WO2019139363A1 - 무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도 - Google Patents

무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도 Download PDF

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WO2019139363A1
WO2019139363A1 PCT/KR2019/000371 KR2019000371W WO2019139363A1 WO 2019139363 A1 WO2019139363 A1 WO 2019139363A1 KR 2019000371 W KR2019000371 W KR 2019000371W WO 2019139363 A1 WO2019139363 A1 WO 2019139363A1
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cancer
dna
circulating tumor
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PCT/KR2019/000371
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조은해
이준남
장자현
전영주
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주식회사 녹십자지놈
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    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a circulating tumor DNA, and more particularly, to a method for detecting a circulating tumor DNA by extracting cell-free DNA from a biological sample, obtaining sequence information,
  • the present invention relates to a method for detecting circulating tumor DNA in a cell-free DNA and its use.
  • cfDNA Cell-free DNA
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • cfDNA in healthy human blood exists at a very low concentration of 1-10 ng / ml, but it is 5-10 times higher in cancer patients and may be increased by other factors including chronic inflammation (Wan JCM et al., Nat Rev Cancer. Vol. 4 pp. 223-238, 2017). Therefore, it is important to detect ctDNA that has genetic information of cancer cells in cfDNA. Concentration of ctDNA is known to be correlated with tumor size or stage. According to a study of 640 patients, ctDNA concentrations were 100-fold higher on average in patients with stage 4 than in patients with stage 1 (Bettegow C et al., Sci. Transl Med., 6, pp. 224, 244, 2014). The development of next generation sequencing (NGS) and digital PCR (dPCR) technology has enabled the analysis of trace DNA, and the analysis of ctDNA is accelerating.
  • NGS next generation sequencing
  • dPCR digital PCR
  • ctDNA is characterized by tumor-specific mutations and genetic alterations, reflecting the current state of the tumor because it has a half-life of as short as 2 hours, and is capable of non-invasive and repetitive harvesting (Diehl F et al. , Nat Med Vol. 14, pp. 985-990, 2008).
  • ctDNA is a tumor-specific biomarker, and has been attracting attention as an indicator of cancer diagnosis, monitoring, and prognosis.
  • Cancer is caused by the accumulation of mutations in the cell's genes, which do not normally regulate cell division. Therefore, the chromosomes of cancer cells are characterized by frequent occurrence of chromosomal abnormality such as deletion, duplication, and translocation. As a result of studies on the mechanism of cancer development due to chromosomal abnormalities, attempts to utilize chromosomal abnormalities such as fusion genes as indicators of cancer diagnosis and prognosis (Parker BC and Zhang W, Chin J Cancer. Vol. 11, pp. 594-603, 2013).
  • microdeletion confirmed in the cancer tissue DNA of patients was analyzed by ctDNA before and after surgery. Eight patients before surgery, 3 out of 8 Microdeletion was detected in all relapsed patients. In this way, the detection of microdeletion of ctDNA is clinically significant and tumor-specific chromosomal abnormalities are reflected in ctDNA (Harris FR et al., Sci. Rep. Vol. 6, pp. 29831, 2016).
  • the present inventors have solved the above problems and have made intensive efforts to develop a method for detecting circulating tumor DNA (ctDNA) with high sensitivity, false positive and false negative results. As a result, , The present inventors confirmed that high sensitivity and low false positive / false negative results can be obtained, thus completing the present invention.
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • It is still another object of the present invention to provide a method for diagnosing cancer comprising the step of detecting a circulating tumor DNA by the above method.
  • the present invention provides a method for detecting a cell-free DNA, comprising the steps of: a) obtaining sequence information of a cell-free DNA isolated from a biological sample; b) aligning said sequence information to a reference genome database of reference groups; c) sorting only the sequence information having a cut-off value or more by checking the quality of the sorted sequence information, d) dividing the standard chromosome into a predetermined number of bins, identifying and normalizing the amount of each interval for reads; e) calculating an average and standard deviation of the leads matched in each interval bin normalized in the reference group, and calculating a Z score between the normalized values in step d); f) calculating the I score by classifying the chromosomes using the Z score (z score); And g) determining if the I score is greater than or equal to a cut-off value, determining a sample in which the circulating tumor DNA is present, detecting circulating tumor DNA (ctDNA) in the biological
  • the present invention also provides a method for detecting a cell-free DNA, comprising: a reading unit for reading out sequence information of a cell-free DNA separated from a biological sample; An alignment unit for aligning the decoded sequence to a standard chromosome sequence database of a reference group; A quality management unit for sorting only sequence information of samples having a cut-off value or more with respect to sorted sequence information; (I score) is calculated based on the Z score (Z score), and the I score (I score) is equal to or greater than the reference value
  • the present invention provides a circulating tumor DNA detecting apparatus comprising a determining section for determining whether or not the circulating tumor DNA is present.
  • the invention also provides a computer readable medium comprising instructions configured to be executed by a processor for detecting circular tumor DNA, comprising: a) obtaining sequence information of cell-free DNA isolated from a biological sample; b) aligning the obtained sequence information to a reference genome database of a reference group; c) checking the quality of the sorted sequence information and selecting only the sequence information having a cut-off value or more; d) dividing the standard chromosome into a predetermined number of bins, and identifying and normalizing the amount of each section with respect to the selected sequence information; e) calculating an average and standard deviation of the leads matched in each interval bin normalized in the reference group, and calculating a Z score between the normalized values in step d); f) dividing the chromosomal region based on the Z score and calculating an I score; And g) determining if the I score is greater than or equal to a cut-off value, and determining that the sample is a cirrhotic tumor DNA, .
  • the present invention also provides a method for providing information for determining the incidence, risk or prognosis of cancer, including the above method.
