WO2021029473A1 - 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트 - Google Patents

암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트 Download PDF

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신호정
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고민정
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Definitions

  • the present invention relates to a kit for diagnosing multiple high-speed drug genes for predicting drug side effects and personalized drug treatment for cancer and chronic disease-related multi-prescription drugs. More specifically, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14 , CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1 ,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *570
  • the present inventors developed a multi-fast drug gene diagnosis technology to rapidly and effectively diagnose individual differences in drug reactions and major mutations related to adverse reactions, centering on drugs that are multiprescribed for cancer and chronic diseases in Koreans, and utilize this technology.
  • Non-Patent Document 1 Nelson et al., Pharmacogenetics, 6:1-42, 1996
  • Non-Patent Document 2 J Natl. Cancer Inst., 83:1164-1168
  • Non-Patent Document 3 Tai HL. Am J Hum Genet. 58:694-702, 1996
  • Non-Patent Document 4 Ameyaw M-M. et al., Hum Mol Genet. 8:367-370, 1999
  • Non-Patent Document 5 Clin Pharmacol Ther. 2018 Feb;103(2):210-216
  • Non-Patent Document 6 Clin Pharmacol Ther. 2014 Oct;96(4):423-8
  • Non-Patent Document 7 Clin Pharmacol Ther. 2017 Sep;102(3):397-404
  • Non-Patent Document 8 Int. J. Mol Sci. 2016 Nov; 17(11):1890
  • Non-Patent Document 9 Nat Genet. 2014 Sep;46(9):1017-20
  • An object of the present invention is to rapidly detect mutations in biomarkers related to cancer and chronic diseases, and to provide a multi-fast drug gene diagnosis kit for predicting drug side effects for cancer and chronic disease-related multi-prescription drugs and personalized drug treatment. .
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing multiple high-speed pharmacokinetics for predicting drug side effects and personalized drug therapy for the multi-prescription drugs using the kit.
  • the present invention in the multi-speed drug gene diagnostic kit for predicting drug side effects and personalized drug treatment for cancer and chronic disease-related multi-prescription drugs, comprising the primers of SEQ ID NOs: 1 to 124, , ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1,*3 , DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs503086
  • the kit consists of 2X PCR Amplification Mix, 2X Multiplex PCR Amplification Mix, amplification primer mix 1 (APM1) consisting of primers of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and primers of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 6
  • Amplification primer mix 2 (APM2)
  • Amplification primer mix 3 (APM3) consisting of primers of SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 8
  • Amplification primer mix 4 (APM4) consisting of primers of SEQ ID NO: 9 to 24, SEQ ID NO: 25
  • Amplification primer mix 5 (APM5) consisting of primers of SEQ ID NOs: 29-44
  • amplification primer mix 6 (APM6) consisting of primers of SEQ ID NOs: 29-44
  • Amplification primer mix 7 (APM7) consisting of primers of SEQ ID NOs: 45-46
  • Amplification primer mix 8 consisting of primers of SEQ ID NOs: 47 to 56 (APM8)
  • Amplification primer mix 9 (
  • kit may further include Shmp Alkaline Phosphatase (SAP) and/or Exonuclease 1 (Exo).
  • SAP Shrimp Alkaline Phosphatase
  • Exo Exonuclease 1
  • the side effects may be selected from the group consisting of Stevens-Johnson syndrome, toxic epidermal necrosis dissolution, irritability syndrome, severe liver injury, and muscle disease.
  • the drug is voriconazole, piroxicam, aspirin, celecoxib, diclofenac, tramadol, ibuprofen, omeprazole, esomeprazole, lansoprazole, pantoprazole, rabeprazole, simbassatin, cerivastatin , Pravastatin, rosuvastatin, atorvastatin, clopidogrel, flecainide, propaphenone, nifedipine, captopril, quinacryl, enalapril, lisinopril, telmisartan, losartan, metoprolol, irbesartan, cande Sartan, carvedirol, hydrochlorothiazide, warfarin, glimepiride, glibenclamide, gliclazide, metformin, allopurinol, lapatinib, tamoxifen, c
  • the present invention also provides a method for diagnosing multiple high-speed pharmacological genes for predicting drug side effects and personalized drug treatment for cancer and chronic disease-related multi-prescription drugs, comprising the following steps:
  • the multiple polymerase chain reaction may be performed using one or more primers selected from the group consisting of primers of SEQ ID NOs: 1 to 76.
  • CYP2D6 was specifically amplified using SEQ ID NOs: 1 to 8
  • CYP2C19 was specifically amplified using SEQ ID NOs: 9 to 14
  • CYP4F2 was specifically amplified using SEQ ID NOs: 15 to 16.
  • SEQ ID NOs: 17 to 22 the CYP2C9 gene is specifically amplified, and the VKORC1 gene is specifically amplified using SEQ IDs: 23 to 24, and the HLA-B gene is specific using SEQ ID NOs: 25 to 26.
  • the snapshot analysis may be performed using one or more primers selected from the group consisting of primers of SEQ ID NOs: 77 to 124.
  • genotyping is, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1, *2, *3, *17, CYP2C9 *1 ,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52, *60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T,
  • FIG. 2 is a table showing information on genes and their mutations used in the present invention.
  • 3 is a table showing drug reactions and side effects that can be predicted by the method according to the present invention, and target genes therefor.
  • 5 shows PCR conditions for amplifying a gene using the primer in the present invention.
  • Figure 6 shows the primer sequence and information for the snapshot analysis according to the present invention.
  • FIG. 8 shows a snapshot condition according to the present invention.
  • SAP Shrimp Alkaline Phosphatase
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing an example of confirming a mutation and presenting a drug administration guide using the kit according to the present invention.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • polymorphism' refers to the arrangement in a sequence of genes that change within a population. Polymorphisms are made up of different “alleles”. This polymorphic arrangement can be identified by its position in the gene and the different amino acids or bases found therein. These amino acid variations are the result of two different alleles, two possible variant bases, C and T. Because the genotype is made up of two different distinct alleles, any of several possible variants can be observed in any one individual (eg, CC, CT or TT in this example). Individual polymorphisms are also known to those of skill in the art and are used, for example, in the Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation available on the NCBI website. It is an identifier (“reference SNP”, “refSNP” or “rs#).
  • dbSNP Single Nucleotide Polymorphism Database
  • genotype refers to a specific allele of a specific gene in a cell or tissue sample. 'Phenotype' refers to the morphological, physiological, or biochemical characteristics of an individual determined by the genotype. The genotype is distinct from the phenotype, and refers to the constitution of an individual's genes, and in a narrower sense, it refers to alleles that exist on one gene.
  • Allele refers to one of two or more alternative forms of a gene that occupy the same chromosomal locus.
  • the equivalent genetic marker of an allele is a genetic marker associated with the allele of interest, ie, it indicates a linkage disequilibrium with the allele of interest.
  • Allele frequency' refers to the frequency (ratio or percentage) that an allele exists within an individual, within a lineage, or within a population of lineages. It can be estimated by averaging the allele frequency within a line or population or in a sample of individuals from a line or population.
  • 'Risk' indicates that the incidence of the disease or condition is statistically high in the individual carrying the specific polymorphic allele compared to the incidence of the disease or condition in a member of the individual who does not carry the specific polymorphic allele.
  • Nucleic acid refers to a polynucleotide or oligonucleotide such as deoxyribonucleic acid (DNA), and if appropriate ribonucleic acid (RNA).
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • the term also applies equally to analogs of either RNA or DNA prepared from nucleotide analogs (e.g., peptide nucleic acids), and single (sense or antisense) and double-stranded polynucleotides, as applied to the described embodiments. Include. In the present invention, the term “nucleic acid” and “nucleotide” are used in combination.
  • 'Primer' is an oligonucleotide sequence that hybridizes to a complementary RNA or DNA target polynucleotide and serves as a starting point for the stepwise synthesis of polynucleotides from mononucleotides, for example by the action of nucleotidyl transferases occurring in polymerase chain reactions. Means.
  • the term “functional equivalent” refers to, for example, one or more substitutions, deletions or additions from a reference sequence, a net effect that does not result in various functional dissimilarities between the reference sequence and the subject sequence. It refers to both the nucleotide and nucleic acid sequences of the mutant sequence.
  • the nucleotide sequence has at least about 65% identity, more preferably at least about 75% identity, and most preferably about 95% identity.
  • sequences having substantially equivalent biological activity and substantially equivalent comparability characteristics are treated as substantial equivalents.
  • Subject' or'patient' means any single individual in need of treatment, including humans, cattle, dogs, guinea pigs, rabbits, chickens, insects, and the like.
  • any subject who participated in a clinical study trial showing no clinical manifestation of any disease, or a subject who participated in an epidemiological study or a subject used as a control group is included.
  • humans were targeted.
  • tissue or cell sample means a collection of similar cells obtained from tissues of a subject or patient.
  • the source of the tissue or cell sample may be a fresh, frozen and/or preserved organ or tissue sample or solid tissue from a biopsy or aspirate; Blood or any blood component; It may be a cell at any point in the subject's pregnancy or development.
  • the tissue sample can also be a primary or cultured cell or cell line.
  • the present invention is based on the fact that various drug reactions or adverse drug reactions (ADRs) are associated with drug metabolism, transport, and pharmacodynamics total 27 genes, 50 mutations, ABCG2, ACE, ADRA1A, AGTR1, C11orf65, COQ2, CYP2C19 , CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, DPYD, G6PD, GNB3, HLA-B, HLA-DQA1, HLA-DRB1, Internal Control HGF, KCNJ11, MMP3, NEDD4L, NUDT15, PTGS2, SLC14A2, SLCO1A1, TPMT, and UGT genes
  • Subtype that is, a kit for detecting the presence of a specific mutation in each gene and a specific mutation using the kit to quickly and accurately detect the drug side effects for cancer and chronic disease-related multi-prescription drugs and for personalized drug treatment Provides a method for diagnosing multiple high-speed drug genes.
