WO2019132581A1 - 유방암 및 난소암 등 암 진단용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

유방암 및 난소암 등 암 진단용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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WO2019132581A1
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cancer
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composition
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임지은
김시은
이민경
김광중
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주식회사 엔젠바이오
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for diagnosing cancer such as breast cancer and ovarian cancer, and a use thereof, and more particularly, to a composition capable of detecting a mutation of BRCA 1/2 gene related to cancer and its use.
  • the cause of breast cancer varies, and when the genetic predisposition is confirmed, it is called hereditary breast cancer.
  • Genes related to breast cancer can be classified into high penetrance genes and low penetrance genes depending on the risk.
  • BRCA1 and BRCA2 are typical high-penetrance genes and are known to increase the risk of breast cancer and ovarian cancer by mutation.
  • Genetic testing for genetic breast cancer and ovarian cancer syndrome (HBOC) is also included, as it is generally recommended that genetic testing for BRCA1 / 2 mutations be found in breast cancer patients, such as family history or the age of breast cancer. do.
  • the BRCA1 gene is located on chromosome 17 and consists of 22 exons. It is the first gene proven to increase the risk of developing breast and ovarian cancer.
  • the BRCA2 gene located on chromosome 13, is composed of 26 exons and has been verified as a gene that increases the risk of breast cancer and ovarian cancer following BRCA1. Those who inherited the BRCA1 and BRCA2 gene mutations from one of their parents will have a chance of developing breast cancer by the age of 70, and the probability of developing breast cancer before the age of 40 to 50 years before menopause is 59%.
  • BRCA1 is involved in the development of ovarian cancer as well as breast cancer, and the incidence of ovarian cancer in people with BRCA1 mutations reaches 44% before age 70 (Ford, et al., 1994).
  • the mutated BRCA gene may be inherited from the paternal as well as the maternal system, and the incidence of breast cancer increases when both males and females have genetic mutations.
  • BRCA1 and BRCA2 mutations have been identified in different ethnic groups, and up to 3400 BRCA1 and BRCA2 mutants, polymorphisms and sequence mutations have been identified (Breast Cancer Information Core (BIC), National Center for Human Genome Research, National Institute of Health: http: //research.nhgri.nih.gov/projects/bic/). Analysis of BRCA1 and BRCA2 gene mutations greatly deepens understanding of breast cancer, but the frequency and specific mutation types of BRCA1 and BRCA2 mutations in Korean have not been revealed. In particular, breast cancer has 7,600 new cases per year in Korea, and women have the second highest incidence rate after stomach cancer (Korea Central Cancer Registry Annual Report).
  • Next-generation sequencing technology is a technology that dramatically reduces the time and cost required for genome decoding because it can produce large amounts of data in a short period of time, unlike conventional methods.
  • the next generation sequencing technology has developed sequencing platform over time, and analysis prices have become cheaper, and genetic diseases, rare diseases, and cancer have succeeded in finding the causative genes of the disease using next-generation sequencing methods.
  • the next most common sequence analysis method of illumina currently used is DNA extraction from a specimen, fragmentation or amplification to a certain size, and then a library having a specific size is prepared and used for sequencing.
  • the first sequencing data is produced by repeating four kinds of complementary nucleotide binding and separation reactions in one base unit using a large-capacity sequencing apparatus, and thereafter, the initial data is processed by trimming, mapping, , Identification of genetic mutations, and analysis of mutation information (Annotation).
  • NGS next-generation sequencing
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a composition for diagnosing breast cancer and ovarian cancer which have high sensitivity and accuracy, and as a result, they have found that a BRCA1 / 2 gene including mutations occurring in breast cancer and ovarian cancer is fragmented on a specific basis, , The present inventors confirmed that the mutation information of the sample can be detected with high sensitivity and accuracy, and completed the present invention.
  • A a first primer capable of amplifying a region of the BRCA 1 gene represented by SEQ ID NO: 303 and comprising inosine at the 5 'end;
  • a first dual primer capable of amplifying a region of Chr 13.32911910 to 32912050 of the BRCA2 gene represented by SEQ ID NO: 327 to detect a single base mutation (SNP);
  • a second dual primer capable of amplifying a region of Chr 13.32912143 to 32912289 of the BRCA2 gene represented by SEQ ID NO: 327 to detect a single base mutation (SNP), thereby providing a composition for diagnosing breast cancer or ovarian cancer do.
  • A amplifying a target gene in a biological sample using the composition; (b) determining the nucleotide sequence of the amplified gene; And (c) detecting the gene mutation by analyzing the determined nucleotide sequence, thereby providing a method for diagnosing a breast cancer or an ovarian cancer-related disease by detecting a gene mutation.
  • the present invention also provides diagnostic use of the composition for diagnosis of breast cancer or ovarian cancer-related diseases.
  • the present invention also provides a method for detecting a mutation of a gene related to breast cancer and ovarian cancer.
  • the present invention also provides a primer comprising a primer represented by SEQ ID NOS: 33, 34, 182, 183, and 270, which specifically binds to a BRCA 1/2 gene sequence and which specifically binds to the BRCA 1/2 gene sequence , At least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 32, 35 to 181, 184 to 269 and 271 to 294.
  • A amplifying a target gene in a biological sample using the composition; (b) determining the nucleotide sequence of the amplified gene; And (c) detecting the gene mutation by analyzing the determined nucleotide sequence, thereby providing a method for diagnosing a breast cancer or an ovarian cancer-related disease by detecting a gene mutation.