  • FIG. 1 is a whole flow chart for detecting circulating tumor DNA of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the correction result of the number of sequencing leads before and after GC correction by the LOESS algorithm during the QC (quality control) process of the read data.
  • Figure 3 shows the results of an assay for the sensitivity of the assay according to the hybridization ratio of circulating tumor DNA according to the method of the present invention.
  • the sequence analysis data obtained in the sample is normalized, and the sequence analysis is performed based on the reference value, and then divided into a predetermined number of bins to normalize the lead amount per each bin.
  • (I score) is calculated based on the segmentation of the chromosome based on the derived Z score (Z score), and the I score (I score) is equal to or greater than the reference value , It was confirmed that round-off tumor DNA could be detected with high sensitivity and low false positive / false negative when judged as a sample with circulating tumor DNA.
  • the DNA extracted from the blood of normal and cancer patients is sequenced, the quality is managed using the LOESS algorithm, the chromosome is divided into a predetermined number of bins, Is normalized to the GC ratio and then the average and standard deviation of the leads matched to each bin in the normal sample are obtained and then the Z score with the normalized value is calculated and the Z score Z score) is segmented and the I score (I score) is calculated by using this segmentation, and a method of judging the presence of the circulating tumor DNA when the I score (I score) (Fig. 1)
  • read means one nucleic acid fragment that has been analyzed for sequence information using various methods known in the art.
  • " sequence information " and " lead " in this specification have the same meaning in that they are the result of obtaining sequence information through a sequencing process.
  • step d calculating an average and standard deviation of the leads matched in each interval bin normalized in the reference group, and calculating a Z score between the normalized values in step d);
  • g judging that circulating tumor DNA is present in the biological sample when the I score is equal to or greater than a cut-off value, and detecting a circulating tumor DNA (ctDNA) .
  • the nucleic acid purified in step (ai) is randomly fragmented by enzymatic cleavage, comminution or hydroshear method to form single- Sequencing, or a pair-end sequencing library.
  • the term " reference population " refers to a group of reference groups that can be compared, such as a standard sequence database, to a group of people who are currently without a particular disease or condition.
  • the standard nucleotide sequence in the standard chromosome sequence database of the reference group may be a reference chromosome registered in a public health institution such as NCBI.
  • the next-generation sequencer includes, but is not limited to, the Hiseq system of Illuminator Company, the Miseq system of Illuminator Company, the genome of Illuminator Co., Analyzer (GA) system, 454 FLX from Roche Company, SOLiD system from Applied Biosystems Company, LifeTechnology Company's ion torrent system.
  • the alignment step may be performed using the BWA algorithm and the Hg19 sequence, but not limited thereto.
  • the BWA algorithm may include, but is not limited to, BWA-ALN, BWA-SW, or Bowtie2.
  • confirming the quality of the aligned sequence information in the step (c) means checking how much the actual sequencing lead matches the reference chromosome sequence using the mapping quality score index do.
  • the region of the nucleic acid sequence in the step of identifying the region of the nucleic acid sequence of the step (c-i), may be 20 kb to 1 MB, though not limited thereto.
  • the mapping quality score may vary depending on the desired criterion, but may be 15 to 70, more specifically 60 .
  • the GC ratio may vary depending on a desired standard, but may be 20 to 70%, more specifically 30 to 60%.
  • the step c) may be performed except for the data of the central body or the horses of the chromosome.
  • the term " central body " may be characterized by being about 1 Mb from the starting point of each chromosome long arm (q arm), but is not limited thereto.
  • the term " horse group " is characterized by being within 1 Mb from the starting point of each chromosome short arm (p arm) or within 1 Mb from the end point of the long arm (q arm).
  • step (d) the step (d)
  • the constant interval bin in (d-i) may be specifically 50 kb to 1000 kb.
  • a certain interval bin is not limited to 100 kb to 2 MB, specifically 500 kb to 1500 kb, more specifically, More specifically from 800 kb to 1200 kb, and most specifically from 900 kb to 1100 kb.
  • the regression analysis of the step (iii) may be performed using any regression analysis method capable of calculating the regression coefficient, but it may be a LOESS analysis.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the step of calculating the Z score of the step (e) may include the step of standardizing the sequencing lead value for each specific bin. More specifically, .
  • step (f) the step (f)
  • the reference value of the average absolute value of the Z score is 1-2, more specifically, 2.
  • the reference value of the I score in step (g) is 50-150, more specifically 70-130, more specifically 80-120, most specifically 90-110 .
  • a biosensor comprising: a deciphering unit for deciphering sequence information of cell-free DNA isolated from a biological sample; An alignment unit for aligning the decoded sequence to a standard chromosome sequence database of a reference group; A quality management unit for sorting only sequence information of samples having a cut-off value or more with respect to sorted sequence information; (I score) is calculated based on the Z score (Z score), and the I score (I score) is larger than the reference value , And a determination section for determining a sample in which the circulating tumor DNA is present.
  • the present invention is a computer-readable medium comprising instructions configured to be executed by a processor for detecting circular tumor DNA, comprising: a) obtaining sequence information of cell-free DNA isolated from a biological sample; b) aligning the obtained sequence information to a reference genome database of a reference group; c) checking the quality of the sorted sequence information and selecting only the sequence information having a cut-off value or more; d) dividing the standard chromosome into a predetermined number of bins, and identifying and normalizing the amount of each section with respect to the selected sequence information; e) calculating an average and standard deviation of the leads matched in each interval bin normalized in the reference group, and calculating a Z score between the normalized values in step d); f) calculating the I score (I score) by classifying the chromosome region using the calculated Z score (Z score); And g) determining if the I score (I socre) is greater than or equal to a cut-off value, determining that the sample is a
  • the present invention relates to a method for providing information for determining the onset of cancer, the risk of onset, or the prognosis of cancer, including the method.