  • kit and method of the present invention are ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1, *2, *3, *17, CYP2C9 *1, *2, *3 ,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN ( Duplicate), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ
  • the multi-high-speed pharmacokinetics diagnostic kit for predicting drug side effects and personalized drug treatment for cancer and chronic disease-related multi-prescription drugs of the present invention includes primers of SEQ ID NOs: 1 to 124 (see FIGS. 4 and 6), and ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1 *2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs503086
  • the kit includes 2X PCR Amplification Mix, 2X Multiplex PCR Amplification Mix, amplification primer mix 1 (APM1), amplification primer mix 2 (APM2), amplification primer mix 3 (APM3), amplification primer mix 4 (APM4), amplification Primer Mix 5 (APM5), Amplification Primer Mix 6 (APM6), Amplification Primer Mix 7 (APM7), Amplification Primer Mix 8 (APM8), Amplification Primer Mix 9 (APM9), Amplification Primer Mix 10 (APM10), Snapshot Multi Flex Reagent (SNaPshot MR), Snapshot Primer Mix 1 (SPM1), Snapshot Primer Mix 2 (SPM2), Snapshot Primer Mix 3 (SPM3), Snapshot Primer Mix 4 (SPM4), Snapshot Primer Mix 5 (SPM5) ), control DNA and nuclease-free water.
  • Amplification primer mix 1 Amplification primer mix 1
  • APM2 amplification primer mix 2
  • APM3 amplification primer mix 3
  • APM4
  • 2X PCR Amplification Mix is sold by Solgent, and per 10 ul of 10X EF tag polymerase buffer 2 ul, 5X Band Doctor 1 ul, 2.5mM dNTP 2 ul, 2.5U EF tag polymerase 0.25 ul and nuclease-free water 4.75 ul
  • 2X Multiplex PCR Amplification Mix is sold by Solgent, 10X H tag polymerase buffer per 10 ul per time 2 ul, 5X Band Doctor 1 ul, 2.5mM dNTP 2 ul, 2.5U EF tag polymerase 0.25 ul and nuclease free water 4.75 ul.
  • kit may further include Shmp Alkaline Phosphatase (SAP) and/or Exonuclease 1 (Exo).
  • SAP Shrimp Alkaline Phosphatase
  • Exo Exonuclease 1
  • the amplification primer mix 1 is composed of the primers of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4
  • the amplification primer mix 2 is composed of the primers of SEQ ID NOs: 5 to 6
  • the amplification primer mix 3 is sequence Consists of primers of SEQ ID NOs: 7 to 8
  • amplification primer mix 4 is composed of primers of SEQ ID NOs: 9 to 24
  • amplification primer mix 5 is composed of primers of SEQ ID NOs: 25 to 28
  • amplification primer mix 6 is sequence Consists of primers of Nos.
  • amplification primer mix 7 consists of primers of SEQ ID NOs: 45 to 46
  • amplification primer mix 8 is composed of primers of SEQ ID NOs: 47 to 56
  • amplification primer mix 9 is of SEQ ID NO: 57 It consists of the primers of to 66
  • amplification primer mix 10 consists of the primers of SEQ ID NOs: 67 to 76.
  • the amplification primer mix (APM) 4, 6, 7, 8, 9 and 10 were amplified using 2X Multiplex PCR Amplification Mix, and the amplification primer mix (APM) 1, 2, 3 and 5 used 2X PCR Amplification Mix. To amplify.
  • the snapshot multiplex reagent uses a commercially available reagent from Applied biosystems, and as shown in FIG. 6, the snapshot primer mix (SPM) 1 consists of primers of SEQ ID NOs: 77 to 87, and the snapshot Primer mix 2 consists of primers of SEQ ID NOs: 88 to 99, snapshot primer mix 3 consists of primers of SEQ ID NOs: 100 to 109, and snapshot primer mix 4 consists of primers of SEQ ID NOs: 110 to 119, snap Shot primer mix 5 consists of primers of SEQ ID NOs: 120 to 124. Nuclease-free water uses a commercially available reagent from Solgent.
  • the kit of the present invention uses genomic DNA prepared from biological samples such as human or mammalian blood, whole blood nucleic acids, etc., using a single base extension (SBE, SNaPshot, Mutation identification by primer extension) for a total of 50 mutations of 27 genes. ), and is characterized in that it is a kit that helps predict related drug reactions and drug side effects (ADR).
  • SBE single base extension
  • SNaPshot Mutation identification by primer extension
  • nucleotide 8825 of the ABCG2 gene (NCBI Reference Sequence: NC_000004.10) is converted from C to A (rs2231142) using the kit, and the ACE gene (NCBI Reference Sequence: NC_000017.10).
  • nucleotides 11435-11436 (rs1799752), nucleotide 94459 of ADRA1A gene (NCBI Reference Sequence: NC_000008.11) is T to C conversion (rs1048101), AGTR1 gene (NCBI Reference Sequence: NC_000003.12) is converted from A to C (rs5186), the 49126th nucleotide of the C11orf65 gene (NCBI Reference Sequence: NC_000011.10) is converted from G to T (rs11212617), and the COQ2 gene (NCBI Reference Sequence: NC_000004.12) is converted from C to G (rs4693075), the 470865 nucleotide of the DPYD gene (NCBI Reference Sequence: NC_000001.11) is converted from G to A (rs3918290), from A to 838532 nucleotide Conversion to T (rs6737
  • CYP2C19 gene (NCBI Reference Sequence: NG_008384.2, The Human Cytochrome P450 (CYP) Allel Nomenclature reference) *1 (Wild type), *2 (19154th nucleotide converted from G to A, rs4244285), *3 ( 17948th nucleotide is converted from G to A, rs4986893), *17 (-806th nucleotide is converted from C to T, rs12248560), CYP2C9 gene (NCBI Reference Sequence: NG_008385.1, The Human Cytochrome P450 (CYP) Allel Nomenclature Reference) of *1 (Wild type), *2 (conversion from nucleotide C to T at 3608, rs1799853), *3 (conversion from nucleotide at 42614 A to C, rs1057910), *13 (T to C at nucleotide 3276 Conversion to, rs725
  • nucleotide 473 of the HGF gene (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11) can be used as an amplification quality control gene.
  • the drug is voriconazole, piroxicam, aspirin, celecoxib, diclofenac, tramadol, ibuprofen, omeprazole, esomeprazole, lansoprazole, pantoprazole, rabeprazole, simbassatin, seri Vastatin, pravastatin, rosuvastatin, atorvastatin, clopidogrel, flecainide, propaphenone, nifedipine, captopril, quinacryl, enalapril, lisinopril, telmisartan, losartan, metoprolol, irbesartan , Candesartan, carvedirol, hydrochlorothiazide, warfarin, glimepiride, glibenclamide, gliclazide, metformin, allopurinol, lapatinib, tamoxifen
  • the kit according to the present invention is ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1, *2, *3, *17, CYP2C9 *1, *2, *3, * 13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (duplicate) , CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 47319T, KCNJ11
  • the probe means "any substance useful for detecting other substances".
  • the probe may be an oligonucleotide or a conjugated oligonucleotide that specifically hybridizes to a specific region within the allele of interest.
  • Conjugated oligonucleotide refers to an oligonucleotide that covalently binds to a chromophore or ligand containing molecule (eg, antigen), which is highly specific to a receptor molecule (eg, antigen specific antibody).
  • the probe may be a PCR primer for amplifying a specific region within the allele of interest together with other primers.
  • the probe may be an antibody that recognizes an allele of interest or a protein product of the allele.
  • the kit may further include tools and/or reagents for collecting a biological sample from a patient, as well as tools and/or reagents for preparing genomic DNA, RNA, cDNA or protein from the sample. For example, it may include PCR primers for amplifying the relevant region of genomic DNA.
  • the kit may contain probes for genetic factors useful for pharmacogenomic profiling.
  • a labeled oligonucleotide can be used to easily identify it during analysis. Examples of labels that can be used include radioactive labels, enzymes, fluorescent compounds, streptavidin, avidin, biotin, magnetic moieties, metal binding moieties, antigen or antibody moieties, and the like.
  • the present invention uses the kit as a total of 27 genes, 50 mutations related to drug reactions and drug side effects, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,* 3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,* 41,*49,*52,*60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1* 02, HLA-DRB1*
  • the allele can be detected, for example, by directly detecting the region/nucleotide in the allele using genomic DNA prepared from a biological sample such as blood, saliva, urine, or hair. Alleles can also be detected, for example, by serological methods or microcytotoxic methods.
  • an equivalent genetic marker of the allele can also be determined by detection of an equivalent genetic marker of the allele, and the equivalent genetic marker is, for example, a single nucleotide polymorphism (SNP), a microsatellite marker, or other types of It is polymorphic. In the present invention, the use of SNP is preferred.
  • the equivalent genetic marker of an allele is a genetic marker associated with the allele of interest, ie, it indicates a linkage disequilibrium with the allele of interest.
  • SNP analysis may be performed using a real time PCR system, or may be performed through direct determination of the nucleotide sequence of a nucleic acid by a dideoxy method, or a probe containing a sequence of a SNP site or A probe complementary thereto is hybridized with the DNA and the nucleotide sequence of the polymorphic site is determined by measuring the degree of hybridization obtained therefrom, or an allele-specific probe hybridization method, an allele-specific amplification method (allele- specific amplification), sequencing, 5'nuclease digestion, molecular becon assay, oligonucleotide ligation assay, size analysis And single-strand conformation polymorphism.
  • DNA products obtained from PCR can be detected using sequence-specific probes such as hydrolysis probes (Taqman, Becons, Scorpions) and matching probes, for example. These probes are designed to bind to the area of interest.
  • sequence-specific probes such as hydrolysis probes (Taqman, Becons, Scorpions) and matching probes, for example. These probes are designed to bind to the area of interest.
  • the PCR product can also be detected by a DNA-binding agent.
  • the presence of an allele of interest can also be determined by detection of an equivalent genetic marker of the allele. Genetic markers close to the allele of interest tend to co-segregate with the allele or exhibit linkage disequilibrium. Thus, the presence of these markers (equivalent genetic markers) is an indicator of the presence of the allele of interest and thus the risk of developing ADR.
  • Useful equivalent genetic markers are usually about 200 kb or less (eg, 100 kb, 80 kb, 60 kb, 40 kb or 20 kb) from the allele of interest.
  • the presence or absence of an equivalent genetic marker can be detected using the above-described method or a method known in the art.
  • RNA, cDNA, or protein products of an allele of interest can be detected to determine the presence or absence of the allele.
  • the presence of mutations in the gene of interest can be detected by a sequence-based genotyping method (Sanger sequencing) or allele-specific PCR in various known methods, but the sequencing method takes a lot of time to read and a special program for reading. And the possibility of error due to allele-specific PCR.
