CN114703284A - 一种血液游离dna甲基化定量检测方法及其应用 - Google Patents
一种血液游离dna甲基化定量检测方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114703284A CN114703284A CN202210399036.6A CN202210399036A CN114703284A CN 114703284 A CN114703284 A CN 114703284A CN 202210399036 A CN202210399036 A CN 202210399036A CN 114703284 A CN114703284 A CN 114703284A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- methylation
- cfdna
- blood
- sample
- value
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 50
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 title abstract description 15
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 153
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 153
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 47
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 38
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 10
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 4
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 101000648539 Homo sapiens Transmembrane protein 59-like Proteins 0.000 description 2
- 102100028863 Transmembrane protein 59-like Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
- G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
- G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
- G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics
- G16B50/30—Data warehousing; Computing architectures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Abstract
本发明公开了一种血液游离DNA的甲基化定量检测方法及其应用，属于生物检测技术领域。该方法能够有效改善现有的基于游离DNA的甲基化肿瘤标记物的预测准确率，适用于肿瘤的早筛应用。本方法利用健康人类血液白细胞的基因组DNA甲基化率作为血液样本的甲基化值。检测待测血液样本的甲基化率后，通过减去健康血液的甲基化值并与检测到的cfDNA片段数目进行乘积，得到肿瘤细胞来源的甲基化的cfDNA片段的数目，作为cfDNA绝对甲基化值。通过对比研究发现使用cfDNA绝对甲基化值能够显著提高现有cfDNA甲基化肿瘤标记物的预测准确率。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种血液游离DNA甲基化定量检测方法及其应用。
背景技术
癌症的早期检测，在肿瘤有机会发展转移之前检测到肿瘤，是提高肿瘤病人生存的最佳策略。近些年来，大量研究表明检测血液中肿瘤来源的cfDNA是一种非侵入性，安全且有效的早期癌症的检测方法。但很多早期，甚至中晚期肿瘤患者的血液中来源于肿瘤的cfDNA水平却相对较低。因此基于cfDNA的癌症筛查的主要挑战是如何从血液中不同来源的cfDNA中识别出微量的肿瘤来源的cfDNA。
肿瘤的发生与原癌基因的激活与抑癌基因的失活密切相关，而癌症相关基因的表达与沉默往往受到表观遗传信息调控。在多种表观调控方式中，甲基化是一种非常稳定而且具体组织特异性的调控方式。研究者观察到人类正常组织癌变风险与基因组中甲基化变异程度直接相关，比如结直肠癌细胞的异常甲基化的程度相对较高。因而检测血液中的源于肿瘤cfDNA的异常甲基化对于发现早期癌症是一种可靠的方法。