  • a method for diagnosing cancer comprising the step of detecting a circulating tumor DNA by the above method.
  • " cancer " of the present invention includes, but is not limited to, cancer of solid tumors such as breast, airway, brain, reproductive organs, urinary tract, eye, liver, skin, head and neck, thyroid, parathyroid, It is not.
  • the term also includes lymphoma, sarcoma, and leukemia.
  • breast cancers include, but are not limited to, invasive duct carcinoma, invasive lobular carcinoma, intranasal carcinoma, and lobular carcinoma.
  • Prayer Cancer examples include, but are not limited to, small cell lung carcinoma and non-small cell lung carcinoma, as well as bronchial adenoma and pleura pneumoblastoma.
  • brain tumors include, but are not limited to, brain and hypogastric glioma, cerebellum and cerebral astrocytoma, hematoblastoma, and ventricular cell tumor, as well as neuroectodermal or pineal tumors.
  • Tumors of the male reproductive organs include, but are not limited to, prostate cancer and testicular cancer.
  • Tumors of the female reproductive organs include, but are not limited to, endometrial cancer, cervical cancer, ovarian cancer, vaginal cancer, and vulvar cancer as well as uterine sarcoma.
  • Tumors of the digestive tract include, but are not limited to, anal cancer, colon cancer, rectal cancer, esophageal cancer, gallbladder cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, rectal cancer, small bowel cancer and salivary gland cancer.
  • Tumors of the urinary tract include, but are not limited to, bladder cancer, penile cancer, kidney cancer, renal cancer (e.g., renal cell carcinoma), urothelial cancer and urethral cancer.
  • the ocular cancer includes, but is not limited to, guanine melanoma and retinoblastoma.
  • liver cancers include, but are not limited to, hepatocellular carcinoma (hepatocellular carcinoma with or without fiber stratified variant), cholangiocarcinoma (hepatic carcinoma) and mixed hepatocellular carcinoma.
  • Skin cancers include, but are not limited to, squamous cell carcinoma, Kaposi sarcoma, malignant melanoma, Merkel cell skin cancer and non-melanoma skin cancer.
  • Head and neck cancers include, but are not limited to, larynx / hypopharynx / nasopharyngeal /
  • the lymphomas include, but are not limited to, AIDS-related lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, Hodgkin's disease and lymphoma of the central nervous system.
  • the sarcoma includes, but is not limited to, soft tissue sarcoma, osteosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, lymphatic sarcoma and rhabdomyosarcoma.
  • Leukemias include, but are not limited to, acute myelogenous leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia and hair follicular leukemia.
  • " diagnosis " of the present invention means identification or classification of a medical or pathological state, disease or condition.
  • " diagnosis &quot may refer to the development of cancer, the recurrence of cancer, the progression of cancer or the metastasis of cancer.
  • &Quot; Diagnosis &quot can also refer to the classification of the severity of cancer outbreaks, cancer recurrence, cancer progression, or cancer metastasis.
  • the invention of cancer, the recurrence of cancer, the progression of cancer or the diagnosis of metastasis of cancer can be performed according to any protocol available to a person skilled in the art (e.g. a physician).
  • the term " prognosis " of the present invention means the invention of cancer, the recurrence of cancer, the progression of cancer, and / or the prediction of the likelihood of cancer metastasis.
  • the predictive method of the present invention can be used to make a clinical treatment decision by selecting the most appropriate treatment mode for any particular patient.
  • the predictive method of the present invention is a valuable tool to assist in diagnosing and / or diagnosing cancer patient invention, recurrence of cancer, progression of cancer and / or determining whether cancer metastasis is likely to occur.
  • the DNA of the HG29 cancer cell line was diluted in normal human DNA in various ratios (0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 100% Analysis was performed and an average of 10 million readings of sequence information data per sample were produced.
  • the fastq file was aligned with the reference chromosome Hg19 sequence using the BWA-mem algorithm. There was a possibility of error when sorting the library sequence, and the error was corrected.
  • the chromosomes were segmented by the CBS algorithm using the calculated binaural Z score as data.
  • the I score of each sample was obtained by multiplying the average Z score of the segmented region having an average Z score value of 2 or more and the chromosome length by the sum of these values, and the samples whose I score value exceeded 100 were found to have circulating tumor DNA .
  • I score was calculated by the following equation.
  • the I score values of the samples diluted with 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% and 100% of the DNA of the HG29 cancer cell line are shown in Table 1.
  • FIG. 3 shows the result of evaluating the sensitivity of the analysis according to the hybridization ratio of the circulating tumor DNA.
  • Blood samples of 19 normal and 7 cancer patients were collected in EDTA tubes and stored in EDTA tubes.
  • the blood plasma was first centrifuged at 1200g, 4 ° C, and 15 minutes within 2 hours after collection, The plasma was centrifuged at 16000g at 4 ° C for 10 minutes to separate the plasma supernatant except for the precipitate.
  • cell-free DNA was extracted using QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit, and 2-4 ng of DNA was made into a library to perform sequencing of NextSeq equipment, and an average of 10 million read sequence information data per sample was produced .
  • the I score values were all 0 in 19 normal samples, while the I score values of 7 cancer patient samples were all above 7,500, and the average was 11,121 The I score value was confirmed.
  • the I score of the cancer patient sample is shown in Table 2.
  • the method of detecting circulating tumor DNA not only improves the accuracy of detection of circulating tumor DNA using Next Generation Sequencing (NGS), but also the detection accuracy of a very low concentration of circulating tumor DNA It is possible to increase commercial utilization. Therefore, the method of the present invention can determine the presence of circulating tumor DNA at an early stage and is useful for determining the incidence of cancer, the risk of onset, or the prognosis.