  • the method of the present invention can be used to analyze an effective genome-side association structure by identifying the structure of the haplotype within the gene and the SNP representing each haplotype.
  • the method of the present invention uses a method of detecting 50 mutations (single base polymorphism, SNP) of a total of 27 genes, and includes the following steps:
  • the multiple polymerase chain reaction in step (b) may be performed using one or more primers selected from the group consisting of primers of SEQ ID NOs: 1 to 76.
  • CYP2D6 was specifically amplified using SEQ ID NOs: 1 to 8
  • CYP2C19 was specifically amplified using SEQ ID NOs: 9 to 14
  • CYP4F2 was specifically amplified using SEQ ID NOs: 15 to 16.
  • SEQ ID NOs: 17 to 22 the CYP2C9 gene is specifically amplified, and the VKORC1 gene is specifically amplified using SEQ IDs: 23 to 24, and the HLA-B gene is specific using SEQ ID NOs: 25 to 26.
  • the multiple single base primers for the snapshot analysis in step (c) use any one primer selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 77 to 124.
  • Genotype confirmation in step (c) is ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1, *2, *3, *17, CYP2C9 *1, *2, *3 ,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN ( Duplicate), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11
  • the method may be performed in the following manner.
  • SNPs and mutation sites were included to be amplified, and exons 2 to 4 of HLA-B, exon 1 of HLA-DQA1, exon 2 of HLA-DRB1, and exon 2 of HGF was allowed to amplify.
  • an appropriate known method may be selected and used, for example, a method such as multiplex polymerase chain reaction (multiplex PCR) may be used.
  • primer sets of SEQ ID NOs: 1 to 76 were used for the amplification, and their sequences and uses are also included in the scope of the present invention.
  • each primer pair is specific to a specific gene.
  • SNP is analyzed by performing a snapshot analysis method through multiple single base primer expansion.
  • the primers to be used in this step are ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13, *14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 r
  • SEQ ID NOs: 77 to 124 are SEQ ID NOs: 77 to 124, and their sequences and uses are also included in the scope of the present invention.
  • each primer pair is specific to a specific gene.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • detection of such mutations by any available method can be used for diagnostic purposes such as response of drugs, early detection of susceptibility to drug side effects, prognosis, diagnosis and treatment for patients.
  • “Pharmacogenomic profiling” refers to the determination of genetic factors present in a subject, related to a disease or medical condition, particularly adverse reactions to a drug.
  • This method is ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1, *3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5241458, MMP
  • the present invention relates to a method for assessing the risk of causing adverse drug reactions in a patient in response to a drug, comprising a method of determining the genotype using a biological sample from a patient by the above method.
  • the drugs are preferably voriconazole, piroxicam, aspirin, celecoxib, diclofenac, tramadol, ibuprofen, omeprazole, esomeprazole, lansoprazole, pantoprazole, rabeprazole, simbassatin, cerivastatin, pravastatin , Rosuvastatin, atorvastatin, clopidogrel, flecainide, propaphenone, nifedipine, captopril, quinacryl, enalapril, lisinopril, telmisartan, losartan, metoprolol, irbesartan, candesartan , Carvedirol, hydrochlorothiazide, warfarin, glimepiride, glibenclamide, gliclazide, metformin, allopurinol, lapatinib, tamoxifen, cis
  • the drug compound itself or at least one hydrogen in the drug is halo, hydroxy, acylamino, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aryloxy, aryl, aryloxyaryl, carboxy , Carboxyalkyl, carboxy-substituted alkyl, carboxy-cycloalkyl, carboxy substituted cycloalkyl, carboxyaryl, carboxy-substituted aryl, carboxyheteroaryl, carboxy-substituted heteroaryl, carboxyheterocyclic, carboxy-substituted Heterocyclic, cycloalkyl, substituted alkyl, substituted alkoxy, substituted aryl, substituted aryloxy, substituted aryloxyaryl, substituted cycloalkyl, heteroaryl, substituted heteroaryl, heterocyclic or substituted hetero It refers to a compound such as the drug, except that it is halo, hydroxy,
  • the patient's probability of inventing ADR is at least about 1.5 times, more preferably at least about 2 times, even more preferably at least about 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 times the probability of developing ADR in the general population, And most preferably at least about 10 times.
  • the probability may be determined using any method known in the art, such as using the incidence of risk factors.
  • the “risk” factors of ADR are factors related to ADR.
  • the sensitivity of the risk factor is preferably at least about 40%, more preferably at least about 50%, 60%, 70%, 80%, 85% or 90%. Most preferably, the sensitivity is at least 95%.
  • the “sensitivity” of a risk factor for predicting ADR is the percentage of ADR patients with that risk factor. For example, if all SJS patients have allele A, the sensitivity of allele A to predict SJS is 100%. If 20 of 40 SJS patients have allele B, then the sensitivity of allele B to predict SJS at that time is 50%.
  • the present invention also relates to drug reactions and adverse drug reactions (ADR) ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1, *2, *3, *17, CYP2C9 *1, *2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,* 60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T
  • the present invention is ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1, *2, *3, *17, CYP2C9 *1, *2, *3, *13, *14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs30250
  • nucleic acids are written in a 5'->3' orientation from left to right.
  • Numerical ranges recited within the specification include the numbers defining the range, and include each integer or any non-integer fraction within the defined range.
  • Example 1 multiplex polymerase chain reaction (multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)
  • the polymerase chain reaction was performed according to the conditions shown in Fig. 5 using an appropriate amplification primer mix according to the desired gene. Polymerase chain reaction was carried out using ABI 9700 (Applied Biosystems, Foster, USA).
  • the reaction solution was configured by matching the final 20ul to include 100ng of the request sample, 10ul of 2X PCR Amplification Mix, and 4ul of amplification primer mix (APM1). After the reaction solution was treated at 94° C. for 5 minutes, it was reacted 35 times at 98° C. 20 seconds, 64° C. 30 seconds, and 72° C. 3 minutes each, and the final extension reaction was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • ExoSAP-IT USB corp., Cleveland, USA
  • Primers of SEQ ID NOs: 77 to 124 were used as primers for each type for multiplex single based primer extension (SNaPshot assay) (see FIG. 6).
  • a polymerase chain reaction product was used as a template, and as shown in FIG. 6, a multiple single base primer expansion reaction was performed according to the conditions shown in FIG. 8 using a snapshot primer mix containing a specific primer.
  • SPM1 Snapshot Primer Mix 1
  • the primers of SEQ ID NOs: 77 to 87 were used to extend multiple single base primers using 11 types of primers designed with different lengths for 11 single polymorphism sites. The reaction was carried out.
  • the snapshot multiplex reagent (SNaPshot MR) of the kit according to the present invention 1 ul, 1/2 term buffer 4 ul, Exo-SAP- It consisted of 7.5 ul of IT product and 1 ul of Snapshot Primer Mix 1 (SPM1).
  • the prepared products were reacted 40 times at 96°C for 10 seconds, 50°C for 5 seconds, and 60°C for 30 seconds, followed by adding 1.2 ul (1 U/ul) of SAP according to the conditions shown in FIG. 9 to 37°C for 60 minutes, The reaction was carried out at 65° C. for 15 minutes to remove the remaining ddNTP.
  • the extension reaction product was obtained by combining ddNTPs with complementary fluorescence attached to each single-base polymorphic position at the end of each primer 3′, and each peak for each SNP was analyzed.
  • GeneMapper v5.0 (Applied Biosystems, Foster, USA) was used as the software, and according to the analysis result, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,* 17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41,* 49,*52,*60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798
  • ADR drug reaction and drug side effects related genes ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1, *2, *3 ,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (defect),*10,*14,*18,*21,*41 ,*49,*52,*60,*XN (duplicate), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02 , HLA-DRB1
  • the presence or absence of each of the specific mutations can be detected at a high speed, so that it can be effectively utilized in a method for predicting and diagnosing risk related to drug reactions and drug side effects.

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Abstract

본 발명은 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 반응 및 약물 부작용 예측으로 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단기술에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 약물 반응 및 약물 부작용과 관련된 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231의 돌연변이 존재 여부를 결정하는 키트를 이용하여 신속하게 결정하는 방법 및 이러한 방법을 이용하여 약물 반응 감소, 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사 용해, 과민 증후군, 중증 간 손상, 근질환 등의 약물 부작용의 발병 위험 여부를 평가하는 용도에 관한 것이다.

Description

암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트
본 발명은 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231의 총 27개의 유전자 50개의 특정 돌연변이의 존재 여부를 tSNP를 이용하여 신속하게 결정하기 위한 키트, 이를 이용하여 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자를 진단하는 방법 및 이러한 방법을 이용하여 약물 반응의 개인차 및 이상반응 위험 여부를 평가하는 용도에 관한 것이다.
이하에 기술되는 내용은 단순히 본 발명과 관련되는 배경 정보만을 제공할 뿐 종래기술을 구성하는 것이 아니다.
British medical journal에 의하면, 약물이상반응으로 인한 사망 중 의사의 처방 혹은 조제 과정 잘못으로 인한 것은 전체의 11% 이내이며, 대부분의 경우는 정상적인 약물처방에 따라 제대로 약물을 복용한 환자에서 발생하는 예상치 않은 약물부작용에 기인한다고 한다. 또한 미국 의사협회의 조사에 따르면, 처방된 약물을 정상적으로 복용한 미국인 환자 중 매년 200만 명 이상이 심각한 약물이상반응을 경험하고 있으며, 매년 10만 명 이상의 환자가 약물이상반응으로 인해 사망하고, 이로 인한 경제적 손실이 1800억 달러에 달하는 것으로 추산된다는 보고도 있다. 우리나라에서는 2016년 보고된 의약품 부작용 등의 정보가 22만 8939건으로 전년 대비 15.6% 증가 했다고 보고된 바 있다. 이러한 약물부작용은 식습관, 유전적, 환경적 요인 등 다양한 원인에 의해 발생할 수 있으며, 그 중 약물 반응의 개인차 및 이상반응 위험 여부를 예측하는데 도움을 주는 유전적 요인에 대해서는 유전적 바이오마커로서 상당 수 연구 및 검증되어 알려져 있다.