在肿瘤早期，血液中来自于肿瘤细胞的cfDNA总量相对较低。大多数cfDNA都是来自于血液中碎裂的白细胞的基因组DNA。而目前常用的cfDNA甲基化水平的计算方法仅计算肿瘤和白细胞来源cfDNA混合后的甲基化水平，导致来源于肿瘤细胞的cfDNA的信号被稀释，从而影响癌症检测的灵敏度。因而针对血液中的cfDNA甲基化水平采用合适的计算方法，对于准确预测是否发生肿瘤具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的cfDNA甲基化水平计算方法准确度低、灵敏度低的技术问题，本发明目的在于提供一种血液游离DNA甲基化定量检测方法及其应用。
本发明所采用的技术方案为：一种血液游离DNA甲基化定量检测方法，所述检测方法包括：
(1)基底离体样本基因组甲基化值：获取基底离体样本基因组DNA，进行预处理；计算基底离体样本基因组中CpG位点的甲基化值，标记为A1；
(2)待测样本的甲基化值：计算待测样本的血液游离DNA中CpG位点甲基化值，标记为A2；检测待测样本的血液游离DNA片段数目，标记为A3；
(3)cfDNA绝对甲基化值：计算(A2-A1)×A3，得到cfDNA绝对甲基化值。
作为优选地，所述步骤(1)中，基底离体样本基因组为健康人类离体血液提取出白细胞的基因组样本。
作为优选地，所述步骤(1)中，预处理包括将健康人类离体白细胞基因组DNA片段打断、筛选、甲基化建库以及二代测序的处理过程。
作为优选地，所述步骤(1)中，DNA片段大小为150-200bp。
作为优选地，所述步骤(2)中，检测待测样本的血液游离DNA片段数为以二代测序法测序结果进行统计，获得每个区域的片段数目。
作为优选地，所述步骤(3)中，cfDNA绝对甲基化值为评估待测样本中肿瘤来源的发生甲基化的cfDNA的数目。
一种如权利要求1-6任一项所述的检测方法在cfDNA甲基化肿瘤标记物筛选中的应用。
作为优选地，所述筛选的标准值为获得的cfDNA绝对甲基化值。
本发明的有益效果为：
(一)本发明提供了一种血液游离DNA甲基化定量检测方法，该检测方法是通过选用白细胞基因组甲基化水平作为标准品甲基化水平。由于血液中绝大多数cfDNA来自于白细胞，且传统的甲基化水平计算方法计算的实际为来源于白细胞及肿瘤的混合游离DNA的甲基化水平，因而往往会造成极大程度稀释来源于肿瘤的基因组信号。因此本申请该检测方法通过利用白细胞基因组甲基化水平进行矫正，可以更加准确地反映出肿瘤细胞来源的游离肿瘤DNA(ctDNA)的甲基化水平。
(二)本发明提供的该血液游离DNA绝对甲基化值应用于肿瘤血液游离DNA甲基化标记物筛选。基于血液游离DNA绝对甲基化值，进行后续血液游离DNA甲基化肿瘤标记物筛选，得到的血液游离DNA甲基化标记物辅助医务工作者进行癌症诊断和筛查。
(三)本发明则利用健康人类白细胞基因组DNA甲基化作为血液甲基化率基底值，使用待测样本血液游离DNA甲基化值与白细胞甲基化值的差值并与cfDNA片段数目(count)的乘积来评估肿瘤细胞来源的甲基化阳性信号(命名为cfDNA绝对甲基化值)，并应用于肿瘤早期筛查预测模型中。结果显示，使用cfDNA绝对甲基化值能够显著提高现有cfDNA甲基化肿瘤标记物的预测性能。
附图说明
图1为实施例1cfDNA绝对甲基化值的计算流程图；
图2为实施例2中白细胞甲基化数据库的构建示意图；
图3为实施例3中基于ddPCR平台的肿瘤标记物的原传统甲基化值与cfDNA绝对甲基化值；
图4为实施例3中基于ddPCR平台的肿瘤标记物的传统甲基化值与cfDNA绝对甲基化值的癌症预测性能对比；
图5为实施例4中基于NGS平台的肝癌肿瘤标记物的传统甲基化值与cfDNA绝对甲基化值的肝癌预测AUC值；
图6为实施例4中的5个肝癌肿瘤标记物的传统甲基化值与cfDNA绝对甲基化值的肝癌预测AUC值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：cfDNA绝对甲基化计算流程，如图1所示，
本申请实施例提供一种新型的血液游离DNA甲基化的计算方法。用于辅助肿瘤早期诊断与早期筛查中的cfDNA甲基化肿瘤标记物的筛选以及模型的构建。具体包括以下几个步骤：
步骤1：招募健康人志愿者采集健康人群血液，进行白细胞基因组DNA提取、打断和片段筛选。
步骤2：筛选150-200bp大小的片段后进行甲基化建库和测序，并进行生物信息分析计算白细胞基因组中各CpG位点的甲基化水平。
步骤3：使用白细胞基因组DNA甲基化对待检测血液样本的cfDNA甲基化进行矫正，得到该样本的cfDNA绝对甲基化值。
步骤4：得到每个位点cfDNA绝对甲基化数值以后，对候选的甲基化位点进行ROC曲线分析，并计算每个位点的AUC值。对cfDNA绝对甲基化值的肿瘤预测性能进行验证。
具体来说，每一步骤详细内容如下：
步骤1：从健康的体检自愿者离体血液样本中分离中间白膜层中的白细胞，进行细胞培养后提取白细胞基因组DNA；
得到白细胞的基因组DNA之后，将白细胞基因组DNA打断成150-200bp左右的片段(模拟cfDNA片段大小)并进行片段筛选。进行cfDNA提取样本的质控，查看片段大小的分布情况。
步骤2：对片段筛选后的白细胞基因组DNA使用NEBnext Enzymatic Methyl-seq试剂盒将未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶并经PCR反应进一步转化为胸腺嘧啶。转化后继续使用上述试剂盒完成测序文库的构建并对文库进行二代测序。测序结果经过生物信息分析得到白细胞全基因组甲基化位点的传统甲基化值。
