KR20170012131A - 샘플 풀링을 활용한 다중 샘플 동시 유전성 질환 검사 방법 - Google Patents

샘플 풀링을 활용한 다중 샘플 동시 유전성 질환 검사 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플 풀링(Sample pooling)을 활용해 다수의 개인의 DNA 검체를 동시에 해독함으로써 유전 변이를 확인하고, 그 유전 변이를 가진 개인을 선별하여, 유전성 질환의 위험성을 예측하는 기술에 관한 것이다.

Description

샘플 풀링을 활용한 다중 샘플 동시 유전성 질환 검사 방법 {Method for simultaneous multi-sample analysis of genetic disease using sample pooling}
본 발명은 샘플 풀링(Sample pooling)을 활용해 다수의 개인의 DNA 검체를 동시에 해독함으로써 유전 변이를 확인하고, 그 유전 변이를 가진 개인을 선별하여, 유전성 질환의 위험성을 예측하는 기술에 관한 것이다.
최근 분자진단검사 기술이 발전함에 따라, 질환 관련 유전자 변이 또는 특정한 유전자형을 검출하여 질환의 발병 가능성 및 발병 위험도를 예측하거나 질환을 진단하는 기술이 개발되어 이용되고 있다. 이러한 유전자 검사는 질병의 예방, 조기 진단, 치료 및 관리에 도움을 주어 질환의 이환율과 사망률을 감소시킬 수 있다.
유전자 검사의 대표적인 방법으로는 직접 염기서열분석법(direct sequencing), 대립유전자-특이적 증폭법(allele-specific PCR), 제한 효소 절편 길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP), Taqman 프로브법, ARMS(amplification refractory mutation system)-PCR, 변성(denaturing) HPLC(dHPLC), 및 실시간 PCR fall short 등을 들 수 있다. 예를 들어, BRCA1 및 BRCA2 유전자에서 변이가 발견되는 경우, 생애 유방암 발병 위험도가 급격하게 높아진다는 것이 알려지면서, 이를 이용한 유전성 유방암 검사 기술이 개발된 바 있다.
이러한 유전자 검사는, 인체 내의 모든 세포가 유전적으로 동일하게 구성되어 있다는 전제하에 인체의 임의의 세포 또는 조직에서 유래한 생물학적 샘플에서 유전자를 추출하여 검사에 사용할 수 있다. 가장 쉽게는 혈액 샘플을 사용할 수 있으며, 이로부터 DNA, RNA, 염색체 또는 대사물질 등을 추출할 수 있다.
종래의 유전자 검사는 각 개체의 샘플마다 개별적으로 검사를 수행하였다. 따라서, 검사하려는 샘플의 개수만큼 검사 비용과 시간이 소요되었으며, 대량의 샘플을 검사할 경우 반복 검사를 위한 막대한 비용과 시간이 필요하였다. 특히, 발병률이 낮은 유전성 질환에 대해서는 대부분의 샘플이 음성의 결과를 나타냄에도 불구하고 각 샘플마다 검사를 진행해야 하는 비효율적인 문제가 있었다. 더욱이, 대상 유전자의 길이가 길고 복잡한 경우 게놈 해독 기술의 발전에도 불구하고 하나의 샘플에 대한 검사를 수행하는데 많은 시간과 높은 비용이 소요된다는 문제점이 있어, 임상에서의 이용이 제한되어 왔다.
국내특허공개 10-2015-0011699호 (2015. 2. 2.)
이에, 본 발명에서는 다수의 개인의 게놈을 한 번에 해독하여 질환 관련 유전자 변이 또는 특정한 유전자형을 검출함으로써 질환의 발병 가능성 및 발병 위험성을 예측하거나 질환을 진단하는 기술을 제공한다.