그런데, 이러한 유전자 변이는 다양한 종류가 보고되어 있기 때문에 분석시간과 비용의 효율성을 증대하기 위해 최소한의 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)을 통해 정확한 유전형을 결정하는 것이 중요하다. 최근에, 상기 유전자를 일부 포함하는 서양인에서 주로 발견되는 CYP2D6 유전자 변이를 중심으로 SNP를 분석하는 로슈사의 AmpliChip CYP450 Test, 루미넥스사의 xTAGⓡ CYP2D6 Kit v3, 한국 바이오니아사의 AccuPower® Warfarin genotyping Kit 제품이 보고되고 있다. 그러나 변이 유전자의 조합이 서양인에서 발견되는 변이를 중심으로 구성되어 있거나, 1~2개 약물유전자만 검사가 가능하여 국내에서 다처방 되는 약물 반응의 개인차 및 이상반응 위험 여부를 평가하는 제품은 매우 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 한국인에서 암 및 만성질환에 다처방 되는 약물을 중심으로 약물 반응의 개인차 및 이상반응과 관련된 주요한 돌연변이를 신속하고 효과적으로 진단하기 위한 다중고속 약물유전자 진단기술을 개발하였으며, 본 기술을 활용하면 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231의 총 27개의 유전자 50개의 특정 대립 유전자의 존재 여부를 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
(비특허문헌 1)Nelson et al., Pharmacogenetics, 6:1-42, 1996
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본 발명의 목적은 암 및 만성질환 관련 바이오마커의 돌연변이를 신속하게 검출하여, 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 상기 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트에 있어서, 서열번호 1 내지 124의 프라이머를 포함하고, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 돌연변이 존재 여부를 결정하는 것을 특징으로 하는, 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에서 있어서, 상기 키트는 2X PCR Amplification Mix, 2X Multiplex PCR Amplification Mix, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 1 (APM1), 서열번호 5 내지 서열번호 6의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 2 (APM2), 서열번호 7 내지 서열번호 8의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 3 (APM3), 서열번호 9 내지 24의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 4 (APM4), 서열번호 25 내지 28의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 5 (APM5), 서열번호 29 내지 44의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 6 (APM6), 서열번호 45 내지 46의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 7 (APM7), 서열번호 47 내지 56의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 8 (APM8), 서열번호 57 내지 66의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 9 (APM9), 서열번호 67 내지 76의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 10 (APM10), 스냅샷 멀티플렉스 시약(SNaPshot MR), 서열번호 77 내지 87의 프라이머로 구성되는 스냅샷 프라이머 믹스 1 (SPM1), 서열번호 88 내지 99의 프라이머로 구성되는 스냅샷 프라이머 믹스 2 (SPM2), 서열번호 100 내지 109의 프라이머를 구성되는 스냅샷 프라이머 믹스 3 (SPM3), 서열번호 110 내지 119의 프라이머로 구성되는 스냅샷 프라이머 믹스 4 (SPM4), 서열번호 120 내지 124의 프라이머로 구성되는 스냅샷 프라이머 믹스 5 (SPM5), 대조군 DNA 및 뉴클레아제 프리 워터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 쉬림프 알칼린 포스파타아제 (Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)) 및/또는 엑소뉴클레아제 1 (Exonuclease 1 (Exo))를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 있어서, 상기 부작용은 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사 용해, 과민 증후군, 중증 간 손상, 근 질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 보리코나졸, 피록시캄, 아스피린, 세레콕시브, 디클로페낙, 트라마돌, 이부프로펜, 오메프라졸, 에스오메프라졸, 란소프라졸, 판토프라졸, 라베프라졸, 심바스사틴, 세리바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 아토르바스타틴, 클로피도그렐, 플레카이니드, 프로파페논, 니페디핀, 캡토프릴, 퀴나크릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 텔미사르탄, 로사르탄, 메토프롤롤, 이르베사르탄, 칸데사르탄, 카르베디롤, 히드로클로로티아지드, 와파린, 글리메피리드, 글리벤클라미드, 글리클라지드, 메트포르민, 알로푸리놀, 라파티닙, 타목시펜, 시스플라틴, 메르캅토푸린, 파조파닙, 카페시타빈, 플루오로우라실, 이리노테칸, 아자티오프린, 라스부리카제 및 이들 유사 약물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단방법을 제공한다:
(a) 상기 키트를 이용하여, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 SNP를 확정하는 단계;
(b) ABCG2, ACE, ADRA1A, AGTR1, C11orf65, COQ2, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, DPYD, G6PDGNB3, HLA-B, HLA-DQA1, HLA-DRB1, Internal Control HGF, KCNJ11MMP3, NEDD4L, NUDT15, PTGS2, SLC14A2, SLCO1B1, TPMT, UGT1A1 및 VKORC1으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 유전자를 증폭하기 위해 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
(c) 다중 단일염기 프라이머를 사용하여 스냅샷 (SNaPshot) 분석법을 수행하여 생성산물에 대한 SNP를 분석하여 유전형을 확인하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)에서, 상기 다중 중합효소 연쇄반응은 서열번호 1 내지 76의 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 서열번호 1 내지 8을 이용하여 CYP2D6를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 9 내지 14를 이용하여 CYP2C19을 특이적으로 증폭하고, 서열번호 15 내지 16을 이용하여 CYP4F2를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 17 내지 22를 이용하여 CYP2C9 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 23 내지 24를 이용하여 VKORC1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 25 내지 26을 이용하여 HLA-B 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 27 내지 28을 이용하여 G6PD 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 29 내지 30을 이용하여 HLA-DRB1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 31 내지 32를 이용하여 HLA-DQA1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 33 내지 34를 이용하여 증폭 정도관리 유전자 HGF를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 35 내지 38을 이용하여 TPMT 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 39 내지 40을 이용하여 NUDT15 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 41 내지 44를 이용하여 DPYD 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 45 내지 46을 이용하여 UGT1A1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 47 내지 50을 이용하여 SLCO1B1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 51 내지 52를 이용하여 ABCG2 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 53 내지 56을 이용하여 SLC14A2 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 57 내지 58을 이용하여 C11orf65 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 59 내지 60을 이용하여 ACE 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 61 내지 62를 이용하여 COQ2 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 63 내지 64를 이용하여 KCNJ11 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 65 내지 66을 이용하여 NEDD4L 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 67 내지 68을 이용하여 ADRA1A 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 69 내지 70을 이용하여 AGTR1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 71 내지 72를 이용하여 GNB3 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 73 내지 74를 이용하여 MMP3 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 75 내지 76을 이용하여 PTGS 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (c)에서, 상기 스냅샷 분석은 서열번호 77 내지 124의 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (c)에서, 유전형 확인은, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 돌연변이를 확인함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 약물과민반응 및 약물부작용과 관련된 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231의 돌연변이를 검출하는 키트 및 이를 이용한 진단방법은 특히 한국인을 포함한 아시아인에 대해 높은 정확성을 나타내며, 신속하고 간편하게 진단할 수 있어, 약물 부작용을 약물과민 반응을 사전에 예방하고 치료의 효과 및 성공률을 높이는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 키트를 이용하여 약효를 포함한 약물의 반응과 약물 부작용과 관련된 27개 유전자에 대하여 50개의 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 사용하는 유전자 및 이의 변이 정보를 나타낸 표이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법으로 예측할 수 있는 약물 반응 및 부작용 및 이에 대한 대상 유전자를 나타낸 표이다.
도 4는 본 발명에 따른 유전자 증폭용 프라이머의 서열 및 이에 대한 정보를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에서 상기 프라이머를 이용하여 유전자를 증폭하기 위한 PCR 조건을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 스냅샷 분석을 위한 프라이머 서열 및 이에 대한 정보를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에서 상기 스냅샷 분석을 위해, 증폭된 증폭 산물 내 프라이머 및 dNTP를 제거하기 위한 Exo-SAP IT 처리 조건을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 스냅샷 조건을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에서 스냅샷 분석시, 스냅샷 산물에 대한 쉬림프 알칼린 포스파타아제 (Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP))의 처리 조건을 나타낸다.
도 10은 본 발명에 따른 키트를 활용하여 돌연변이를 확인하고, 약물 복용 가이드를 제시하는 일예를 모식도로 나타낸 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
‘유전적 다형성 (genetic polymorphism)’은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, 이하 SNP)이라고 한다.
‘다형성’이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 “대립유전자”로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용 가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스 (Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자 (“기준 SNP”, “refSNP” 또는 “rs#)이다.
‘유전자형’이라는 용어는 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립 유전자를 지칭한다. ‘표현형’은 유전형에 의해서 결정되는 개체의 형태학적, 생리학적, 또는 생화학적 특징을 표현형이라 한다. 유전형이란 표현형과 구별되는 것으로, 개인의 유전자 구성을 뜻하며, 보다 좁은 의미로는 한 유전자 위에 존재하는 대립 유전자들(alleles)을 말한다.
‘대립인자’또는 ‘대립 유전자’란 같은 염색체 위치 (same chromosomal locus)를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태 (alternative forms) 중 하나를 뜻한다. 대립유전자의 등가 유전 표지는 관심 대상의 대립유전자에 연관된 유전 표지로서, 즉, 그것은 관심 대상의 대립유전자와 연관불균형을 나타낸다.
‘대립유전자 빈도’는 대립유전자가 개체 내, 계통 내, 또는 계통의 집단 내에 존재하는 빈도 (비율 또는 백분율)를 지칭한다. 계통 또는 집단 내에서의 대립 유전자 빈도 또는 계통 또는 집단으로부터 개체들의 샘플의 대립유전자 빈도를 평균화함으로써 추정할 수 있다.
‘위험’은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다.
‘핵산’은 데옥시리보핵산 (DNA), 및 적절하다면 리보핵산 (RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체 (예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 서술된 구체예에 적용된 대로, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서는 ‘핵산’이라는 용어와 ‘뉴클레오티드’가 병용하여 쓰이고 있다.
‘프라이머’는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
“기능적 등가물”이라는 용어는 예를 들어, 기준 (reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준 서열과 실험 (subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과 (net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가진다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 함성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다.
‘대상’ 또는 ‘환자’는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.