步骤3：步骤3.1经过步骤2进行处理得到每个白细胞重复样本和每个位点的甲基化位点甲基化数值之后，将每个样本整理成行为甲基化位点(i)，列为样本(j)的矩阵文件，如下述所示：
其中，Wm为白细胞标准品甲基化数据值矩阵，共测得50个体检自愿者白细胞，12200多个候选肿瘤相关甲基化位点。
步骤3.2
将白细胞甲基化数据按照每个位点进行均值计算，为了保证均值可以代表集中数据的结果，对数据使用切尾平均数的计算方法并且过滤了位点覆盖度小于50x的甲基化位点。将数据的最高和最低的10％的数值过滤，计算80％最集中数据的平均值作为白细胞的每个位点的平均甲基化。
其中，Wav为经过白细胞标准品的甲基化位点均值数据库。
步骤3.3：得到白细胞每个甲基化位点的甲基化数值的均值以后。使用白细胞传统甲基化数值作为血液cfDNA甲基化水平的基底与每个待测样本的传统甲基化值进行比较，得到每个位点甲基化数值与白细胞基底值之间的差异甲基化。具体计算过程如下：
其中，ΔM为各位点样本传统甲基化与白细胞标准品位点甲基化的差值，Sm为所测样本甲基化矩阵，Wav为白细胞标准品甲基化位点传统甲基化值矩阵。
步骤3.4：
得到待测样本中每个位点的甲基化差异之后，与相应甲基化位点上统计的cfDNA片段数目做乘积(ΔM×Cfrag)来计算每个位点的绝对甲基化数值。具体计算过程如下：
其中，Mabs为绝对甲基化值，ΔM为步骤3.3所计算甲基化差值矩阵，Cfrag为包含所测甲基化位点的cfDNA片段数目。
经过以上步骤，可以得到待测样本各CpG位点的cfDNA绝对甲基化值。
步骤4：得到每个CpG位点的cfDNA绝对甲基化值之后，进行后续的位点筛选及建模分析，筛选合适的甲基化位点进行肿瘤早期诊断以及筛查。
实验例2：白细胞甲基化数据库的构建：如图2所示，
步骤1：采集约50例体检渠道志愿者血液作为离体样本，筛选出身体健康体检结果无异常的志愿者离体血液样本。
步骤2：将采集的离体血液样本进行离心，提取中间白膜层的健康人白细胞进行培养。
步骤3：提取白细胞基因组DNA，参考《TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒》标准流程提取白细胞基因组DNA，基因组DNA提取后进行质控。
步骤4：将白细胞基因组DNA打断成150-200bp左右，并筛选片段长度150-200bp左右的DNA片段。
步骤5：片段筛选后的白细胞DNA，进行转化、建库以及白细胞全基因组甲基化NGS测序。
步骤6：下机的原始数据首先使用fastQC过滤低质量的序列(phred33 score<＝20)以及read中的adapter序列和polyA/T序列。过滤后的高质量reads使用BSMAP回帖到hg19人类基因组，并筛选出回帖质量较高的reads。使用picard去除PCR重复后再通过samtools选择回帖到目标基因组区域(DNA甲基化标记物所对应的区域)的reads并计算各个DNA甲基化标记物的甲基化水平。
步骤7：基于该50例健康体检志愿者白细胞基因组样本的甲基化数据，建立初步的健康人白细胞甲基化数据库，并应用于后续待测样本的cfDNA绝对甲基化值的计算中。
实验例3：cfDNA绝对甲基化算法在基于ddPCR平台的肿瘤标记物上的应用
本实验例是cfDNA绝对甲基化算法在ddPCR肿瘤标记物上的应用。所研究的肿瘤标记物的cfDNA绝对甲基化值相比于传统甲基化值，其癌症预测性能有显著提高。
具体实施步骤如下：
步骤1：血浆cfDNA提取：血浆cfDNA提取具体操作步骤使用广州优泽生物游离DNA提取试剂盒《游离DNA提取试剂盒(抽滤法)#C02-1》。
步骤2：cfDNA质量QC：将收集的DNA样本轻柔震荡混匀后进行后续Qubit检测。取2μL用于Qubit 3.0检测，检测样本的浓度。提取总量标准：cfDNA总量≧20ng为合格。
步骤3：DNA甲基化转化：使用广州优泽生物《肝癌甲基化基因检测试剂盒(数字PCR法)#C01-1》参考方法进行cfDNA的转化及PCR扩增。
步骤4：ddPCR甲基化测定：本实施例使用Bio-rad数字PCR仪(QX200DropletDigital PCR(ddPCRTM))对步骤3中转化扩增后的cfDNA进行甲基化率检测，并计算所检测的肿瘤标记物的甲基化率以及包含肿瘤标记物位点的cfDNA片段数目。
步骤5：计算cfDNA绝对甲基化值：
得到所研究的肿瘤标记物的传统甲基化数值之后，进一步利用白细胞的甲基化值并按照以下公式计算绝对甲基化值。
Mabs＝ΔM×Cfrag
其中，Mabs为绝对甲基化值，ΔM为步骤4中检测的肿瘤标记物的甲基化率与健康血液基底值的差值，Cfrag为包含肿瘤标记物位点的cfDNA片段数目。
如图3和图4所示，使用的样本数目为：癌症患者：43例，健康人群样本：102例。针对该145例样本进行cfDNA提取、转化、ddPCR检测以及传统和绝对甲基化值的计算。过滤掉低质量样本后，进行ROC曲线分析。
结果显示健康人群和癌症患者的绝对甲基化值差异相比于传统甲基化差异更加明显，并且绝对甲基化值预测癌症样本时具有更高的准确性。
实验例4：cfDNA绝对甲基化算法在基于二代测序平台的肿瘤标记物上的应用
本实施例探究了cfDNA绝对甲基化算法在基于二代测序平台的肿瘤标记物上的应用并与传统方法进行比较。结果显示使用cfDNA绝对甲基化算法的肝癌肿瘤标记物的预测性能显著提高。