  • the present invention also provides diagnostic use of the composition for diagnosis of breast cancer or ovarian cancer-related diseases.
  • the present invention also provides a method for detecting a mutation of a breast cancer or ovarian cancer-associated gene.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of analysis of BRCA1 / 2 gene using a primer set (BRCAaccuTestPlus, A +) according to the present invention and a primer set (BA2)
  • BRCAaccuTestPlus, A + a primer set according to the present invention
  • BA2 a primer set
  • (A) is the result of confirming the ratio of the area that is 50% or more of the average coverage
  • (B) is the result of confirming the ratio of the area that is 20% or more of the average coverage.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of BRCA1 / 2 gene analysis using a primer set (BRCAaccuTestPlus) according to the present invention and a third-party primer set (a third-party product) (B) is the result of measuring average coverage.
  • FIG. 3 is a graph showing the distribution of the BRCA1 / 2 gene according to the lead depth of each sample when the primer set (BRCAaccuTest Plus) according to the present invention and a primer set (other company) (B) is the result of measurement of distribution by lead depth using a third-party product.
  • FIG. 5 is a result of testing coverage of a primer set according to the present invention and an FFPE sample of a third party product.
  • FIG. 6 shows the results of analysis of the BRCA1 / 2 gene in the FFPE sample using the primer set (BRCAaccuTest Plus) according to the present invention and a primer set of a third party.
  • (B) is a result of using a primer set of a third party.
  • FIG. 7 shows the results of measurement of the distribution of ampicillin leads for each sample using a primer set for analysis of FFPE samples of other companies.
  • " NGS " in the present invention means Next Generation Sequencing, which means next generation sequencing and next generation nucleotide sequence analysis. This refers to a technique of sculpting the whole genome and performing sequencing at a large capacity based on chemical hybridization of the fragment, including the technology of Agilent, Illumina, Roche and Life Technologies, Is defined as including technology of third generation technology, Pacificbio technology, technology of Nanopore Technology, and fourth generation technology.
  • &quot Single Nucleotide Variation (SNV) " refers to a single nucleotide polymorphism that refers to a single nucleotide difference in a plurality of populations within a single species, refers to the difference between single nucleotides in the population of the nucleotide sequence and the difference from the standard nucleotide sequence in the sequencing data.
  • SNV Single Nucleotide Variation
  • " insert / deletion mutation (Indel) " in the present invention means insertion or deletion mutation capable of changing the number of nucleic acids of a gene.
  • the mutation of the gene related to breast cancer and ovarian cancer can be accurately diagnosed when the sensitivity and the accuracy are detected.
  • the mutation of BRCA1 / 2 gene related to cancer such as breast cancer and ovarian cancer is analyzed by the NGS method, and mutation of cancer-related gene can be detected with high sensitivity and accuracy ( Table 1, Fig. 5).
  • the present invention provides, in one aspect, (a) a first primer capable of amplifying a region of the BRCA 1 gene represented by SEQ ID NO: 303 and comprising inosine at the 5 'end; (b) a first dual primer capable of amplifying a region of Chr 13.32911910 to 32912050 of the BRCA2 gene represented by SEQ ID NO: 327 to detect a single base mutation (SNP); And (c) a second dual primer capable of amplifying a region of Chr 13.32912143 to 32912289 of the BRCA2 gene represented by SEQ ID NO: 327 to detect a single base mutation (SNP).
  • SNP single base mutation
  • the present invention provides a method of amplifying a target gene, comprising: (a) amplifying a target gene in a biological sample using the composition; (b) determining the nucleotide sequence of the amplified gene; And (c) detecting the gene mutation by analyzing the determined nucleotide sequence, thereby diagnosing a breast cancer or ovarian cancer-related disease.
  • the present invention relates to diagnostic use of the composition for breast cancer or ovarian cancer-related diseases.
  • the 'gene region' of the present invention includes intron sequences of ⁇ 100 bp, specifically ⁇ 50 bp, more specifically ⁇ 20 bp in the exon region and exon region translated into protein.
  • Chr. Means chromosome, and Chr 13 means chromosome 13.
  • Chr 13. 32911910 of the gene region represented by SEQ ID NO: 327 means 32911910 base of chromosome 13 when calculated from the chromosome position in exon 11 of the BRCA2 gene represented by SEQ ID NO: 327, Have the same meaning.
  • the 'oligonucleotide' of the present invention generally means a nucleotide polymer composed of about 10 to about 100 nucleotides. However, the length of the nucleotide may be more than 100 or less than 10 nucleotides.
  • the 'nucleotide' of the present invention is a basic unit of a nucleic acid composed of a phosphate group, a 5-carbon sugar and a nitrogen base.
  • RNA 5-amlodipine is ribose.
  • DNA 5-carbon sugar is 2-deoxyribose.
  • sugars contain a hydroxyl group (-OH) at the 5-carbon sugar-2.
  • -OH hydroxyl group
  • the 'hybridization' of the present invention means the annealing of a complementary sequence to a target nucleic acid (sequence to be detected).
  • a target nucleic acid sequence to be detected.
  • the ability of two nucleic acid polymers, including complementary sequences, to discover each other and hybridize through base pairing is a well-known phenomenon.
  • the 'hybrid' of the present invention is a complex formed between two single-stranded nucleotide sequences by a Watson-Creek base pair or a non-standard base pair between complementary bases.
  • the term " label " of the present invention refers to any atom or molecule that provides a detectable (specifically quantifiable) signal and that can be bound to a nucleic acid.
