정렬된 핵산단편의 정렬 일치도 점수(mapping quality score)를 만족하는 핵산단편을 따로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 정렬 일치도 점수(mapping quality score)는 원하는 기준에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 15-70점, 더욱 바람직하게는 50~70점 일 수 있고, 가장 바람직하게는 60점일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 GC plot은 정렬된 핵산단편의 염색체 구간 별 분포를 구간 별 핵산단편의 수 또는 핵산단편 사이의 거리를 계산하여 벡터화된 데이터로 생성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 핵산단편의 수 또는 핵산단편 사이의 거리 계산값을 벡터화하는 방법은 계산값을 벡터화하는 공지된 기술이면 제한없이 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 정렬된 서열정보의 염색체 구간 별 분포를 핵산단편의 수로 계산하는 것은 하기의 단계를 포함하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다:
i) 염색체를 일정구간(bin)으로 구분하는 단계;
ii) 각 구간에 정렬된 핵산단편의 수를 결정하는 단계;
iii) 각 구간에 결정된 핵산단편 수를 샘플의 전체 핵산단편 수로 나누어 정규화(normalization)하는 단계; 및
iv) 각 구간의 순서를 X 축 값으로 하고, 상기 iii) 단계에서 계산한 정규화 값을 Y축 값으로 하여 GC plot을 생성하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 정렬된 서열정보의 염색체 구간 별 분포를 핵산단편 사이의 거리로 계산하는 것은 하기의 단계를 포함하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다:
i) 염색체를 일정구간(bin)으로 구분하는 단계;
ii) 각 구간에 정렬된 핵산단편 사이의 거리(Fragments Distance, FD)값을 계산하는 단계;
iii) 각 구간별로 계산된 거리값을 기반으로 각 구간의 거리의 대표값(RepFD)을 결정하는 단계;
iv) 상기 iii) 단계에서 계산된 대표값을 전체 핵산단편 거리 값의 대표값으로 나누어 정규화(normalization)하는 단계; 및
iv) 각 구간의 순서를 X 축 값으로 하고, 상기 iv) 단계에서 계산한 정규화 값을 Y축 값으로 하여 GC plot을 생성하는 단계.
본 발명에서 상기 GC plot은 염색체 1번부터 22번까지의 GC plot을 Y축으로 정렬하여 하나의 이미지를 생성하거나, 1번부터 22번까지 생성한 이미지를 z 축으로 합쳐서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 대표값(RepFD)은 핵산단편 사이의 거리의 합, 차, 곱, 평균, 중앙값, 분위수, 최소값, 최대값, 분산, 표준편차, 중앙값 절대편차, 변동계수 이들의 역수값 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 일정구간(bin)은 1Kb 내지 3Gb인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 핵산단편을 그룹화하는 단계를 추가로 사용할 수 있으며, 이때 그룹화 기준은, 정렬된 핵산단편의 어댑터 서열을 바탕으로 수행할 수 있다. 정방향으로 정렬된 핵산단편과 역방향으로 정렬된 핵산단편으로 별도로 구분하여서 선별된 서열정보에 대해서 핵산단편 사이의 거리를 계산할 수 있다.
본 발명에서, 상기 FD 값은 수득한 n개의 핵산 단편에 대하여, i 번째 핵산 단편과 i+1 내지 n 번째 핵산 단편에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵산 단편의 기준값 사이의 거리로 정의되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 FD 값은 수득한 n개의 핵산 단편에 대하여, 제1핵산 단편과 제2내지 제n개 핵산 단편으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵산 단편의 기준값과의 거리를 계산하여 이들의 합, 차, 곱, 평균, 곱의 로그, 합의 로그, 중앙값, 분위수, 최소값, 최대값, 분산, 표준편차, 중앙값 절대 편차 및 변동 계수로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 값 및/또는 하나 이상의 이들의 역수값과, 가중치가 포함된 계산 결과 및 이에 한정되지 않는 통계치를 FD 값으로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 “하나 이상의 값 및/또는 하나 이상의 이들의 역수값”이라는 기재는 앞서 기재된 수치값들 중에서 하나 또는 2 이상이 조합되어 사용될 수 있다는 의미로 해석된다.
본 발명에서, 상기 “핵산 단편의 기준값”은 핵산 단편의 중앙값으로부터 임의의 값을 더하거나 뺀 값인 것인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 FD 값은 수득한 n개의 핵산 단편에 대하여, 다음과 같이 정의 할 수 있다.
FD = Dist(Ri~Rj) (1<i<j<n),
여기서 Dist 함수는 선별된 Ri와 Rj 두 핵산 단편 사이에 포함되는 모든 핵산 단편의 정렬 위치값 차이의 합, 차, 곱, 평균, 곱의 로그, 합의 로그, 중앙값, 분위수, 최소값, 최대값, 분산, 표준편차, 중앙값 절대 편차 및 변동 계수로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 값 및/또는 하나 이상의 이들의 역수값과, 가중치가 포함된 계산 결과 및 이에 한정되지 않는 통계치를 계산한다.