일예로, 본 발명은 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링(pooling)하는 단계, 상기 풀링된 샘플로부터 유전 변이를 검출하는 단계, 및 상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계를 포함하는, 유전 변이를 가진 개체를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
다른 예로, 본 발명은 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링(pooling)하는 단계, 상기 풀링된 샘플로부터 유전 변이를 검출하는 단계, 상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계, 및 상기 유전 변이를 가진 개체의 유전성 질환의 발병 위험성을 확인하는 단계를 포함하는, 유전성 질환의 발병 위험성을 예측하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
다른 예로, 본 발명은 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링하는 단계, 상기 풀링된 샘플로부터 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 유전 변이를 검출하는 단계, 및 상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계를 포함하는, BRCA1 및 BRCA2 유전자의 유전 변이를 가진 개체를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
다른 예로, 본 발명은 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링(pooling)하는 단계, 상기 풀링된 샘플로부터 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 유전 변이를 검출하는 단계, 상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계, 및 상기 유전 변이를 가진 개체의 유방암 발병 위험성을 확인하는 단계를 포함하는, 유방암의 발병 위험성을 예측하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
일 양태로, 본 발명은 샘플 풀링을 활용해 다수의 개인의 DNA 검체로부터 유전 변이를 확인하고, 그 유전 변이를 가진 개인을 선별하여, 유전성 질환의 위험성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
그 예로, 본 발명은 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링(pooling)하는 단계, 상기 풀링된 샘플로부터 유전 변이를 검출하는 단계, 및 상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계를 포함하는, 유전 변이를 가진 개체를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링(pooling)하는 단계, 상기 풀링된 샘플로부터 유전 변이를 검출하는 단계, 상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계, 및 상기 유전 변이를 가진 개체의 유전성 질환의 발병 위험성을 확인하는 단계를 포함하는, 유전성 질환의 발병 위험성을 예측하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 각 단계별로 보다 상세하게 설명하기로 한다.
(a) 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링(pooling)하는 단계
복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링하는 것은, 다수 개인의 DNA 샘플을 섞어 하나의 샘플로 만드는 과정을 말한다. 이 때, 풀링되는 각 DNA 샘플은, 특별한 제한은 없으나, 일반적으로 3개 내지 10개 이상의 샘플이 풀링되며 적은 수의 유전자 (예를 들어 BRCA1 및 BRCA2 유전자 2종 검사)를 분석할 경우 염기서열분석기기의 용량에 따라 100개 이상의 DNA 샘플 풀링이 가능하다.
개체의 각 DNA 샘플은 골고루 섞여 염기 서열 해독에 일괄적인 비율로 나오도록 하기 위하여 샘플의 수나 농도를 적절하게 조정할 수 있다. 바람직하게는, 개체의 각 DNA 샘플은 실질적으로 동량으로 풀링될 수 있다. 본 발명에 해당하는 실험과정을 따를 때 일반적으로 각 DNA 샘플의 농도는 1 나노그램(nanogram) 이상이 필요하지만 이 농도는 실시예에 따라 변화할 수 있다.
본 발명에서 개체는, 특별히 제한되지 않으며, 인간을 포함하는 포유동물과 비-포유동물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간의 유전 변이를 검출하거나 유전성 질환의 위험성을 예측하는 데 본원의 기술이 적용될 수 있고, 그 외에도, 소, 말, 돼지, 오리, 닭, 타조, 개, 염소 등의 가축류에 적용하는 것이 가능하다.
개체의 DNA 샘플은, 각 개체의 각종 생물학적 검체들로부터 추출된 것일 수 있다. 상기 생물학적 검체는 특정 세포, 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물학적 검체는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 체액도 포함할 수 있다. 구체예로, 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 복수액, 흉수액, 뇌척수액, 타액, 소변, 정액, 대변, 유방 삼출물(breast exudate), 눈물, 림프액, 시토졸(cytosol), 양수, 방광 세척액(bladder washes) 또는 기관지폐포 세척액(bronchioalveolar lavages) 등을 예시할 수 있다.