‘조직 또는 세포 샘플’은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 다양한 약물 반응 또는 약물 부작용 (ADR)이 약물대사, 수송, 약력학적 총 27개의 유전자, 50개의 돌연변이와 연관되어 있는 사실을 근거로, ABCG2, ACE, ADRA1A, AGTR1, C11orf65, COQ2, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, DPYD, G6PD, GNB3, HLA-B, HLA-DQA1, HLA-DRB1, Internal Control HGF, KCNJ11, MMP3, NEDD4L, NUDT15, PTGS2, SLC14A2, SLCO1B1, TPMT, UGT1A1 및 VKORC1 유전자의 서브 타입, 즉, 각 유전자의 특정 돌연변이의 존재를 검출하는 키트 및 상기 키트를 이용하여 특정 돌연변이를 신속하고 정확하게 검출하여 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 키트 및 방법은 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231의 총 27개 유전자 50개의 돌연변이의 존재 (도 2 참조)를 분석하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명에 따른 키트 및 방법의 구성 및 특징을 하기와 같이 예를 들어 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트
본 발명의 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트는 서열번호 1 내지 124의 프라이머를 포함하고 (도 4 및 도 6 참조), ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 돌연변이 존재 여부 (도 2 참조)를 결정하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 키트는 2X PCR Amplification Mix, 2X Multiplex PCR Amplification Mix, 증폭 프라이머 믹스 1 (APM1), 증폭 프라이머 믹스 2 (APM2), 증폭 프라이머 믹스 3 (APM3), 증폭 프라이머 믹스 4 (APM4), 증폭 프라이머 믹스 5 (APM5), 증폭 프라이머 믹스 6 (APM6), 증폭 프라이머 믹스 7 (APM7), 증폭 프라이머 믹스 8 (APM8), 증폭 프라이머 믹스 9 (APM9), 증폭 프라이머 믹스 10 (APM10), 스냅샷 멀티플렉스 시약(SNaPshot MR), 스냅샷 프라이머 믹스 1 (SPM1), 스냅샷 프라이머 믹스 2 (SPM2), 스냅샷 프라이머 믹스 3 (SPM3), 스냅샷 프라이머 믹스 4 (SPM4), 스냅샷 프라이머 믹스 5 (SPM5), 대조군 DNA 및 뉴클레아제 프리 워터를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이때, 예를 들어, 2X PCR Amplification Mix는 솔젠트 (Solgent) 사에서 판매되는 것을 사용하며, 1회 10 ul 당 10X EF 태그 폴리머라제 완충액 2 ul, 5X 밴드 닥터 1 ul, 2.5mM dNTP 2 ul, 2.5U EF 태그 폴리머라제 0.25 ul 및 뉴클레아제 프리 워터 4.75 ul로 구성되고, 2X Multiplex PCR Amplification Mix는 솔젠트 (Solgent) 사에서 판매되는 것을 사용하며, 1회 10 ul 당 10X H 태그 폴리머라제 완충액 2 ul, 5X 밴드 닥터 1 ul, 2.5mM dNTP 2 ul, 2.5U EF 태그 폴리머라제 0.25 ul 및 뉴클레아제 프리 워터 4.75 ul로 구성될 수 있다.
또한, 상기 키트는 쉬림프 알칼린 포스파타아제 (Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)) 및/또는 엑소뉴클레아제 1 (Exonuclease 1 (Exo))를 추가로 포함할 수 있다.
도 4에 제시된 바와 같이, 상기 증폭 프라이머 믹스 1은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머로 구성되고, 증폭 프라이머 믹스 2는 서열번호 5 내지 서열번호 6의 프라이머로 구성되고, 증폭 프라이머 믹스 3은 서열번호 7 내지 서열번호 8의 프라이머로 구성되고, 증폭 프라이머 믹스 4는 서열번호 9 내지 24의 프라이머로 구성되고, 증폭 프라이머 믹스 5는 서열번호 25 내지 28의 프라이머로 구성되고, 증폭 프라이머 믹스 6은 서열번호 29 내지 44의 프라이머로 구성되고, 증폭 프라이머 믹스 7은 서열번호 45 내지 46의 프라이머로 구성되고, 증폭 프라이머 믹스 8은 서열번호 47 내지 56의 프라이머로 구성되고, 증폭 프라이머 믹스 9는 서열번호 57 내지 66의 프라이머로 구성되고, 증폭 프라이머 믹스 10은 서열번호 67 내지 76의 프라이머로 구성된다. 상기 증폭 프라이머 믹스 (APM) 4, 6, 7, 8, 9 및 10은 2X Multiplex PCR Amplification Mix를 이용하여 증폭하고, 증폭 프라이머 믹스 (APM) 1, 2, 3 및 5는 2X PCR Amplification Mix를 이용하여 증폭한다.
상기 스냅샷 멀티플렉스 시약은 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied biosystems) 사의 판매용 시약을 사용하며, 도 6에 제시된 바와 같이, 스냅샷 프라이머 믹스 (SPM) 1은 서열번호 77 내지 87의 프라이머로 구성되고, 스냅샷 프라이머 믹스 2는 서열번호 88 내지 99의 프라이머로 구성되고, 스냅샷 프라이머 믹스 3은 서열번호 100 내지 109의 프라이머로 구성되고, 스냅샷 프라이머 믹스 4는 서열번호 110내지 119의 프라이머로 구성되고, 스냅샷 프라이머 믹스 5는 서열번호 120 내지 124의 프라이머로 구성된다. 뉴클레아제 프리 워터는 솔젠트 (Solgent) 사의 판매용 시약을 사용한다.
본 발명의 키트는 사람 또는 포유류의 혈액, 전혈 핵산 등의 생체 시료로부터 마련된 게놈 DNA를 사용하여 총 27개 유전자 50개의 돌연변이를 단일염기확장법 (Single Base Extension, SBE, SNaPshot, Mutation identification by primer extension)으로 정성하여 관련 약물 반응 및 약물 부작용 (ADR)을 예측하는데 도움을 주는 키트인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 일 구체예로서, 상기 키트를 활용하여 ABCG2 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000004.10)의 8825번째 뉴클레오티드가 C에서 A로 변환 (rs2231142), ACE 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000017.10)의 11435-11436번째 뉴클레오티드가 TTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTGTCGCCCATACAGTCACTTTT의 삽입 또는 결실로의 변환 (rs1799752), ADRA1A 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000008.11)의 94459번째 뉴클레오티드가 T에서 C로의 변환 (rs1048101), AGTR1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000003.12)의 1166번째 뉴클레오티드가 A에서 C로 변환 (rs5186), C11orf65 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000011.10)의 49126번째 뉴클레오티드가 G에서 T로의 변환 (rs11212617), COQ2 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000004.12)의 13900번째 뉴클레오티드가 C에서 G로의 변환 (rs4693075), DPYD 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000001.11)의 470865번째의 뉴클레오티드가 G에서 A로의 변환 (rs3918290), 838532번째 뉴클레오티드의 A에서 T로의 변환 (rs67376798), G6PD 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000023.10)의 11716번째 뉴클레오티드가 A에서 T로의 변환 (rs5030872), 11737번째 뉴클레오티드가 C에서 T로 변환 (rs5030868), GNB3 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000012.12)의 4424번째 뉴클레오티드가 C에서 T로 변환 (rs5443), KCNJ 11 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000011.9)의 67번째 뉴클레오티드가 A에서 G로 변환 (rs5219), MMP3 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000011.10)의 -1676_-1675번째 뉴클레오티드가 T의 삽입 (rs3025058), NEDD4L 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000018.10)의 99899번째 뉴클레오티드가 G에서 A로의 변환 (rs4149601), NUDT15 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000013.11)의 7973번째 뉴클레오티드가 C에서 T로 변환 (rs116855232), PTGS2 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000001.11)의 -899번째 뉴클레오티드가 G에서 C로의 변환 (rs20417), SLC14A2 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000018.10)의 48254번째 뉴클레오티드가 G에서 A로의 변환 (rs1123617), 57730번째 뉴클레오티드가 G에서 A로의 변환 (rs3745009) 및 VKORC1 유전자 (NCBI Reference Sequence: AY587020)의-1639번째 뉴클레오티드의 G에서 A로의 변환 (rs9923231)을 검출하는데 사용된다.