즉, 본 발명에서 FD 값(Fragment Distance Value)는 정렬된 핵산 단편 사이의 거리를 의미한다. 여기서 거리 계산을 위한 핵산 단편의 선별 경우의 수는 다음과 같이 정의 할 수 있다. 총 N개의 핵산 단편이 존재할 경우 개의 핵산 단편 간 거리 조합이 가능하다. 즉, i가 1일 경우, i+1은 2가 되어 2 내지 n 번째 핵산 단편에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵산 단편과의 거리를 정의 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FD 값은 상기 i 번째 핵산 단편 내부의 특정 위치와 i+1 내지 n 번째 중 어느 하나 이상의 핵산 단편 내부의 특정 위치 사이의 거리를 계산하는 것을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어 어떤 핵산 단편의 길이가 50bp 이며, 염색체 1번의 4,183 위치에 정렬 되었다고 하면, 이 핵산 단편의 거리 계산에 사용할 수 있는 유전적 위치값은 염색체 1번의 4,183 ~ 4,232 이다.
상기 핵산 단편과 인접한 50bp 길이의 핵산 단편이 염색체 1번의 4,232번째 위치에 정렬되면, 이 핵산 단편의 거리 계산에 사용할 수 있는 유전적 위치값은 염색체 1번의 4,232 ~ 4,281이고, 두 핵산 단편 사이의 FD 값은 1에서 99가 될 수 있다.
또 다른 인접한 50bp 길이의 핵산 단편이 염색체 1번의 4123번째 위치에 정렬되면, 이 핵산 단편의 거리 계산에 사용할 수 있는 유전적 위치값은 염색체 1번의 4,123~4,172이며, 두 핵산 단편 사이의 FD 값은 61에서 159이며, 첫 번째 예시 핵산 단편과의 FD 값은 12에서 110으로, 상기 두 FD 값 범위의 한 값의 합, 차, 곱, 평균, 곱의 로그, 합의 로그, 중앙값, 분위수, 최소값, 최대값, 분산, 표준편차, 중앙값 절대 편차 및 변동 계수로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 값 및/또는 하나 이상의 이들의 역수값, 및 가중치가 포함된 계산결과 및 이에 한정되지 않는 통계치를 FD 값으로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 두 FD값 범위의 한 값의 역수값인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다
바람직하게는 본 발명에 있어서, 상기 FD 값은 핵산 단편의 중앙값으로부터 임의의 값을 더하거나 뺀 값인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, FD의 중앙값은 계산된 FD 값들을 크기의 순서대로 정렬했을 때 가장 중앙에 위치하는 값을 의미한다. 예를 들어 1, 2, 100 과 같이 세 개의 값이 있을 때, 2가 가장 중앙에 있기 때문에 2가 중앙값이 된다. 만약 짝수 개의 FD 값이 있을 경우 가운데 있는 두 값의 평균으로 중앙값을 결정 한다. 예를 들어 1, 10, 90, 200의 FD 값이 있을 경우 중앙값은 10과 90의 평균인 50이 된다.
본 발명에 있어서, 상기 임의의 값은 핵산 단편의 위치를 나타낼 수 있으면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 0 내지 5 kbp 또는 핵산 단편 길이의 0 내지 300%, 0 내지 3 kbp 또는 핵산 단편 길이의 0 내지 200%, 0 내지 1 kbp 또는 핵산 단편 길이의 0 내지 100%, 더욱 바람직하게는 0 내지 500 bp 또는 핵산 단편 길이의 0 내지 50% 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 FD값은 페어드 엔드 시퀀싱(paired-end sequencing)일 경우, 정방향 및 역방향 서열정보(reads)의 위치값을 기반으로 도출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어, 50bp 길이의 페어드 엔드 리드 쌍에서, 정방향 리드는 염색체 1번의 4183번째 위치에 정렬되고, 역방향 리드는 4349번째 위치에 정렬되면, 이 핵산단편의 양 말단은 4183, 4349가 되고, 핵산 단편 거리에 사용할 수 있는 기준값은 4183~4349이다. 이 때 상기 핵산 단편과 인접한 다른 페어드 엔드 리드 쌍에서, 정방향 리드는 염색체 1번의 4349번째 위치에 정렬되고, 역방향 리드는 4515번째 정렬되면, 이 핵산 단편의 위치 값은 4349~4515 이다. 이 두 핵산 단편의 거리는 0~333이 될 수 있고, 가장 바람직하게 각 핵산 단편의 중앙값의 거리인 166이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 페어드 엔드 시퀀싱으로 서열정보를 수득할 경우, 서열정보(reads)의 정렬 점수가 기준값 미만인 핵산 단편의 경우, 계산과정에서 제외하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FD 값은 싱글 엔드 시퀀싱(single-end sequencing)일 경우, 정방향 또는 역방향 서열정보(read)의 위치값 한 종류를 기반으로 도출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 싱글 엔드 시퀀싱의 경우, 정방향으로 정렬된 서열정보를 기반으로 위치값을 도출할 경우에는 임의의 값을 더해주며, 역방향으로 정렬된 서열정보를 기반으로 위치값을 도출할 경우에는 임의의 값을 빼주는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 임의의 값은 FD 값이 핵산 단편의 위치를 명확하게 나타내도록 하는 값이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 0 내지 5kbp 또는 핵산 단편 길이의 0 내지 300%, 0 내지 3kbp 또는 핵산 단편 길이의 0 내지 200%, 0 내지 1kbp 또는 핵산 단편 길이의 0 내지 100%, 더욱 바람직하게는 0 내지 500bp 또는 핵산 단편 길이의 0 내지 50% 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 분석하고자 하는 핵산은 시퀀싱 되어 리드(reads)라는 단위로 표현될 수 있다. 