  • the label can provide a signal detectable by fluorescence, radioactivity, chromaticity, X-ray diffraction or absorption, magnetism, and the like.
  • the ' specificity ' of the present invention refers to the characterization of a probe to describe its ability to distinguish between a target and a non-target sequence.
  • the specificity of the probe means that the nucleotide sequence hybridizes with the target sequence as set forth, and does not substantially hybridize with the non-target sequence or hybridization with the non-target sequence is minimized.
  • the probe specificity depends on sequence and assay conditions.
  • the primer of the present invention can be obtained by cloning a desired sequence using a conventional cloning method (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982) or using a commercially available DNA synthesizer It can be chemically synthesized and obtained in a large amount.
  • the 'dual primer' of the present invention means a primer corresponding to all the SNP sequences of a specific genetic locus of the BRCA1 / 2 gene.
  • the dual primer of the present invention may comprise a first primer complementary to the A / T pair and a second primer complementary to the G / C pair.
  • the 'amplicon' of the present invention means an amplification product amplified by a primer.
  • the primer may be characterized by being able to detect the exon mutation of each gene, the GC ratio being in the range of 40 to 60%, and complementary to the gene sequence having no repeating sequence of nucleotides.
  • the first primer may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 270, and inosine may be bonded to the 5'-terminal thereof.
  • the first dual primer may be a primer represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 33 and 34.
  • the second dual primer may be a primer represented by SEQ ID NOS: 182 and 183.
  • gene fragments satisfying the above conditions are constructed as shown in Table 1 below.
  • the mutation of the gene may be characterized in that it occurs at one or more positions selected from the group consisting of the gene regions described in Table 1.
  • the composition may further comprise a primer capable of amplifying a part or all of one or more gene sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 295 to 343.
  • Sequence information of the gene regions of SEQ ID NOS: 295 to 343 that can be amplified by the primers of the present invention is shown in Table 2 below.
  • composition may further comprise at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 32, 35 to 181, 184 to 269, and 271 to 294.
  • nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 294 of the above primers are shown in Table 3 below.
  • the gene mutation may be a mutation occurring in a gene or a chromosome but specifically includes a group consisting of single nucleotide variation (SNV), insertion / deletion mutation (Indel) and inversion And may be characterized by being one or more mutations selected.
  • SNV single nucleotide variation
  • Indel insertion / deletion mutation
  • inversion may be characterized by being one or more mutations selected.
  • a method of amplifying a target gene comprising: (a) amplifying a target gene using the composition in a biological sample; (b) determining the sequence of the amplified gene; And (c) detecting a mutation of the cancer, such as breast cancer and ovarian cancer, by analyzing the determined base sequence.
  • the step of capturing the gene of the present invention means amplifying a target gene specifically using a primer complementary to the target gene sequence to be analyzed, and the step of detecting the mutation of the gene means that the captured gene fragment is amplified
  • the method refers to a method of determining a sequence by a multiplex parallel sequencing method. Specifically, the method may be performed by the NGS method, but is not limited thereto.
  • the biological sample is selected from the group consisting of blood, frozen tissue, paraffin tissue (FFPE), fine needle aspiration biopsy (FNA), bone marrow aspiration biopsy (BMA), oral cells and mixtures thereof But is not limited thereto.
  • FFPE paraffin tissue
  • FNA fine needle aspiration biopsy
  • BMA bone marrow aspiration biopsy
  • the present invention provides a primer comprising a primer represented by SEQ ID NOS: 33, 34, 182, 183, and 270, which specifically binds to BRCA 1/2 gene sequence, wherein the composition further comprises at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 32, 35 to 181, 184 to 269, and 271 to 294.
  • a method for amplifying a target gene comprising: (a) amplifying a target gene in a biological sample using the composition; (b) determining the nucleotide sequence of the amplified gene; And (c) detecting the gene mutation by analyzing the determined nucleotide sequence, thereby diagnosing a breast cancer or ovarian cancer-related disease.
  • the present invention relates to the use of the composition for diagnosing breast cancer or ovarian cancer-related diseases.
  • a method for amplifying a target gene comprising: (a) amplifying a target gene in a biological sample using the composition; (b) determining the nucleotide sequence of the amplified gene; And (c) detecting the gene mutation by analyzing the determined nucleotide sequence.
  • Example 1 For the BRCA1 / 2 gene, a comparative experiment between the primer prepared in Example 1 and the other product was carried out on a total of 8 positive samples, and the performance was confirmed.
  • the experimental method was Targeted NGS test, and the equipment used in the experiment was MiSeq or MiSeqDx.
  • Raw data in the FASTQ file format was obtained from the MiSeq or MiSeqDx device, and the primer sequence was removed using the ahocorasick algorithm in the FASTQ file.
  • the paired end read is merged into a single read to combine the first pair and the second pair of the trimmed read, and then the BWA-MEM algorithm is used to align the hg19 sequence and the Insertion / Deletion information is used in the GATKLite algorithm
  • the BWA-MEM algorithm is used to align the hg19 sequence and the Insertion / Deletion information is used in the GATKLite algorithm
  • the primer sets (BRCAaccuTestPlus), third-party BRCA test products and third-party FFPE samples using the method of the present invention were compared in the same manner as in 2-1.
  • composition for diagnosing cancer such as breast cancer and ovarian cancer can detect the mutation of BRCA 1/2 gene related to cancer with high sensitivity and accuracy and is useful for diagnosis of cancer such as breast cancer and ovarian cancer.