이들 생물학적 검체로부터 DNA 를 추출하는 방법은 종래 알려진 기술들을 적용할 수 있으며, 예를 들어, 상용화된 DNA 추출 키트를 사용하여 분리할 수 있다. 그 외에도, 알카리 용해 방법, 가열에 의한 DNA 분리 방법, 리튬에 기반한 방법 등을 사용할 수 있다.
(b) 풀링된 샘플로부터 유전 변이를 검출하는 단계
풀링된 샘플로부터 검출 가능한 유전 변이로는, 질환 발병 위험성 또는 질환 감수성(susceptibility)과 관련되어 있다고 종래 보고된 모든 유전자 상의 변이를 포함한다. 또한, 유전 변이는 유전적 조성의 변환이나 변화에 의하여 일어나는 모든 변이를 포함하며, 예를 들어, 대립 유전자(allele), 단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphism: SNP), MNP (Multi Nucleotide Polymorphism), 미소부수체(microsatellite), CNV (Copy Number Variation), 돌연변이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 돌연변이는 점 돌연변이(point mutation), 전이(transition) 돌연변이, 전환(transversion) 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 중복(duplication), 결실(deletion), 삽입(insertion), 전좌(translocation), 역위(inversion), 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한, 유전자는 게놈 DNA, 또는 상보적 DNA(complementary DNA: cDNA)일 수 있다.
예를 들어, BRCA1 및 BRCA2 유전자에서 변이가 발견되는 경우, 유방암 발병 위험도가 급격하게 높아진다는 것이 알려진 바 있다. 따라서, 본원의 일예로, 풀링된 샘플 내에 BRCA1 및 BRCA2 유전자 상에 변이가 존재하는 샘플이 포함되어있는지 여부와, BRCA1 및 BRCA2 유전자 상의 어느 부위에 변이가 존재하는 지를 검출할 수 있다.
풀링된 샘플로부터 유전 변이를 검출하는 방법으로는, 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing; NGS)을 사용할 수 있다. NGS 는 타겟으로 하는 유전체 영역을 무수히 많은 조각(리드)으로 나눈 뒤 각각의 염기서열을 조합하여 유전체를 해독하는 분석 방법으로, 이렇게 생성된 리드들은 참조 서열(reference sequence)에 맵핑되고, 특정 영역에 맵핑된 리드들의 서열 정보를 바탕으로 해당 영역의 서열을 재구성하게 된다. 일 구현예에서, 유전 변이가 특정 유전자형에 해당하는 경우, 검사 대상 샘플의 특정 위치의 유전자형은 해당 위치를 포함한 영역에 맵핑된 리드들에서의 해당 위치에서의 대립형질빈도(allele frequency)로 유추될 수 있다. 또한, 유전 변이가 특정 돌연변이에 해당하는 경우, 검사 대상 샘플의 특정 위치에서의 돌연변이는, 해당 위치를 포함한 영역에 맵핑된 리드들에서의 서열 간 비교 분석을 통해 확인될 수 있다. 또한, 상기 유전 변이의 종류(예컨대, 삽입 또는 결실) 및 부위는 종래 알려진 많은 구조 변이 검출 프로그램에 의해 확인될 수 있다. 상기 구조 변이 검출 프로그램의 예로는 MoDIL, SeqSeq, PEMer, VariationHunter, Pindell, BreakDancer 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, NGS 분석을 통해 풀링된 샘플로부터 유전 변이를 검출함으로써, 변이가 일어난 유전자, 변이가 일어난 특정 위치, 및 변이의 형태에 대한 정보를 얻을 수 있게 된다.
NGS 는 상용화되어 있는 NGS 분석 장비를 활용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, Illumina 사의 플랫폼(HiSeq, MiSeq, MiSeqDx, Genome Analyser, NextSeq500 등), Roche 사의 454 GS FLX+ 또는 454 GS Junior, Thermo Fisher (Life Technologies) 사의 Ion Torrent PGM, Life Technology 사의 ABI SOLiD 2000, Pacific Biosciences 사의 RS 등을 예시할 수 있다.