또한 CYP2C19 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_008384.2 , The Human Cytochrome P450 (CYP) Allel Nomenclature 참고)의 *1 (Wild type),*2 (19154번째 뉴클레오티드가 G에서 A로 변환, rs4244285),*3 (17948번째 뉴클레오티드가 G에서 A로 변환, rs4986893),*17 (-806번째 뉴클레오티드가 C에서 T로 변환, rs12248560), CYP2C9 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_008385.1, The Human Cytochrome P450 (CYP) Allel Nomenclature 참고)의 *1 (Wild type), *2 (3608번째 뉴클레오티드 C에서 T로의 변환, rs1799853), *3 (42614번째 뉴클레오티드 A에서 C로의 변환, rs1057910), *13 (3276번째 뉴클레오티드의 T에서 C로의 변환, rs72558187), *14 (3552번째 뉴클레오티드의 G에서 A로의 변환, rs72558189), CYP2D6 유전자 (NCBI Reference Sequence: M33388, The Human Cytochrome P450 (CYP) Allel Nomenclature 참고)의 *1 (wild type), *10B (100번째 뉴클레오티드 C에서 T로의 변환, rs1065852), *49 (1611번째 뉴클레오티드의 T에서 A로의 변환, rs1135822), *14B (1758번째 뉴클레오타이드의 G에서 A로의 변환, rs5030865), *4 (1846번째 뉴클레오티드의 G에서 A로의 변환, rs3892097), *60 (1887번째 뉴클레오티드의 TA 삽입), *21 (2573-2574번째 뉴클레오티드의 C 삽입, rs72549352), *2 (2850번째 뉴클레오티드 C에서 T로의 변환, rs16947), *41 (2988번째 뉴클레오티드의 G에서 A로의 변환, rs28371725), *52 (3877번째 뉴클레오티드의 G에서 A로의 변환, rs28371733 ), *18 (4125-4133번째 뉴클레오티드의 GTGCCCACT 중복), *5 (CYP2D6 deletion), *XN (CYP2D6 duplication), CYP4F2 유전자 (NCBI Reference Sequence: AF467894.1, The Human Cytochrome P450 (CYP) Allel Nomenclature 참고)의 *1 (wild type), *3 (1297번째 뉴클레오티드의 G에서 A로의 변환, rs2108622), SLCO1B1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_011745.1, SLCO Nomenclature 참고)의 *1A (wild type), *1B (50611번째 뉴클레오티드의 A에서 G로의 변환, rs2306283), *5 (52422번째 뉴클레오티드의 T에서 C로의 변환, rs4149056), *15 (50611번째 뉴클레오티드의 A에서 G로의 변환, rs2306283 및 52422번째 뉴클레오티드의 T에서 C로의 변환, rs4149056), TPMT 유전자 (NCBI Reference Sequence; NM_000367.2, TPMT Nomenclature 참고)의 *1 (Wild type), *3C (719번째 뉴클레오티드의 A에서 G로의 변환, rs1142345), *6 (539번째 뉴클레오티드의 A에서 T로의 변환, rs75543815), UGT1A1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NT_005120.25, UGT1A1 Nomenclature 참고)의 *1 (Wild type), *28(-39번째 뉴클레오티드의 TA 결실 및 삽입, rs3064744), HLA-B 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1)의 *57 (384번째 뉴클레오티드의 C에서 G로의 변환, 667번째 뉴클레오티드의 G에서 A로의 변환), *58 (384번째 뉴클레오티드의 C에서 G로의 변환), HLA-DQA1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1)의 *02 (91번째 뉴클레오티드의 A에서 G로의 변환), HLA-DRB1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1)의 *07 (8240번째 뉴클레오티드의 G에서 A로의 변환)을 검출하는데 사용된다. HLA-DRB1 유전자의 *07 대립유전자를 확인하기 위해 증폭 정도관리 유전자로 HGF 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11)의 473번째 뉴클레오티드를 함께 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 약물은 보리코나졸, 피록시캄, 아스피린, 세레콕시브, 디클로페낙, 트라마돌, 이부프로펜, 오메프라졸, 에스오메프라졸, 란소프라졸, 판토프라졸, 라베프라졸, 심바스사틴, 세리바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 아토르바스타틴, 클로피도그렐, 플레카이니드, 프로파페논, 니페디핀, 캡토프릴, 퀴나크릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 텔미사르탄, 로사르탄, 메토프롤롤, 이르베사르탄, 칸데사르탄, 카르베디롤, 히드로클로로티아지드, 와파린, 글리메피리드, 글리벤클라미드, 글리클라지드, 메트포르민, 알로푸리놀, 라파티닙, 타목시펜, 시스플라틴, 메르캅토푸린, 파조파닙, 카페시타빈, 플루오로우라실, 이리노테칸, 아자티오프린, 라스부리카제 및 이들 유사 약물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종일 수 있고, 약물 부작용은 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사 용해, 과민 증후군, 중증 간 손상, 근 질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231으로 구성된 군에서 하나 이상의 돌연변이 대립 유전자 검출을 위한 프로브를 포함한다.
본원에서 상기 프로브는 “다른 물질을 검출하는데 유용한 임의의 물질”을 의미한다. 따라서 프로브는 관심 대상의 대립 유전자 내의 특정 영역에 특이적으로 부합화 (hybridization)하는, 올리고뉴클레오티드 또는 접합 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 접합 올리고뉴클레오티드는 발색단 또는 리간드 함유 분자 (예, 항원)에 공유적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 이는 수용체 분자에 고도로 특이적이다 (예, 항원 특이적인 항체). 프로브는 다른 프라이머와 함께 관심 대상의 대립유전자 내의 특정 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머일 수 있다. 나아가, 상기 프로브는 관심 대상의 대립유전자나 그 대립유전자의 단백질 산물을 인식하는 항체일 수 있다.
상기 키트는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, RNA, cDNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/ 또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자용의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예로서는 방사능 표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 자성 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등이 있다.
특히, 본 발명에서는 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231으로 구성된 군에서 하나 이상의 돌연변이 및 돌연변이 영역의 증폭을 위한 프라이머 세트, 예를 들어 서열번호 1 내지 76으로 표시되는 프라이머 세트들을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 키트를 이용한 돌연변이 분석 방법
본 발명은 상기 키트를 이용하여 약물 반응 및 약물 부작용과 관련된 총 27개 유전자, 50개 돌연변이인 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231의 돌연변이 존재 여부를 검출하여 각 유전자의 돌연변이를 신속하고 정확하게 검출하여 분석하는 방법을 제공하며, 확인된 돌연변이를 바탕으로 약효를 포함한 약물 반응, 약물 부작용 평가, 약물 동정 등을 포함하는 모든 용도를 포함한다.
대립 유전자는 예를 들면 혈액, 타액, 소변 또는 모발 등의 생체 시료로부터 마련된 게놈 DNA를 사용하여 대립유전자 내의 영역/뉴클레오티드를 직접적으로 검출함으로써 검출할 수 있다. 대립유전자는 예를 들면 혈청학적 방법 또는 미세세포 독성법에 의해서도 검출할 수 있다.
또한 그 대립유전자의 등가 유전 표지 (equivalent genetic marker)의 검출에 의해 결정할 수도 있으며, 상기 등가 유전 표지는, 예를 들면, 단일염기 다형 (SNP), 마이크로새털라이트 표지 (microsatellite marker) 또는 다른 종류의 유전자 다형이다. 본 발명에서는 SNP의 사용이 바람직하다. 대립유전자의 등가 유전 표지는 관심 대상의 대립유전자에 연관된 유전 표지로서, 즉, 그것은 관심 대상의 대립유전자와 연관불균형을 나타낸다.
ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231의 총 27개 유전자, 50개의 돌연변이 등의 유전 표지의 존재는 그 내부의 표지 또는 특정 영역의 직접적인 검출에 의해 결정할 수 있다.
예를 들면, 리얼 타임 (Real time) PCR 시스템을 이용하여 SNP 분석을 수행하거나, 디데옥시법에 의해 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통해 수행할 수 있으며, 또는 SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하거나, 대립형질 특이적 프로브 혼성화 방법 (allele-specific probe hybridization), 대립형질 특이적 증폭 방법 (allele-specific amplification), 서열 분석법 (sequencing), 5’뉴클레아제 분해법 (5’nuclease digestion), 분자 비콘에세이법 (molecular becon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 에세이법 (oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법 (size analysis) 및 단일 가닥 배좌 다형성법 (single-strand conformation polymorphism) 등을 이용하여 수행될 수 있다.
PCR로부터 얻어진 DNA 산물은 예를 들면, 가수분해 프로브 (Taqman, Becons, Scorpions), 부합화 프로브와 같은 서열 특이적 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 이들 프로브는 관심 대상의 영역에 결합하도록 설계된다. 상기 PCR 산물은 DNA-결합제에 의해서도 검출될 수 있다.
관심 대상의 대립유전자의 존재는 그 대립유전자의 등가 유전 표지의 검출에 의해서도 결정할 수 있다. 관심대상의 대립유전자에 가까운 유전 표지는 그 대립유전자와 공 분리 (co-segregate)하거나 또는 연관 불균형을 나타내는 경향이 있다. 따라서 이들 표지 (등가 유전 표지)의 존재는 관심 대상의 대립유전자의 존재의 지표이며, 따라서 ADR 발병 위험의 지표이다.
유용한 등가 유전 표지는 관심 대상의 대립유전자로부터 보통 약 200kb 또는 그 미만 (예, 100kb, 80kb, 60kb, 40kb 또는 20kb)에 있으며. 상술한 방법 또는 당 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 등가 유전 표지의 존재나 부재를 검출할 수 있다.
또한, 관심 대상 대립유전자의 RNA, cDNA, 또는 단백질 산물을, 그 대립유전자의 존재나 부재의 결정을 위해 검출할 수 있다.
이처럼, 관심 대상 유전자의 돌연변이 존재를 다양한 공지의 방법에 서열 기반 유전자형 분석 방법 (Sanger sequencing) 또는 대립 형질 특이적 PCR 등에 의해 검출할 수 있지만, Sequencing 방법은 판독 시간이 많이 소요되고, 판독에 특별한 프로그램을 요구하며, 대립 형질 특이적 PCR에 의한 오류 가능성을 내포한다. 하지만, 본 발명에서 검출하고자 하는 특정 돌연변이 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231를 분석하는 것으로, Sequencing를 축소한 방법이며, 따라서 정확도 및 시간단축에 있어 효율적이다.
또한 본 발명의 방법은 유전자 내 일배체형의 구조 및 각각의 일배체형을 대표하는 SNP를 파악하여 효과적인 전유전체 (genome-side) 연관 구조를 분석하는데 사용할 수 있다.
따라서 본 발명의 방법은, 총 27가지 유전자 50개의 돌연변이 (단일염기 다형성, SNP)를 검출하는 방법을 사용하고, 하기 단계들을 포함한다:
(a) ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231의 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 SNP를 확정하는 단계 (도 2 참조);
(b) ABCG2, ACE, ADRA1A, AGTR1, C11orf65, COQ2, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, DPYD, G6PDGNB3, HLA-B, HLA-DQA1, HLA-DRB1, Internal Control HGF, KCNJ11MMP3, NEDD4L, NUDT15, PTGS2, SLC14A2, SLCO1B1, TPMT, UGT1A1, VKORC1을 증폭하기 위해 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
(c) 다중 단일염기 프라이머를 사용하여 스냅샷 (SNaPshot) 분석법을 수행하여 생성산물에 대한 SNP를 분석하여 유전형을 확인하는 단계를 포함한다.
이때 단계 (b)에서 다중 중합효소 연쇄반응은 서열번호 1 내지 76의 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 서열번호 1 내지 8을 이용하여 CYP2D6를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 9 내지 14를 이용하여 CYP2C19을 특이적으로 증폭하고, 서열번호 15 내지 16을 이용하여 CYP4F2를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 17 내지 22를 이용하여 CYP2C9 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 23 내지 24를 이용하여 VKORC1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 25 내지 26을 이용하여 HLA-B 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 27 내지 28을 이용하여 G6PD 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 29 내지 30을 이용하여 HLA-DRB1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 31 내지 32를 이용하여 HLA-DQA1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 33 내지 34를 이용하여 증폭 정도관리 유전자 HGF를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 35 내지 38을 이용하여 TPMT 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 39 내지 40을 이용하여 NUDT15 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 41 내지 44를 이용하여 DPYD 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 45 내지 46을 이용하여 UGT1A1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 47 내지 50을 이용하여 SLCO1B1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 51 내지 52를 이용하여 ABCG2 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 53 내지 56을 이용하여 SLC14A2 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 57 내지 58을 이용하여 C11orf65 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 59 내지 60을 이용하여 ACE 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 61 내지 62를 이용하여 COQ2 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 63 내지 64를 이용하여 KCNJ11 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 65 내지 66을 이용하여 NEDD4L 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 67 내지 68을 이용하여 ADRA1A 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 69 내지 70을 이용하여 AGTR1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 71 내지 72를 이용하여 GNB3 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 73 내지 74를 이용하여 MMP3 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 75 내지 76을 이용하여 PTGS 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있다.