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Abstract

본 발명은 유방암 및 난소암 등 암 진단용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 BRCA1/2 유전자 특정 영역 서열을 증폭할 수 있는 특이적 프라이머를 포함하는 유방암 및 난소암 등 암 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물을 이용하면, 유방암 및 난소암 등 암 과 관련된 BRCA1/2 유전자 변이를 높은 민감도와 정확도 검출할 수 있어 유용하다.

Description

유방암 및 난소암 등 암 진단용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 유방암 및 난소암 등 암 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 암 관련 BRCA 1/2 유전자의 변이를 검출할 수 있는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
유방암의 발생요인은 다양하며 유전적 소인이 확인되는 경우 유전성 유방암이라 한다. 유전성 유방암과 관련된 유전자는 위험률에 따라 고침투율 유전자와 저침투율 유전자로 나눌 수 있다. BRCA1과 BRCA2는 대표적인 고침투율 유전자로 돌연변이에 의해 유방암 및 난소암의 발병 위험이 증가하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 가족력이나 유방암 발생 나이 등 유방암 환자에서 BRCA1/2 돌연변이가 발견될 가능성이 있는 경우 유전자검사를 권고하고 있으며, 유전성 유방암-난소암 증후군(Hereditary breast and ovarian cancer syndrome, HBOC) 환자도 여기에 포함된다.
BRCA1 유전자는 염색체 17번에 위치하며 22개의 엑손으로 구성되며, 최초로 유방암 및 난소암의 발병 위험성을 증가시키는 유전자로 검증된 유전자이다. BRCA2 유전자는 염색체 13번에 위치하며, 26개의 엑손으로 구성되고 BRCA1에 이어 유방암 및 난소암의 발병 위험성을 증가시키는 유전자로 검증되었다. 부모 중 한쪽으로부터 BRCA1, BRCA2 유전자 돌연변이를 유전받은 사람은 70세가 될 때까지 유방암 발병 확률이 87%에 이르며, 폐경기 이전의 40 내지 50세에 유방암이 발병할 확률은 59%이다.
BRCA1은 유방암뿐 아니라 난소암의 발병에도 관련이 있어, BRCA1 유전자 돌연변이를 가진 사람의 난소암 발병률은 70세 이전에 44%에 이른다(Ford, et al., 1994). 돌연변이가 일어난 BRCA 유전자는 모계뿐 아니라 부계로부터 유전될 수도 있으며, 여성뿐 아니라 남성도 유전자 돌연변이를 가진 경우, 유방암의 발병율은 높아진다.
대략 유방암의 7%, 난소암의 10%가 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 돌연변이와 관련이 있는 것으로 알려지고 있다. 이들 두 유전자 중에 돌연변이가 있을 경우, 유방암 발생률이 56~87%까지 상승되며, 난소암의 발생률도 정상인의 10배 이상으로 상승된다. 또한 유방암, 난소암의 재발율을 증가시키며, 전립선암, 대장암 등 기타 암들에 대한 질병민감도를 증가시키는 것으로 알려져 있다.
BRCA1 및 BRCA2 유전자의 돌연변이 발생빈도는 민족별로 차이가 있으며, 현재까지 3400 여종의 생식세포 BRCA1 및 BRCA2 돌연변이, 다형성 및 서열 변이가 확인되었다(Breast Cancer Information Core(BIC), National Center for Human Genome Research, National Institute of Health:http://research.nhgri.nih.gov/projects/bic/). BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이의 분석은 유방암의 유전에 관한 이해를 크게 심화시켰으나, 한국인을 대상으로 한 BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이의 발생 빈도 및 특이적인 돌연변이 유형에 대해서는 밝혀진 바와 많지 않다. 특히, 유방암은 국내에서 연간 7,600 여명의 신규 환자가 발생하고 있으며, 여성의 경우 위암에 이어 두 번째로 높은 발병률을 기록하고 있다(한국 중앙 암 등록사업 연례보고서).
차세대 염기서열 분석 기술은 기존의 방법과 달리 대용량의 데이터를 빠른 시간에 생산할 수 있으므로, 유전체 해독에 필요한 시간과 비용을 획기적으로 절감시킨 기술이다. 차세대 염기서열 분석 기술은 시간이 지남에 따라 시퀀싱 플랫폼은 발전하고 분석 가격은 점점 저렴해지고 있으며, 유전질환과 희귀질환, 암 등에서 차세대 염기서열 분석법을 이용해 질병의 원인 유전자를 찾는데 성공하고 있다. 현재 가장 많이 이용되고 있는illumina社의 차세대 염기서열 분석법은 검체로부터 DNA를 추출한 이후 조각화 시키거나 일정한 크기로 증폭 시킨 이후 특정 크기를 가지는 라이브러리(library)를 제작하여 시퀀싱에 사용한다. 대용량 시퀀싱 장비를 사용하여 한 개의 염기단위로 4가지 종류의 상보적 뉴클레오타이드(nucleotide) 결합 및 분리 반응을 반복하면서 초기시퀀싱 데이터를 생산하게 되고, 이후에 초기 데이터의 가공(Trimming), 매핑(Mapping), 유전체 변이의 동정 및 변이 정보의 해석(Annotation) 등 생물정보학(Bioinformatics)을 이용한 분석 단계를 수행하여 이루어진다.