(c) 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계
풀링된 샘플로부터 유전 변이가 검출될 경우, 샘플에 포함된 각각의 개체의 유전체(DNA)를 대상으로, NGS 분석에서 확인된 특정 변이 부위에 대한 염기서열 분석을 별도의 염기서열분석법을 통해 조사함으로써, 검출된 유전 변이를 가진 개체를 식별할 수 있다. 종래 개체 각각에 대한 NGS 분석으로 변이를 선별하는 방법에 비하여, 본 발명의 방법은 풀링된 샘플로부터 1차적으로 질병과 직접적으로 연관된 변이의 존재와 위치를 확인한 후, 그 특정 위치를 포함하는 부위에 대해서만 각 개체 샘플에 대한 직접 염기서열분석을 수행하여 변이를 가진 개체를 식별하므로, 검사에 소요되는 시간과 비용을 절감하고 효율을 높일 수 있다.
검출된 유전 변이를 가진 개체의 확인은, 풀링에 포함된 N 명의 개체의 DNA 샘플 각각에 대해, 검출된 변이가 존재하는 지를 직접 염기서열분석법(direct sequencing), 예를 들어 생어 시퀀싱(sanger sequencing) 방법을 활용할 수 있다.
예를 들어, 풀링된 샘플에서 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 변이가 발견될 경우, 그 유전자 변이가 검출된 샘플이 어떤 개인의 샘플인지를 Sanger 시퀀싱 방법을 통하여 확인할 수 있다. 구체적으로 예를 들어, BRCA1의 특정 엑손에 변이가 존재하는 경우 그 엑손 부위만을 증폭하여 생어 시퀀싱하는 과정을 N 명의 개인 DNA 샘플 전체에 대해 수행할 경우 어떤 개인이 그 특정 엑손에 변이를 가지는지 확인할 수 있다. 이 방법을 통해 N 명 DNA 샘플의 BRCA1 및 BRCA2 전체 유전자에 대해 생어 시퀀싱하는데 필요할 시간과 비용을 절감할 수 있다.
(d) 유전 변이를 가진 개체의 유전성 질환의 발병 위험성을 확인하는 단계
상술한 단계들을 통해 특정 유전자 변이의 존재와 그 유전자 변이를 가진 개체를 확인한 다음, 공공데이터베이스를 활용하여 그 유전자 변이와 유전 질환의 발병 위험성과의 관련성을 확인하여 질환 위험도를 예측할 수 있다. 예를 들어, 상술한 단계를 통하여 BRCA1 및 BRCA2 유전자 변이를 가진 개인을 식별하였다면, 최종적으로 유전자 변이와 유방암 발병 상관관계를 BRCA 변이 정보를 담고 있는 공공데이터베이스와 연구 문헌을 통해 확인하고, 유전성 유방암의 위험도를 분석할 수 있다. 예를 들어, 발견된 BRCA1 및 BRCA2 유전 변이들 중 질병 유발 관계가 증명된 변이들을 공공데이터베이스의 정보를 토대로 선별할 수 있다.
현재 다수의 연구기관 및 연구그룹에서 SNP 및 여러 변이 관련 데이터베이스가 만들어져 운영되고 있다. 공공의 데이터베이스에는 Clinvar, BIC, HGMD, LOVD, UMD 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 아래 표 1은 사용 가능한 데이터베이스의 종류를 예시한다.