이 리드는 시퀀싱 방법에 따라 싱글 엔드 시퀀싱(single end sequencing read, SE) 및 페어드 엔드 시퀀싱(paired end sequencing read, PE)으로 나눌 수 있다. SE 방식의 리드는 핵산 분자의 5`과 3` 중 한 곳을 랜덤한 방향으로 일정한 길이만큼 시퀀싱 한 것을 의미하고, PE 방식의 리드는 5`과 3` 을 모두 일정 한 길이만큼 시퀀싱 하게 된다. 이러한 차이 때문에, SE 모드로 시퀀싱 할 경우 한 개의 핵산 단편으로부터 1개의 리드가 생기고, PE 모드에서는 1개의 핵산 단편으로부터 2개의 리드가 쌍으로 생성되는 것은 통상의 기술자에게 잘 알려진 사실이다.
핵산 단편 사이의 정확한 거리를 계산 하기 위한 가장 이상적인 방식은 핵산 분자를 처음부터 끝까지 시퀀싱하고, 그 리드를 정렬하고, 정렬된 값의 중앙값(센터)을 이용하는 것이다. 그러나 기술적으로 위 방식은 시퀀싱 기술의 한계 및 비용적인 측면 때문에 제약이 있는 실정이다. 따라서 SE, PE와 같은 방식으로 시퀀싱을 하게 되는데, PE 방식의 경우 핵산 분자의 시작과 끝 위치를 알 수 있기 때문에 이 값들의 조합을 통해 핵산 단편의 정확한 위치(중앙값)를 파악 할 수 있으나, SE 방식의 경우 핵산 단편의 한쪽 끝 정보만을 이용할 수 있기 때문에 정확한 위치(중앙값) 계산에 한계가 있다.
또한 정방향, 역방향의 양 뱡향으로 시퀀싱 된(정렬된), 모든 리드의 말단 정보를 이용해 핵산 분자의 거리 계산시, 시퀀싱 방향 이라는 요소 때문에 정확하지 않은 값이 계산 될 수 있다.
따라서, 시퀀싱 방식의 기술적 이유로 정방향 리드의 5`말단은, 핵산 분자의 중심 위치 보다 작은 위치 값을 갖고, 역방향 리드의 3`말단은 큰 값을 갖게 된다. 이러한 특징을 이용해, 정방향 리드의 경우 임의의 값(Extended bp)을 더해주고, 역방향 리드는 빼주게 되면 핵산 분자의 중심 위치에 가까운 값을 추정 할 수 있다.
즉, 임의의 값(Extended bp)은 사용하는 시료에 따라 달라질 수 있으며, 세포유리 핵산의 경우 그 핵산의 평균 길이가 166bp 정도로 알려져 있기 때문에 약 80bp 정도로 설정을 할 수 있다. 만일 단편화 장비(ex; sonication)를 통해 실험이 진행 된 경우 단편화 과정에서 설정한 타겟 길이의 절반 정도를 extended bp으로 설정 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 대표값(RepFD)은 FD 값의 합, 차, 곱, 평균, 중앙값, 분위수, 최소값, 최대값, 분산, 표준편차, 중앙값 절대 편차 및 변동 계수로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 값 및/또는 하나 이상의 이들의 역수값인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 FD 값들의 중앙값, 평균값 또는 이의 역수값인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 인공지능 모델은 정상인 이미지와 암이 있는 이미지를 구별할 수 있도록 학습할 수 있는 모델이면 제한없이 사용가능하며, 바람직하게는 딥러닝 모델인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인공지능 모델은 인공신경망 기반으로 벡터화된 데이터를 분석할 수 있는 인공신경망 알고리즘이면 제한없이 이용할 수 있으나, 바람직하게는 합성곱 신경망(convolutional neural network, CNN), 심층 신경망(Deep Neural Network, DNN), 순환 신경망(Recurrent Neural Network, RNN) 및 오토 인코더(autoencoder)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 순환 신경망은 LSTM(Long-short term memory) 신경망, GRU(Gated Recurrent Unit) 신경망, 바닐라 순환 신경망(Vanilla recurrent neural network) 및 집중적 순환 신경망(attentive recurrent neural network)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인공지능 모델이 CNN일 경우, binary classification을 수행하는 손실함수는 하기 수식 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, Multi-class classification을 수행하는 손실함수는 하기 수식 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
Figure PCTKR2022016448-appb-img-000001
Figure PCTKR2022016448-appb-img-000002
본 발명에서, 상기 binary classification은 인공지능 모델이 암 유무를 판별하도록 학습하는 것을 의미하며, multi-class classification은 인공지능 모델이 암 종을 판별하도록 학습하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 인공지능 모델이 CNN일 경우, 학습은 하기 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다:
i) 생산된 GC plot을 training(학습), validation(검증), test(성능평가) 데이터로 분류하는 단계;
이 때, Training 데이터는 CNN 모델을 학습할 때 사용되고, Validation 데이터는 hyper-parameter tuning 검증에 사용되며, Test 데이터는 최적의 모델 생산 후, 성능 평가로 사용되는 것을 특징으로 함.