최근 임상유전학 분야에서 차세대유전체 염기서열분석법(Next-Generation Sequencing, NGS)를 이용한 다양한 질환에서의 원인유전자 규명에 대한 임상 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 암 유전자 돌연변이 검사에 이용하고자 하는 움직임이 있다. NGS는 기존의 Sanger 염기서열분석법에 비해 비용과 시간을 획기적으로 절감할 수 있는 장점이 있어, 검사에 유용하게 이용될 수 있을 것이라 기대되는 기술이다. 현행 암 유전자 돌연변이 선별검사의 단점을 개선할 새로운 검사법이 필요하기 때문에 최근 대중화된 NGS 기술을 활용하는 것이 대안이 될 수 있다. NGS 기술의 장점은 저렴한 비용으로 대부분의 질환에 대해 동시 선별이 가능하며, 현행 선별검사의 위양성률을 감소시킬 수 있고, 새로운 원인을 찾아낼 수 있다는 것이다.
이에 본 발명자들은 민감도와 정확성이 높은 유방암 및 난소암 진단용 조성물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 유방암 및 난소암에서 발생하는 변이를 포함하는 BRCA1/2 유전자를 특정 기준으로 조각 내어 각 단편 별로 상보적인 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 샘플을 분석할 경우, 샘플의 변이정보를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 유방암 및 난소암 등 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 이용한 유방암 및 난소암 등 암 진단을 위한 유전자 변이 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 (a) 서열번호 303으로 표시되는 BRCA 1 유전자의 영역을 증폭할 수 있고, 5’ 말단에 이노신이 포함된 제1프라이머; (b) 서열번호 327로 표시되는 BRCA 2 유전자의 Chr 13. 32911910 ~ 32912050 영역을 증폭하여 단일염기변이(SNP)를 검출할 수 있는 제1 듀얼 프라이머; 및 (c) 서열번호 327로 표시되는 BRCA 2 유전자의 Chr 13. 32912143 ~ 32912289 영역을 증폭하여 단일염기변이(SNP)를 검출할 수 있는 제2 듀얼 프라이머를 포함하는 유방암 또는 난소암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 조성물을 이용하여 생체시료에서 타겟 유전자를 증폭하는 단계; (b) 상기 증폭된 유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 및 (c) 상기 결정된 염기서열을 분석하여 유전자 변이를 검출하는 단계를 포함하는 유전자 변이의 검출을 통한 유방암 또는 난소암 관련 질환의 진단방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물의 유방암 또는 난소암 관련 질환 진단용도를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 생체시료에서 상기 조성물을 이용하여 타겟 유전자를 포획하는 단계; (b) 포획된 유전자의 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 결정된 염기 서열을 분석하여 유전자 변이를 검출하는 단계;를 포함하는 유방암 및 난소암 관련 유전자 변이의 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, BRCA 1/2 유전자 서열에 특이적으로 결합하는, 서열번호 33, 34, 182, 183, 및 270으로 표시되는 프라이머를 포함하고, BRCA 1/2 유전자 서열에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 내지 32, 35 내지 181, 184 내지 269 및 271 내지 294로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머를 추가로 포함하는 유방암 또는 난소암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 조성물을 이용하여 생체시료에서 타겟 유전자를 증폭하는 단계; (b) 상기 증폭된 유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 및 (c) 상기 결정된 염기서열을 분석하여 유전자 변이를 검출하는 단계를 포함하는 유전자 변이의 검출을 통한 유방암 또는 난소암 관련 질환의 진단방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물의 유방암 또는 난소암 관련 질환 진단용도를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 조성물을 이용하여 생체시료에서 타겟 유전자를 증폭하는 단계; (b) 상기 증폭된 유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 및 (c) 상기 결정된 염기서열을 분석하여 유전자 변이를 검출하는 단계를 포함하는 유방암 또는 난소암 관련 유전자 변이의 검출 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트(BRCAaccuTestPlus, A+)와 타사의 프라이머 세트(BA2)를 이용하여 BRCA1/2 유전자를 분석하였을 때, 각 샘플 별로 모든 검사대상 영역이 고르게 분석되었는지를 확인하는 Uniformity 테스트 결과로서, (A)는 평균 커버리지의 50% 이상인 영역의 비율을 확인한 결과이고, (B)는 평균 커버리지의 20% 이상인 영역의 비율을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머 세트(BRCAaccuTestPlus)와 타사의 프라이머 세트(타사제품)를 이용하여 BRCA1/2 유전자를 분석하였을 때, 각 샘플 별로 커버리지를 측정한 결과로, (A)는 최소 커버리지, (B)는 평균 커버리지를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 프라이머 세트(BRCAaccuTest Plus)와 타사의 프라이머 세트(타사제품)를 이용하여 BRCA1/2 유전자를 분석하였을 때, 각 샘플 별로 리드 depth별 분포를 측정한 결과로, (A)는 본 발명의 프라이머 세트이고, (B)는 타사제품을 이용한 리드 depth별 분포 측정 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 프라이머 세트와 타사제품의 FFPE 샘플에서의 균일성을 테스트한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 프라이머 세트와 타사제품의 FFPE 샘플에서의 coverage를 테스트한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 프라이머 세트(BRCAaccuTest Plus)와 타사의 프라이머 세트를 이용하여 FFPE 샘플에서의 BRCA1/2 유전자를 분석하였을 때, 각 샘플 별로 앰플리콘 리드 분포를 측정한 결과로, (A)는 본 발명의 프라이머 세트이고, (B)는 타사의 프라이머 세트를 이용한 결과이다.