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Abstract

본 발명은 무세포 DNA에서 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 순환 종양 DNA 검출 방법은 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용하여 순환 종양 DNA 검출의 정확도를 높일 뿐만 아니라 검출하기 어려웠던 매우 낮은 농도의 순환 종양 DNA에 대한 검출 정확도를 높여서 상업적 활용도를 높일 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 순환 종양 DNA의 존재 여부를 조기에 판단할 수 있어, 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단에 유용하다.

Description

무세포 DNA를 포함하는 샘플에서 순환 종양 DNA를 검출하는 방법 및 그 용도
본 발명은 순환 종양 DNA를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체시료에서 무세포 DNA(cell free DNA)를 추출하여, 서열정보를 획득한 다음, 염색체 영역의 정규화 교정 및 회귀분석을 이용한 무세포 DNA에서 순환 종양 DNA의 검출방법 및 그 용도에 관한 것이다.
세포의 괴사(necrosis), 세포자살(apoptosis), 분비(secretion)에 의해 혈액, 림프액, 소변 등에서 세포의 존재 여부와 관계없이 검출되는 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA)가 존재한다. 그 중 종양세포로부터 유래되어 혈액을 떠다니는 작은 크기의 genomic DNA를 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)라고 일컫는다(Wan JCM et al., Nat Rev Cancer. Vol. 4 pp. 223-238, 2017).
일반적으로 건강한 사람의 혈액 속 cfDNA는 1-10ng/ml 정도의 매우 낮은 농도로 존재하지만 암 환자에게선 5-10배 이상 높게 나타나며 만성 염증을 비롯한 다른 요인에 의해서도 증가할 수 있다고 알려져 있다(Wan JCM et al., Nat Rev Cancer. Vol. 4 pp. 223-238, 2017). 때문에 cfDNA 안에서 암 세포의 유전정보를 가지고 있는 ctDNA를 검출해 내는 것이 중요하다. ctDNA의 농도는 종양의 크기 또는 병기와 상관관계를 가지는 것으로 알려져 있는데, 640명의 환자를 대상으로 한 조사에 따르면 1병기의 환자에 비해 4병기의 환자에게서 ctDNA 농도가 평균 100배 높게 나타났다( Bettegowda C et al., Sci. Transl Med. Vol. 6, pp. 224ra24, 2014). 차세대염기서열분석법(NGS)과 디지털 PCR(dPCR) 기술의 발전으로 미량의 DNA분석이 가능해지면서 ctDNA의 분석연구가 가속화되고 있다.
또한, ctDNA는 종양 특유의 돌연변이 및 유전적 변화를 포함하고 있으며, 반감기가 2시간 정도로 짧기 때문에 종양의 현재상태를 반영하고, 비침습적이고 반복적 채취가 가능하다는 특징을 가지고 있다(Diehl F et al., Nat Med Vol. 14, pp. 985-990, 2008). 이러한 특징으로 ctDNA는 종양 특이적 생체표지자로써 암 진단, 모니터링 및 예후 관측의 지표로써 각광받고 있으며 다양한 분야에 적용하기 위한 연구가 진행되고 있다.
혈액 속에 존재하는 cfDNA의 존재는 1948년에 알려졌지만 혈액에 미량 존재하기 때문에 초기 시퀀싱(sequencing) 기술로는 분석이 어려웠고, cfDNA를 종양의 생체지표로 이용하기에 분석의 일관성이나 신뢰성이 부족하였다. 하지만 최근 분자진단기술이 발전함에 따라 BEAMing 기법이나 PAP, Digital PCR, TAM-Seq 등의 고감도 분석 기법들이 개발되어 미량의 ctDNA를 검출, 정량화가 가능하게 되면서 임상적으로 적용하기 위한 연구가 진행되고 있다.
ctDNA 분석의 임상적 적용 분야는 조기검진, 진단, 동반진단 및 예후추적 등으로 나누어지는데, 현재 동반진단과 치료의 예후 분석 분야가 가장 진전되어 있다. 초기 단계의 치료가 중요한 암의 특성 상 조기 진단을 위한 연구도 활발히 이루어지고 있으나 초기에 생성되는 ctDNA의 정도가 개인마다 다르며 아직 연구된 암의 종류가 다양하지 않다는 문제점이 있다.
현재 ctDNA를 검출하기 위한 노력이 다방면에서 진행되고 있지만, 아직 기술적인 한계로 인해 ctDNA의 임상적 적용에는 제약이 있으며 꾸준한 기술 개발과 연구가 진행 중인 실정이다. 최근 FDA에서 ctDNA를 통한 유전자검사로 비소세포폐암(NSCLC)을 진단하는 방법이 승인됨에 따라 ctDNA 분석의 임상적 상용화가 시작되었다(http://www.investor.jnj.com/releaseDetail.cfm?releaseid=296494).
암은 세포의 유전자에 돌연변이가 누적되면서 세포분열이 정상적으로 조절되지 않아 발생한다. 때문에 암세포의 염색체는 결실이나 중복, 전좌와 같은 염색체 이상(chromosomal abnormality)이 빈번하게 나타나는 특징이 있다. 염색체 이상으로 인해 나타나는 암의 발생 기작에 관한 연구들이 이루어지면서 융합 유전자(Fusion gene)와 같은 염색체이상을 암의 진단 및 예후관측의 지표로 활용하려는 노력이 계속되고 있다(Parker BC and Zhang W, Chin J Cancer. Vol. 11, pp. 594-603, 2013).