具体实施步骤如下：
步骤1：cfDNA的提取：使用广州优泽生物游离DNA提取试剂盒《游离DNA提取试剂盒(抽滤法)#C02-1》试剂盒进行cfDNA的提取，提取后对cfDNA进行浓度测量。
步骤2：cfDNA甲基化转化及建库测序：为了保证游离DNA的完整性，使用酶转方法进行cfDNA转化，使用试剂盒为《NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit(96次反应)#E7120L》，转化建库方法参考该试剂盒的标准方法。建库完成后，将文库外送测序。
步骤3：测序数据的分析：下机的原始数据首先使用fastQC过滤低质量的序列(phred33 score<＝20)以及read中的接头序列和polyA/T序列。过滤后的高质量reads使用BSMAP回帖到hg19人类基因组，并筛选出回帖质量较高的reads。使用picard去除PCR重复后再通过samtools选择回帖到目标基因组区域(DNA甲基化标记物所对应的区域)的reads并计算各个DNA甲基化标记物的甲基化水平。
步骤4：cfDNA绝对甲基化值的计算：
计算各甲基化位点的传统甲基化值以及回帖到各甲基化位点的cfDNA片段数目。根据cfDNA绝对甲基化值计算公式计算出各甲基化位点的cfDNA绝对甲基化值，并进行肝癌预测ROC曲线分析来比较各位点的两种甲基化值的预测性能。
如图5所示，该实施例使用了肝癌患者血液样本171例，良性肝病患者血液样本126例。针对该297例样本，发明人进行了cfDNA提取、酶转化、建库以及NGS测序，并通过生物信息学分析计算出各CpG位点的传统甲基化数值和绝对甲基化值。使用各位点的甲基化值进行ROC曲线分析发现，各位点的cfDNA绝对甲基化值的AUC值相比于传统方法有了整体的提升。
如图6所示，进一步地，对5个高预测性能的位点进行了详细地研究，发现使用绝对甲基化算法后，这些位点的AUC值均有显著提高。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种血液游离DNA甲基化定量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
(1)基底离体样本基因组甲基化值：获取基底离体样本基因组DNA，进行预处理；计算基底离体样本基因组中CpG位点的甲基化值，标记为A1；
(2)待测样本的甲基化值：计算待测样本的血液游离DNA中CpG位点甲基化值，标记为A2；检测待测样本的血液游离DNA片段数目，标记为A3；
(3)cfDNA绝对甲基化值：计算(A2-A1)×A3，得到cfDNA绝对甲基化值。
2.根据权利要求1所述的血液游离DNA甲基化定量检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，基底离体样本基因组为健康人类离体血液提取出白细胞的基因组样本。
3.根据权利要求1所述的血液游离DNA甲基化定量检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，预处理包括将健康人类离体白细胞基因组DNA片段打断、筛选、甲基化建库以及二代测序的处理过程。
4.根据权利要求3所述的血液游离DNA甲基化定量检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，DNA片段大小为150-200bp。
5.根据权利要求1所述的血液游离DNA甲基化定量检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，检测待测样本的血液游离DNA片段数为以二代测序法测序结果进行统计，获得每个区域的片段数目。
6.根据权利要求1所述的血液游离DNA甲基化定量检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，cfDNA绝对甲基化值为评估待测样本中肿瘤来源的发生甲基化的cfDNA的数目。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的检测方法在cfDNA甲基化肿瘤标记物筛选中的应用。
8.根据权利要求7所述的血液游离DNA甲基化定量检测方法的应用，其特征在于，所述筛选的标准值为cfDNA绝对甲基化值。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210399036.6A CN114703284A (zh) | 2022-04-15 | 2022-04-15 | 一种血液游离dna甲基化定量检测方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210399036.6A CN114703284A (zh) | 2022-04-15 | 2022-04-15 | 一种血液游离dna甲基化定量检测方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114703284A true CN114703284A (zh) | 2022-07-05 |
Family