ii) Hyper-parameter tuning 및 학습 과정을 통해서 최적의 CNN 모델을 구축하는 단계; 및
iii) Hyper-parameter tuning을 통해서 얻어진 여러 모델의 성능을 validation data를 이용하여 비교하여, validation data 성능이 가장 좋은 모델을 최적의 모델로 결정하는 단계;
본 발명에서, 상기 Hyper-parameter tuning 과정은 CNN 모델을 이루는 여러 parameter(convolution layer 수, dense layer 수, convolution filter 수 등) 값을 최적화 하는 과정으로 Hyper-parameter tuning 과정으로는 Bayesian optimization 및 grid search 기법을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 학습 과정은 정해진 hyper-parameter들을 이용하여 CNN 모델의 내부 parameter(weights)들을 최적화 시켜, Training loss 대비 validation loss가 증가하기 시작하면 모델이 과적합(Overfitting) 되었다 판단하고, 그전에 model 학습을 중단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계에서 인공지능 모델이 입력된 벡터화된 데이터로부터 분석한 결과값은 특정 score 또는 실수이면 제한없이 이용가능하며, 바람직하게는 DPI(Deep Probability Index) 값인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, Deep probability Index는 인공지능 model의 마지막 layer에 binary classification일 경우 sigmoid function, multi-class classification일 경우 softmax function을 사용하여 인공지능의 output을 0 ~ 1 scale로 조정하여 확률값으로 표현한 값을 의미한다.
Binary classification일 경우에는 sigmoid function을 이용하여 암 일 경우 DPI 값이 1이 되게끔 학습을 하게 된다. 예를 들어, 신경모세포종 샘플과 정상 샘플이 입력되면, 신경모세포종 샘플의 DPI 값이 1에 가깝도록 학습하는 것이다.
Multi-class classification 일 경우에는 softmax function을 이용하여, class 개수만큼의 DPI 값을 뽑게 된다. Class 개수만큼의 DPI값의 합은 1이되고, 실제 해당되는 암 종의 DPI값이 1이 되게끔 학습을 하게 된다. 예를 들어, 3개의 class 신경모세포종, 간암, 정상이 있고, 신경모세포종 sample이 들어오면, 유방암 class를 1에 가깝게 학습하게 되는 것이다.
본 발명에서 상기 (d) 단계의 출력 결과값은 암 종별로 도출되는 것을 특징으로 할수 있다.
본 발명에서, 상기 인공지능 모델은 학습할 때, 암이 있으면 output 결과가 1에 가깝게 학습하고, 암이 없으면 output 결과가 0에 가깝게 학습을 시켜서, 0.5를 기준으로 0.5 이상이면 암이 있다고 판단하고, 0.5 이하이면 암이 없다고 판단하여 performance 측정을 수행하였다(Training, validation, test accuracy).
여기서, 0.5의 기준값은 언제든지 바뀔 수 있는 값이라는 것은 통상의 기술자에게 자명한 것이다. 예를 들어서 False positive(위양성)를 줄이고자 하면, 0.5보다 높은 기준값을 설정하여 암이 있다고 판단되는 기준을 엄격하게 가져 갈 수 있고, False Negative(위음성)를 줄이고자 하면 기준값을 더 낮게 측정하여 암이 있다고 판단되는 기준을 조금 더 약하게 가져 갈 수 있다.