공공데이터베이스 URL
Clinvar http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
BIC Breast Cancer Information Core http://research.nhgri.nih.gov/bic/
HGMD Human Gene Mutation Database http://www.hgmd.cf.ac.uk/
LOVD Leiden Open Variation Database http://www.lovd.nl/
UMD Universal Mutation Database http://www.umd.be/
dbSNP Database of Single Nucleotide Polymorphism http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/
dbGAP Database of Genotypes and Phenotypes http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim
HGVbase Human Genome Variation Database http://hgvbase.cgb.ki.se
DGV Database of Genomic Variants http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
HapMap International HapMap Project hapmap.ncbi.nlm.nih.gov
CGAPGAI CGAP Genetic Annotation Initiative http://gai.nci.nih.gov/cgap-gai/
그 외 유전 변이 정보를 위한 데이터베이스는 상술한 몇몇 큰 데이터베이스와 수백 가지의 유전자 각각에 대한 특화된 데이터베이스로 다원화하여 존재하고 있으므로, 이들 정보를 활용하여 본원에서 확인된 유전 변이와 질환 위험도와의 관련성을 도출하고 질환 발병 위험성을 예측할 수 있다.
예를 들어, 공공데이터베이스에서의 BRCA 유전자 변이 선별 기준은 아래 표 2와 같다.
공공데이터베이스 유방암 변이 기준
Clinvar Pathogenic, likely pathogenic
BIC Cilinically important
HGMD DM, DM?, FTV
LOVD +/? , +?/?
UMD 5-Causal, 4-likely causal
상술한 방법들을 통하여, 본 발명은 샘플 풀링을 활용해 다수의 개인의 DNA 검체를 동시에 해독해 질환 관련 유전자를 읽어 내는 기술과 시스템을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 다수의 게놈을 해독해 질환 관련 유전자 변이를 가진 개인을 선별해 내는 기술과 시스템을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 질환 관련 유전자 변이를 가진 개체의 질환 위험도를 계산해 내는 예방 목적의 진단 시스템과 방법론을 제공할 수 있다.
나아가, 본 발명은 질환의 발병 위험성을 예측하는 것에서 더 나아가, 유전변이를 가진 개체를 확인함으로써, 질환의 의학적 병태를 진단하거나, 질환의 예후를 예측하거나, 질환을 모니터링하거나, 치료 효능을 평가하거나, 질환의 치료방침을 결정하거나, 질병의 치료제를 개발하기 위한 방법 등으로 사용 가능하다.
본 발명에서 유전성 질환은 유전 변이에 의해 유발될 수 있는 모든 질환을 포함한다. 예를 들어, 염색체 이상에 의한 질환, 유전자 이상에 의한 질환, 유전 소인 및 환경적인 요소의 상호작용에 의해 발생하는 질환, 미토콘드리아에 의한 유전 질환 등을 포함하며, 구체예로, 유전 변이와 관련있는 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 심혈관질환, 단일유전자 변이 질환, 신경계 질환, 허혈성 질환, 대동맥판상부 협착증, 낭포성섬유증, 파브리병, 페닐케톤뇨증, 마르판 증후군 (Marfan syndrome), 과다콜레스테롤증, 망막세포변성, 망막아세포종, 근무력증, 혈우병, 고셔병(Gaucher disease), 겸상적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), X-연관무감마글로불린혈증, 선천성 부신과형성증, 윌리암스 증후군, 녹내장, 레트 증후군(Rett's syndrome), 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 근관성 근육병증(Myotubular myopathy), 로웨 증후군(Lowe syndrome), 멘케스 증후군(Menkes syndrome), X-연관된 부신백질이영양증(X-linked adrenoleukodystrophy), 호에랄-레이다슨 증후군(Hoyeraal-Hreidarsson syndrome), 척수성 근위축증(Spinal Muscular atrophy), 이염색 백색질 장애(Metachromatic leukodystrophy) 또는 크라베병(Krabbe disease) 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
대표적인 구현예로서, 본 발명은 BRCA1 및 BRCA2 유전자에 대하여 적용함으로써 유전성 유방암의 위험성을 예측하기 위한 방법을 제공할 수 있다.