도 7은 타사의 FFPE 샘플 분석용 프라이머 세트를 이용한 샘플 별 앰플리콘 리드 분포를 측정한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서의 용어 “NGS”는 Next Generation Sequencing을 의미하는 것으로, 차세대 시퀀싱, 차세대 염기서열 분석을 의미하기도 한다. 이는 전장유전체(Whole genome)를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응(hybridization)에 기초하여 대용량으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미하고, Agilent, Illumina, Roche 및 Life Technologies사의 기술을 포함하고, 넓은 의미로는 제3세대 기술인 Pacificbio사의 기술, Nanopore Technology 등의 기술 및 제 4세대 기술을 포함하는 것으로 정의한다.
본 발명에서 용어 “단일염기변이(Single Nucleotide Variation, SNV)”는 단일염기서열다형성(Single Nucleotide Polymorphism)이 하나의 종내 다수의 집단에서 나타나는 단일염기의 차이를 말하는 것에 비해, 하나의 서열 또는 종내 소수의 집단에서 나타나는 단일염기의 차이를 의미하고, 주로 시퀀싱 데이터에서 나타나는 표준염기서열과의 차이를 의미한다.
본 발명에서의 용어 “삽입/결실변이(Indel)”는 유전자의 핵산 개수를 변화시킬 수 있는 삽입 또는 결실 변이를 의미한다.
본 발명에서는 유방암 및 난소암과 관련된 유전자의 변이를 높은 민감도와 정확도로 검출할 경우, 이를 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 유방암 및 난소암 등의 암과 관련된 BRCA1/2 유전자의 변이를 NGS 방법으로 분석하여, 높은 민감도와 정확도로 암 관련 유전자의 변이를 검출할 수 있음을 확인하였다(표 1, 도 5).
따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 서열번호 303으로 표시되는 BRCA 1 유전자의 영역을 증폭할 수 있고, 5’ 말단에 이노신이 포함된 제1프라이머; (b) 서열번호 327로 표시되는 BRCA 2 유전자의 Chr 13. 32911910 ~ 32912050 영역을 증폭하여 단일염기변이(SNP)를 검출할 수 있는 제1 듀얼 프라이머; 및 (c) 서열번호 327로 표시되는 BRCA 2 유전자의 Chr 13. 32912143 ~ 32912289 영역을 증폭하여 단일염기변이(SNP)를 검출할 수 있는 제2 듀얼 프라이머를 포함하는 유방암 또는 난소암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 조성물을 이용하여 생체시료에서 타겟 유전자를 증폭하는 단계; (b) 상기 증폭된 유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 및 (c) 상기 결정된 염기서열을 분석하여 유전자 변이를 검출하는 단계를 포함하는 유전자 변이의 검출을 통한 유방암 또는 난소암 관련 질환의 진단방법에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 조성물의 유방암 또는 난소암 관련 질환 진단용도에 관한 것이다.
본 발명의 ‘유전자 영역’은 단백질로 번역되는 엑손 영역 및 엑손 영역에서 ±100bp, 구체적으로는 ±50bp, 더욱 구체적으로는 ±20bp의 인트론 서열을 포함한다.
본 발명의 Chr. 은 염색체를 의미하며, Chr 13은 염색체 13을 의미한다.
본 발명에서 서열번호 327로 표시되는 유전자 영역의 Chr 13. 32911910은 서열번호 327로 표시되는 BRCA2 유전자의 엑손 11번에서 염색체 위치로 계산하였을 때, 13번 염색체의 32911910번째 염기를 의미하며, 나머지 숫자도 같은 의미를 가진다.
본 발명의 '올리고뉴클레오타이드'는 일반적으로 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 고분자를 의미한다. 그러나, 뉴클레오타이드의 길이는 100개 이상이거나 10개 이하일 수 있다.
본 발명의 '뉴클레오타이드'는 포스페이트 그룹, 5-탄당 및 질소 염기로 구성된 핵산의 기본 단위이다. RNA에서 5-탄당은 리보스이다. DNA에서 5-탄당은 2-데옥시리보스이다. 5-뉴클레오타이드의 경우, 당은 5-탄당-2에서 하이드록실그룹(-OH)을 함유한다. 이 용어는 또한 리보스의 2 위치에 메톡시 그룹과 같이 상기 기본 단위의 유사체를 포함한다.
본 발명의 '혼성화'는 표적 핵산(검출하고자 하는 서열)에 상보 서열의 교잡(annealing)을 의미한다. 상보 서열을 포함한 두 핵산 고분자가 서로를 발견하고 염기 쌍 상호작용을 통해 교잡하는 능력은 잘 알려진 현상이다.
본 발명의 '하이브리드'는 상보적인 염기 사이의 왓슨-크릭 염기 쌍 또는 비표준 염기 쌍에 의해 두 개의 단일가닥 뉴클레오타이드 서열 사이에 형성된 복합체이다.
본 발명의 '표지'는 검출 가능한 (구체적으로는 정량가능한) 시그날을 제공하고 핵산에 결합될 수 있는 모든 원자 또는 분자를 가리킨다. 표지는 형광, 방사성, 색도, X-선 회절 또는 흡수, 마그네티즘 등에 의해 검출 가능한 시그날을 제공할 수 있다.