가장 바람직하게는 학습된 인공지능 모델을 이용하여 unseen data(학습에 training하지 않은 답을 알고 있는 data)를 적용시켜서, DPI값의 probability를 확인하여 기준값을 정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 출력 결과값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계는 출력 결과값 중, 가장 높은 값을 나타내는 암 종을 샘플의 암으로 판정하는 단계를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보가 포함된 서열정보를 해독하는 해독부;
해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부;
정렬된 서열 기반의 핵산단편을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는 데이터 생성부;
생성된 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값과 비교하여 암 유무를 판정하는 암 진단부; 및
출력된 결과값을 분석하여 암 종을 예측하는 암 종 예측부를 포함하는 암 진단 및 암 종 예측 장치를 포함하는 암 진단 및 암 종 예측장치에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 해독부는 독립된 장치에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 해독부는 NGS 장치에서 메틸화 정보가 포함된 서열정보 즉, read를 생산할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 진단 및 암 종을 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되,
(a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보가 포함된 서열정보를 획득하는 단계;
(b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
(c) 상기 정렬된 서열정보(reads) 기반의 핵산단편을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는단계;
(d) 생성된 상기 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계; 및
(e) 상기 출력 결과값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계를 통하여, 암 유무 및 암 종을 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보를 포함하는 서열정보를 획득하는 단계;
(b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
(c) 상기 정렬된 서열정보(reads) 기반의 핵산단편(fragments)을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는단계;
(d) 생성된 상기 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계; 및
(e) 상기 출력 결과값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계를 포함하는 암 진단 및 암 종 예측방법에 관한 것이다.
다른 양태에서 본원에 따른 방법은 컴퓨터를 이용하여 구현될 수 있다. 일 구현예에서, 컴퓨터는 칩 세트에 연결된 하나 이상의 프로세서를 포함한다. 또한 칩 세트에는 메모리, 저장 장치, 키보드, 그래픽 어댑터(Graphics Adapter), 포인팅 장치(Pointing Device) 및 네트워크 어댑터(Network Adapter) 등이 연결되어 있다. 일 구현예에서, 상기 칩 세트의 성능은 메모리 컨트롤러 허브(Memory Controller Hub) 및 I/O 컨트롤러 허브에 의하여 가능하다. 다른 구현예에서, 상기 메모리는 칩 세트 대신에 프로세서에 직접 연결되어 사용될 수 있다. 저장 장치는 하드 드라이브, CD-ROM(Compact Disk Read-Only Memory), DVD 또는 기타 메모리 장치를 포함하는 데이터를 유지할 수 있는 임의의 장치이다. 메모리는 프로세서에 의하여 사용된 데이터 및 명령에 관여한다. 상기 포인팅 디바이스는 마우스, 트랙볼 (Track Ball) 또는 다른 유형의 포인팅 디바이스일 수 있고, 키보드와 조합하여 입력 데이터를 컴퓨터 시스템으로 전송하는데 사용된다. 상기 그래픽 어댑터는 디스플레이 상에서 이미지 및 다른 정보를 나타낸다. 상기 네트워크 어댑터는 근거리 또는 장거리 통신망으로 컴퓨터 시스템과 연결된다. 본원에 사용되는 컴퓨터는 하지만 위와 같은 구성으로 제한되는 것은 아니고, 일부 구성이 없거나, 추가의 구성을 포함 할 수 있으며, 또한 저장장치영역네트워크(Storage Area Network, SAN)의 일부일 수 있으며, 본원의 컴퓨터는 본원에 따른 방법의 수행을 위한 프로그램에 모듈의 실행에 적합하도록 구성될 수 있다.
본원에서 모듈이라 함은, 본원에 따른 기술적 사상을 수행하기 위한 하드웨어 및 상기 하드웨어를 구동하기 위한 소프트웨어의 기능적, 구조적 결합을 의미할 수 있다. 예컨대, 상기 모듈은 소정의 코드와 상기 소정의 코드가 수행되기 위한 하드웨어 리소스(Resource)의 논리적인 단위를 의미할 수 있으며, 반드시 물리적으로 연결된 코드를 의미하거나, 한 종류의 하드웨어를 의미하는 것은 아님은 본원 기술분야의 당업자에게 자명한 것이다.
본원에 따른 방법은 하드웨어, 펌웨어, 또는 소프트웨어 또는 이들의 조합으로 구현될 수 있다. 소트프웨어로 구현되는 경우 저장매체는 컴퓨터와 같은 장치에 의해 판독가능한 형태의 저장 또는 전달하는 임의의 매체를 포함한다. 예를 들면 컴퓨터 판독가능한 매체는 ROM(Read Only Memory); RAM(Random Access Memory); 자기디스크 저장 매체; 광저장 매체; 플래쉬 메모리 장치 및 기타 전기적, 광학적 또는 음향적 신호 전달 매체 등을 포함한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 혈액에서 메틸화된 cfDNA를 추출하여, 차세대 염기서열 분석 수행
정상인 185명 및 신경모세포종(neuroblastoma) 환자 57명의 혈액을 채취 후 3000 rpm, 25℃, 10분의 조건으로 혈장 부분만 1차 원심분리한 다음, 1차 원심분리된 혈장을 16000g, 25℃, 10분의 조건으로 2차 원심분리하여 침전물을 제외한 혈장 상층액을 분리하였다. 분리된 혈장에 대해 chemagen DNA kit 사용하여 cell-free DNA를 추출하고, Truseq Nano DNA HT library prep kit (Illumina)를 사용해 우선 adaptor ligation 과정까지 수행한 다음, cfMediIP kit (diagnode)의 antibody를 이용해 10 rpm, 4℃, 17시간 반응하여 5mC immunoprecipitation을 진행한 다음 purification을 진행하고, 다시 Truseq Nano DNA HT library prep kit (Illumina)를 사용해 PCR enrichment를 진행하여, 최종적인 library를 제작하였다. 제작한 library는 Novaseq 6000 (Illumina) 를 150 paired-end 모드로 sequencing을 진행하여 샘플 당 약 30 million 개의 reads 를 생산하였다.