그 예로, 본 발명은 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링하는 단계, 상기 풀링된 샘플로부터 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 유전 변이를 검출하는 단계, 및 상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계를 포함하는, BRCA1 및 BRCA2 유전자의 유전 변이를 가진 개체를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링(pooling)하는 단계, 상기 풀링된 샘플로부터 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 유전 변이를 검출하는 단계, 상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계, 및 상기 유전 변이를 가진 개체의 유방암 발병 위험성을 확인하는 단계를 포함하는, 유방암의 발병 위험성을 예측하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 다수 개인의 게놈을 DNA 풀링 방법을 통해 한번에 해독하여 매우 경제적인 비용으로 유전 변이를 확인할 수 있다. 또한 상기 방법을 활용하여 검출된 유전자 변이를 가진 개인을 정확히 확인할 수 있다. 또한 최종적으로 유전자 변이를 가진 개인의 유전성 질환 발병 위험도를 계산하여 유전성 질환의 위험도를 예측할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 샘플 풀링 기반 BRCA 유전자 변이 검사 흐름도를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 복수의 DNA 샘플에 대한 유전성 유방암 검사
8명의 익명화된 전혈 (Whole blood) 검체 샘플을 수집하여 QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
Serial Dilution을 통하여 각 개체 DNA가 4 ng씩 동일하게 포함된 전체 32 ng의 DNA를 이용하여 ThermoFisher Life Technologies 사의 Ion AmpliSeqTM BRCA1 and BRCA2 Panel (ThermoFisher, USA)을 이용하여 targeted sequencing을 수행하였다. 32 ng의 DNA를 Ion AmpliSeqTM HiFi master mix (ThermoFisher, USA)와 167개의 BRCA1 또는 BRCA2 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 쌍을 이용하여 19 cycle의 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR의 조건은 Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0의 manual을 따랐다.
Amplicon들의 partial primer digestion, phosphorylation, ligation to adapter과정은 Ion XpressTM Barcode Adapters kit (ThermoFisher, USA) manual을 따랐다. 이 과정을 통해 수립된 Amplicon library는 AMPure® XP reagent (Beckman Coulter, USA)를 통해 정제되었다. Library는 ThermoFisher의 Ion Library Qualtitation Kit를 이용하여 농도를 결정하였고 최종적으로 8-16 pmol/liter로 희석되어 NGS 분석에 사용되었다.
Emersion PCR은 ThermoFisher의 Ion OneTouchTM System, Ion OneTouchTM 200 Template Kit v2의 instruction manual을 따라 수행되었다. Template가 확인된 Ion SphereTM Particle은 ThermoFisher의 Dynabeads® MyOneTM Streptavidin C1 beads를 이용하여 Ion OneTouchTM ES System을 이용하여 농축 및 정제되어 Ion 318 Chip에 loading되었다. Sequencing은 Ion PGM 기기 (ThermoFisher)의 instruction manual에 따라 진행되었고, 500 flow run을 통해 약 200 bp reading을 진행하였다.
Sequencing 자료의 분석은 Ion Torrent SuiteTM Software (ThermoFisher, USA)를 이용하였다. 분석 과정은 염기신호처리, 염기 calling, 서열품질 score 부여, adapter서열 제외, duplicate 제외, 표준염기서열 배정, mapping 품질 분석, coverage 분석, 변이 결정으로 세분화 되어 있다. Coverage 분석과 변이 결정과정은 Torrent Variant Caller plugin software (ThermoFisher)에 의해 수행되었다.
BRCA1 또는 BRCA2 유전자의 아미노산변화 변이 (nonsynonymous)들은 BIC database (https://research.nhgri.nih.gov/projects/bic/index.shtml), ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)를 이용해 임상적인 효과에 대한 해석을 추출하였고, 1000 genomes (www.1000genomes.org)이나 Exome Variant Server (evs.gs.washington.edu/EVS)등에서 minor allele frequency 1% 이상인 경우 variant call에서 제외하였다.