더 나아가 종양세포로부터 유래된 ctDNA는 정상세포에서는 나타나지 않는 염색체이상을 반영한다는 접근에서, cfDNA를 통한 염색체 이상 검출을 임상적으로 활용하려는 연구가 이루어지고 있다. 최근 분자진단기술의 발전으로 cfDNA에서 염색체 이상 검출이 가능해짐에 따라, Digital Karyotyping, PARE 분석을 통해서 암 환자의 cfDNA에서 종양 특이적인 염색체이상을 검출이 가능하다는 연구와 함께 이를 임상적으로 확인한 연구결과들이 보고되고 있다(Leary RJ et al., Sci Transl Med. Vol. 4, Issue 162. 2012).
난소암 환자 10명을 대상으로 한 Faye R. Harris의 연구에 따르면, 환자의 암 조직 DNA에서 확인한 미세결실을 수술 전후에 얻은 ctDNA에서 분석한 결과, 수술 전 8명의 환자, 수술 후 8명 중 3명의 재발환자 모두에게서 미세결실을 검출 하였다. 이를 통해 ctDNA의 미세결실 검출이 임상적으로 유의미하며, 종양 특이적인 염색체 이상이 ctDNA에 반영되는 것을 확인하였다(Harris FR et al., Sci Rep. Vol. 6 pp.29831, 2016).
이러한 기술배경하에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, 높은 민감도와 위양성 및 위음성 결과가 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 검출방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 염색체 영역의 정규화 교정 및 회귀분석을 수행할 경우, 높은 민감도와 낮은 위양성/위음성의 분석결과를 얻을 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 순환 종양 DNA의 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 순환 종양 DNA를 검출하는 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 방법으로 순환 종양 DNA를 검출하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 방법을 포함하는 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 방법으로 순환 종양 DNA를 검출하는 단계를 포함하는 암의 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계; b) 상기 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계 d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화 하는 단계; e) 참조집단에서 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수를 계산하는 단계; f) 상기 Z 점수(z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수(I score)를 계산하는 단계; 및 g) 상기 I 점수(I score)가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정하는 단계를 포함하는, 생체시료 내 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 기준값(cut-off value) 이상인 샘플의 서열정보만 선별하는 품질관리부; 및 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 참조집단 샘플과 비교하여 Z 점수(Z score)를 계산한 다음, 이를 바탕으로 I 점수(I score)를 도출하여, I 점수(I score)가 기준값 이상일 경우, 순환 종양 DNA 존재 여부를 판정하는 결정부를 포함하는 순환 종양 DNA 검출 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 컴퓨터 판독 가능한 매체로서, 순환 종양 DNA를 검출하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계; b) 획득한 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; c) 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계; d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화 하는 단계; e) 참조집단에서 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계; f) 상기 Z 점수(Z score)를 기반으로 염색체 영역을 구분하여, I 점수(I score)를 계산하는 단계; 및 g) I 점수(I score)가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정하는 단계를 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법을 포함하는 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 순환 종양 DNA를 검출하기 위한 전체 흐름도이다.
도 2는 read data의 QC(퀄리티 관리, quality control) 과정 중, LOESS 알고리즘에 의한 GC 교정 전과 후의 시퀀싱 리드 수의 보정결과를 도식화 한 것이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 순환 종양 DNA의 혼성화 비율에 따른 분석 민감도를 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따라 정상인 샘플 및 암 환자 샘플 혈액에서 실제로 순환 종양 DNA를 검출한 다음, 양성일치도(Positive Percent Agreement)를 평가한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 샘플에서 획득한 서열 분석 데이터를 정규화하고, 기준값을 바탕으로 정리한 뒤, 일정 구간(bin)으로 나누어 각 구간(bin) 별 리드 양을 정규화 한 다음, 참조집단 샘플과의 Z 점수(Z score)를 계산하고, 도출된 Z 점수(Z score)를 기반으로 염색체를 다시 나눈 뒤(segmentation), 이를 바탕으로 I 점수(I score)를 계산하여, I 점수(I score)가 기준값 이상일 때 이를 순환종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정할 경우, 높은 민감도와 낮은 위양성/위음성을 가지고 순환 종양 DNA를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 정상인과 암 환자혈액에서 추출한 DNA를 시퀀싱 한 뒤, LOESS 알고리즘을 이용하여 품질을 관리하고, 염색체를 일정 구간(bin)으로 구분하여 각 구간 별 매칭되는 리드 양을 GC 비율로 정규화한 다음, 정상인 샘플에서 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한다음, 상기 정규화한 값과의 Z 점수(Z score)를 계산하고 이를 기반으로 Z 점수(Z score)가 급변하는 염색체 영역을 다시 나눈 뒤(segmentation), 이를 이용하여 I 점수(I score)를 계산하여, I 점수(I score)가 기준값 이상일 경우, 순환종양 DNA가 있다고 판정하는 방법을 개발하였다(도 1)
본 명세서에서 용어 "리드(read)"는, 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 서열정보를 분석한 하나의 핵산 단편을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “서열정보” 및 “리드”는 시퀀싱 과정을 통해 서열정보를 수득한 결과물이라는 점에서 동일한 의미를 가진다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서,
a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계;
b) 상기 획득한 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계;
d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화 하는 단계;
e) 참조집단에서 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계;
f) 상기 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수(I score)를 계산하는 단계; 및
g) 상기 I 점수(I score)가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 상기 생체시료 내에 순환 종양 DNA가 존재하는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서,
상기 a) 단계는
(a-i) 채취된 무세포 DNA에서 염석 방법(salting-out method), 컬럼크로마토그래피 방법(column chromatography method), 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
(a-ii) 상기 정제된 핵산에 대하여, 싱글-엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어-엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