실시예 2. 핵산단편 수 기반 GC plot 생성
실시예 1에서 수득한 리드를 bwa(version 0.7.17-r1188) alignment tool을 이용하여 핵산 단편 데이터를 참조 유전체에 정렬한 다음, biobambam2 bammarkduplicates (version 2.0.87) tool을 이용하여 PCR duplicate 핵산 단편을 제거하고, sambamba(version 0.6.6)을 이용하여 mapping quality가 60 이하인 핵산 단편을 제거하였다.
GC plot은 염색체의 시작부터 말단까지 NGS reads가 정렬된 상태를 표현하는데, 성염색체를 제외한 모든 염색체를 겹치지 않는 100 kilobase bin으로 나눈 다음, 각 bin에 할당된 reads의 수를 세었다(read count value). 각 bin에 할당된 reads count 값을 샘플의 전체 reads 수로 나누어 정규화(Normalization) 과정을 진행하였다. 정규화된 bin read count값을 Y값, 각 bin의 순서를 X값으로 놓고 염색체 별로 GC plot 생산하고, 생산한 GC plot을 1번 염색체부터 22번 염색체까지 정렬하여 1개의 이미지를 생산하였다(도 2).
실시예 3. GC plot 기반 신경모세포종 딥러닝 모델 구축 및 DPI 계산
3-1. 딥러닝 모델 구축
실시예 2에서 생산한 GC plot을 training(학습), validation(검증), test(성능평가) 데이터로 나누어, Training 데이터는 CNN 모델을 학습할 때 사용하고, Validation 데이터는 hyper-parameter tuning 검증에 사용하였으며, Test 데이터는 최적의 모델 생산 후, 성능 평가로 사용하였다.
Tensorflow (version 2.4.1)을 이용하여 CNN 모델 구축 및 학습에 사용하였는데, CNN 모델에 구조는 convolution layer -> pooling layer -> fully connected layer 순으로 이루어져 있고, convolution layer 다음에는 항상 pooling layer가 삽입되어 있다. Convolution layer 개수 및 fully connected layer에 개수는 hyper-parameter tuning 과정을 통해서 결정하였다. 모델을 학습할 때, 손실함수(loss function)를 최소화 하는 방향으로 학습 진행하였으며, 손실함수는 수식 1 및 수식 2와 같다.
최적의 모델을 구하기 위해 scikit-optimize (version 0.7.4) python package를 이용하여 hyper-parameter tuning하였다. Hyper-parameter tuning 과정은 CNN 모델을 이루는 여러 parameter(convolution layer 수, dense layer 수, convolution filter 수 등) 값을 최적화 하는 과정으로, Convolution layer 개수, convolution filter 개수, convolution patch size, fully connected layer 개수, hidden node 개수, activation function, dropout 유무, learning rate를 hyper-parameter로 지정 후 Bayesian optimization 기법을 이용하여 최적의 모델 구축하였으며, 정해진 hyper-parameter로 모델을 학습할 때 Training loss 대비 validation loss가 증가하기 시작하면 모델이 과적합(Overfitting) 되었다 판단되어 그전에 model 학습 중단하였고, Hyper-parameter tuning 과정에서 얻어진 여러 모델의 성능을 validation data를 이용하여 비교 후 성능이 가장 좋은 모델을 최적의 모델이라 판단하고, test data를 이용해 성능 평가 진행하였다.
3-2. DPI(Deep Probability Index) 계산
Hyper-parameter tuning을 통해서 구해진 최적의 모델에 데이터 (GC plot)을 넣어주면, 모델의 output layer를 통해서 확률 값이 출력된다.
먼저, Binary classification일 경우에는 모델의 output layer에 sigmoid function을 사용하였다. Sigmoid function은 하기 수식 3과 같다.
Figure PCTKR2022016448-appb-img-000003
수식 3에서 출력되는 확률 값(DPI)은 하나로서, 암의 진단에 사용하였다.
Multi-class classification일 경우에는 모델의 output layer에 softmax function을 사용하였으며, 수식 4와 같다.
Figure PCTKR2022016448-appb-img-000004
수식 4에서 출력되는 확률값(DPI)은 class 개수만큼 출력되므로, 암의 종류 구분에 사용하였다.