Sanger sequencing은 검증이 필요한 개체의 DNA를 이용하여 관련 변이가 존재하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)를 이용하여 design한 후, ㈜마크로젠의 oligonucleotide synthesis service를 이용하여 합성하여 사용하였다. PCR은 DOCTOR PROTEIN (Korea)의 Dr.Taq-HOT MasterMix를 이용하여 수행되었고, PCR 산물은 QIAGEN의 QIAquick PCR Purification Kit를 이용하여 정제된 후, ThermoFisher사의 BigDye® Terminator v3.1 과 ABI 3730xl DNA Analyzer를 이용하여 Sanger sequencing 분석되었다.
표 3은 실시예 1에 의하여 서로 다른 8개 샘플을 풀링하여 NGS 염기서열분석을 수행한 후 BRCA1 유전자의 변이들을 Sanger Sequencing을 통해 각 샘플에서 확인한 결과를 나타낸다. Freq는 NGS분석에서 각 변이들이 샘플 풀에서 보여준 변이 대립형질 (Allele)의 빈도이다.
Figure pat00001
표 4는 실시예 1에 의하여 서로 다른 8개 샘플을 풀링하여 NGS 염기서열분석을 수행한 후 BRCA2 유전자의 변이들을 Sanger Sequencing을 통해 각 샘플에서 확인한 결과이다. Freq는 NGS분석에서 각 변이들이 샘플 풀에서 보여준 변이 대립형질 (Allele)의 빈도이다. A~D 샘플 중 일반적인 polymorphism만 보이는 샘플들의 자료는 포함시키지 않았다 (Sample-C, Sample-G).
Figure pat00002

Claims (10)

  1. 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링(pooling)하는 단계,
    상기 풀링된 샘플로부터 유전 변이를 검출하는 단계,
    상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계, 및
    상기 유전 변이를 가진 개체의 유전성 질환의 발병 위험성을 확인하는 단계를 포함하는,
    유전성 질환의 발병 위험성을 예측하기 위한 정보 제공 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 샘플을 풀링하는 단계는, 개체의 각 DNA 샘플을 동량으로 풀링하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DNA 샘플은 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 복수액, 흉수액, 뇌척수액, 타액, 소변, 정액, 대변, 유방 삼출물(breast exudate), 눈물, 림프액, 시토졸(cytosol), 양수, 방광 세척액(bladder washes) 또는 기관지폐포 세척액에서 추출된 DNA 샘플인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유전 변이는 대립 유전자(allele), 단일 뉴클레오티드 다형성(Single Nucleotide Polymorphism: SNP), MNP (Multi Nucleotide Polymorphism), 미소부수체(microsatellite), CNV (Copy Number Variation), 돌연변이, 또는 이들의 조합인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이는 점 돌연변이(point mutation), 전이(transition) 돌연변이, 전환(transversion) 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 중복(duplication), 결실(deletion), 삽입(insertion), 전좌(translocation), 역위(inversion), 또는 이들의 조합인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 풀링된 샘플로부터 유전 변이의 검출은 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing)을 통해 수행되는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 검출된 유전 변이를 가진 개체의 확인은 생어 시퀀싱(sanger sequencing) 을 통해 수행되는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 유전 변이를 가진 개체의 유전성 질환의 발병 위험성의 확인은 공공데이터베이스를 통하여 상기 유전 변이와 유전성 질환과의 관련성을 확인하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  9. 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링하는 단계,
    상기 풀링된 샘플로부터 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 유전 변이를 검출하는 단계, 및
    상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계를 포함하는,
    BRCA1 및 BRCA2 유전자의 유전 변이를 가진 개체를 스크리닝하는 방법.
  10. 복수의 개체의 각 DNA 샘플을 풀링(pooling)하는 단계,
    상기 풀링된 샘플로부터 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 유전 변이를 검출하는 단계,
    상기 검출된 유전 변이를 가진 개체를 확인하는 단계, 및
    상기 유전 변이를 가진 개체의 유방암 발병 위험성을 확인하는 단계를 포함하는,
    유방암의 발병 위험성을 예측하기 위한 정보 제공 방법.
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