(a-iii) 상기 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
(a-iv) 상기 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 (a-i) 및 상기 (a-ii) 단계 사이에, 상기 (a-i) 단계에서 정제된 핵산을, 효소적 절단, 분쇄 또는 하이드로쉐어방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)하여 싱글-엔드 시퀀싱 또는 페어-엔드 시퀀싱 라이브러리를 제작하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 ”참조집단”은 표준 염기서열 데이터베이스와 같이 비교할 수 있는 기준(reference) 집단으로, 현재 특정 질환 또는 병증이 없는 사람의 집단을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에서 표준 염기서열은 NCBI 등의 공공보건기관에 등록되어 있는 참조 염색체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 차세대 유전자서열 검사기(next-generation sequencer)는 이에 제한되지는 않으나, 일루미나 컴파니의 하이섹(Hiseq) 시스템, 일루미나 컴파니의 마이섹(Miseq) 시스템, 일루미나 컴파니의 게놈 분석기(GA) 시스템, 로슈 컴파니(Roche Company)의 454 FLX, 어플라이드 바이오시스템즈 컴파니의 SOLiD 시스템, 라이프 테크놀러지 컴파니의 이온토렌트 시스템일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 정렬단계는 이에 제한되지는 않으나, BWA 알고리즘 및 Hg19 서열을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 BWA 알고리즘은 BWA-ALN, BWA-SW 또는 Bowtie2 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계에서 상기 정렬된 서열정보에 대하여 퀄리티를 확인하는 것은, 정렬 일치도 점수(Mapping Quality Score) 지표를 이용하여 실제 시퀀싱 리드가 참조 염색체 서열과 얼마나 일치하는지를 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계는
(c-i) 각 정렬된 핵산서열의 영역을 특정하는 단계; 및
(c-ii) 상기 영역 내에서 정렬 일치도 점수(mapping quality score)와 GC 비율의 기준값을 만족하는 서열을 선별하는 단계;를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c-i) 단계의 핵산서열의 영역을 특정하는 단계에서, 핵산서열의 영역은 이에 제한되는 않으나, 20kb~1MB일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c-ii) 단계에서, 상기 기준값은 상기 정렬 일치도 점수(mapping quality score)가는 원하는 기준에 따라 달라질 수 있으나, 구체적으로는 15 내지 70, 보다 구체적으로는 60일 수 있다. 상기 (c-ii) 단계에서, 상기 GC 비율이 원하는 기준에 따라 비율이 달라질 수 있으나, 구체적으로는 20 내지 70%, 보다 구체적으로는 30 내지 60% 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계는 염색체의 중심체 또는 말단체의 데이터를 제외하고 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서 용어 “중심체”는 각 염색체 장완(q arm)의 시작점으로부터 1Mb 내외인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 용어 “말단체”는 각 염색체 단완(p arm)의 시작점으로부터 1 Mb 내외 이내 또는 장완(q arm)의 종료점으로부터 1 Mb 이내인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는
(d-i) 표준 염색체를 일정구간(bin)으로 나누는 단계;
(d-ii) 상기 구간별 정렬된 리드 개수 및 리드들의 GC양을 산출하는 단계;
(d-iii) 상기 리드 개수 및 GC양을 바탕으로 회귀분석을 실시하여 회귀계수를 산출하는 단계; 및
(d-iv) 상기 회귀계수를 이용하여 리드 개수를 정규화하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, (d-i)에서의 일정구간(bin)은, 구체적으로는 50 kb내지 1000 kb일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d-i) 단계의 핵산서열의 영역을 특정하는 단계에서, 일정구간(bin)은 이에 제한되는 않으나, 100 kb 내지 2MB, 구체적으로 500kb 내지 1500 kb, 보다 구체적으로는 600kb 내지 1600 kb, 보다 더 구체적으로 800kb 내지 1200 kb, 가장 구체적으로 900 kb 내지 1100 kb 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (iii) 단계의 회귀분석은 회귀계수를 산출할 수 있는 회귀분석 방법이면 모두 이용가능하나, 구체적으로는 LOESS 분석인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계는 특정 영역(bin)별 시퀀싱 리드 값을 표준화하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로는 하기의 수식 1로 계산하는 것을 특징으로 할 수 있다.
Figure PCTKR2019000371-appb-I000001
본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계는
(f-i) 각 구간별 Z 점수(Z score)를 기반으로 CBS 방법(Circular Binary segmentation method)으로 염색체 영역을 구분하는 단계;
(f-ii) 상기 구분된 구역의 Z 점수(Z score)의 평균 절대값이 기준값 이상인 지역의 염색체 길이(size)를 구하는 단계; 및
(f-iii) 하기 수식 2로 I 점수(I score)를 계산하는 단계:
Figure PCTKR2019000371-appb-I000002
본 발명에 있어서, 상기 Z 점수(Z score)의 평균 절대값의 기준값은 1-2이고, 보다 구체적으로는 2인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (g) 단계의 I 점수(I score)의 기준값은 50-150이고, 보다 구체적으로는 70-130, 보다 더 구체적으로 80-120, 가장 구체적으로 90-110인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 기준값(cut-off value) 이상인 샘플의 서열정보만 선별하는 품질관리부; 및 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 참조집단 샘플과 비교하여 Z 점수(Z score)를 계산한 다음, 이를 바탕으로 I 점수(I score)를 도출하여 I 점수(I score)가 기준값 이상일 경우, 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정하는 결정부를 포함하는 순환 종양 DNA 검출 장치에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 컴퓨터 판독 가능한 매체로서, 순환 종양 DNA를 검출하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계; b) 획득한 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; c) 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계; d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화 하는 단계; e) 참조집단에서 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계; f) 계산된 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체 영역을 구분하여, I 점수(I score)를 계산하는 단계; 및 g) I 점수(I socre)가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정하는 단계를 포함하는, 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 방법을 포함하는 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점에서 상기 방법으로 순환 종양 DNA를 검출하는 단계를 포함하는 암의 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 용어 “암”은 고형 종양, 예로서, 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 눈, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선의 암 및 그의 원위 전이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 용어는 또한 림프종, 육종, 및 백혈병을 포함한다.