실시예 4. 메틸화된 cfDNA를 이용한 핵산단편 수 기반 GC plot의 신경모세포종 딥러닝 모델 구축 및 성능 확인
정상 샘플 (n=186)과 신경모세포종 샘플 (n=57) 을 이용해 DPI 값의 성능을 테스트 하였다. 모든 샘플은 Train, Validation, Test 그룹으로 나눠 진행했고, Train 샘플을 이용하여 model을 구축한 다음 Validation 그룹 및 Test 그룹의 샘플을 이용해서, Train 샘플을 이용해 만든 모델의 성능을 확인하였다.
Figure PCTKR2022016448-appb-img-000005
그 결과, 표 2, 도 3 및 4에 기재된 바와 같이, Accuracy 는 Train, Valid, Test 그룹에서 각각 100 %, 92%, 94.1 %인 것을 확인하였고, ROC 분석 결과인 AUC 값은 Train, Valid, Test 그룹에서 각각 1.0, 0.95, 0.99인 것을 확인하였다.
도 3은 정확도를 측정하는 방법 중 ROC(Receiver Operating Characteristic) curve 를 활용한 분석으로, 커브 아래 면적의 넓이인 AUC(Area Under the Curve) 값이 높을 수록 정확도가 높다고 해석한다. AUC 값은 0-1 사이의 값을 갖으며, 랜덤으로 레이블 값을 예측했을 때 (baseline) 기대되는 AUC 값이 0.5, 완벽히 정확하게 예측했을 때 기대되는 AUC 값이 1이다.
도 4는 본 발명의 인공지능 모델에서 계산된 암이 있을 확률값(DPI 값을 정상 샘플과 신경모세포종 샘플 그룹에서 boxplot으로 나타낸 것으로, 붉은 선이 DPI cutoff인 0.5를 나타낸다.
Figure PCTKR2022016448-appb-img-000006
실시예 5. cfDNA를 이용한 핵산단편 수 기반 GC plot의 신경모세포종 딥러닝 모델 구축 및 성능 확인
5-1. 혈액에서 DNA를 추출하여, 차세대 염기서열 분석 수행
정상인 186명 및 신경모세포종 환자 57명의 혈액을 10mL씩 채취하여 EDTA Tube에 보관하였으며, 채취 후 2시간 이내에 1200g, 4℃15분의 조건으로 혈장 부분만 1차 원심분리한 다음, 1차 원심분리된 혈장을 16000g, 4℃10분의 조건으로 2차 원심분리하여 침전물을 제외한 혈장 상층액을 분리하였다. 분리된 혈장에 대해 Tiangenmicro DNA kit (Tiangen)을 사용하여 cell-free DNA를 추출하고, MGIEasy cell-free DNA library prep set kit 를 사용하여 library preparation 과정을 수행 한 다음, DNBseq G400 장비 (MGI) 를 100 base Paired end 모드로 sequencing 하였다. 그 결과, 샘플 당 약 170 million 개의 reads가 생산되는 것을 확인 하였다.
5-2. 딥러닝 모델 구축 및 성능 확인
정상 샘플 (n=186)과 신경모세포종 샘플 (n=57) 을 이용해 DPI 값의 성능을 테스트 하였다. 모든 샘플은 Train, Validation, Test 그룹으로 나눠 진행했고, Train 샘플을 이용하여 model을 구축한 다음 Validation 그룹 및 Test 그룹의 샘플을 이용해서, Train 샘플을 이용해 만든 모델의 성능을 확인하였다.
Figure PCTKR2022016448-appb-img-000007
그 결과, 표 4, 도 6 및 7에 기재된 바와 같이, Accuracy 는 Train, Valid, Test 그룹에서 각각 92.9 %, 97.3%, 94.6 %인 것을 확인하였고, ROC 분석 결과인 AUC 값은 Train, Valid, Test 그룹에서 각각 0.98, 0.98, 0.95인 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2022016448-appb-img-000008
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 메틸화된 무세포 핵산을 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법은, 기존의 리드 개수(read count) 기반으로 염색체 양을 결정하는 단계를 이용하는 방식 또는 정렬된 리드(reads) 사이의 거리 개념을 이용하는 검출 방법 등에서 리드와 관련된 값을 하나하나의 정형화된 값으로 활용하는 데 비하여 벡터화된 데이터를 생성하여 AI 알고리즘을 이용하여 분석하기 때문에, 리드 커버리지가 낮더라도 유사한 효과를 발휘할 수 있어 유용하다.

Claims (17)

  1. (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보를 포함하는 서열정보를 획득하는 단계;
    (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    (c) 상기 정렬된 서열정보(reads) 기반의 핵산단편(fragments)을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는단계;
    (d) 생성된 상기 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계; 및
    (e) 상기 출력 결과값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계를 포함하는 암 진단 및 암 종 예측을 위한 정보의 제공방법.