상기 단계 (c)에서 스냅샷 분석을 위한 다중 단일염기 프라이머는 서열번호 77 내지 124로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 프라이머를 이용한다.
상기 단계 (c)에서 유전형 확인은, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 돌연변이를 확인하는 것일 수 있다.
일 구체예로서 상기 방법은 다음과 같은 방법으로 수행될 수 있다.
(a) 목적하는 ABCG2, ACE, ADRA1A, AGTR1, C11orf65, COQ2, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, DPYD, G6PDGNB3, HLA-B, HLA-DQA1, HLA-DRB1, Internal Control HGF, KCNJ11MMP3, NEDD4L, NUDT15, PTGS2, SLC14A2, SLCO1B1, TPMT, UGT1A1 및 VKORC1의 특정 부위를 증폭한다.
본 발명의 일 실시예에서는 SNP, 돌연변이 부위를 포함하여 증폭되도록 하였고, HLA-B의 엑손 2 내지 4, HLA-DQA1의 엑손 1번, HLA-DRB1의 엑손 2번, HGF의 엑손 2번 부위가 증폭되도록 하였다. 이때, 적절한 공지의 방법을 선택하여 사용할 수 있는데, 예를 들어, 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR) 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 상기 증폭을 위해 서열번호 1 내지 76의 프라이머 세트를 사용하였으며, 이들의 서열 및 용도 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 각 프라이머 쌍은 특정 유전자에 특이적이다.
(c) 다중 단일염기 프라이머 확장을 통한 스냅샷 분석법을 수행하여 SNP를 분석한다.
이 단계에서 사용할 프라이머를 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231의 각 돌연변이가 이 구별될 수 있는 앞쪽에 정렬되도록 설계하고 다중 단일염기 다형성 (SNP) 부위에 상기 프라이머를 이용하여 확장반응을 수행한다.
본 발명의 일 실시예에서 사용한 다중 단일 염기 프라이머는 서열번호 77 내지 124로서, 이들의 서열 및 용도 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 각 프라이머 쌍은 특정 유전자에 특이적이다.
이후, 생성 산물에 대한 단일 염기 다형성 (SNP)에 대한 최고점을 분석하여 유전형을 확인함으로써 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 돌연변이 여부를 결정한다 (도 1 참조).
따라서 임의의 이용 가능한 방법에 의한 이러한 돌연변이의 검출이 진단 목적, 예컨대, 약물의 반응, 약물 부작용에 대한 감수성의 조기 검출, 환자에 대한 예후, 진단 및 치료를 보조하는데 사용될 수 있다.
상기 방법에 의한 본 발명의 또 다른 측면은 약리게놈학 프로파일링의 방법이다. “약리게놈학 프로파일링”은 질병 또는 의학적 상태, 특히 약물에 대한 부작용과 관련된, 대상자 (subject)에 존재하는 유전 인자의 결정을 의미한다. 이 방법은 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이의 존재를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 필요에 따라 다른 유전인자 (genetic factor)의 결정을 포함할 수 있다. 그러한 다른 유전 인자는 ADR을 포함하는 어떤 질병 또는 의학적 상태의 소인과도 관련될 수 있다.
각 돌연변이 검출 결과를 활용한 약물 반응 및 약물 부작용 (ADR) 평가
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 환자로부터 생체 시료를 사용하여 유전형을 결정하는 방법을 포함하는, 약물에 반응하여 환자에서 약물 부작용을 일으킬 위험을 평가하는 방법에 관한 것이다.
즉, 상기 유전 표지, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231의 존재 또는 부재에 기초하여 환자의 약물 반응 또는 약물 부작용 (예, 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사 용해, 또는 과민 증후군 등)의 발병 위험 여부를 평가하는 방법을 제공한다. 이때 대립유전자의 존재는 약물부작용의 위험의 지표이다.
상기 약물은 바람직하게는 보리코나졸, 피록시캄, 아스피린, 세레콕시브, 디클로페낙, 트라마돌, 이부프로펜, 오메프라졸, 에스오메프라졸, 란소프라졸, 판토프라졸, 라베프라졸, 심바스사틴, 세리바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 아토르바스타틴, 클로피도그렐, 플레카이니드, 프로파페논, 니페디핀, 캡토프릴, 퀴나크릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 텔미사르탄, 로사르탄, 메토프롤롤, 이르베사르탄, 칸데사르탄, 카르베디롤, 히드로클로로티아지드, 와파린, 글리메피리드, 글리벤클라미드, 글리클라지드, 메트포르민, 알로푸리놀, 라파티닙, 타목시펜, 시스플라틴, 메르캅토푸린, 파조파닙, 카페시타빈, 플루오로우라실, 이리노테칸, 아자티오프린, 라스부리카제 및 이들 유사 약물로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명에서 약물 화합물은, 상기 약물 화합물 그 자체, 또는 그 약물 중의 적어도 하나의 수소가 할로, 히드록시, 아실아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴옥시, 아릴, 아릴옥시아릴, 카복시, 카복시알킬, 카복시-치환된 알킬, 카복시-사이클로알킬, 카복시 치환된 사이클로알킬, 카복시아릴, 카복시-치환된 아릴, 카복시헤테로아릴, 카복시-치환된 헤테로아릴, 카복시헤테로사이클릭, 카복시-치환된 헤테로사이클릭, 사이클로알킬, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 아릴, 치환된 아릴옥시, 치환된 아릴옥시아릴, 치환된 사이클로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 또는 치환된 헤테로사이클릭기로 치환된 것을 제외하고는 그 약물과 같은 화합물을 의미한다. 상기 치환기가 함유하는 탄소수는 0 내지10, 0 내지 6, 0 내지 4, 또는 0 내지 2일 수 있다.
상기 약물에 대해 ADR 발병 확률이 일반집단 (general population)의 ADR 발병 확률보다 높으면 그 환자는 ADR의 “위험”이 있다.
그 환자의 ADR 발명 확률은 일반집단의 ADR 발병 확률의 적어도 약 1.5배, 더 바람직하게는 적어도 약 2배, 그보다 더 바람직하게는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9배, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 10배이다. 그 확률은, 위험인자의 발생 수 (incidence)를 이용하는 등의, 당 기술 분야에 알려진 어떤 방법을 사용하여 결정하여도 좋다.
ADR의“위험”인자는 ADR과 관련된 인자이다. 위험 인자의 감도는 바람직하게는 적어도 약 40%, 더 바람직하게는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 90%이다. 가장 바람직하게는, 그 감도는 적어도 95%이다. ADR을 예측하기 위한 위험 인자의 “감도 (sensitivity)”는 그 위험 인자를 보유한 ADR 환자의 백분율이다. 예를 들어, 만일 모든 SJS 환자가 대립유전자 A를 가지면, SJS를 예측하기 위한 그 대립 유전자 A의 감도는 100%이다. 만일 40명의 SJS 환자 중 20명이 대립유전자 B를 갖는다면, 그때의 SJS를 예측하기 위한 그 대립유전자 B의 감도는 50%이다.
적어도 약 40%의 감도로, 약물 반응 및 약물 부작용 (ADR)과 관련된 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231 돌연변이는 본 발명에 있어서의 위험 인자로 사용할 수 있다. 바람직하게는, 그 위험 인자의 감도는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 90%이다. 더 바람직하게는, 그 감도는 적어도 95%이다.
본 발명은 또한, 약물 반응과 약물 부작용 (ADR)과 관련된 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231의 돌연변이를 보유하는 환자에 있어서 ADR (예, SJS/TEN, HSS, 중증 간 손상, 근질환 등)을 유발하는 유사 화합물을 동정하는 방법을 포함한다.
이와 같이, 본 발명은 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231의 신속 정확한 검출 방법 및 이러한 결과를 활용할 수 있는, 약물 부작용 평가, 약물 동정 등을 포함하는 모든 용도를 포함한다.
<실시예>
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5‘->3’ 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
실시예 1: 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)
도 4에 제시된 바와 같이, 목적하는 유전자에 따라 적절한 증폭 프라이머 믹스를 사용하여 도 5에 제시된 조건에 따라 중합효소연쇄반응을 진행하였다. 중합효소연쇄반응은 ABI 9700 (Applied Biosystems, Foster, USA)을 이용하여 실시하였다.
예를 들어, APM1 의 경우, 반응액은 의뢰검체 100ng, 2X PCR Amplification Mix 10ul 및 증폭 프라이머 믹스 (APM1) 4ul를 포함하도록 최종 20ul를 맞추어 구성하였다. 상기 반응액을 94℃에서 5분간 처리한 후에, 98℃ 20초, 64℃ 30초, 72℃ 3분씩 35회 반응시켰고, 최종연장 반응은 72℃에서 5분간 수행하였다.
다음으로 중합효소 연쇄반응이 끝난 산물을 얼음 수조로 옮긴 후, 파라필름 (parafilm) 위에 PCR 산물 2 ul, 6X 로딩 버퍼 1 ul를 섞어, 1% 아가로오스 겔에 100 bp와 1 kb의 믹스드 DNA 래더 (Mixed DNA ladder) 2 ul를 0.5X TBE 버퍼와 섞어서 100 V, 30분간 전기영동을 실시하였다.
이후, 1% 아가로오스 겔을 형광 물질을 함유한 겔 레드 (gel red)로 염색하여 DNA 크기를 확인하였다. PCR 산물 크기를 확인한 후 샘플 내의 프라이머와 dNTP를 제거하기 위해, 도 7에 제시된 조건에 따라 ExoSAP-IT (USB corp., Cleveland, USA) 처리를 한 다음, 37℃ 35분, 80℃ 15분간 반응시켰다.
실시예 2: 다중 단일염기 프라이머 확장 반응 (multiplex single based primer extension, SNaPshot assay)을 이용한 대립유전자 검사
2-1. 유형별 프라이머 설계
다중 단일염기 프라이머 확장반응 (multiplex single based primer extension, SNaPshot assay)을 위한 유형별 프라이머는 서열번호 77 내지 124의 프라이머를 사용하였다 (도 6 참조).