유방암의 일례로는 침윤성 관 암종, 침윤성 소엽성 암종, 관상피내 암종, 및 소엽상피내 암종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
기도암의 일례로는 소세포 폐 암종 및 비-소세포 폐 암종 뿐만 아니라, 기관지 선종 및 흉막폐장 모세포종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
뇌암의 일례로는 뇌간 및 시상하부 신경아교종, 소뇌 및 대뇌 성상세포종, 수모세포종, 뇌실막세포종 뿐만 아니라, 신경외배엽 또는 송과체 종양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
남성 생식 기관의 종양으로는 전립선암 및 고환암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여성 생식 기관의 종양으로는 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 질암, 및 외음부암 뿐만 아니라, 자궁의 육종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
소화관의 종양으로는 항문암, 결장암, 직장결장암, 식도암, 담낭암, 위암, 췌장암, 직장암, 소장암 및 타액선암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
요로의 종양으로는 방광암, 음경암, 신장암, 신우암 (예컨대, 신 세포 암종), 요관암 및 요도암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
안구암으로는 안내 흑색종 및 망막모세포종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
간암의 예로는 간세포 암종 (섬유층판성 변형이 있거나 없는 간 세포 암종), 담관암종 (간내 쓸개관 암종) 및 혼합 간세포 담관암종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
피부암으로는 편평세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈 세포 피부암 및 비-흑색종 피부암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
두경부암으로는 후두/하인두/비인두/구인두 암, 및 구순 및 구강 암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
림프종으로는 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨병 및 중추신경계의 림프종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
육종으로는 연조직의 육종, 골육종, 악성 섬유 조직구종, 림프육종 및 횡문근육종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
백혈병으로는 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 모발 상세포 백혈병을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 “진단(diagnosis)”은 의료적 또는 병리적 상태(state), 질병 또는 상태(condition)의 확인 또는 분류를 의미한다. 예를 들면, “진단”은 암의 발병, 암의 재발, 암의 진행 또는 암의 전이를 의미할 수 있다. “진단”은 또한 암의 발병, 암의 재발, 암의 진행 또는 암의 전이의 중증도(severity)의 분류를 의미할 수 있다. 암의 발명, 암의 재발, 암의 진행 또는 암의 전이의 진단은 당업자(예를 들면 의사)가 사용할 수 있는 임의의 프로톨에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 용어 “예후(prognosis)”는 암의 발명, 암의 재발, 암의 진행 및/또는 암의 전이의 가능성의 예측을 의미한다. 본 발명의 상기 예측 방법은 임의의 특정환자에 대한 가장 적절한 치료 양식을 선택하는 것으로 임상적으로 치료 결정을 내리기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 예측 방법은 환자의 암의 발명, 암의 재발, 암의 진행 및/또는 암의 전이가 발생할 가능성이 높은지를 판단하는 것에 대한 진단 및/또는 진단을 보조하는 가치있는 도구이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. I score의 분석 민감도 확인 시험
HG29 암 세포주의 DNA를 정상인 DNA에 다양한 비율(0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 100%)로 희석시킨 샘플을 사용해 라이브러리로 만들어 NextSeq 장비에서 염기서열 분석을 수행 하였으며 샘플 당 평균 10 million read의 서열정보 데이터를 생산하였다.
차세대염기서열분석기(NGS) 장비에서 생성된 Bcl 파일(염기서열정보 포함)을 fastq 형식으로 변환한 다음, fastq 파일을 BWA-mem 알고리즘을 사용하여 참조염색체 Hg19 서열을 기준으로 라이브러리 서열을 정렬하였다. 라이브러리 서열의 정렬 시 오류가 발생할 확률이 있어 오류를 교정하는 과정을 수행하였다.
GC 양에 따라 reads의 분포가 편향되는 것을 확인했고(도 2), LOESS 알고리즘을 사용하여 염색체별 GC 비율에 따라 정렬된 라이브러리 서열의 숫자를 교정하였다(도 2).
이후 하기 수식 1로 Z 점수(Z score)를 계산하였다:
Figure PCTKR2019000371-appb-I000003
I score를 계산하기 위해, 계산된 bin별 Z score를 데이터로 사용해, CBS 알고리즘으로, 염색체를 분할(Segmentation)하는 과정이 선행되었다.
평균 Z score 값이 절대값 2 이상인 분할 지역의 평균 Z score 와 염색체 길이를 곱한 뒤, 이 값들의 합으로 각 샘플의 I score를 구하였고 I score 값이 100을 넘어가는 샘플은 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판단하였다. I score는 하기의 식으로 계산하였다.
Figure PCTKR2019000371-appb-I000004
HG29 암 세포주의 DNA를 정상인 DNA에 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 100%로 희석시킨 샘플들의 I score 값은 표 1과 같다.
Figure PCTKR2019000371-appb-T000001
도 3은 순환 종양 DNA의 혼성화 비율에 따른 분석 민감도를 평가한 결과를 나타낸 것으로, I score 임계값 100을 사용시, 분석민감도는 종양 DNA가 5% 혼성화된 샘플까지 검출 가능한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. I score의 양성일치도, 음성일치도 평가
19명의 정상인과 7명의 암 환자 혈액을 10mL씩 각각 채취하여 EDTA Tube에 보관하였으며, 채취 후 2시간 이내에 1200g, 4℃, 15분의 조건으로 혈장 부분만 1차 원심분리한 다음, 1차 원심분리된 혈장을 16000g, 4℃, 10분의 조건으로 2차 원심분리하여 침전물을 제외한 혈장 상층액을 분리하였다. 분리된 혈장에 대해 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit을 사용하여 cell-free DNA를 추출하고 2-4ng의 DNA를 라이브러리로 만들어 NextSeq 장비 염기서열 분석을 수행 하였으며 샘플당 평균 10 million read의 서열정보 데이터를 생산하였다.