본 발명의 '특이성'은 표적과 비표적 서열을 구분하는 능력을 기술하기 위한 프로브의 특징을 가리킨다. 이와 관련하여, 프로브가 특이적이라는 것은 뉴클레오타이드 서열이 정해진 표적 서열과 혼성화하고 비표적 서열과는 실질적으로 하이브리드하지 않거나 비표적 서열과의 혼성화가 최소로 이루어진다는 것을 의미한다. 프로브 특이성은 서열 및 검정 조건에 의해 좌우된다.
본 발명의 프라이머는 통상의 클로닝 방법(Maniatis, T., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982)을 이용하여 목적하는 서열을 클로닝하거나 시판되는 DNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성하여 다량으로 얻을 수 있다.
본 발명의 ‘듀얼 프라이머’는 BRCA1/2 유전자의 특정 유전좌위의 SNP 서열 모두에 대응하는 프라이머를 의미하는 것으로, 예를 들어, BRCA1/2 유전자의 특정 위치가 정상인에서는 A/T 이고, 돌연변이는 G/C인 경우, 본 발명의 듀얼 프라이머는 A/T 쌍과 상보적인 제1프라이머 및 G/C 쌍과 상보적인 제2프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 ‘앰플리콘’은 프라이머에 의해 증폭되는 증폭 산물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 각 유전자의 엑손 돌연변이를 검출할 수 있고, GC 비율이 40 내지 60% 범위를 유지하며, 종열반복 배열이 없는 유전자 서열과 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1프라이머는 서열번호 270의 염기서열로 표시되고, 5’-말단에 이노신이 결합한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 듀얼 프라이머는 서열번호 33 및 34의 염기서열로 표시되는 프라이머인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 듀얼 프라이머는 서열번호 182 및 183으로 표시되는 프라이머인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 조건을 만족하는 유전자 단편을 하기 표 1과 같이 구성하였다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 변이는 표 1에서 기재된 유전자 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 발생하는 것을 특징으로 할 수 있다.
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Figure PCTKR2018016846-appb-I000001
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본 발명에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 295 내지 343으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 서열 일부 또는 전체를 증폭할 수 있는 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머가 증폭할 수 있는 서열번호 295 내지 343의 유전자 영역의 서열정보는 하기 표 2와 같다.
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Figure PCTKR2018016846-appb-I000011
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본 발명에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 32, 35 내지 181, 184 내지 269 및 271 내지 294로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머의 서열번호 1 내지 294로 표시되는 염기 서열은 하기 표 3과 같다.
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Figure PCTKR2018016846-appb-I000031
본 발명에 있어서, 상기 유전자 변이는 유전자 또는 염색체에 발생한 돌연변이면 모두 가능하나, 구체적으로는 단일염기변이(single nucleotide variation, SNV), 삽입/결실변이(Indel) 및 역위(inversion)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 변이인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 생체시료에서 상기 조성물을 이용하여 타겟 유전자를 증폭하는 단계; (b) 증폭된 유전자의 서열을 결정하는 단계; 및 (c) 결정된 염기 서열을 분석하여 유전자 변이를 검출하는 단계를 포함하는 유방암 및 난소암 등 암 관련 유전자 변이의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 유전자를 포획하는 단계는, 분석하고자 하는 타겟 유전자 염기 서열과 상보적인 프라이머를 이용하여 타겟 유전자 특이적으로 증폭하는 것을 의미하고, 유전자의 변이를 검출하는 단계는 포획된 유전자 조각을 증폭한 다음, 다중 병렬 시퀀싱(Multiplex parallel sequencing) 방법으로 서열을 결정하는 방법을 의미하며, 구체적으로는 NGS 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생체 시료는 혈액, 냉동조직, 파라핀 조직(FFPE), 세침흡인생검(FNA), 골수흡인생검(BMA), 구강세포 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또다른 관점에서, BRCA 1/2 유전자 서열에 특이적으로 결합하는, 서열번호 33, 34, 182, 183, 및 270으로 표시되는 프라이머를 포함하고, BRCA 1/2 유전자 서열에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 내지 32, 35 내지 181, 184 내지 269 및 271 내지 294로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머를 추가로 포함하는 유방암 또는 난소암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 상기 조성물을 이용하여 생체시료에서 타겟 유전자를 증폭하는 단계; (b) 상기 증폭된 유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 및 (c) 상기 결정된 염기서열을 분석하여 유전자 변이를 검출하는 단계를 포함하는 유전자 변이의 검출을 통한 유방암 또는 난소암 관련 질환의 진단방법에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서 상기 조성물의 유방암 또는 난소암 관련 질환 진단용도에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 상기 조성물을 이용하여 생체시료에서 타겟 유전자를 증폭하는 단계; (b) 상기 증폭된 유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 및 (c) 상기 결정된 염기 서열을 분석하여 유전자 변이를 검출하는 단계를 포함하는 유방암 또는 난소암 관련 유전자 변이의 검출 방법에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 생체시료 분석을 위한 프라이머 제작
유방암 및 난소암 등 암 관련 BRCA1/2 유전자의 변이를 효과적으로 분석하기 위하여, 상기 표 2의 유전자 엑손 영역에 상보적으로 결합할 수 있는 서열번호 1 내지 294의 프로브를 제작하였다(표 3).