ID=82174355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210399036.6A Pending CN114703284A (zh) | 2022-04-15 | 2022-04-15 | 一种血液游离dna甲基化定量检测方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114703284A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115064211A (zh) * | 2022-08-15 | 2022-09-16 | 臻和(北京)生物科技有限公司 | 一种基于全基因组甲基化测序的ctDNA预测方法及其应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012162660A2 (en) * | 2011-05-25 | 2012-11-29 | Brown University | Methods using dna methylation for identifying a cell or a mixture of cells for prognosis and diagnosis of diseases, and for cell remediation therapies |
| US20170175205A1 (en) * | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Illumina, Inc. | Distinguishing methylation levels in complex biological samples |
| CN109680049A (zh) * | 2018-12-03 | 2019-04-26 | 东南大学 | 一种基于血液游离DNA高通量测序分析cfDNA所属个体生理状态的方法及其应用 |
| WO2019139363A1 (ko) * | 2018-01-11 | 2019-07-18 | 주식회사 녹십자지놈 | 무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도 |
| US20200131582A1 (en) * | 2016-06-07 | 2020-04-30 | The Regents Of The University Of California | Cell-free dna methylation patterns for disease and condition analysis |
| WO2021133993A2 (en) * | 2019-12-24 | 2021-07-01 | Lexent Bio, Inc. | Methods and systems for molecular disease assessment via analysis of circulating tumor dna |
| US20210358565A1 (en) * | 2017-01-24 | 2021-11-18 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for assessment of genetic variations |
-
2022
- 2022-04-15 CN CN202210399036.6A patent/CN114703284A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012162660A2 (en) * | 2011-05-25 | 2012-11-29 | Brown University | Methods using dna methylation for identifying a cell or a mixture of cells for prognosis and diagnosis of diseases, and for cell remediation therapies |
| US20170175205A1 (en) * | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Illumina, Inc. | Distinguishing methylation levels in complex biological samples |
| US20200131582A1 (en) * | 2016-06-07 | 2020-04-30 | The Regents Of The University Of California | Cell-free dna methylation patterns for disease and condition analysis |
| US20210358565A1 (en) * | 2017-01-24 | 2021-11-18 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for assessment of genetic variations |