실시예 1의 방법으로, 서열정보 데이터를 분석한 결과 19명의 정상 샘플에서 I score 값은 모두 0으로 확인된 반면, 7명의 암 환자 샘플 I score 값은 모두 7,500이상의 수치가 나타났으며, 평균 11,121의 I score 값을 확인할 수 있었다. 암 환자 샘플의 I score 값은 표 2와 같다.
Figure PCTKR2019000371-appb-T000002
순환 종양 DNA의 존재 여부를 판단하는 임계값을 I score 100으로 기준하였을 때 표 3 및 도 4에 개시된 바와 같이 PPA(Positive Percent Agreement, 양성 일치도)와 NPA(Negative Percent Agreement, 음성 일치도) 모두 100%임을 확인 할 수 있었다.
Figure PCTKR2019000371-appb-T000003
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 순환 종양 DNA 검출 방법은 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용하여 순환 종양 DNA 검출의 정확도를 높일 뿐만 아니라 검출하기 어려웠던 매우 낮은 농도의 순환 종양 DNA에 대한 검출 정확도를 높여서 상업적 활용도를 높일 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 순환 종양 DNA의 존재 여부를 조기에 판단할 수 있어, 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단에 유용하다.

Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는 생체시료 내 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)의 검출 방법:
    a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA 의 서열정보를 획득하는 단계;
    b) 상기 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계;
    d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화하는 단계;
    e) 참조집단의 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수를 계산하는 단계;
    f) 상기 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수를 계산하는 단계; 및
    g) 상기 I 점수(I score)가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 상기 생체시료 내에 순환 종양 DNA가 존재하는 것으로 판정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법:
    (a-i) 채취된 무세포 DNA에서 염석 방법(salting-out method), 컬럼크로마토그래피 방법(column chromatography method), 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
    (a-ii) 상기 정제된 핵산에 대하여, 싱글-엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어-엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
    (a-iii) 상기 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
    (a-iv) 상기 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 (a-i) 및 상기 (a-ii) 단계 사이에, 상기 (a-i) 단계에서 정제된 핵산을, 효소적 절단, 분쇄 또는 하이드로쉐어방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)하여 싱글-엔드 시퀀싱 또는 페어-엔드 시퀀싱 라이브러리를 제작하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법:
    (c-i) 각 정렬된 핵산서열의 영역을 특정하는 단계; 및
    (c-ii) 상기 영역 내에서 정렬 일치도 점수(mapping quality score)와 GC 비율의 기준값을 만족하는 서열을 선별하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 상기 기준값은, 상기 정렬 일치도 점수(mapping quality score)가 15 내지 70이고, GC 비율은 30 내지 60%인 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법.
  6. 제4항에 있어서, c) 단계는, 염색체의 중심체 또는 말단체의 데이터를 제외하고 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법:
    (d-i) 표준 염색체를 일정구간(bin)으로 나누는 단계;
    (d-ii) 상기 구간별 정렬된 리드 개수 및 리드들의 GC양을 산출하는 단계;
    (d-iii) 상기 리드 개수 및 GC양을 바탕으로 회귀분석을 실시하여 회귀계수를 산출하는 단계; 및
    (d-iv) 상기 회귀계수를 이용하여 리드 개수를 정규화하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, (d-i)에서의 일정구간(bin)은 100 kb 내지 2 Mb인 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 e) 단계는, 하기의 수식 1로 계산하는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법:
    Figure PCTKR2019000371-appb-I000005
  10. 제1항에 있어서, 상기 (f) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출방법:
    (f-i) 각 구간별 Z 점수를 기반으로 CBS(Circular Binary Segmentation) 방법으로 염색체 영역을 구분하는 단계;
    (f-ii) 상기 구분된 구역의 Z 점수의 평균 절대값이 기준값 이상인 지역의 염색체길이(size)를 구하는 단계; 및
    (f-iii) 하기 수식 2로 I 점수를 계산하는 단계
    Figure PCTKR2019000371-appb-I000006
  11. 제10항에 있어서, 상기 Z 점수의 평균 절대값의 기준값은 1-2인 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 I 점수의 기준값은 50-150인 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법으로 순환 종양 DNA를 검출 하는 단계를 포함하는 암의 발병 여부, 발병 위험성 또는 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법.
  14. 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 해독하는 해독부;
    해독된 서열을 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부;
    정렬된 서열정보(reads)에 대하여 기준값(cut-off value) 이상인 샘플의 서열정보만 선별하는 품질관리부; 및
    선별된 서열정보(reads)에 대하여, 참조집단 샘플과 비교하여 Z 점수(Z score)를 계산한 다음, 이를 바탕으로 I 점수(I score)를 도출하여, I 점수가 기준값 이상일 경우, 순환 종양 DNA 존재 여부를 판정하는 결정부를 포함하는 순환 종양 DNA 검출 장치.
  15. 컴퓨터 판독 가능한 매체로서, 순환 종양 DNA를 검출하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되,
    a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계;
    b) 획득한 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    c) 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계;
    d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화 하는 단계;
    e) 참조집단에서 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계;
    f) 계산된 Z 점수를 기반으로 염색체 영역을 구분하여, I 점수(I score)를 계산하는 단계; 및
    g) I 점수가 기준값(cut-off value) 이상일 경우, 순환 종양 DNA가 존재하는 샘플로 판정하는 단계;
    를 포함하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법으로 순환 종양 DNA를 검출 하는 단계를 포함하는 암의 진단 방법.
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