실시예 2. 제작된 프라이머를 이용한 BRCA1/2 유전자 변이 분석
BRCA1/2 유전자에 대하여, 실시예 1에서 제작한 프라이머와 타사제품과의 비교실험을 총 8개의 양성 샘플에서 수행하여, 성능을 확인하였다. 실험 방법은 Targeted NGS 검사였으며, 실험에 사용한 장비는 MiSeq 또는 MiSeqDx 이었다. MiSeq 또는 MiSeqDx 장비에서 FASTQ 파일 형식의 Raw Data를 수득한 다음, FASTQ 파일에서 ahocorasick 알고리즘을 이용하여 primer 서열을 제거 후, read의 base quality가 떨어지는 부분을 trimming 하였다. Trimming이 끝난 read를 first pair 와 second pair가 겹치는 부분을 합쳐주기 위해 paired end read를 single read로 merge 시킨 뒤, BWA-MEM 알고리즘으로 hg19 서열에 정렬한 뒤, GATKLite 알고리즘으로 Insertion/Deletion 정보를 이용하여 mapping 된 결과를 보정 및 재배열하고, Base Quality를 재계산한 다음, Freebayes의 variant caller 알고리즘을 이용하여 변이를 검출하고, VEP 알고리즘으로 변이의 Annotation 정보를 정리하였다.
본 발명의 프라이머 세트(BRCAaccuTest Plus)와 타사제품의 검출 성능을 요약한 결과는 하기 표 4와 같다.
Figure PCTKR2018016846-appb-T000004
2-1. 표준물질과 혈액샘플에서 BRCAaccuTestPlus vs 타사제품 성능 비교.
모든 검사 대상 영역이 고르게 분석 되었는지 여부를 평가하는 균일성(uniformity test) 결과, 표 5 및 도 1에 개시된 바와 같이 평균 커버리지의 50%, 20% 이상인 영역이 모두 본원 발명의 프라이머 세트를 이용할 경우, 증가하여 균일성이 증가하는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2018016846-appb-T000005
BRCA 1/2 유전자의 모든 검사대상 영역에서 최소 리드(read) 수가 20개 이상인 영역의 비율을 확인하는 Covered>20X를 확인한 결과, 타사 제품과 동등한 성능을 나타내었으나, 본원 발명의 프라이머는 리드 depth 100 전후로 최소커버리지가 크게 증가하여 높은 정확도를 가지는 것을 확인할 수 있었다(표 6, 도 2)
Figure PCTKR2018016846-appb-T000006
샘플별 read depth 분포를 분석한 결과, 100X 이하 리드가 본원 발명의 프라이머 세트에는 거의 없고, 대부분 200~500X 사이에 분포하여 타사제품 대비 성능이 향상된 것을 확인할 수 있었다(표 7, 도 3)
Figure PCTKR2018016846-appb-T000007
Figure PCTKR2018016846-appb-I000032
2-2. FFPE샘플에서 BRCAaccuTestPlus vs 타사제품 성능 비교.
본원 발명의 방법을 이용한 프라이머 세트(BRCAaccuTestPlus), 타사 BRCA 테스트 제품 및 타사 FFPE 샘플 BRCA 테스트용 제품 성능을 2-1과 같은 방법으로 비교하였다.
그 결과, 균일성, 커버리지, 리드 depth 분포 모두 본원 발명의 프라이머 세트가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다(도 4 내지 7).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 유방암 및 난소암 등 암 진단용 조성물은 암과 관련된 BRCA 1/2 유전자의 변이를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있어, 유방암 및 난소암 등의 암 진단에 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (10)

1. (a) 서열번호 303으로 표시되는 BRCA 1 유전자의 영역을 증폭할 수 있고, 5’ 말단에 이노신이 포함된 제1프라이머;
(b) 서열번호 327로 표시되는 BRCA 2 유전자의 Chr 13. 32911910 ~ 32912050 영역을 증폭하여 단일염기변이(SNP)를 검출할 수 있는 제1 듀얼 프라이머; 및
(c) 서열번호 327로 표시되는 BRCA 2 유전자의 Chr 13. 32912143 ~ 32912289 영역을 증폭하여 단일염기변이(SNP)를 검출할 수 있는 제2 듀얼 프라이머를 포함하는 유방암 또는 난소암 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 제1프라이머는 서열번호 270의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물
제1항에 있어서, 상기 제1 듀얼 프라이머는 서열번호 33 및 34의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 제2 듀얼 프라이머는 서열번호 182 및 183의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 32, 35 내지 181, 184 내지 269 및 271 내지 294로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
BRCA 1/2 유전자 서열에 특이적으로 결합하는, 서열번호 33, 34, 182, 183, 및 270으로 표시되는 프라이머를 포함하고, BRCA 1/2 유전자 서열에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 내지 32, 35 내지 181, 184 내지 269 및 271 내지 294로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머를 추가로 포함하는 유방암 또는 난소암 진단용 조성물.
다음 단계를 포함하는 유방암 또는 난소암 관련 유전자 변이의 검출 방법:
(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여 생체시료에서 타겟 유전자를 증폭하는 단계;
(b) 상기 증폭된 유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 및
(c) 상기 결정된 염기서열을 분석하여 유전자 변이를 검출하는 단계.
제7항에 있어서, 상기 생체시료는 혈액, 냉동조직, 파라핀조직(FFPE), 세침흡인생검 (FNA), 골수흡인생검(BMA), 구강세포 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 유전자 변이는 단일염기변이(single nucleotide variation, SNV), 삽입/결실변이(Indel) 및 역위(inversion)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 변이인 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 유방암 또는 난소암 관련 유전자 변이의 검출 방법:
(a) 제6항의 조성물을 이용하여 생체시료에서 타겟 유전자를 증폭하는 단계;
(b) 상기 증폭된 유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 및
(c) 상기 결정된 염기서열을 분석하여 유전자 변이를 검출하는 단계.
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