| WO2019139363A1 (ko) * | 2018-01-11 | 2019-07-18 | 주식회사 녹십자지놈 | 무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도 |
| CN109680049A (zh) * | 2018-12-03 | 2019-04-26 | 东南大学 | 一种基于血液游离DNA高通量测序分析cfDNA所属个体生理状态的方法及其应用 |
| WO2021133993A2 (en) * | 2019-12-24 | 2021-07-01 | Lexent Bio, Inc. | Methods and systems for molecular disease assessment via analysis of circulating tumor dna |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| XIAOMENG LIU 等: "Comprehensive DNA methylation analysis of tissue of origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing (MCTA-Seq)", 《CLINICAL EPIGENETICS》 * |
| 钟明等: "血浆游离DNA中抑癌基因肿瘤高甲基化基因1甲基化检测方法的建立及其在乳腺疾病诊断中的意义", 《诊断学理论与实践》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115064211A (zh) * | 2022-08-15 | 2022-09-16 | 臻和(北京)生物科技有限公司 | 一种基于全基因组甲基化测序的ctDNA预测方法及其应用 |
| CN115064211B (zh) * | 2022-08-15 | 2023-01-24 | 臻和(北京)生物科技有限公司 | 一种基于全基因组甲基化测序的ctDNA预测方法及装置 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6829211B2 (ja) | 癌スクリーニング及び胎児分析のための変異検出 | |
| JP6161607B2 (ja) | サンプルにおける異なる異数性の有無を決定する方法 | |
| CN113366122B (zh) | 游离dna末端特征 | |
| CN113539355B (zh) | 预测cfDNA的组织特异性来源及相关疾病概率评估系统及应用 | |
| EP3658684B1 (en) | Enhancement of cancer screening using cell-free viral nucleic acids | |
| CN110982907B (zh) | 甲状腺结节相关rDNA甲基化标志物及其应用 | |
| CN106661609B (zh) | 用于预测先天性心脏缺陷的方法 | |
| CN111778326B (zh) | 用于子宫内膜容受性评估的基因标志物组合及其应用 | |
| WO2021139716A1 (en) | Biterminal dna fragment types in cell-free samples and uses thereof | |
| CN111968701A (zh) | 检测指定基因组区域体细胞拷贝数变异的方法和装置 | |
| WO2014171778A1 (ko) | 조기 유방암 예후 예측 진단용 유전자 마커 및 이의 용도 | |
| KR20190085667A (ko) | 무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도 | |
| CN114703284A (zh) | 一种血液游离dna甲基化定量检测方法及其应用 | |
| WO2023142625A1 (zh) | 一种甲基化测序数据过滤方法及应用 | |
| CN114507738A (zh) | 甲基化位点、检测甲基化水平的产品的用途及试剂盒 | |
| CN117441027A (zh) | Heatrich-BS：用于亚硫酸氢盐测序的富含CpG的区域的热富集 | |
| Tsui et al. | Breaking Down Cell-Free DNA Fragmentation: A Markov Model Approach | |
| EP4278015A1 (en) | Methods for determining cancer | |
| KR20240063745A (ko) | Cell-free DNA 를 이용한 건강 및 질병관리 시스템 및 방법 | |
| CN115094143A (zh) | 长链非编码rna在制备子宫内膜癌预后判断、疗效监测和/或复发监控产品中的应用 | |
| CN114141303A (zh) | 一种肺癌筛查模型的构建方法以及肺癌筛查的试剂盒 | |
| KR20200137875A (ko) | 2단계 Z-score에 기반한 비침습적 산전 검사 방법 및 장치 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220705 |