  2. (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보를 포함하는 서열정보를 획득하는 단계;
    (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    (c) 상기 정렬된 서열정보(reads) 기반의 핵산단편(fragments)을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는단계;
    (d) 생성된 상기 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계; 및
    (e) 상기 출력 결과값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계를 포함하는 암 진단 및 암 종 예측방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (a) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a-i) 생체시료에서 메틸화 정보가 포함된 핵산을 수득하는 단계;
    (a-ii) 채취된 핵산에서 솔팅-아웃 방법(salting-out method), 컬럼 크로마토그래피 방법(column chromatography method) 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
    (a-iii) 정제된 핵산 또는 효소적 절단, 분쇄, 수압 절단 방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)된 핵산에 대하여, 싱글 엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어 엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
    (a-iv) 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
    (a-v) 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (a-i) 단계의 메틸화 정보는 바이설파이트 전환법(bisulfite conversion), 효소전환법 (Enzymatic conversion) 또는 메틸화 DNA 면역침강법(Methylated DNA Immunoprecipitation, MeDIP)으로 수득한 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 벡터화된 데이터는 그랜드 캐년 플롯(Grand Canyon plot, GC plot) 인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 GC plot은 정렬된 핵산단편의 염색체 구간 별 분포를 구간 별 수(count) 또는 핵산단편(fragment) 사이의 거리를 계산하여 벡터화된 데이터로 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 염색체 구간 별 분포를 핵산단편의 수로 계산하는 것은 하기의 단계를 포함하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법:
    i) 염색체를 일정구간(bin)으로 구분하는 단계;
    ii) 각 구간에 정렬된 핵산단편의 수를 결정하는 단계;
    iii) 각 구간에 결정된 핵산단편 수를 샘플의 전체 핵산단편 수로 나누어 정규화(normalization)하는 단계; 및
    iv) 각 구간의 순서를 X 축 값으로 하고, 상기 iii) 단계에서 계산한 정규화 값을 Y축 값으로 하여 GC plot을 생성하는 단계.
  8. 제6항에 있어서, 상기 염색체 구간 별 분포를 핵산단편 사이의 거리로 계산하는 것은 하기의 단계를 포함하여 수행하는 것을 특징으로 방법:
    i) 염색체를 일정구간(bin)으로 구분하는 단계;
    ii) 각 구간에 정렬된 핵산단편 사이의 거리(Fragments Distance, FD)값을 계산하는 단계;
    iii) 각 구간별로 계산된 거리값을 기반으로 각 구간의 거리의 대표값(RepFD)을 결정하는 단계;
    iv) 상기 iii) 단계에서 계산된 대표값을 전체 핵산단편 사이의 거리 값의 대표값으로 나누어 정규화(normalization)하는 단계; 및
    iv) 각 구간의 순서를 X 축 값으로 하고, 상기 iv) 단계에서 계산한 정규화 값을 Y축 값으로 하여 GC plot을 생성하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 대표값은 핵산단편 사이의 거리의 합, 차, 곱, 평균, 중앙값, 분위수, 최소값, 최대값, 분산, 표준편차, 중앙값 절대편차, 변동계수, 이들의 역수값 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 인공지능 모델은 정상인 벡터화된 데이터와 암이 있는 벡터화된 데이터를 구별할 수 있도록 학습하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 인공지능 모델은 합성곱 신경망(convolutional neural network, CNN), 심층 신경망(Deep Neural Network, DNN), 순환 신경망(Recurrent Neural Network, RNN) 및 오토 인코더(autoencoder)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 인공지능 모델이 CNN이고, binary classification 을 학습할 경우, 손실함수는 하기 수식 1로 표시되며, 상기 인공지능 모델이 CNN이고, Multi-class classification을 학습할 경우, 손실함수는 하기 수식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure PCTKR2022016448-appb-img-000009
    Figure PCTKR2022016448-appb-img-000010
  13. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 인공지능 모델이 입력된 벡터화된 데이터를 분석하여 출력하는 결과값은 DPI(Deep Probability Index)값인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 기준값은 0.5이며, 0.5 이상일 경우, 암인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 출력 결과값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계는 출력 결과값 중, 가장 높은 값을 나타내는 암 종을 샘플의 암으로 판정하는 단계를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보가 포함된 서열정보를 해독하는 해독부;
    해독된 서열을 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부;
    정렬된 서열 기반의 핵산단편을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는 데이터 생성부;
    생성된 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석하고, 기준값과 비교하여 암 유무를 판정하는 암 진단부; 및
    출력된 결과값을 분석하여 암 종을 예측하는 암 종 예측부를 포함하는 암 진단 및 암 종 예측 장치.
  17. 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 암 진단 및 암 종을 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되,
    (a) 생체시료에서 핵산을 추출하여 메틸화 정보가 포함된 서열정보를 획득하는 단계;
    (b) 획득한 서열정보(reads)를 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    (c) 상기 정렬된 서열정보(reads) 기반의 핵산단편을 이용하여 벡터화된 데이터를 생성하는단계;
    (d) 생성된 상기 벡터화된 데이터를 학습된 인공지능 모델에 입력하여 분석한 출력 결과값과 기준값(cut-off value)을 비교하여 암 유무를 판정하는 단계; 및
    (e) 상기 출력 결과값 비교를 통해 암 종을 예측하는 단계를 통하여, 암 유무 및 암 종을 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
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