프라이머들의 3‘ 끝이 각 유전자에 있는 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231를 구별할 수 있는 돌연변이 직전 뉴클레오티드와 정렬되도록 설계하였다.
2-2. 스냅샷 분석법
스냅샷 분석을 위해 중합효소연쇄반응 산물을 주형으로 하고 도 6에 제시된 바와 같이 특이적 프라이머를 포함하는 스냅샷 프라이머 믹스를 이용하여 도 8에 제시된 조건에 따라 다중 단일염기프라이머 확장반응을 실시하였다.
예를 들어, 스냅샷 프라이머 믹스 1 (SPM1)의 경우, 서열번호 77 내지 87의 프라이머를 사용하여 11개의 단일염기다형성 부위에 대해 길이를 다르게 설계한 11개의 유형별 프라이머를 이용하여 다중 단일염기 프라이머 확장반응을 시행하였다.
다중 단일염기 프라이머 확장반응은 스냅샷 프라이머 믹스 1 (SPM1)의 경우 본 발명에 따른 키트의 스냅샷 멀티플렉스 시약 (SNaPshot MR) 1 ul, 1/2 텀 (term) 버퍼 4 ul, Exo-SAP-IT 산물 7.5ul 및 스냅샷 프라이머 믹스 1 (SPM1) 1 ul로 구성하였다.
준비한 산물들은 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 30초를 40회 반응 시킨 뒤, 도 9에 제시된 조건에 따라 SAP을 1.2 ul (1 U/ul)를 각각 첨가하여 37℃ 60분, 65℃ 15분간 반응시켜 남아있는 ddNTP를 제거하였다.
반응 산물 1 ul에 GeneScan-120 LIZ 사이즈 스탠다드 0.5 ul 및 Hi-Di 포름아미드 8.5 ul를 넣어 ABI 3500 유전자 분석기 (Applied biosystems, Foster, USA)를 이용하여 분석하였다.
2-3. 단일 염기 다형성 (SNP) 분석
각 단일염기 다형성 위치에 상보적인 형광을 붙인 ddNTP가 각 프라이머 3‘ 끝에 오도록 조합하여 확장 반응 산물을 얻어, 각 SNP에 대한 각각의 최고점을 분석하였다. 소프트웨어는 GeneMapper v5.0 (Applied Biosystems, Foster, USA)을 이용하였으며 분석결과에 따라 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231의 존재 여부를 확인하였다.
그리고 실험으로 통해 얻어진 결과를 표준검사법 (gold standard, Sequencing)으로 얻어진 유전자 서열 정보 (sequencing data)와 비교하였다.
ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231을 동시에 검사한 결과는 도 1에 도시하였다.
이러한 결과를 통해, 본 발명의 키트를 사용하면, 약물 반응 및 약물 부작용 (ADR) 관련 유전자 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이의 존재 여부를 빠르고 정확하게 확인할 수 있음을 알 수 있다.
따라서 본 발명을 이용하여 상기 특정 각 돌연변이의 존재 여부를 고속으로 검출하여 약물 반응 및 약물 부작용과 관련된 위험도 예측 및 진단 방법에 효과적으로 활용할 수 있을 것이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 발명에 따른 약물과민반응 및 약물부작용과 관련된 ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28, VKORC1 rs9923231의 돌연변이를 검출하는 키트 및 이를 이용한 진단방법은 특히 한국인을 포함한 아시아인에 대해 높은 정확성을 나타내며, 신속하고 간편하게 진단할 수 있어, 약물 부작용을 약물과민 반응을 사전에 예방하고 치료의 효과 및 성공률을 높이는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트에 있어서,
    서열번호 1 내지 124의 프라이머를 포함하고,
    ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 돌연변이 존재 여부를 결정하는 것을 특징으로 하는, 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 키트는 2X PCR Amplification Mix, 2X Multiplex PCR Amplification Mix, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 1 (APM1), 서열번호 5 내지 서열번호 6의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 2 (APM2), 서열번호 7 내지 서열번호 8의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 3 (APM3), 서열번호 9 내지 24의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 4 (APM4), 서열번호 25 내지 28의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 5 (APM5), 서열번호 29 내지 44의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 6 (APM6), 서열번호 45 내지 46의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 7 (APM7), 서열번호 47 내지 56의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 8 (APM8), 서열번호 57 내지 66의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 9 (APM9), 서열번호 67 내지 76의 프라이머로 구성되는 증폭 프라이머 믹스 10 (APM10), 스냅샷 멀티플렉스 시약(SNaPshot MR), 서열번호 77 내지 87의 프라이머로 구성되는 스냅샷 프라이머 믹스 1 (SPM1), 서열번호 88 내지 99의 프라이머로 구성되는 스냅샷 프라이머 믹스 2 (SPM2), 서열번호 100 내지 109의 프라이머를 구성되는 스냅샷 프라이머 믹스 3 (SPM3), 서열번호 110 내지 119의 프라이머로 구성되는 스냅샷 프라이머 믹스 4 (SPM4), 서열번호 120 내지 124의 프라이머로 구성되는 스냅샷 프라이머 믹스 5 (SPM5), 대조군 DNA 및 뉴클레아제 프리 워터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 키트는 쉬림프 알칼린 포스파타아제 (Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)) 및/또는 엑소뉴클레아제 1 (Exonuclease 1 (Exo))를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 부작용이 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사 용해, 과민 증후군, 중증 간 손상 및 근 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 키트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약물이 보리코나졸, 피록시캄, 아스피린, 세레콕시브, 디클로페낙, 트라마돌, 이부프로펜, 오메프라졸, 에스오메프라졸, 란소프라졸, 판토프라졸, 라베프라졸, 심바스사틴, 세리바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 아토르바스타틴, 클로피도그렐, 플레카이니드, 프로파페논, 니페디핀, 캡토프릴, 퀴나크릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 텔미사르탄, 로사르탄, 메토프롤롤, 이르베사르탄, 칸데사르탄, 카르베디롤, 히드로클로로티아지드, 와파린, 글리메피리드, 글리벤클라미드, 글리클라지드, 메트포르민, 알로푸리놀, 라파티닙, 타목시펜, 시스플라틴, 메르캅토푸린, 파조파닙, 카페시타빈, 플루오로우라실, 이리노테칸, 아자티오프린, 라스부리카제 및 이들 유사 약물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 키트.
  6. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단방법:
    (a) 청구항 1에 따른 키트를 이용하여, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs325058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 SNP를 확정하는 단계;
    (b) ABCG2, ACE, ADRA1A, AGTR1, C11orf65, COQ2, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, DPYD, G6PDGNB3, HLA-B, HLA-DQA1, HLA-DRB1, Internal Control HGF, KCNJ11MMP3, NEDD4L, NUDT15, PTGS2, SLC14A2, SLCO1B1, TPMT, UGT1A1 및 VKORC1으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 유전자를 증폭하기 위해 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
    (c) 다중 단일염기 프라이머를 사용하여 스냅샷 (SNaPshot) 분석법을 수행하여 생성산물에 대한 SNP를 분석하여 유전형을 확인하는 단계.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서, 상기 다중 중합효소 연쇄반응은 서열번호 1 내지 76의 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 다중 중합효소 연쇄반응은 상기 서열번호 1 내지 8을 이용하여 CYP2D6를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 9 내지 14를 이용하여 CYP2C19을 특이적으로 증폭하고, 서열번호 15 내지 16을 이용하여 CYP4F2를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 17 내지 22를 이용하여 CYP2C9 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 23 내지 24를 이용하여 VKORC1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 25 내지 26을 이용하여 HLA-B 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 27 내지 28을 이용하여 G6PD 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 29 내지 30을 이용하여 HLA-DRB1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 31 내지 32를 이용하여 HLA-DQA1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 33 내지 34를 이용하여 증폭 정도관리 유전자 HGF를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 35 내지 38을 이용하여 TPMT 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 39 내지 40을 이용하여 NUDT15 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 41 내지 44를 이용하여 DPYD 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 45 내지 46을 이용하여 UGT1A1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 47 내지 50을 이용하여 SLCO1B1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 51 내지 52를 이용하여 ABCG2 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 53 내지 56을 이용하여 SLC14A2 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 57 내지 58을 이용하여 C11orf65 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 59 내지 60을 이용하여 ACE 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 61 내지 62를 이용하여 COQ2 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 63 내지 64를 이용하여 KCNJ11 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 65 내지 66을 이용하여 NEDD4L 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 67 내지 68을 이용하여 ADRA1A 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 69 내지 70을 이용하여 AGTR1 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 71 내지 72를 이용하여 GNB3 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 73 내지 74를 이용하여 MMP3 유전자를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 75 내지 76을 이용하여 PTGS 유전자를 특이적으로 증폭하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서, 상기 스냅샷 분석은 서열번호 77 내지 124의 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프라이머를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서, 유전형 확인은, ABCG2 rs2231142, ACE rs1799752, ADRA1A rs1048101, AGTR1 rs5186, C11orf65 rs11212617, COQ2 rs4693075, CYP2C19 *1,*2,*3,*17, CYP2C9 *1,*2,*3,*13,*14, CYP2D6 *1,*2,*4,*5 (결손),*10,*14,*18,*21,*41,*49,*52,*60,*XN (중복), CYP4F2 *1,*3, DPYD rs3918290, rs67376798, G6PD rs5030872, rs5030868, GNB3 rs5443, HLA-B *5701,*5801, HLA-DQA1*02, HLA-DRB1*07, Internal Control HGF 473T, KCNJ11 rs5219, MMP3 rs3025058, NEDD4L rs4149601, NUDT15 rs116855232, PTGS2 rs20417, SLC14A2 rs1123617, rs3745009, SLCO1B1 *1A,*1B,*5,*15, TPMT *1,*3C,*6, UGT1A1 *1,*28 및 VKORC1 rs9923231으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 돌연변이를 확인하는 것임을 특징으로 하는, 방법.
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PCT/KR2019/010516 WO2021029473A1 (ko) 2019-08-14 2019-08-19 암 및 만성질환 관련 다처방 약물에 대한 약물 부작용 예측 및 개인맞춤 약물치료를 위한 다중고속 약물유전자 진단용 키트

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